BG60405B2 - Фармацевтични състави от микробно произведен интерлевкин-2 - Google Patents
Фармацевтични състави от микробно произведен интерлевкин-2 Download PDFInfo
- Publication number
- BG60405B2 BG60405B2 BG96075A BG9607592A BG60405B2 BG 60405 B2 BG60405 B2 BG 60405B2 BG 96075 A BG96075 A BG 96075A BG 9607592 A BG9607592 A BG 9607592A BG 60405 B2 BG60405 B2 BG 60405B2
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- recombinant
- microbially produced
- composition
- selectively oxidized
- dissolved
- Prior art date
Links
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 title claims abstract description 116
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 title claims abstract description 116
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims abstract description 10
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims abstract description 10
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 25
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 12
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 12
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical group OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 9
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 claims description 8
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 239000008135 aqueous vehicle Substances 0.000 claims description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 4
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 claims description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical group C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 claims description 2
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 claims description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 2
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 claims description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 238000005215 recombination Methods 0.000 abstract 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 abstract 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 abstract 1
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 27
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 14
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 10
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 7
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 6
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 5
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MSXVEPNJUHWQHW-UHFFFAOYSA-N 2-methylbutan-2-ol Chemical compound CCC(C)(C)O MSXVEPNJUHWQHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 3
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 3
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 3
- BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N butan-2-ol Chemical compound CCC(C)O BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 150000001945 cysteines Chemical group 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000025747 Rheumatic disease Diseases 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- GONSYFXEPMZGNN-UHFFFAOYSA-N acetic acid;propan-1-ol Chemical compound CCCO.CC(O)=O GONSYFXEPMZGNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMZXXNPJQYDFJX-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;2,2,2-trifluoroacetic acid Chemical compound CC#N.OC(=O)C(F)(F)F PMZXXNPJQYDFJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052936 alkali metal sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- -1 alkyl alkali metal Chemical class 0.000 description 2
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N cystine group Chemical group C([C@@H](C(=O)O)N)SSC[C@@H](C(=O)O)N LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- IFPHDUVGLXEIOQ-UHFFFAOYSA-N ortho-iodosylbenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1I=O IFPHDUVGLXEIOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- ZIHBOROHTYWINY-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol;2,2,2-trifluoroacetic acid Chemical compound CCCO.OC(=O)C(F)(F)F ZIHBOROHTYWINY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091011896 CSF1 Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N Leu-enkephalin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=CC=C1 URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N 0.000 description 1
- 208000005777 Lupus Nephritis Diseases 0.000 description 1
- 206010067737 Lupus hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 102100028123 Macrophage colony-stimulating factor 1 Human genes 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002022 anti-cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000842 anti-protozoal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002152 aqueous-organic solution Substances 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011393 cytotoxic chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940124622 immune-modulator drug Drugs 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000013541 low molecular weight contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000000552 rheumatic effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000005062 synaptic transmission Effects 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Субстанцията от селективно окислен, микробно произведен рекомбинантен интерлевкин-2 е стерилна, устойчива и лиофилизирана. Рекомбинантният интерлевкин-2 е смесен с водноразтворим носител манитол, осигуряващ обема, и достатъчно количество натриев додесилсулфат, за да се осигури разтворимостта във вода. Субстанцията може да се включи във водна инжекция за парентерално приложение и е устойчива и добре поносима от пациентите.
Description
Настоящето изобретение е в областта на фармацевтичните препарати по-специално, се отнася и до фармацевтични състави от микробно произведен интерлевкин-2.
НИВО НА ТЕХНИКАТА
Интерлевкин-2, лимфокин, произведен от лимфоцити на нормална периферна кръв и причиняващ пролиферация на антиген или митоген, стимулиращ Т клетки след разкрито установени лектини, антигени или други стимули, за пръв път е бил описан от Mordan,
D.A., et al., Science /1976/193, 1007-1008. Тогава го нарекли Т клетъчен растежен фактор, заради способността му да предизвиква пролиферация на стимулирани Т лимфоцити. Сега е установено, че в допълнение на растежните му качества има и свойството да модулира различни функции на клетките на имунната система ин витро и ин виво и е отново наречен интерлевкин-2 /IL-2/. IL-2 е един от няколкото лимфоцитно произведени куриер-регулаторни молекули, които осъществяват имуноцитното взаимодействие и функции.
Интерлевкин-2 първоначално е бил произведен от култивирани човешки лимфоцити от периферна кръв /PBL/ или друг интерлевкин-2, произвеждащ клетъчни линии. Това е описано в US 4 401 756. Рекомбинантна DNA технология осигурява алтернатива на РВЦ и клетъчни линии за производство на IL-2. Taniguchi, Т., et al., Nature /1983/302:305-310и Devos, R., Nucleic Acids Research /1983/ 11:4307-4323 съобщават за човешки интерлевкин-2 ген и го представят в микроорганизми.
BE 898 016 признат 14 ноември 1983 и US приложение 564 224 /US 4 518 584 признат 21 май 1985 /описват мутеини от интерлевкин-2, в които нормално се намира цисте ин на 125-та позиция от естествен тип или естествени молекули са били премахнати или заместени с неутрални амино киселини, като серин. Тези мутеини притежават биологично активен интерлевкин-2. Белгийският патент установява, че рекомбинантните мутеини могат да се представят с нативен интерлевкин-2, комбинирайки ги с воден носител и инжектирайки ги венозно, подкожно или по друг начин.
РАЗКРИВАНЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО Един аспект на настоящето изобретение е, че IL-2 композицията е подходяща за реконституция във фармацевтично годен воден носител за парентерално приложение на пациенти за обезпечаване на IL-2 лечение, включващо стерилна лиофилизирана микстура от :
а/ терапевтично ефективно количество от окислен микробно произведен рекомбинантен 1L-2, който е свободен от non-IL-2 протеин;
б/ фармацевтично годен водно разтворим носител, който не повлиява стабилността на микробно произведения IL-2;
в/ достатъчно съдържание на повърхностен активен агент, като сулфатите на алкалните метали, натриев диацил сулфат /SDS/ , саркосинати на алкалните метали или натриев деоксихолат, да осигури водната разтворимост на микробно произведения рекомбинантен IL-2.
За предпочитане, рекомбинантният IL2 е бил селективно окислен, подобно на цистеините на позиция 58 и 105 от една дисулфидна връзка, за да направи молекулата биологично активна.
Друг аспект на това изобретение е фармацевтичното съединение за провеждане на лечение на пациенти, включващо стерилен разтвор от по-горе описаната микстура, разтворена във фармацевтично годен воден парентерален носител, като споменатият разтвор съдържа от около 0,01 до 2 мг от микробно произведения рекомбинантен IL-2 за мл.
СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО Използваният тук термин “IL-2” означава неглюкозиран протеин, произведен от микроорганизми, които са впоследствие трансформирани с човешки интерлевкин-2 DNA или модификация на човешки интерлевкин-2 DNA, който прилича на протеин, имащ:
а) една амино киселина, която е субстанциално идентична на амино киселина от порядъка на нативен човешки интерлевкин2-, включващ дисулфидна връзка на цистини на позиция 58 и 105;
б) биологическа активност, която е обща с нативния човешки интерлевкин-2. Субстанциалната идентичност на амино киселинния ред предполага, че редът е идентичен или се отличава чрез една или повече амино киселинни промени (унищожаване, съединяване, заместване), че това не е причина за неблагоприятно функционално несходство между синтетичния протеин и нативния човешки интерлевкин-2. Примери за такива протеини са рекомбинантния IL-2, описан в ЕР приложение 83101035 0, регистриран на З.П. 1983, (публикуван 19.Х.1983 под № 91539) и ЕР приложение 82307036.2 регистриран на 22.XII.1982 (публикуван на 14.IX.1983 под № 88195), рекомбинантен 1L2 мутеин, описан в ЕР приложение № 83306221.9, регистриран 13.Х.1983 (публикуван 30.V. 1984 под № 109748), което е еквивалентно на BE №893 016, обща собственост с US пат.№4 518 584 и рекомбинантния IL-2, описан в това предложение.
Използваният тук термин “трансформиран микроорганизъм”, означава микроорганизъм, който е генетично направляван да произвежда протеин, притежаващ активността на нативен човешки интерлевкин-2. Примери на трансформирани микроорганизми са описани в посочения ЕР публикувани №№ 88 198; 91 539; 109 748 и US № 564 224. Бактериите са предпочитаните микроорганизми за производство на IL-2. Типичен трансформиран микроорганизъм, полезен в настоящето изобретение, е Ешерихия коли К-12 род ММ294 трансформиран с плазмид pLWt (депозит на American Type Culture Collection
4.VIII.1983 от Cetus Corporation c предварителна уговорка на Budapest Treaty и имащ № 39 405). Синтетичният рекомбинантен IL-2 може също да бъде направен от подходящо трансформирана среда и от клетки от млекопитаещи. Е. коли е точно предпочитаният организъм.
Известна е пълната диаграма за начина на действие и пречистването на микробно произведения рекомбинантен IL-2. Описанието цели обезпечаването на по-нататъшните й детайли. Справката е направена също в US № 594 351; 661 902; 594 223 и 594 250, отк ритията от които са обединени в предложеното изобретение.
Трансформираните микроорганизми растат в подходяща хранителна среда, с типична оптична гъстота /ОГ/ поне около 30 до 680 нМ и за предпочитане между около 20 и 40 до 680 нМ. Съставът на хранителната среда зависи от включените микроорганизми. Средата е водна, съдържаща съединения, които реализират естествените изисквания на микроорганизмите. Хранителната среда съдържа типичен източник на въглерод и азот, енергийни източници, магнезий, калий и натриеви йони и свободни аминокиселини и пуринови и пиримидинови бази. /Виж Review of Medical Bioligy, Lange Medical Publication, 14 Ed, 8095, 1980/. В предложените носители, включващи trp-инициатор, триптофановата концентрация в средата е внимателно контролирана, за да стане ограничител на IL-2. Хранителните среди за Е. коли са добре известни. Предпочитаният метод е описан в US 4499188, признат на 12.11.1985.
След като клетките се отделят от културата, те могат да бъдат концентрирани, ако е необходимо от около 20 до 150 мг/мл; ( за предпочитане 160-200 до 680 нМ, ОГ 40 до 300) чрез филтрация, центрофугиране или конвенционални методи.
Следвайки концентрацията, клетъчните мембрани на микроорганизмите се разкъсват. Главната цел на разкъсването е улесняване на последващата екстракция и разтваряне. Конвенционалните техники на клетъчно разкъсване като хомогенизация, ултразвукова обработка или циклично налягане могат да бъдат използвани на този етап от процеса. Предпочитаните методи са ултразвукова обработка или хомогенизация с Manton-Ganlin хомогенизатор. Крайната точка на разкъсването може да се контролира чрез оптичната гъстота на суспензията до около 65 до 85%. В някои случаи разкъсването може да разруши всички клетки, така че да не останат интактни клетки през етапа на разтваряне. Преди разкъсването pH на течната фаза на концентрата се определя, ако е необходимо, до стойности, които улесняват премахването на протеините на Е.коли в последващите етапи, докато задържат протеините на рекомбинантния IL-2, като неразтворим комплекс в клетъчните остатъци. Стойността на pH може да се нагоди, като се прибавят подходящи буфери. В повечето случаи се използва pH в границите 8-8,5.
Етапите на последователно възвръщане на разкъсването, са описани първоначално с отделяне на IL-2 от протеина на Е. коли до висока степен на чистота (предпочита се поне около 95 % и по-добре около 98%), при добро производство, докато поддържат IL-2 в редуцирано състояние. Едновременно процесите на очистване също намаляват пирогенните субстанции в крайния продукт, до стойности, годни за парентерално приложение на пациенти.
След като клетките се разкъсат, специфичната материя може да се отдели от течната фаза на разкъсания и ресуспендиран във водна среда буфер с оптимално за извличането pH. На този етап специфичната материя може да бъде изборно промита с буфер, за да се освободи водно разтворимият протеин от Е. коли. Във всеки случай, белтъчната концентрация на клетъчната суспензия, подлежаща на извличане, е в стойности около 5 до около 60 мг/мл, за предпочитане от 20 до 40 мг/мл.
Извличането на белтъка иа Е.коли от клетъчния материал може да се осъществи конкурентно с разкъсването или като резултат на последващо разкъсване. За предпочитане е да се осъществи като етап, следващ разкъсването. Веществото, извършващо извличането, е воден разтвор на хаотропичен агент /слаб протеин, денатуриран, който разкъсва водородните връзки и въздейства на третичната структура на белтъците/. Това вещество селективно отстранява масата на белтъка на Е. коли от клетъчните остатъци, напускащ поне съществена част от рекомбинантния IL-2 свързан (включен или свързан) с клетъчните остатъци. Селективността е улеснена от хидрофобността на рекомбинантния IL-2 и от факта, че е в редуцирано, неразтворимо състояние, при pH близо до изоелектричната точка на белтъка. В допълнение, съществена част от рекомбинантния IL-2 може да присъства ин виво, като включени тела на значителна маса, както е случая с други белтъчни колонии, изявени във високи стойности в Е.коли. Примери на екстрахиращи вещества са урея и гуанидин хидрохлорид /гуанидин хидрохлорид не може да се използва, когато за разтварящ агент се използва SDS/. Уреата е за предпочитане. Концентрацията на халотропния агент в екстрахираната смес ще зависи от специфичния агент, който се изпол зва и количеството на клетъчния материал в екстрахираната смес. В случай, че е уреа, се използва концентрация между 3,5 М и 4,5 М, за предпочитане около 4 М при 25°С. Ако извличането продължава по-дълго време, желателно е да се използва по-ниска концентрация. При извличането се използва обикновено температура в границите от 20°С до 25°С, за улеснение се използва стайна температура. Смесването се използва за повишаване на контакта между разтвора и специфичното вещество и то ще намали времето за извличане на non-IL-2 протеини от клетъчните остатъци. Кинетичният анализ на екстракционния процес се извършва на колона, използвайки SDSPAGA и този процес завършва за 15-30 мин.
След извличането, микстурата се разделя на твърда и течна съставка. Рекомбинантният IL-2 в твърдата съставка е селективно разтворим чрез свързване на твърдата съставка с неутрален воден буфер, съдържащ редуциращ и разтварящ агент. Могат да се използват физиологично годни повърхностно активни агенти /детергенти/, които имат подходящ хидрофобно-хидрофилен баланс, за да разтварят хидрофобния рекомбинантен IL-2. Предпочитаните разтварящи агенти са сулфати на алкалните метали, съдържащи 10 до 14 въглеродни атома и алкил саркозинати на алкалните метали със SDS и саркозил.
Сумата от разтворимите агенти, използвани в разтварянето, зависи изцяло от специфичните агенти. Когато се използват SDS или саркозил, предпочитаното съотношение между SDS и саркозил в твърдата съставка на протеина е около 0,5 : 1 до 1,4 : 1. Разтворимата среда съдържа също достатъчно количество редуциращ агент, предпазващ разтворения IL-2 от окисление в значителна степен. Могат да се използват протеин редуциращи агенти-дитиотреитол /DTT/ и 2-меркапто етанол. Концентрацията на редуциращия агент като ДТТ в средата е обикновено между 5 и 20 мМ. Разтварянето би се осъществило типично при температура от 20°С до 25°С със смесване, за да се улесни контакта между твърдата съставка и разтворимата среда. По-високите температури може да разтворят протеините на Е.коли. Разтварянето се смята за пълно, когато опитът се извършва за 15 мин или когато разтворът стане прозрачен.
Неразтвореният материал се отделя след пълното разтваряне.
След разтварянето на IL-2, последният може да бъде изборно извлечен от водния разтвор чрез редукция с 2-бутанол или 2-метил2-бутанал, за да се отстрани от добавените протеини на Е.коли, включващи определени контаминанти, които имат молекулно тегло много близко до това на IL-2. Използват се условия (йонна сила в степен от 0,05 и 0,15), при които водният разтвор и бутанолът не могат да се смесят субстанциално. При осъществяването на органично извличане, протеинната концентрация във воден разтвор се определя, ако е необходимо, да бъде по-малка от около 6 мг/мл, за предпочитане около 0,5 до 4 мг/мл. Подтискащите условия се поддържат чрез осъществяване на извличане в присъствието на редуциращи агенти /DTT/. Бутанолът нормално се добавя към водния разтвор на разтворения IL-2 в обемно съотношение от 1:1 до около 3:1 /извлек-воден разтвор/, за предпочитане около 1:1. Извличането може да бъде осъществено на един етап или с продължителни операции. Температурата трябва да бъде от 20°С до 100°С и рН от около 4 до 9, за предпочитане между 5 и 6. Времето за контакт между разтвора и бутанола не е от съществено значение, то е относително кратко-в границите на няколко минути. След пълното извличане водната и бутаноловата съставка се разделят и IL-2 се отделя от бутаноловата съставка. Предпочитаната процедура за разделяне на IL2 от бутаноловата съставка е киселата преципитация. Това се осъществява чрез добавяне на бутаноловата съставка към водния буфер, рН 7,5 докато органичната съставка се разтвори (приблизително 2-3 обема буфер за 1 обем органична съставка) и след това рН се намалява на около 5,5 до 7, за предпочитане 6 до 6,2, защото 1L-2 преципитира.
Следващата стъпка в процеса е разделянето на рекомбинантния IL-2 и на някои контаминация на Е.коли, останали след извличането и оптимално от разтварящия агент. Използват се гел филтрираща хроматография, RP-HPLC, или комбинация от двете. Гел филтриращата хроматография се осъществява, за предпочитане на два етапа, за да се отстранят пирогенните компоненти и протеинните контаминанти, имащи молекулно тегло по-високо или по-ниско от рекомбинантния IL-2.
Рекомбинантният 1L-2 има молекулно около
15,5 К далтона. Теловете са способни да фракционират разтвора, позволяващ отделянето на IL-2 от контаминантите, и са търговски достъпни. Сефакрил S-200 е предпочитаният гел за отстраняване на компоненти с по-високо молекулно тегло и Сефадекс G-25, G-75 или G-100 гел са предпочитани за придвижване на контаминанти с ниско молекулно тегло. Гел филтрацията протича в буферни разтвори ( рН 5,5 до 7) съдържащи около 0,1-1% разтварящ агент и около 1 до 10 нМ редуциращ агент.
RP-HPLC е алтернатива на гел филтрацията. RP-HPLC е способен за отстраняване на молекули от разтвори с молекулно тегло близко до това на рекомбинантния IL-2, които не могат да бъдат отстранени чрез гел филтрация. Като допълнение, контаминантите както и бактериалният ендотоксин се отстраняват по-ефектно чрез RP-HPLC. Затова RPHPLC може да се използва като краен очистващ етап след гел филтрацията. Поддържащите (постоянни) съставки осигуряват пълно разлагане на протеините и може да се използват като краен очистващ етап след гел филтрация. Поддържащите (постоянни) съставки, които осигуряват пълно разлагане на протеини, могат да бъдат използвани в RP-HPLC. С-4, С8 или С-18 с размери на порите 300 А. са предпочитаните поддържащи съставки. Разделянето се осъществява в кисело рН, помалко от около 2,3, обикновено 2,1 до 2,3, за да се запази IL-2 в разтвор. В това отношение, рН на разтвора за разтваряне (гел филтрация) се предпочита да бъде в тези граници. Разтворът се зарежда в колоната на RP-HPLC и се абсорбира върху постоянните съставки. Градиентьт на системата на разтваряне, съдържаща органична киселина като оцетна киселина или трифлуор оцетна киселина и органичен разтвор като пропанол или ацетонитрил, се използва за промиване на IL-2 от колоната. Оцетна киселина-пропанол, трифлуор оцетна киселина-пропанол и трифлуор оцетна киселина-ацетонитрил са предпочитаните системи за разтваряне. Рекомбинантният IL-2 се промива в оцетна киселина-пропанол с около 40% пропанол, в трифлуор оцетна киселина-пропанол с около 50% пропанол и в трифлуор оцетна киселина-ацетонитрил, с около 62% ацетонитрил. Органичното разтворимо вещество, използвано за промиване, обикновено се повишава бързо до ниво малко под концентрацията на разтворимото вещество, при което рекомбинантният промит IL-2 следва чрез бавна промяна на градиента в порядъка от 0,1 до 1 % мин.
Веднага щом рекомбинантният IL-2 се покрие от хроматографията, той се лиофилизира и ресуспендира в неутрален воден буфер, съдържащ редуциращ агент, който запазва рекомбинантния IL-2 в редуцирано състояние, и разтварящ агент (съхраняващ рекомбинантния IL-2 в разтворено състояние). Рекомбинантният IL-2 е стабилен в тази форма и може да бъде складиран за бъдещо лечение.
Една алтернативна и предпочитана процедура е селективното окисление при контролирани условия. Рекомбинантният IL-2 се отделя след това чрез гел филтрация и очистване от окислените продукти чрез RP-HPLC или гел филтрация, последвана от RP-HPLC. Тези резултати при умело очистване от контаминантите чрез гел филтрация са толкова подобри, колкото са нежеланите оксидационни продукти. Предпочитаната окислителна процедура е селективното окисление на пълно редуцирания микробно произведен синтетичен рекомбинантен IL-2 протеин, имащ една амино киселина идентична с рекомбинантния IL-2 протеин, включващ цистеини, които в последния протеин са включени интрамолекуларно на позиции 58 до 105 под формата на цистин в контролния опит, така че цистеините са селективно окислени под формата на цистин на позиция 58 до 105. Ефикасността на контролираното и селективно окисление се подобрява, ако рекомбинантният IL-2 мутеин се използва така, както е описан и обявен в BE 898 016 и US 4 518 584. В такъв случай цистеинът на позиция 125 е премахнат или заменен с неутрална амино киселина и така се предотвратява неправилната интрамолекуларна връзка и / или интермолекуларни връзки с цистеина на позиция 125 по време на окислението, което също прави димерни или полимерни форми на IL-2. В този процес пълната микробна редукция, продуцираща синтетичния рекомбинантен IL-2 протеин е за предпочитане да реагира с ойодозобензоат, който окислява селективно цистеина във водна среда с рН поне с 1/2 единица по-малко от рКа на цистеина, където концентрацията на синтетичния протеин е реактивна та смес е по-малка с около 5 мг/мл и молекулярното съотношение на о-йодозобензоат и протеин е поне стехиометрично, при условие, че о-йодозобензоатьт е в излишък в последната фаза на реакцията. Селективното окисление продуцира биологично активна молекула. RP-HPLC пречистване на селективно окисления продукт може да се извърши извън условията, описани по горе в отсъствието на редуциращ агент и в присъствието на детергент в еднаква или по-малка концентрация от тази, която се използва в описаната по горе гел филтрация.
Чистотата на рекомбинантния IL-2 след хроматографията е поне около 95 % и обичайно е поне около 98%. Този високо чист материал съдържа поне около 5 нг ендотоксин, обикновено по-малко от 0,01 нг ендотоксин на 100,000 единици IL-2 активност.
Формирането на рекомбинантния IL-2 съгласно настоящето изобретение може да се извършва като отделни операции, използващи пречистване, селективно окисление на IL2 или една операция, която съчетава пречистване и селективно окисление на IL-2. Във втория случай началният материал за получаване е рекомбинантният IL-2, съдържащ продукт за обратната фаза с висок коефициент на течна хроматография /RP-HPLC/ третирана при селективно окислен продукт, предпочитане рекомбинантен IL-2, селективно окислен чрез RP-HPLC продукт, включващ разтвор от рекомбинантния IL-2 във водно органичен разтвор. Естеството на органичния разтвор зависи от системата разтворими вещества, използвани в RP-HPLC. Може да се използва комбинацията от органична киселина, каквато е оцетната киселина или трифлуор оцетната киселина и органично разтворим пропанол или ацетонитрил.
Първата стъпка при получаване на рекомбинантния IL-2 чрез RP-HPLC е да се превърне водната микстура чрез разреждане във воден буфер, съдържащ детергент, какъвто е SDS или саркозил, които увеличават разтворимостта на рекомбинантния IL-2 във вода. Следвайки това разреждане органичната съставка се очиства от рекомбинантния IL-2, съдържащ водна съставка и концентрацията на детергента се намалява чрез диафилтрация, използваща един определен буфер. Когато SDS се използва, SDS се редуцира до стойности от около 100 до 250 за предпочитане приблизително 200 /zr/мг 1L-2. Следвайки диафилтрацията, концентрацията на IL-2 се определя отново в порядъка от около 0,01 до 2 мг/мл и водният разтвор носител се добавя до желаното ниво. Носителят се добавя в такова количество, че присъствието му в разтвора да е около 1 до 10% тегл. за предпочитане около 5% тегл. Точното количество на добавения носител не е критично. Конвенционалните твърди вещества, използвани във фармацевтичните таблетки, могат да се използват като носители. Тези материали са водно разтворими, не влизат в реакция с IL-2 и сами по себе си са стабилни. Те също трябва да са нехигроскопични. Примери за носители, които могат да бъдат добавени, са лактоза, манитол и други редуцирани захари като сорбитол, скорбяла и хидролизата на скорбялата от пшеница, царевица, ориз и картофи, микрокристалинна целулоза, албумин какъвто е човешкият серумен албумин. Манитолът е за предпочитане.
Носителят е добавен към формулата, така че когато единична доза от разтвора се лиофилизира в контейнерите или в стерилна ампула, замразеният сух остатък може ясно да се види с просто око. Предпочитаният носител манитол, произвеждащ бял кристален остатък, не е чувствителен към вода. Нечувствителността на манитола към водата подобрява стабилността на формулата. След добавяне на носителя-единица от дозата (обемите,които ще осигурят 0,01 до 2 мг, за предпочитане 0,2-0,3 мг IL-2 за доза) на разтвора са разпределени в контейнерите, покрити със запушалки, съдържанието се лиофилизира чрез конвенционално замразяване-изсушаване.
Лиофилизираният стерилен продукт, съдържащ се в микстура от: 1) рекомбинантен IL-2, 2) носител (манитол) ,3)детергент (SDS), и 4) малко количество буфер, което обезпечава физиологично pH, когато микстурата е готова. Рекомбинантният 1L-2 съставлява около 0,015 до 3,85 % от теглото на микстурата, за предпочитане около 0,4 до 0,6 % от нея. Складираните тестове от този продукт показват, че 1L-2 е стабилен в тази форма за повече от три месеца при 2 до 8° С.
Лиофилизираната микстура може да се възстанови чрез инжектиране на конвенционален парентерален воден разтвор, така както вода за инжекция, Рингер, декстроза, декстроза и натриев хлорид, или други подобни в ампулата. Ампулите съдържат 1 до 5 мл, за предпочитане 1 до 2 мл.
Създадената формула е подходяща за парентерално приложение при хора или други бозайници, за да обезпечи 1L-2 терапия. Тази терапия е пригодена за различни имуномодулиращи индикации, каквито са Т клетъчна мутагенеза, индукция на цитотоксични Т клетки, увеличаване на естествената килърна клетъчна активност, индукция на гама интерферон, възстановяване или повишаване на клетъчния имунитет /лечение на имунодефицитни състояния/, увеличаване на клетъчната антитуморна активност.
Следващите примери илюстрират изобретението.
Пример
Рекомбинантният IL-2, използван в този пример, е desala IL-2 serl25. Аминокиселинният ред на този 1L-2 се различава от аминокиселинния ред на нативния човешки IL-2 по това, че отсъства началният аланин от нативната молекула и цистеина на позиция 125 е заменен от серия. Проби от Е. коли, произвеждащи този IL-2, са били депозирани от Cetus Corporation the American Type Culture Collect., 12301 Parklawn Drive, Rockvile, Md., USA на 26 септември, 1983, под добавен №39626 под осигуряването на Budapest Treaty.
329 мг от RP-HPLC пречистен цистеин окисляват IL-2 продукт (белтъчна концентрация 0,94 мг/мл в 60% 2-пропанолол, 6 % оцетна киселина разтворена 10 пъти в 50 мМ натриев ацетат, 1 мМ етилен диамин тетраоцетна киселина /ЕДТА/, 0,1% SDS с pH 5,5.
Разтвореният рекомбинантен IL-2 се концентрира, използвайки 10 атм куха нишковидна гилза (най-малко молекулно тегло 10,000 далтона) до обем от 600 мл и след това се диафилтрира за 3 обема срещу 50мМ натриев ацетат, 1 мМ ЕДТА, 0,1% SDS при 5,5. Материалът след това допълнително се диафилтрира срещу 10 мМ натриев фосфат, съдържащ 5 мкг SDS/мл протеин. Приблизително 255 мг IL-2 в концентрация от 0,6 мг/мл се възстановяват /425 мл/.
Само 222 мг се използват за формиране, които се разпределят както следва: 370 мл от IL-2 разтвор /222 мг, 0,6 мг/мл/ се разреждат с 10 мМ натриев фосфат, pH 7,5 и 20 % манитол като крайна композиция:
0,25 мг/мл IL-2 В 10 мМ натриев фосфат,
5% манитол pH 7,5
Разтворът след това се филтрира стерилно през 0,2μ филтър и се лиофилизира. Материалът се затваря под вакуум.
Тази производствена формула е използвана клинично при хора и е добре понесена в дози до 2 милиона единици/м2, когато се прилага като продължителна интравенозна инфузия или до 1 милион единици/м2 при интравенозно или интрамускулно приложение. Подходящи индикации за използване на рекомбинантния IL-2 включват:
1. Лечение на имуннонедостатъчни състояния, придобити, вродени или предизвикани от хемотерапия, имунотерапия или облъчване (радиация).
2. Повишаване на клетъчно непряк имунен отговор при лечение на вирусни, паразитни, бактериални, злокачествени, гъбични, протозойни или микробактериални или други инфекциозни заболявания.
3. Влияе на повишаването на имунологичния отговор на клетките ин виво при лечение на инфекциозни, малигнени, ревматични или автоимунни заболявания.
4. Лечение на ревматоидни или други възпалителни артрити.
5. Лечение на заболявания с анормален имунен отговор, като мултиплетна склероза, системен лупус еритематодес, гломерулонефрити или хепатити.
6. Регулация на хемопоетичната тъкан при хемопоетични тумори или пре-канцерози или апластични състояния.
7. Използва се като помощно средство в индукцията на клетъчния или хуморален отговор на естествено присъстващи, естествено прилагани химически синтезирани или модифицирани рекомбинантни ваксини или други антигени, приложими за терапевтични цели.
8. Използва се като медиатор на невротрансмисията или като психоактивен терапевтик, като енкефалин за терапевтични цели, или като модулатор на функцията на централната нервна система.
9. В локална апликация за лечение на по-горе споменатите заболявания.
10. В комбинация с цитотоксична хемотерапия или облъчване, или хирургическо ле чение на злокачествени заболявания или преканцерози в директна терапевтична или спомагателна среда.
11. В комбинация с агенти с директно антивирусно, анти-гьбично, антибактериално или антипротозоино действие, или в комбинация с лекарства за лечение на типична или атипична туберкулоза.
12. В комбинация с други имуномодулиращи лекарства, лимфокини /II-1, П-З, CSF1, алфа-интерферони, гама-интерферони/ естествено намиращи се или индуциращи антицелуларни токсини или молекули, които постигат разреждане или стаза, или малигнени клетки в лечението на злокачествени, инфекциозни, автоимунни или ревматични заболявания.
13. За профилактика на инфекциозни заболявания.
По подобен начин рекомбинантният IL2 белтък от див тип, както е разкрит в ЕР 91 539 или окислително устойчиви мутеини, където метионинът е бил възстановен чрез друга амино киселина, разкрито в US 692 596, регистрирано 18 януари 1985 описанието на което е включено тук, може да се формулира съгласно настоящето изобретение. Всички форми на IL-2 от див тип или естествена форма или мутеини, са включени в настоящето изобретение.
Claims (15)
- Патентни претенции1. Рекомбинантен IL-2, подходящ за включване във фармацевтично годен воден носител за парентерално приложение на пациенти за обезпечаване на IL-2 лечение, включващ стерилна лиофилизирана смес от: а/терапевтично ефективно количество от селективно окислен, микробно произведен рекомбинантен IL-2, който е свободен от попIL-2 протеин и съдържа поне 95% чист рекомбинантен IL-2 и по-малко от 5 мг ендотоксин за 100 000 единици от IL-2 активност;б/ физиологично годен, водно разтворим носител, който не действа върху стабилността на селективно окисления, микробно произведен IL-2; и в/ достатъчно съдържание на повърхностно активен агент за обезпечаване водната разтворимост на селективно окисления, микробно произведен, хидрофобен рекомбинантен IL-2.
- 2. Състав съгласно претенция 1, в която микробно произведеният рекомбинантен IL-2 включва по-малко от 5% от теглото на IL-2 протеин и повърхностно активният агент е натриев диацилсулфат или натриев деоксихолат.
- 3. Състав съгласно претенция 1, в който окисленият микробно произведен IL-2 съставлява около 0,02 до 3,85 % от теглото на микстурата.
- 4. Състав съгласно претенция 1, в който рекомбинантният IL-2 е desala IL-2 кк |И.
- 5. Състав съгласно претенция 1, в който водно разтворимият носител е манитол.
- 6. Състав съгласно претенция 2, в който SDS е около 100 до 250 мкг/мг от 1L-2.
- 7. Състав съгласно претенция 2, според който рекомбинантният IL-2 е desala IL-2KklM, рекомбинантният IL-2 протеин включва помалко от около 5% от теглото си non IL-2 протеин, IL-2 съставлява около 0,015 % до3,85 % от теглото на микстурата, и водно разтворимият носител е манитол и SDS е в количество от около 100 до около 250 мкг/мг от IL-2.
- 8. Фармацевтичен състав за обезпечаване на лечение на болни, включващ стерилен разтвор от : сместа съгласно претенция 1, разтворена във фармацевтично подходяща водна парентерална инжекция, наречена разтвор, съдържащ от около 0,01 мг до около 2мг/мл от селективно окисления, микробно произведен рекомбинантен IL-2.
- 9. Фармацевтичен състав за обезпечаване на IL-2 терапия на болни включващ стерилен разтвор от : сместа съгласно претенция 2, разтворена във фармацевтично подходяща водна парентерална инжекция, наречена разтвор, съдържащ от около 0,01 мг до 2 мг/ мл от селективно окисления, микробно произведен рекомбинантен IL-2.
- 10. Фармацевтичен състав за обезпечаване на IL-2 терапия на болни, включващ сте- рилен разтвор от : сместа съгласно претенция3, разтворена във фармацевтично подходяща водна парентерална инжекция, наречена разтвор, съдържащ от около 0,01 мг до около5 2 мг/мл от селективно окисления, микробно произведен рекомбинантен IL-2.
- 11. Фармацевтичен състав за обезпечаване на IL-2 терапия на болни, включващ стерилен разтвор от : сместа съгласно претенция 10 4, разтворена във фармацевтично подходяща водна парентерална инжекция, наречена разтвор, съдържащ от около 0,01 мг до около 2 мг/мл от селективно окисления, микробно произведен рекомбинантен IL-2.15
- 12. Фармацевтичен състав за обезпечаване на 1L-2 терапия на болни, включващ стерилен разтвор от : сместа съгласно претенция5, разтворена във фармацевтично подходяща водна парентерална инжекция, наречена разтвор, съдържащ от около 0,01 мг до около 2 мг/мл от селективно окисления, микробно произведен, рекомбинантен IL-2.
- 13. Фармацевтичен състав за обезпечаване на IL-2 терапия на болни, включващ стерилен разтвор от : сместа съгласно претенция6, разтворена във фармацевтично подходяща водна парентерална инжекция, наречена разтвор, съдържащ от около 0,01 мг до около 2 мг/ мл от селективно окисления, микробно произведен рекомбинантен IL-2.
- 14. Фармацевтичен състав за обезпечаване на IL-2 терапия на болни, включващ стерилен разтвор от : сместа съгласно претенция7, разтворена във фармацевтично подходяща водна парентерална инжекция, наречена разтвор, съдържащ от около 0,01 мг до около 2 мг/мл от селективно окисления, микробно произведен, рекомбинантен интерлевкин-2.
- 15. Фармацевтичен състав съгласно претенция 8, в който водният парентерален носител е вода за инжекция.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
BG96075A BG60405B2 (bg) | 1992-03-16 | 1992-03-16 | Фармацевтични състави от микробно произведен интерлевкин-2 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
BG96075A BG60405B2 (bg) | 1992-03-16 | 1992-03-16 | Фармацевтични състави от микробно произведен интерлевкин-2 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
BG60405B2 true BG60405B2 (bg) | 1995-02-28 |
Family
ID=3924334
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
BG96075A BG60405B2 (bg) | 1992-03-16 | 1992-03-16 | Фармацевтични състави от микробно произведен интерлевкин-2 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
BG (1) | BG60405B2 (bg) |
-
1992
- 1992-03-16 BG BG96075A patent/BG60405B2/bg unknown
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4604377A (en) | Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 | |
EP0268110B1 (en) | Pharmaceutical compositions of recombinant interleukin-2 and formulation processes | |
EP0206828B1 (en) | Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts and the use thereof | |
EP0217645B1 (en) | Stable formulation of biologically active proteins for parenteral injection | |
US5004605A (en) | Low pH pharmaceutical compositions of recombinant β-interferon | |
US5037644A (en) | Pharmaceutical compositions of recombinant interleukin-2 and formulation processes | |
US5183746A (en) | Formulation processes for pharmaceutical compositions of recombinant β- | |
EP0215658B1 (en) | Improved formulation for recombinant beta-interferon processes for recovery and stabilization of beta-interferon and the use thereof | |
EP0270799A1 (en) | Pharmaceutical compositions of recombinant beta-interferon and formulation processes | |
EP0211835B1 (en) | Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 | |
EP0357645B1 (en) | Improved process for recovering microbially produced interleukin-2 | |
US5643566A (en) | Formulation processes for lipophilic proteins | |
US5162507A (en) | Process for recovering purified, oxidized, renatured recombinant interleukin-2 from microorganisms | |
JP2955294B2 (ja) | 微生物から精製され、酸化され、再生された組換えインターロイキン‐2を回収する方法 | |
US4999339A (en) | Combination therapy of IL-2 and DTIC for the treatment of melanoma | |
WO1989004665A2 (en) | Treatment of infections caused by a primary immunodeficiency with interleukin-2 | |
BG60405B2 (bg) | Фармацевтични състави от микробно произведен интерлевкин-2 | |
CA1283356C (en) | Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 | |
JPH08505042A (ja) | レトロウイルス感染の阻害 | |
CA1337671C (en) | Process for recovering purified, oxidized, renatured recombinant interleukin-2 from microorganisms |