BG60405B2 - фармацевтични състави от микробно произведен интерлевкин-2 - Google Patents

Abstract

Субстанцията от селективно окислен, микробно произведен рекомбинантен интерлевкин-2 е стерилна, устойчива и лиофилизирана. Рекомбинантният интерлевкин-2 е смесен с водноразтворим носител манитол, осигуряващ обема, и достатъчно количество натриев додесилсулфат, за да се осигури разтворимостта във вода. Субстанцията може да се включи във водна инжекция за парентерално приложение и е устойчива и добре поносима от пациентите.

Description

Настоящето изобретение е в областта на фармацевтичните препарати по-специално, се отнася и до фармацевтични състави от микробно произведен интерлевкин-2.

НИВО НА ТЕХНИКАТА

Интерлевкин-2, лимфокин, произведен от лимфоцити на нормална периферна кръв и причиняващ пролиферация на антиген или митоген, стимулиращ Т клетки след разкрито установени лектини, антигени или други стимули, за пръв път е бил описан от Mordan,

D.A., et al., Science /1976/193, 1007-1008. Тогава го нарекли Т клетъчен растежен фактор, заради способността му да предизвиква пролиферация на стимулирани Т лимфоцити. Сега е установено, че в допълнение на растежните му качества има и свойството да модулира различни функции на клетките на имунната система ин витро и ин виво и е отново наречен интерлевкин-2 /IL-2/. IL-2 е един от няколкото лимфоцитно произведени куриер-регулаторни молекули, които осъществяват имуноцитното взаимодействие и функции.

Интерлевкин-2 първоначално е бил произведен от култивирани човешки лимфоцити от периферна кръв /PBL/ или друг интерлевкин-2, произвеждащ клетъчни линии. Това е описано в US 4 401 756. Рекомбинантна DNA технология осигурява алтернатива на РВЦ и клетъчни линии за производство на IL-2. Taniguchi, Т., et al., Nature /1983/302:305-310и Devos, R., Nucleic Acids Research /1983/ 11:4307-4323 съобщават за човешки интерлевкин-2 ген и го представят в микроорганизми.

BE 898 016 признат 14 ноември 1983 и US приложение 564 224 /US 4 518 584 признат 21 май 1985 /описват мутеини от интерлевкин-2, в които нормално се намира цисте ин на 125-та позиция от естествен тип или естествени молекули са били премахнати или заместени с неутрални амино киселини, като серин. Тези мутеини притежават биологично активен интерлевкин-2. Белгийският патент установява, че рекомбинантните мутеини могат да се представят с нативен интерлевкин-2, комбинирайки ги с воден носител и инжектирайки ги венозно, подкожно или по друг начин.

РАЗКРИВАНЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО Един аспект на настоящето изобретение е, че IL-2 композицията е подходяща за реконституция във фармацевтично годен воден носител за парентерално приложение на пациенти за обезпечаване на IL-2 лечение, включващо стерилна лиофилизирана микстура от :

а/ терапевтично ефективно количество от окислен микробно произведен рекомбинантен 1L-2, който е свободен от non-IL-2 протеин;

б/ фармацевтично годен водно разтворим носител, който не повлиява стабилността на микробно произведения IL-2;

в/ достатъчно съдържание на повърхностен активен агент, като сулфатите на алкалните метали, натриев диацил сулфат /SDS/ , саркосинати на алкалните метали или натриев деоксихолат, да осигури водната разтворимост на микробно произведения рекомбинантен IL-2.

За предпочитане, рекомбинантният IL2 е бил селективно окислен, подобно на цистеините на позиция 58 и 105 от една дисулфидна връзка, за да направи молекулата биологично активна.

Друг аспект на това изобретение е фармацевтичното съединение за провеждане на лечение на пациенти, включващо стерилен разтвор от по-горе описаната микстура, разтворена във фармацевтично годен воден парентерален носител, като споменатият разтвор съдържа от около 0,01 до 2 мг от микробно произведения рекомбинантен IL-2 за мл.

СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО Използваният тук термин “IL-2” означава неглюкозиран протеин, произведен от микроорганизми, които са впоследствие трансформирани с човешки интерлевкин-2 DNA или модификация на човешки интерлевкин-2 DNA, който прилича на протеин, имащ:

а) една амино киселина, която е субстанциално идентична на амино киселина от порядъка на нативен човешки интерлевкин2-, включващ дисулфидна връзка на цистини на позиция 58 и 105;

б) биологическа активност, която е обща с нативния човешки интерлевкин-2. Субстанциалната идентичност на амино киселинния ред предполага, че редът е идентичен или се отличава чрез една или повече амино киселинни промени (унищожаване, съединяване, заместване), че това не е причина за неблагоприятно функционално несходство между синтетичния протеин и нативния човешки интерлевкин-2. Примери за такива протеини са рекомбинантния IL-2, описан в ЕР приложение 83101035 0, регистриран на З.П. 1983, (публикуван 19.Х.1983 под № 91539) и ЕР приложение 82307036.2 регистриран на 22.XII.1982 (публикуван на 14.IX.1983 под № 88195), рекомбинантен 1L2 мутеин, описан в ЕР приложение № 83306221.9, регистриран 13.Х.1983 (публикуван 30.V. 1984 под № 109748), което е еквивалентно на BE №893 016, обща собственост с US пат.№4 518 584 и рекомбинантния IL-2, описан в това предложение.

Използваният тук термин “трансформиран микроорганизъм”, означава микроорганизъм, който е генетично направляван да произвежда протеин, притежаващ активността на нативен човешки интерлевкин-2. Примери на трансформирани микроорганизми са описани в посочения ЕР публикувани №№ 88 198; 91 539; 109 748 и US № 564 224. Бактериите са предпочитаните микроорганизми за производство на IL-2. Типичен трансформиран микроорганизъм, полезен в настоящето изобретение, е Ешерихия коли К-12 род ММ294 трансформиран с плазмид pLW_t (депозит на American Type Culture Collection

4.VIII.1983 от Cetus Corporation c предварителна уговорка на Budapest Treaty и имащ № 39 405). Синтетичният рекомбинантен IL-2 може също да бъде направен от подходящо трансформирана среда и от клетки от млекопитаещи. Е. коли е точно предпочитаният организъм.

Известна е пълната диаграма за начина на действие и пречистването на микробно произведения рекомбинантен IL-2. Описанието цели обезпечаването на по-нататъшните й детайли. Справката е направена също в US № 594 351; 661 902; 594 223 и 594 250, отк ритията от които са обединени в предложеното изобретение.

Трансформираните микроорганизми растат в подходяща хранителна среда, с типична оптична гъстота /ОГ/ поне около 30 до 680 нМ и за предпочитане между около 20 и 40 до 680 нМ. Съставът на хранителната среда зависи от включените микроорганизми. Средата е водна, съдържаща съединения, които реализират естествените изисквания на микроорганизмите. Хранителната среда съдържа типичен източник на въглерод и азот, енергийни източници, магнезий, калий и натриеви йони и свободни аминокиселини и пуринови и пиримидинови бази. /Виж Review of Medical Bioligy, Lange Medical Publication, 14 Ed, 8095, 1980/. В предложените носители, включващи trp-инициатор, триптофановата концентрация в средата е внимателно контролирана, за да стане ограничител на IL-2. Хранителните среди за Е. коли са добре известни. Предпочитаният метод е описан в US 4499188, признат на 12.11.1985.

След като клетките се отделят от културата, те могат да бъдат концентрирани, ако е необходимо от около 20 до 150 мг/мл; ( за предпочитане 160-200 до 680 нМ, ОГ 40 до 300) чрез филтрация, центрофугиране или конвенционални методи.

Следвайки концентрацията, клетъчните мембрани на микроорганизмите се разкъсват. Главната цел на разкъсването е улесняване на последващата екстракция и разтваряне. Конвенционалните техники на клетъчно разкъсване като хомогенизация, ултразвукова обработка или циклично налягане могат да бъдат използвани на този етап от процеса. Предпочитаните методи са ултразвукова обработка или хомогенизация с Manton-Ganlin хомогенизатор. Крайната точка на разкъсването може да се контролира чрез оптичната гъстота на суспензията до около 65 до 85%. В някои случаи разкъсването може да разруши всички клетки, така че да не останат интактни клетки през етапа на разтваряне. Преди разкъсването pH на течната фаза на концентрата се определя, ако е необходимо, до стойности, които улесняват премахването на протеините на Е.коли в последващите етапи, докато задържат протеините на рекомбинантния IL-2, като неразтворим комплекс в клетъчните остатъци. Стойността на pH може да се нагоди, като се прибавят подходящи буфери. В повечето случаи се използва pH в границите 8-8,5.

Етапите на последователно възвръщане на разкъсването, са описани първоначално с отделяне на IL-2 от протеина на Е. коли до висока степен на чистота (предпочита се поне около 95 % и по-добре около 98%), при добро производство, докато поддържат IL-2 в редуцирано състояние. Едновременно процесите на очистване също намаляват пирогенните субстанции в крайния продукт, до стойности, годни за парентерално приложение на пациенти.

След като клетките се разкъсат, специфичната материя може да се отдели от течната фаза на разкъсания и ресуспендиран във водна среда буфер с оптимално за извличането pH. На този етап специфичната материя може да бъде изборно промита с буфер, за да се освободи водно разтворимият протеин от Е. коли. Във всеки случай, белтъчната концентрация на клетъчната суспензия, подлежаща на извличане, е в стойности около 5 до около 60 мг/мл, за предпочитане от 20 до 40 мг/мл.

Извличането на белтъка иа Е.коли от клетъчния материал може да се осъществи конкурентно с разкъсването или като резултат на последващо разкъсване. За предпочитане е да се осъществи като етап, следващ разкъсването. Веществото, извършващо извличането, е воден разтвор на хаотропичен агент /слаб протеин, денатуриран, който разкъсва водородните връзки и въздейства на третичната структура на белтъците/. Това вещество селективно отстранява масата на белтъка на Е. коли от клетъчните остатъци, напускащ поне съществена част от рекомбинантния IL-2 свързан (включен или свързан) с клетъчните остатъци. Селективността е улеснена от хидрофобността на рекомбинантния IL-2 и от факта, че е в редуцирано, неразтворимо състояние, при pH близо до изоелектричната точка на белтъка. В допълнение, съществена част от рекомбинантния IL-2 може да присъства ин виво, като включени тела на значителна маса, както е случая с други белтъчни колонии, изявени във високи стойности в Е.коли. Примери на екстрахиращи вещества са урея и гуанидин хидрохлорид /гуанидин хидрохлорид не може да се използва, когато за разтварящ агент се използва SDS/. Уреата е за предпочитане. Концентрацията на халотропния агент в екстрахираната смес ще зависи от специфичния агент, който се изпол зва и количеството на клетъчния материал в екстрахираната смес. В случай, че е уреа, се използва концентрация между 3,5 М и 4,5 М, за предпочитане около 4 М при 25°С. Ако извличането продължава по-дълго време, желателно е да се използва по-ниска концентрация. При извличането се използва обикновено температура в границите от 20°С до 25°С, за улеснение се използва стайна температура. Смесването се използва за повишаване на контакта между разтвора и специфичното вещество и то ще намали времето за извличане на non-IL-2 протеини от клетъчните остатъци. Кинетичният анализ на екстракционния процес се извършва на колона, използвайки SDSPAGA и този процес завършва за 15-30 мин.

След извличането, микстурата се разделя на твърда и течна съставка. Рекомбинантният IL-2 в твърдата съставка е селективно разтворим чрез свързване на твърдата съставка с неутрален воден буфер, съдържащ редуциращ и разтварящ агент. Могат да се използват физиологично годни повърхностно активни агенти /детергенти/, които имат подходящ хидрофобно-хидрофилен баланс, за да разтварят хидрофобния рекомбинантен IL-2. Предпочитаните разтварящи агенти са сулфати на алкалните метали, съдържащи 10 до 14 въглеродни атома и алкил саркозинати на алкалните метали със SDS и саркозил.

Сумата от разтворимите агенти, използвани в разтварянето, зависи изцяло от специфичните агенти. Когато се използват SDS или саркозил, предпочитаното съотношение между SDS и саркозил в твърдата съставка на протеина е около 0,5 : 1 до 1,4 : 1. Разтворимата среда съдържа също достатъчно количество редуциращ агент, предпазващ разтворения IL-2 от окисление в значителна степен. Могат да се използват протеин редуциращи агенти-дитиотреитол /DTT/ и 2-меркапто етанол. Концентрацията на редуциращия агент като ДТТ в средата е обикновено между 5 и 20 мМ. Разтварянето би се осъществило типично при температура от 20°С до 25°С със смесване, за да се улесни контакта между твърдата съставка и разтворимата среда. По-високите температури може да разтворят протеините на Е.коли. Разтварянето се смята за пълно, когато опитът се извършва за 15 мин или когато разтворът стане прозрачен.

Неразтвореният материал се отделя след пълното разтваряне.

След разтварянето на IL-2, последният може да бъде изборно извлечен от водния разтвор чрез редукция с 2-бутанол или 2-метил2-бутанал, за да се отстрани от добавените протеини на Е.коли, включващи определени контаминанти, които имат молекулно тегло много близко до това на IL-2. Използват се условия (йонна сила в степен от 0,05 и 0,15), при които водният разтвор и бутанолът не могат да се смесят субстанциално. При осъществяването на органично извличане, протеинната концентрация във воден разтвор се определя, ако е необходимо, да бъде по-малка от около 6 мг/мл, за предпочитане около 0,5 до 4 мг/мл. Подтискащите условия се поддържат чрез осъществяване на извличане в присъствието на редуциращи агенти /DTT/. Бутанолът нормално се добавя към водния разтвор на разтворения IL-2 в обемно съотношение от 1:1 до около 3:1 /извлек-воден разтвор/, за предпочитане около 1:1. Извличането може да бъде осъществено на един етап или с продължителни операции. Температурата трябва да бъде от 20°С до 100°С и рН от около 4 до 9, за предпочитане между 5 и 6. Времето за контакт между разтвора и бутанола не е от съществено значение, то е относително кратко-в границите на няколко минути. След пълното извличане водната и бутаноловата съставка се разделят и IL-2 се отделя от бутаноловата съставка. Предпочитаната процедура за разделяне на IL2 от бутаноловата съставка е киселата преципитация. Това се осъществява чрез добавяне на бутаноловата съставка към водния буфер, рН 7,5 докато органичната съставка се разтвори (приблизително 2-3 обема буфер за 1 обем органична съставка) и след това рН се намалява на около 5,5 до 7, за предпочитане 6 до 6,2, защото 1L-2 преципитира.

Следващата стъпка в процеса е разделянето на рекомбинантния IL-2 и на някои контаминация на Е.коли, останали след извличането и оптимално от разтварящия агент. Използват се гел филтрираща хроматография, RP-HPLC, или комбинация от двете. Гел филтриращата хроматография се осъществява, за предпочитане на два етапа, за да се отстранят пирогенните компоненти и протеинните контаминанти, имащи молекулно тегло по-високо или по-ниско от рекомбинантния IL-2.

Рекомбинантният 1L-2 има молекулно около

15,5 К далтона. Теловете са способни да фракционират разтвора, позволяващ отделянето на IL-2 от контаминантите, и са търговски достъпни. Сефакрил S-200 е предпочитаният гел за отстраняване на компоненти с по-високо молекулно тегло и Сефадекс G-25, G-75 или G-100 гел са предпочитани за придвижване на контаминанти с ниско молекулно тегло. Гел филтрацията протича в буферни разтвори ( рН 5,5 до 7) съдържащи около 0,1-1% разтварящ агент и около 1 до 10 нМ редуциращ агент.

RP-HPLC е алтернатива на гел филтрацията. RP-HPLC е способен за отстраняване на молекули от разтвори с молекулно тегло близко до това на рекомбинантния IL-2, които не могат да бъдат отстранени чрез гел филтрация. Като допълнение, контаминантите както и бактериалният ендотоксин се отстраняват по-ефектно чрез RP-HPLC. Затова RPHPLC може да се използва като краен очистващ етап след гел филтрацията. Поддържащите (постоянни) съставки осигуряват пълно разлагане на протеините и може да се използват като краен очистващ етап след гел филтрация. Поддържащите (постоянни) съставки, които осигуряват пълно разлагане на протеини, могат да бъдат използвани в RP-HPLC. С-4, С8 или С-18 с размери на порите 300 А. са предпочитаните поддържащи съставки. Разделянето се осъществява в кисело рН, помалко от около 2,3, обикновено 2,1 до 2,3, за да се запази IL-2 в разтвор. В това отношение, рН на разтвора за разтваряне (гел филтрация) се предпочита да бъде в тези граници. Разтворът се зарежда в колоната на RP-HPLC и се абсорбира върху постоянните съставки. Градиентьт на системата на разтваряне, съдържаща органична киселина като оцетна киселина или трифлуор оцетна киселина и органичен разтвор като пропанол или ацетонитрил, се използва за промиване на IL-2 от колоната. Оцетна киселина-пропанол, трифлуор оцетна киселина-пропанол и трифлуор оцетна киселина-ацетонитрил са предпочитаните системи за разтваряне. Рекомбинантният IL-2 се промива в оцетна киселина-пропанол с около 40% пропанол, в трифлуор оцетна киселина-пропанол с около 50% пропанол и в трифлуор оцетна киселина-ацетонитрил, с около 62% ацетонитрил. Органичното разтворимо вещество, използвано за промиване, обикновено се повишава бързо до ниво малко под концентрацията на разтворимото вещество, при което рекомбинантният промит IL-2 следва чрез бавна промяна на градиента в порядъка от 0,1 до 1 % мин.

Веднага щом рекомбинантният IL-2 се покрие от хроматографията, той се лиофилизира и ресуспендира в неутрален воден буфер, съдържащ редуциращ агент, който запазва рекомбинантния IL-2 в редуцирано състояние, и разтварящ агент (съхраняващ рекомбинантния IL-2 в разтворено състояние). Рекомбинантният IL-2 е стабилен в тази форма и може да бъде складиран за бъдещо лечение.

Една алтернативна и предпочитана процедура е селективното окисление при контролирани условия. Рекомбинантният IL-2 се отделя след това чрез гел филтрация и очистване от окислените продукти чрез RP-HPLC или гел филтрация, последвана от RP-HPLC. Тези резултати при умело очистване от контаминантите чрез гел филтрация са толкова подобри, колкото са нежеланите оксидационни продукти. Предпочитаната окислителна процедура е селективното окисление на пълно редуцирания микробно произведен синтетичен рекомбинантен IL-2 протеин, имащ една амино киселина идентична с рекомбинантния IL-2 протеин, включващ цистеини, които в последния протеин са включени интрамолекуларно на позиции 58 до 105 под формата на цистин в контролния опит, така че цистеините са селективно окислени под формата на цистин на позиция 58 до 105. Ефикасността на контролираното и селективно окисление се подобрява, ако рекомбинантният IL-2 мутеин се използва така, както е описан и обявен в BE 898 016 и US 4 518 584. В такъв случай цистеинът на позиция 125 е премахнат или заменен с неутрална амино киселина и така се предотвратява неправилната интрамолекуларна връзка и / или интермолекуларни връзки с цистеина на позиция 125 по време на окислението, което също прави димерни или полимерни форми на IL-2. В този процес пълната микробна редукция, продуцираща синтетичния рекомбинантен IL-2 протеин е за предпочитане да реагира с ойодозобензоат, който окислява селективно цистеина във водна среда с рН поне с 1/2 единица по-малко от рКа на цистеина, където концентрацията на синтетичния протеин е реактивна та смес е по-малка с около 5 мг/мл и молекулярното съотношение на о-йодозобензоат и протеин е поне стехиометрично, при условие, че о-йодозобензоатьт е в излишък в последната фаза на реакцията. Селективното окисление продуцира биологично активна молекула. RP-HPLC пречистване на селективно окисления продукт може да се извърши извън условията, описани по горе в отсъствието на редуциращ агент и в присъствието на детергент в еднаква или по-малка концентрация от тази, която се използва в описаната по горе гел филтрация.

Чистотата на рекомбинантния IL-2 след хроматографията е поне около 95 % и обичайно е поне около 98%. Този високо чист материал съдържа поне около 5 нг ендотоксин, обикновено по-малко от 0,01 нг ендотоксин на 100,000 единици IL-2 активност.

Формирането на рекомбинантния IL-2 съгласно настоящето изобретение може да се извършва като отделни операции, използващи пречистване, селективно окисление на IL2 или една операция, която съчетава пречистване и селективно окисление на IL-2. Във втория случай началният материал за получаване е рекомбинантният IL-2, съдържащ продукт за обратната фаза с висок коефициент на течна хроматография /RP-HPLC/ третирана при селективно окислен продукт, предпочитане рекомбинантен IL-2, селективно окислен чрез RP-HPLC продукт, включващ разтвор от рекомбинантния IL-2 във водно органичен разтвор. Естеството на органичния разтвор зависи от системата разтворими вещества, използвани в RP-HPLC. Може да се използва комбинацията от органична киселина, каквато е оцетната киселина или трифлуор оцетната киселина и органично разтворим пропанол или ацетонитрил.

Първата стъпка при получаване на рекомбинантния IL-2 чрез RP-HPLC е да се превърне водната микстура чрез разреждане във воден буфер, съдържащ детергент, какъвто е SDS или саркозил, които увеличават разтворимостта на рекомбинантния IL-2 във вода. Следвайки това разреждане органичната съставка се очиства от рекомбинантния IL-2, съдържащ водна съставка и концентрацията на детергента се намалява чрез диафилтрация, използваща един определен буфер. Когато SDS се използва, SDS се редуцира до стойности от около 100 до 250 за предпочитане приблизително 200 /zr/мг 1L-2. Следвайки диафилтрацията, концентрацията на IL-2 се определя отново в порядъка от около 0,01 до 2 мг/мл и водният разтвор носител се добавя до желаното ниво. Носителят се добавя в такова количество, че присъствието му в разтвора да е около 1 до 10% тегл. за предпочитане около 5% тегл. Точното количество на добавения носител не е критично. Конвенционалните твърди вещества, използвани във фармацевтичните таблетки, могат да се използват като носители. Тези материали са водно разтворими, не влизат в реакция с IL-2 и сами по себе си са стабилни. Те също трябва да са нехигроскопични. Примери за носители, които могат да бъдат добавени, са лактоза, манитол и други редуцирани захари като сорбитол, скорбяла и хидролизата на скорбялата от пшеница, царевица, ориз и картофи, микрокристалинна целулоза, албумин какъвто е човешкият серумен албумин. Манитолът е за предпочитане.

Носителят е добавен към формулата, така че когато единична доза от разтвора се лиофилизира в контейнерите или в стерилна ампула, замразеният сух остатък може ясно да се види с просто око. Предпочитаният носител манитол, произвеждащ бял кристален остатък, не е чувствителен към вода. Нечувствителността на манитола към водата подобрява стабилността на формулата. След добавяне на носителя-единица от дозата (обемите,които ще осигурят 0,01 до 2 мг, за предпочитане 0,2-0,3 мг IL-2 за доза) на разтвора са разпределени в контейнерите, покрити със запушалки, съдържанието се лиофилизира чрез конвенционално замразяване-изсушаване.

Лиофилизираният стерилен продукт, съдържащ се в микстура от: 1) рекомбинантен IL-2, 2) носител (манитол) ,3)детергент (SDS), и 4) малко количество буфер, което обезпечава физиологично pH, когато микстурата е готова. Рекомбинантният 1L-2 съставлява около 0,015 до 3,85 % от теглото на микстурата, за предпочитане около 0,4 до 0,6 % от нея. Складираните тестове от този продукт показват, че 1L-2 е стабилен в тази форма за повече от три месеца при 2 до 8° С.

Лиофилизираната микстура може да се възстанови чрез инжектиране на конвенционален парентерален воден разтвор, така както вода за инжекция, Рингер, декстроза, декстроза и натриев хлорид, или други подобни в ампулата. Ампулите съдържат 1 до 5 мл, за предпочитане 1 до 2 мл.

Създадената формула е подходяща за парентерално приложение при хора или други бозайници, за да обезпечи 1L-2 терапия. Тази терапия е пригодена за различни имуномодулиращи индикации, каквито са Т клетъчна мутагенеза, индукция на цитотоксични Т клетки, увеличаване на естествената килърна клетъчна активност, индукция на гама интерферон, възстановяване или повишаване на клетъчния имунитет /лечение на имунодефицитни състояния/, увеличаване на клетъчната антитуморна активност.

Следващите примери илюстрират изобретението.

Пример

Рекомбинантният IL-2, използван в този пример, е desala IL-2 serl25. Аминокиселинният ред на този 1L-2 се различава от аминокиселинния ред на нативния човешки IL-2 по това, че отсъства началният аланин от нативната молекула и цистеина на позиция 125 е заменен от серия. Проби от Е. коли, произвеждащи този IL-2, са били депозирани от Cetus Corporation the American Type Culture Collect., 12301 Parklawn Drive, Rockvile, Md., USA на 26 септември, 1983, под добавен №39626 под осигуряването на Budapest Treaty.

329 мг от RP-HPLC пречистен цистеин окисляват IL-2 продукт (белтъчна концентрация 0,94 мг/мл в 60% 2-пропанолол, 6 % оцетна киселина разтворена 10 пъти в 50 мМ натриев ацетат, 1 мМ етилен диамин тетраоцетна киселина /ЕДТА/, 0,1% SDS с pH 5,5.

Разтвореният рекомбинантен IL-2 се концентрира, използвайки 10 атм куха нишковидна гилза (най-малко молекулно тегло 10,000 далтона) до обем от 600 мл и след това се диафилтрира за 3 обема срещу 50мМ натриев ацетат, 1 мМ ЕДТА, 0,1% SDS при 5,5. Материалът след това допълнително се диафилтрира срещу 10 мМ натриев фосфат, съдържащ 5 мкг SDS/мл протеин. Приблизително 255 мг IL-2 в концентрация от 0,6 мг/мл се възстановяват /425 мл/.

Само 222 мг се използват за формиране, които се разпределят както следва: 370 мл от IL-2 разтвор /222 мг, 0,6 мг/мл/ се разреждат с 10 мМ натриев фосфат, pH 7,5 и 20 % манитол като крайна композиция:

0,25 мг/мл IL-2 В 10 мМ натриев фосфат,

5% манитол pH 7,5

Разтворът след това се филтрира стерилно през 0,2μ филтър и се лиофилизира. Материалът се затваря под вакуум.

Тази производствена формула е използвана клинично при хора и е добре понесена в дози до 2 милиона единици/м², когато се прилага като продължителна интравенозна инфузия или до 1 милион единици/м² при интравенозно или интрамускулно приложение. Подходящи индикации за използване на рекомбинантния IL-2 включват:

1. Лечение на имуннонедостатъчни състояния, придобити, вродени или предизвикани от хемотерапия, имунотерапия или облъчване (радиация).

2. Повишаване на клетъчно непряк имунен отговор при лечение на вирусни, паразитни, бактериални, злокачествени, гъбични, протозойни или микробактериални или други инфекциозни заболявания.

3. Влияе на повишаването на имунологичния отговор на клетките ин виво при лечение на инфекциозни, малигнени, ревматични или автоимунни заболявания.

4. Лечение на ревматоидни или други възпалителни артрити.

5. Лечение на заболявания с анормален имунен отговор, като мултиплетна склероза, системен лупус еритематодес, гломерулонефрити или хепатити.

6. Регулация на хемопоетичната тъкан при хемопоетични тумори или пре-канцерози или апластични състояния.

7. Използва се като помощно средство в индукцията на клетъчния или хуморален отговор на естествено присъстващи, естествено прилагани химически синтезирани или модифицирани рекомбинантни ваксини или други антигени, приложими за терапевтични цели.

8. Използва се като медиатор на невротрансмисията или като психоактивен терапевтик, като енкефалин за терапевтични цели, или като модулатор на функцията на централната нервна система.

9. В локална апликация за лечение на по-горе споменатите заболявания.

10. В комбинация с цитотоксична хемотерапия или облъчване, или хирургическо ле чение на злокачествени заболявания или преканцерози в директна терапевтична или спомагателна среда.

11. В комбинация с агенти с директно антивирусно, анти-гьбично, антибактериално или антипротозоино действие, или в комбинация с лекарства за лечение на типична или атипична туберкулоза.

12. В комбинация с други имуномодулиращи лекарства, лимфокини /II-1, П-З, CSF1, алфа-интерферони, гама-интерферони/ естествено намиращи се или индуциращи антицелуларни токсини или молекули, които постигат разреждане или стаза, или малигнени клетки в лечението на злокачествени, инфекциозни, автоимунни или ревматични заболявания.

13. За профилактика на инфекциозни заболявания.

По подобен начин рекомбинантният IL2 белтък от див тип, както е разкрит в ЕР 91 539 или окислително устойчиви мутеини, където метионинът е бил възстановен чрез друга амино киселина, разкрито в US 692 596, регистрирано 18 януари 1985 описанието на което е включено тук, може да се формулира съгласно настоящето изобретение. Всички форми на IL-2 от див тип или естествена форма или мутеини, са включени в настоящето изобретение.

Claims (15)

1. Патентни претенции

   1. Рекомбинантен IL-2, подходящ за включване във фармацевтично годен воден носител за парентерално приложение на пациенти за обезпечаване на IL-2 лечение, включващ стерилна лиофилизирана смес от: а/терапевтично ефективно количество от селективно окислен, микробно произведен рекомбинантен IL-2, който е свободен от попIL-2 протеин и съдържа поне 95% чист рекомбинантен IL-2 и по-малко от 5 мг ендотоксин за 100 000 единици от IL-2 активност;

   б/ физиологично годен, водно разтворим носител, който не действа върху стабилността на селективно окисления, микробно произведен IL-2; и в/ достатъчно съдържание на повърхностно активен агент за обезпечаване водната разтворимост на селективно окисления, микробно произведен, хидрофобен рекомбинантен IL-2.
2. 2. Състав съгласно претенция 1, в която микробно произведеният рекомбинантен IL-2 включва по-малко от 5% от теглото на IL-2 протеин и повърхностно активният агент е натриев диацилсулфат или натриев деоксихолат.
3. 3. Състав съгласно претенция 1, в който окисленият микробно произведен IL-2 съставлява около 0,02 до 3,85 % от теглото на микстурата.
4. 4. Състав съгласно претенция 1, в който рекомбинантният IL-2 е desala IL-2 _{кк |И}.
5. 5. Състав съгласно претенция 1, в който водно разтворимият носител е манитол.
6. 6. Състав съгласно претенция 2, в който SDS е около 100 до 250 мкг/мг от 1L-2.
7. 7. Състав съгласно претенция 2, според който рекомбинантният IL-2 е desala IL-2_KklM, рекомбинантният IL-2 протеин включва помалко от около 5% от теглото си non IL-2 протеин, IL-2 съставлява около 0,015 % до

   3,85 % от теглото на микстурата, и водно разтворимият носител е манитол и SDS е в количество от около 100 до около 250 мкг/мг от IL-2.
8. 8. Фармацевтичен състав за обезпечаване на лечение на болни, включващ стерилен разтвор от : сместа съгласно претенция 1, разтворена във фармацевтично подходяща водна парентерална инжекция, наречена разтвор, съдържащ от около 0,01 мг до около 2мг/мл от селективно окисления, микробно произведен рекомбинантен IL-2.
9. 9. Фармацевтичен състав за обезпечаване на IL-2 терапия на болни включващ стерилен разтвор от : сместа съгласно претенция 2, разтворена във фармацевтично подходяща водна парентерална инжекция, наречена разтвор, съдържащ от около 0,01 мг до 2 мг/ мл от селективно окисления, микробно произведен рекомбинантен IL-2.
10. 10. Фармацевтичен състав за обезпечаване на IL-2 терапия на болни, включващ сте- рилен разтвор от : сместа съгласно претенция

    3, разтворена във фармацевтично подходяща водна парентерална инжекция, наречена разтвор, съдържащ от около 0,01 мг до около

    5 2 мг/мл от селективно окисления, микробно произведен рекомбинантен IL-2.
11. 11. Фармацевтичен състав за обезпечаване на IL-2 терапия на болни, включващ стерилен разтвор от : сместа съгласно претенция 10 4, разтворена във фармацевтично подходяща водна парентерална инжекция, наречена разтвор, съдържащ от около 0,01 мг до около 2 мг/мл от селективно окисления, микробно произведен рекомбинантен IL-2.

    15
12. 12. Фармацевтичен състав за обезпечаване на 1L-2 терапия на болни, включващ стерилен разтвор от : сместа съгласно претенция

    5, разтворена във фармацевтично подходяща водна парентерална инжекция, наречена разтвор, съдържащ от около 0,01 мг до около 2 мг/мл от селективно окисления, микробно произведен, рекомбинантен IL-2.
13. 13. Фармацевтичен състав за обезпечаване на IL-2 терапия на болни, включващ стерилен разтвор от : сместа съгласно претенция

    6, разтворена във фармацевтично подходяща водна парентерална инжекция, наречена разтвор, съдържащ от около 0,01 мг до около 2 мг/ мл от селективно окисления, микробно произведен рекомбинантен IL-2.
14. 14. Фармацевтичен състав за обезпечаване на IL-2 терапия на болни, включващ стерилен разтвор от : сместа съгласно претенция

    7, разтворена във фармацевтично подходяща водна парентерална инжекция, наречена разтвор, съдържащ от около 0,01 мг до около 2 мг/мл от селективно окисления, микробно произведен, рекомбинантен интерлевкин-2.
15. 15. Фармацевтичен състав съгласно претенция 8, в който водният парентерален носител е вода за инжекция.