BG60405B2 - Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 - Google Patents
Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 Download PDFInfo
- Publication number
- BG60405B2 BG60405B2 BG096075A BG9607592A BG60405B2 BG 60405 B2 BG60405 B2 BG 60405B2 BG 096075 A BG096075 A BG 096075A BG 9607592 A BG9607592 A BG 9607592A BG 60405 B2 BG60405 B2 BG 60405B2
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- recombinant
- microbially produced
- composition
- selectively oxidized
- dissolved
- Prior art date
Links
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 title claims abstract description 116
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 title claims abstract description 116
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims abstract description 10
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims abstract description 10
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 25
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 12
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 12
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical group OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 9
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 claims description 8
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 239000008135 aqueous vehicle Substances 0.000 claims description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 4
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 claims description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical group C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 claims description 2
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 claims description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 2
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 claims description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 238000005215 recombination Methods 0.000 abstract 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 abstract 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 abstract 1
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 27
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 14
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 10
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 7
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 6
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 5
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MSXVEPNJUHWQHW-UHFFFAOYSA-N 2-methylbutan-2-ol Chemical compound CCC(C)(C)O MSXVEPNJUHWQHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 3
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 3
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 3
- BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N butan-2-ol Chemical compound CCC(C)O BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 150000001945 cysteines Chemical group 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000025747 Rheumatic disease Diseases 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- GONSYFXEPMZGNN-UHFFFAOYSA-N acetic acid;propan-1-ol Chemical compound CCCO.CC(O)=O GONSYFXEPMZGNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMZXXNPJQYDFJX-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;2,2,2-trifluoroacetic acid Chemical compound CC#N.OC(=O)C(F)(F)F PMZXXNPJQYDFJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052936 alkali metal sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- -1 alkyl alkali metal Chemical class 0.000 description 2
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N cystine group Chemical group C([C@@H](C(=O)O)N)SSC[C@@H](C(=O)O)N LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- IFPHDUVGLXEIOQ-UHFFFAOYSA-N ortho-iodosylbenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1I=O IFPHDUVGLXEIOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- ZIHBOROHTYWINY-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol;2,2,2-trifluoroacetic acid Chemical compound CCCO.OC(=O)C(F)(F)F ZIHBOROHTYWINY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091011896 CSF1 Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N Leu-enkephalin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=CC=C1 URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N 0.000 description 1
- 208000005777 Lupus Nephritis Diseases 0.000 description 1
- 206010067737 Lupus hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 102100028123 Macrophage colony-stimulating factor 1 Human genes 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002022 anti-cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000842 anti-protozoal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002152 aqueous-organic solution Substances 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011393 cytotoxic chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940124622 immune-modulator drug Drugs 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000013541 low molecular weight contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000000552 rheumatic effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000005062 synaptic transmission Effects 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Настоящето изобретение е в областта на фармацевтичните препарати по-специално, се отнася и до фармацевтични състави от микробно произведен интерлевкин-2.The present invention is in the field of pharmaceutical preparations, in particular, also relates to pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2.
НИВО НА ТЕХНИКАТАBACKGROUND OF THE INVENTION
Интерлевкин-2, лимфокин, произведен от лимфоцити на нормална периферна кръв и причиняващ пролиферация на антиген или митоген, стимулиращ Т клетки след разкрито установени лектини, антигени или други стимули, за пръв път е бил описан от Mordan,Interleukin-2, a lymphokine produced by normal peripheral blood lymphocytes and causing proliferation of antigen or mitogen stimulating T cells after disclosed lectins, antigens or other stimuli, was first described by Mordan,
D.A., et al., Science /1976/193, 1007-1008. Тогава го нарекли Т клетъчен растежен фактор, заради способността му да предизвиква пролиферация на стимулирани Т лимфоцити. Сега е установено, че в допълнение на растежните му качества има и свойството да модулира различни функции на клетките на имунната система ин витро и ин виво и е отново наречен интерлевкин-2 /IL-2/. IL-2 е един от няколкото лимфоцитно произведени куриер-регулаторни молекули, които осъществяват имуноцитното взаимодействие и функции.D.A., et al., Science / 1976/193, 1007-1008. It was then called T cell growth factor because of its ability to induce proliferation of stimulated T lymphocytes. It has now been found that, in addition to its growth properties, it also has the property of modulating various immune cell functions in vitro and in vivo and is again called interleukin-2 (IL-2). IL-2 is one of several lymphocyte-produced courier regulatory molecules that exert immunocytic interactions and functions.
Интерлевкин-2 първоначално е бил произведен от култивирани човешки лимфоцити от периферна кръв /PBL/ или друг интерлевкин-2, произвеждащ клетъчни линии. Това е описано в US 4 401 756. Рекомбинантна DNA технология осигурява алтернатива на РВЦ и клетъчни линии за производство на IL-2. Taniguchi, Т., et al., Nature /1983/302:305-310и Devos, R., Nucleic Acids Research /1983/ 11:4307-4323 съобщават за човешки интерлевкин-2 ген и го представят в микроорганизми.Interleukin-2 was originally produced from cultured human peripheral blood lymphocytes (PBL) or other interleukin-2 producing cell lines. This is described in US 4 401 756. Recombinant DNA technology provides an alternative to RVCs and cell lines for the production of IL-2. Taniguchi, T., et al., Nature / 1983/302: 305-310 and Devos, R., Nucleic Acids Research / 1983/11: 4307-4323 report on the human interleukin-2 gene and present it in microorganisms.
BE 898 016 признат 14 ноември 1983 и US приложение 564 224 /US 4 518 584 признат 21 май 1985 /описват мутеини от интерлевкин-2, в които нормално се намира цисте ин на 125-та позиция от естествен тип или естествени молекули са били премахнати или заместени с неутрални амино киселини, като серин. Тези мутеини притежават биологично активен интерлевкин-2. Белгийският патент установява, че рекомбинантните мутеини могат да се представят с нативен интерлевкин-2, комбинирайки ги с воден носител и инжектирайки ги венозно, подкожно или по друг начин.BE 898 016 recognized November 14, 1983 and U.S. annex 564 224 / US 4 518 584 acknowledged May 21, 1985 / describes interleukin-2 muteins that normally have cysteine in the 125th position of the natural type or natural molecules have been removed or substituted with neutral amino acids such as serine. These muteins possess biologically active interleukin-2. The Belgian patent establishes that recombinant muteins can be represented by native interleukin-2 by combining them with an aqueous vehicle and injecting them intravenously, subcutaneously or otherwise.
РАЗКРИВАНЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО Един аспект на настоящето изобретение е, че IL-2 композицията е подходяща за реконституция във фармацевтично годен воден носител за парентерално приложение на пациенти за обезпечаване на IL-2 лечение, включващо стерилна лиофилизирана микстура от :DISCLOSURE OF THE INVENTION One aspect of the present invention is that the IL-2 composition is suitable for reconstitution in a pharmaceutically acceptable aqueous vehicle for parenteral administration to patients for the provision of IL-2 treatment comprising a sterile lyophilized medicine of:
а/ терапевтично ефективно количество от окислен микробно произведен рекомбинантен 1L-2, който е свободен от non-IL-2 протеин;a) a therapeutically effective amount of oxidized microbially produced recombinant IL-2 which is free of non-IL-2 protein;
б/ фармацевтично годен водно разтворим носител, който не повлиява стабилността на микробно произведения IL-2;b) a pharmaceutically acceptable water soluble carrier which does not affect the stability of the microbially produced IL-2;
в/ достатъчно съдържание на повърхностен активен агент, като сулфатите на алкалните метали, натриев диацил сулфат /SDS/ , саркосинати на алкалните метали или натриев деоксихолат, да осигури водната разтворимост на микробно произведения рекомбинантен IL-2.c) sufficient surfactant content, such as alkali metal sulfates, sodium diacyl sulfate (SDS), alkali metal sarcosines or sodium deoxycholate, to provide the aqueous solubility of the microbially produced recombinant IL-2.
За предпочитане, рекомбинантният IL2 е бил селективно окислен, подобно на цистеините на позиция 58 и 105 от една дисулфидна връзка, за да направи молекулата биологично активна.Preferably, recombinant IL2 has been selectively oxidized, similar to cysteines at positions 58 and 105, by a single disulfide bond to render the molecule biologically active.
Друг аспект на това изобретение е фармацевтичното съединение за провеждане на лечение на пациенти, включващо стерилен разтвор от по-горе описаната микстура, разтворена във фармацевтично годен воден парентерален носител, като споменатият разтвор съдържа от около 0,01 до 2 мг от микробно произведения рекомбинантен IL-2 за мл.Another aspect of this invention is a pharmaceutical composition for the treatment of patients comprising a sterile solution of the above-described medicine dissolved in a pharmaceutically acceptable aqueous parenteral carrier, said solution containing from about 0.01 to 2 mg of microbially produced recombinant IL -2 per ml.
СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО Използваният тук термин “IL-2” означава неглюкозиран протеин, произведен от микроорганизми, които са впоследствие трансформирани с човешки интерлевкин-2 DNA или модификация на човешки интерлевкин-2 DNA, който прилича на протеин, имащ:SUMMARY OF THE INVENTION As used herein, the term "IL-2" means a non-glucose protein produced by microorganisms that has subsequently been transformed with human interleukin-2 DNA or a modification of human interleukin-2 DNA, which resembles a protein having:
а) една амино киселина, която е субстанциално идентична на амино киселина от порядъка на нативен човешки интерлевкин2-, включващ дисулфидна връзка на цистини на позиция 58 и 105;a) an amino acid that is substantially identical to an amino acid of the order of native human interleukin 2-, including the disulfide bond of cystines at positions 58 and 105;
б) биологическа активност, която е обща с нативния човешки интерлевкин-2. Субстанциалната идентичност на амино киселинния ред предполага, че редът е идентичен или се отличава чрез една или повече амино киселинни промени (унищожаване, съединяване, заместване), че това не е причина за неблагоприятно функционално несходство между синтетичния протеин и нативния човешки интерлевкин-2. Примери за такива протеини са рекомбинантния IL-2, описан в ЕР приложение 83101035 0, регистриран на З.П. 1983, (публикуван 19.Х.1983 под № 91539) и ЕР приложение 82307036.2 регистриран на 22.XII.1982 (публикуван на 14.IX.1983 под № 88195), рекомбинантен 1L2 мутеин, описан в ЕР приложение № 83306221.9, регистриран 13.Х.1983 (публикуван 30.V. 1984 под № 109748), което е еквивалентно на BE №893 016, обща собственост с US пат.№4 518 584 и рекомбинантния IL-2, описан в това предложение.b) biological activity that is common with native human interleukin-2. The substantive identity of the amino acid order suggests that the order is identical or distinguished by one or more amino acid changes (destruction, coupling, substitution), that this is not a cause of adverse functional mismatch between the synthetic protein and native human interleukin-2. Examples of such proteins are recombinant IL-2 described in EP annex 83101035 0, registered at Z.P. 1983, (published 19.X.1983 under No. 91539) and EP Annex 82307036.2 registered on 22.XII.1982 (published 14.IX.1983 under No. 88195), recombinant 1L2 mutein described in EP Annex No. 83306221.9, registered 13 .X.1983 (published 30.V. 1984 under No. 109748), which is equivalent to BE No. 893 016, common property with US Patent No. 4 518 584 and the recombinant IL-2 described in this proposal.
Използваният тук термин “трансформиран микроорганизъм”, означава микроорганизъм, който е генетично направляван да произвежда протеин, притежаващ активността на нативен човешки интерлевкин-2. Примери на трансформирани микроорганизми са описани в посочения ЕР публикувани №№ 88 198; 91 539; 109 748 и US № 564 224. Бактериите са предпочитаните микроорганизми за производство на IL-2. Типичен трансформиран микроорганизъм, полезен в настоящето изобретение, е Ешерихия коли К-12 род ММ294 трансформиран с плазмид pLWt (депозит на American Type Culture CollectionAs used herein, the term "transformed microorganism" means a microorganism that is genetically directed to produce a protein having the activity of native human interleukin-2. Examples of transformed microorganisms are described in said EP published No. 88 198; 91 539; 109 748 and US No. 564 224. Bacteria are the preferred microorganisms for the production of IL-2. A typical transformed microorganism useful in the present invention is the Escherichia coli K-12 genus MM294 transformed with plasmid pLW t (deposit of American Type Culture Collection
4.VIII.1983 от Cetus Corporation c предварителна уговорка на Budapest Treaty и имащ № 39 405). Синтетичният рекомбинантен IL-2 може също да бъде направен от подходящо трансформирана среда и от клетки от млекопитаещи. Е. коли е точно предпочитаният организъм.4.VIII.1983 by Cetus Corporation with Budapest Treaty reservation and bearing No. 39 405). Synthetic recombinant IL-2 can also be made from a suitably transformed medium and from mammalian cells. E. coli is exactly the preferred organism.
Известна е пълната диаграма за начина на действие и пречистването на микробно произведения рекомбинантен IL-2. Описанието цели обезпечаването на по-нататъшните й детайли. Справката е направена също в US № 594 351; 661 902; 594 223 и 594 250, отк ритията от които са обединени в предложеното изобретение.A complete diagram of the mode of action and purification of microbially produced recombinant IL-2 is known. The description is intended to provide further details. Reference is also made to US No. 594 351; 661 902; 594 223 and 594 250, the disclosures of which are incorporated in the present invention.
Трансформираните микроорганизми растат в подходяща хранителна среда, с типична оптична гъстота /ОГ/ поне около 30 до 680 нМ и за предпочитане между около 20 и 40 до 680 нМ. Съставът на хранителната среда зависи от включените микроорганизми. Средата е водна, съдържаща съединения, които реализират естествените изисквания на микроорганизмите. Хранителната среда съдържа типичен източник на въглерод и азот, енергийни източници, магнезий, калий и натриеви йони и свободни аминокиселини и пуринови и пиримидинови бази. /Виж Review of Medical Bioligy, Lange Medical Publication, 14 Ed, 8095, 1980/. В предложените носители, включващи trp-инициатор, триптофановата концентрация в средата е внимателно контролирана, за да стане ограничител на IL-2. Хранителните среди за Е. коли са добре известни. Предпочитаният метод е описан в US 4499188, признат на 12.11.1985.The transformed microorganisms grow in a suitable culture medium, with a typical optical density (CO) of at least about 30 to 680 nM and preferably between about 20 and 40 to 680 nM. The composition of the culture medium depends on the microorganisms involved. The medium is an aqueous medium containing compounds that fulfill the natural requirements of the microorganisms. The nutrient medium contains a typical carbon and nitrogen source, energy sources, magnesium, potassium and sodium ions and free amino acids and purine and pyrimidine bases. / See Review of Medical Bioligy, Lange Medical Publication, 14 Ed, 8095, 1980 /. In the proposed carriers including the trp initiator, the tryptophan concentration in the medium is carefully controlled to become a limiter of IL-2. Nutrient media for E. coli are well known. The preferred method is described in US 4499188, recognized on 12/11/1985.
След като клетките се отделят от културата, те могат да бъдат концентрирани, ако е необходимо от около 20 до 150 мг/мл; ( за предпочитане 160-200 до 680 нМ, ОГ 40 до 300) чрез филтрация, центрофугиране или конвенционални методи.Once the cells are removed from the culture, they can be concentrated, if necessary, from about 20 to 150 mg / ml; (preferably 160-200 to 680 nm, OG 40 to 300) by filtration, centrifugation or conventional methods.
Следвайки концентрацията, клетъчните мембрани на микроорганизмите се разкъсват. Главната цел на разкъсването е улесняване на последващата екстракция и разтваряне. Конвенционалните техники на клетъчно разкъсване като хомогенизация, ултразвукова обработка или циклично налягане могат да бъдат използвани на този етап от процеса. Предпочитаните методи са ултразвукова обработка или хомогенизация с Manton-Ganlin хомогенизатор. Крайната точка на разкъсването може да се контролира чрез оптичната гъстота на суспензията до около 65 до 85%. В някои случаи разкъсването може да разруши всички клетки, така че да не останат интактни клетки през етапа на разтваряне. Преди разкъсването pH на течната фаза на концентрата се определя, ако е необходимо, до стойности, които улесняват премахването на протеините на Е.коли в последващите етапи, докато задържат протеините на рекомбинантния IL-2, като неразтворим комплекс в клетъчните остатъци. Стойността на pH може да се нагоди, като се прибавят подходящи буфери. В повечето случаи се използва pH в границите 8-8,5.Following the concentration, the cell membranes of the microorganisms are torn apart. The main purpose of the cleavage is to facilitate subsequent extraction and dissolution. Conventional cellular tearing techniques such as homogenization, ultrasonic treatment or cyclic pressure can be used at this stage of the process. Preferred methods are ultrasonic treatment or homogenization with a Manton-Ganlin homogenizer. The end point of rupture can be controlled by the optical density of the slurry up to about 65 to 85%. In some cases, tearing can destroy all cells so that no intact cells remain during the dissolution phase. Prior to cleavage, the pH of the concentrate liquid phase is determined, if necessary, to values that facilitate the removal of E. coli proteins in subsequent steps while retaining the proteins of recombinant IL-2 as an insoluble complex in cellular debris. The pH may be adjusted by adding appropriate buffers. In most cases, a pH of 8-8.5 is used.
Етапите на последователно възвръщане на разкъсването, са описани първоначално с отделяне на IL-2 от протеина на Е. коли до висока степен на чистота (предпочита се поне около 95 % и по-добре около 98%), при добро производство, докато поддържат IL-2 в редуцирано състояние. Едновременно процесите на очистване също намаляват пирогенните субстанции в крайния продукт, до стойности, годни за парентерално приложение на пациенти.Steps of sequential restoration of rupture were initially described by separating IL-2 from the E. coli protein to a high degree of purity (preferably at least about 95% and more preferably about 98%) in good production while maintaining IL -2 in reduced state. At the same time, the purification processes also reduce the pyrogenic substances in the final product to values suitable for parenteral administration to patients.
След като клетките се разкъсат, специфичната материя може да се отдели от течната фаза на разкъсания и ресуспендиран във водна среда буфер с оптимално за извличането pH. На този етап специфичната материя може да бъде изборно промита с буфер, за да се освободи водно разтворимият протеин от Е. коли. Във всеки случай, белтъчната концентрация на клетъчната суспензия, подлежаща на извличане, е в стойности около 5 до около 60 мг/мл, за предпочитане от 20 до 40 мг/мл.Once the cells are cleaved, the specific matter can be separated from the liquid phase of the cleaved and resuspended in aqueous medium buffer with a pH optimally extracted. At this stage the specific matter can be optionally washed with buffer to release the water-soluble protein from E. coli. In each case, the protein concentration of the cell suspension to be extracted is in the range of about 5 to about 60 mg / ml, preferably from 20 to 40 mg / ml.
Извличането на белтъка иа Е.коли от клетъчния материал може да се осъществи конкурентно с разкъсването или като резултат на последващо разкъсване. За предпочитане е да се осъществи като етап, следващ разкъсването. Веществото, извършващо извличането, е воден разтвор на хаотропичен агент /слаб протеин, денатуриран, който разкъсва водородните връзки и въздейства на третичната структура на белтъците/. Това вещество селективно отстранява масата на белтъка на Е. коли от клетъчните остатъци, напускащ поне съществена част от рекомбинантния IL-2 свързан (включен или свързан) с клетъчните остатъци. Селективността е улеснена от хидрофобността на рекомбинантния IL-2 и от факта, че е в редуцирано, неразтворимо състояние, при pH близо до изоелектричната точка на белтъка. В допълнение, съществена част от рекомбинантния IL-2 може да присъства ин виво, като включени тела на значителна маса, както е случая с други белтъчни колонии, изявени във високи стойности в Е.коли. Примери на екстрахиращи вещества са урея и гуанидин хидрохлорид /гуанидин хидрохлорид не може да се използва, когато за разтварящ агент се използва SDS/. Уреата е за предпочитане. Концентрацията на халотропния агент в екстрахираната смес ще зависи от специфичния агент, който се изпол зва и количеството на клетъчния материал в екстрахираната смес. В случай, че е уреа, се използва концентрация между 3,5 М и 4,5 М, за предпочитане около 4 М при 25°С. Ако извличането продължава по-дълго време, желателно е да се използва по-ниска концентрация. При извличането се използва обикновено температура в границите от 20°С до 25°С, за улеснение се използва стайна температура. Смесването се използва за повишаване на контакта между разтвора и специфичното вещество и то ще намали времето за извличане на non-IL-2 протеини от клетъчните остатъци. Кинетичният анализ на екстракционния процес се извършва на колона, използвайки SDSPAGA и този процес завършва за 15-30 мин.The extraction of the protein and E. coli from the cellular material may be competitive with tearing or as a result of subsequent tearing. It is preferably carried out as a step following the rupture. The extracting substance is an aqueous solution of a chaotropic agent (a weak denatured protein that breaks down hydrogen bonds and affects the tertiary structure of proteins). This substance selectively removes the mass of E. coli protein from the cell debris leaving at least a substantial portion of the recombinant IL-2 bound (included or bound) to the cell debris. The selectivity is facilitated by the hydrophobicity of the recombinant IL-2 and by the fact that it is in a reduced, insoluble state at pH close to the protein isoelectric point. In addition, a substantial portion of recombinant IL-2 may be present in vivo, including bodies of considerable mass, as is the case with other protein colonies expressed in high E. coli values. Examples of extractants are urea and guanidine hydrochloride (guanidine hydrochloride cannot be used when SDS) is used as a solvent. Urea is preferred. The concentration of the halotropic agent in the extracted mixture will depend on the specific agent used and the amount of cellular material in the extracted mixture. In the case of urea, a concentration of between 3.5 M and 4.5 M is used, preferably about 4 M at 25 ° C. If the extraction continues for a longer time, it is desirable to use a lower concentration. Usually, the extraction temperature is in the range of 20 ° C to 25 ° C, room temperature is used for ease. Mixing is used to increase the contact between the solution and the specific substance and it will reduce the time for the extraction of non-IL-2 proteins from the cellular debris. The kinetic analysis of the extraction process was performed on a column using SDSPAGA and this process completed in 15-30 min.
След извличането, микстурата се разделя на твърда и течна съставка. Рекомбинантният IL-2 в твърдата съставка е селективно разтворим чрез свързване на твърдата съставка с неутрален воден буфер, съдържащ редуциращ и разтварящ агент. Могат да се използват физиологично годни повърхностно активни агенти /детергенти/, които имат подходящ хидрофобно-хидрофилен баланс, за да разтварят хидрофобния рекомбинантен IL-2. Предпочитаните разтварящи агенти са сулфати на алкалните метали, съдържащи 10 до 14 въглеродни атома и алкил саркозинати на алкалните метали със SDS и саркозил.After extraction, the medicine is divided into a solid and liquid ingredient. The recombinant IL-2 in the solid is selectively soluble by coupling the solid with a neutral aqueous buffer containing a reducing and dissolving agent. Physiologically acceptable surface-active agents (detergents) that have a suitable hydrophobic-hydrophilic balance may be used to dissolve the hydrophobic recombinant IL-2. The preferred solvents are alkali metal sulfates containing 10 to 14 carbon atoms and alkyl alkali metal sarcosinates with SDS and sarcosyl.
Сумата от разтворимите агенти, използвани в разтварянето, зависи изцяло от специфичните агенти. Когато се използват SDS или саркозил, предпочитаното съотношение между SDS и саркозил в твърдата съставка на протеина е около 0,5 : 1 до 1,4 : 1. Разтворимата среда съдържа също достатъчно количество редуциращ агент, предпазващ разтворения IL-2 от окисление в значителна степен. Могат да се използват протеин редуциращи агенти-дитиотреитол /DTT/ и 2-меркапто етанол. Концентрацията на редуциращия агент като ДТТ в средата е обикновено между 5 и 20 мМ. Разтварянето би се осъществило типично при температура от 20°С до 25°С със смесване, за да се улесни контакта между твърдата съставка и разтворимата среда. По-високите температури може да разтворят протеините на Е.коли. Разтварянето се смята за пълно, когато опитът се извършва за 15 мин или когато разтворът стане прозрачен.The amount of soluble agents used in the dissolution depends entirely on the specific agents. When using SDS or sarcosyl, the preferred ratio of SDS to sarcosyl in the protein component of the protein is about 0.5: 1 to 1.4: 1. The soluble medium also contains a sufficient amount of reducing agent to prevent dissolved IL-2 from oxidation in a significant degree. Protein reducing agents-dithiothreitol (DTT) and 2-mercapto ethanol may be used. The concentration of the reducing agent such as DTT in the medium is usually between 5 and 20 mM. Dissolution would typically be carried out at a temperature of from 20 ° C to 25 ° C with mixing to facilitate contact between the solid component and the soluble medium. Higher temperatures can dissolve E. coli proteins. Dissolution is considered complete when the experiment is performed for 15 min or when the solution is transparent.
Неразтвореният материал се отделя след пълното разтваряне.The undissolved material is separated after complete dissolution.
След разтварянето на IL-2, последният може да бъде изборно извлечен от водния разтвор чрез редукция с 2-бутанол или 2-метил2-бутанал, за да се отстрани от добавените протеини на Е.коли, включващи определени контаминанти, които имат молекулно тегло много близко до това на IL-2. Използват се условия (йонна сила в степен от 0,05 и 0,15), при които водният разтвор и бутанолът не могат да се смесят субстанциално. При осъществяването на органично извличане, протеинната концентрация във воден разтвор се определя, ако е необходимо, да бъде по-малка от около 6 мг/мл, за предпочитане около 0,5 до 4 мг/мл. Подтискащите условия се поддържат чрез осъществяване на извличане в присъствието на редуциращи агенти /DTT/. Бутанолът нормално се добавя към водния разтвор на разтворения IL-2 в обемно съотношение от 1:1 до около 3:1 /извлек-воден разтвор/, за предпочитане около 1:1. Извличането може да бъде осъществено на един етап или с продължителни операции. Температурата трябва да бъде от 20°С до 100°С и рН от около 4 до 9, за предпочитане между 5 и 6. Времето за контакт между разтвора и бутанола не е от съществено значение, то е относително кратко-в границите на няколко минути. След пълното извличане водната и бутаноловата съставка се разделят и IL-2 се отделя от бутаноловата съставка. Предпочитаната процедура за разделяне на IL2 от бутаноловата съставка е киселата преципитация. Това се осъществява чрез добавяне на бутаноловата съставка към водния буфер, рН 7,5 докато органичната съставка се разтвори (приблизително 2-3 обема буфер за 1 обем органична съставка) и след това рН се намалява на около 5,5 до 7, за предпочитане 6 до 6,2, защото 1L-2 преципитира.After the dissolution of IL-2, the latter can be selectively extracted from the aqueous solution by reduction with 2-butanol or 2-methyl2-butanol to remove from the added E. coli proteins, including certain contaminants having a molecular weight of very much close to that of IL-2. Conditions (ionic strengths of 0.05 and 0.15) are used in which the aqueous solution and butanol cannot be mixed substantially. When performing organic extraction, the protein concentration in aqueous solution is, if necessary, determined to be less than about 6 mg / ml, preferably about 0.5 to 4 mg / ml. Suppression conditions are maintained by performing extraction in the presence of reducing agents (DTT). Butanol is normally added to the aqueous solution of dissolved IL-2 in a volume ratio of 1: 1 to about 3: 1 (extract solution), preferably about 1: 1. Extraction can be performed in one step or with continuous operations. The temperature should be from 20 ° C to 100 ° C and a pH of about 4 to 9, preferably between 5 and 6. The contact time between the solution and butanol is not essential, it is relatively short - within a few minutes . After complete extraction, the aqueous and butanol components are separated and IL-2 is separated from the butanol components. The preferred procedure for separating IL2 from the butanol component is acid precipitation. This is accomplished by adding the butanol ingredient to the aqueous buffer, pH 7.5 until the organic ingredient is dissolved (approximately 2-3 volumes of buffer per volume of organic ingredient) and then the pH is reduced to about 5.5 to 7, preferably 6 to 6.2 because 1L-2 precipitates.
Следващата стъпка в процеса е разделянето на рекомбинантния IL-2 и на някои контаминация на Е.коли, останали след извличането и оптимално от разтварящия агент. Използват се гел филтрираща хроматография, RP-HPLC, или комбинация от двете. Гел филтриращата хроматография се осъществява, за предпочитане на два етапа, за да се отстранят пирогенните компоненти и протеинните контаминанти, имащи молекулно тегло по-високо или по-ниско от рекомбинантния IL-2.The next step in the process is the separation of recombinant IL-2 and some E. coli contamination remaining after extraction and optimally by the dissolving agent. Gel filtration chromatography, RP-HPLC, or a combination of both are used. Gel filtration chromatography is preferably carried out in two steps to remove pyrogenic components and protein contaminants having a molecular weight higher or lower than recombinant IL-2.
Рекомбинантният 1L-2 има молекулно околоThe recombinant 1L-2 has a molecular eye
15,5 К далтона. Теловете са способни да фракционират разтвора, позволяващ отделянето на IL-2 от контаминантите, и са търговски достъпни. Сефакрил S-200 е предпочитаният гел за отстраняване на компоненти с по-високо молекулно тегло и Сефадекс G-25, G-75 или G-100 гел са предпочитани за придвижване на контаминанти с ниско молекулно тегло. Гел филтрацията протича в буферни разтвори ( рН 5,5 до 7) съдържащи около 0,1-1% разтварящ агент и около 1 до 10 нМ редуциращ агент.15.5 K Dalton. The gels are capable of fractionating the solution allowing the release of IL-2 from the contaminants and are commercially available. Sephacryl S-200 is the preferred gel for removing higher molecular weight components and Sephadex G-25, G-75 or G-100 gel are preferred for the movement of low molecular weight contaminants. Gel filtration is carried out in buffer solutions (pH 5.5 to 7) containing about 0.1-1% solubilizing agent and about 1 to 10 nM reducing agent.
RP-HPLC е алтернатива на гел филтрацията. RP-HPLC е способен за отстраняване на молекули от разтвори с молекулно тегло близко до това на рекомбинантния IL-2, които не могат да бъдат отстранени чрез гел филтрация. Като допълнение, контаминантите както и бактериалният ендотоксин се отстраняват по-ефектно чрез RP-HPLC. Затова RPHPLC може да се използва като краен очистващ етап след гел филтрацията. Поддържащите (постоянни) съставки осигуряват пълно разлагане на протеините и може да се използват като краен очистващ етап след гел филтрация. Поддържащите (постоянни) съставки, които осигуряват пълно разлагане на протеини, могат да бъдат използвани в RP-HPLC. С-4, С8 или С-18 с размери на порите 300 А. са предпочитаните поддържащи съставки. Разделянето се осъществява в кисело рН, помалко от около 2,3, обикновено 2,1 до 2,3, за да се запази IL-2 в разтвор. В това отношение, рН на разтвора за разтваряне (гел филтрация) се предпочита да бъде в тези граници. Разтворът се зарежда в колоната на RP-HPLC и се абсорбира върху постоянните съставки. Градиентьт на системата на разтваряне, съдържаща органична киселина като оцетна киселина или трифлуор оцетна киселина и органичен разтвор като пропанол или ацетонитрил, се използва за промиване на IL-2 от колоната. Оцетна киселина-пропанол, трифлуор оцетна киселина-пропанол и трифлуор оцетна киселина-ацетонитрил са предпочитаните системи за разтваряне. Рекомбинантният IL-2 се промива в оцетна киселина-пропанол с около 40% пропанол, в трифлуор оцетна киселина-пропанол с около 50% пропанол и в трифлуор оцетна киселина-ацетонитрил, с около 62% ацетонитрил. Органичното разтворимо вещество, използвано за промиване, обикновено се повишава бързо до ниво малко под концентрацията на разтворимото вещество, при което рекомбинантният промит IL-2 следва чрез бавна промяна на градиента в порядъка от 0,1 до 1 % мин.RP-HPLC is an alternative to gel filtration. RP-HPLC is capable of removing molecules from solutions with a molecular weight close to that of recombinant IL-2, which cannot be removed by gel filtration. In addition, contaminants as well as bacterial endotoxin are more effectively removed by RP-HPLC. Therefore, RPHPLC can be used as a final purification step after gel filtration. Supporting (permanent) ingredients provide complete protein degradation and can be used as a final cleansing step after gel filtration. Supporting (permanent) ingredients that provide complete protein degradation can be used in RP-HPLC. C-4, C8, or C-18 with a pore size of 300 A. are the preferred supporting ingredients. Separation is carried out in an acidic pH of less than about 2.3, typically 2.1 to 2.3, to keep IL-2 in solution. In this respect, the pH of the dissolution solution (gel filtration) is preferably within these limits. The solution was loaded into the RP-HPLC column and absorbed onto the constituents. A gradient of a dissolution system containing an organic acid such as acetic acid or trifluoroacetic acid and an organic solution such as propanol or acetonitrile is used to flush the IL-2 from the column. Acetic acid-propanol, trifluoroacetic acid-propanol and trifluoroacetic acid-acetonitrile are preferred dissolution systems. The recombinant IL-2 was washed in acetic acid-propanol with about 40% propanol, in trifluoroacetic acid-propanol with about 50% propanol, and in trifluoroacetic acid-acetonitrile, with about 62% acetonitrile. The organic solute used for flushing generally rises rapidly to a level slightly below the solute concentration, whereby the recombinant wash of IL-2 is followed by a slow gradient change in the range of 0.1 to 1% min.
Веднага щом рекомбинантният IL-2 се покрие от хроматографията, той се лиофилизира и ресуспендира в неутрален воден буфер, съдържащ редуциращ агент, който запазва рекомбинантния IL-2 в редуцирано състояние, и разтварящ агент (съхраняващ рекомбинантния IL-2 в разтворено състояние). Рекомбинантният IL-2 е стабилен в тази форма и може да бъде складиран за бъдещо лечение.As soon as recombinant IL-2 is covered by chromatography, it is lyophilized and resuspended in neutral aqueous buffer containing a reducing agent that keeps the recombinant IL-2 in the reduced state and a dissolving agent (storing the recombinant IL-2 in the dissolved state). Recombinant IL-2 is stable in this form and may be stored for future treatment.
Една алтернативна и предпочитана процедура е селективното окисление при контролирани условия. Рекомбинантният IL-2 се отделя след това чрез гел филтрация и очистване от окислените продукти чрез RP-HPLC или гел филтрация, последвана от RP-HPLC. Тези резултати при умело очистване от контаминантите чрез гел филтрация са толкова подобри, колкото са нежеланите оксидационни продукти. Предпочитаната окислителна процедура е селективното окисление на пълно редуцирания микробно произведен синтетичен рекомбинантен IL-2 протеин, имащ една амино киселина идентична с рекомбинантния IL-2 протеин, включващ цистеини, които в последния протеин са включени интрамолекуларно на позиции 58 до 105 под формата на цистин в контролния опит, така че цистеините са селективно окислени под формата на цистин на позиция 58 до 105. Ефикасността на контролираното и селективно окисление се подобрява, ако рекомбинантният IL-2 мутеин се използва така, както е описан и обявен в BE 898 016 и US 4 518 584. В такъв случай цистеинът на позиция 125 е премахнат или заменен с неутрална амино киселина и така се предотвратява неправилната интрамолекуларна връзка и / или интермолекуларни връзки с цистеина на позиция 125 по време на окислението, което също прави димерни или полимерни форми на IL-2. В този процес пълната микробна редукция, продуцираща синтетичния рекомбинантен IL-2 протеин е за предпочитане да реагира с ойодозобензоат, който окислява селективно цистеина във водна среда с рН поне с 1/2 единица по-малко от рКа на цистеина, където концентрацията на синтетичния протеин е реактивна та смес е по-малка с около 5 мг/мл и молекулярното съотношение на о-йодозобензоат и протеин е поне стехиометрично, при условие, че о-йодозобензоатьт е в излишък в последната фаза на реакцията. Селективното окисление продуцира биологично активна молекула. RP-HPLC пречистване на селективно окисления продукт може да се извърши извън условията, описани по горе в отсъствието на редуциращ агент и в присъствието на детергент в еднаква или по-малка концентрация от тази, която се използва в описаната по горе гел филтрация.An alternative and preferred procedure is selective oxidation under controlled conditions. Recombinant IL-2 is then separated by gel filtration and purification from the oxidized products by RP-HPLC or gel filtration, followed by RP-HPLC. These results in cleansing the contaminants by gel filtration are as much improved as the unwanted oxidation products. The preferred oxidation procedure is the selective oxidation of the fully reduced microbially produced synthetic recombinant IL-2 protein having an amino acid identical to the recombinant IL-2 protein comprising cysteines, which in the latter protein are included intramolecularly at positions 58 in cysteine positions control experiment so that the cysteines are selectively oxidized in the form of cystine at positions 58 to 105. The efficiency of the controlled and selective oxidation is improved if the recombinant IL-2 mutein is used as o is described and disclosed in BE 898 016 and US 4 518 584. In this case, the cysteine at position 125 is removed or replaced by a neutral amino acid, thus preventing the intramolecular bond and / or intermolecular bonds with the cysteine at position 125 being prevented. oxidation, which also makes dimeric or polymeric forms of IL-2. In this process, the complete microbial reduction producing the synthetic recombinant IL-2 protein is preferably reacted with oodosobenzoate, which selectively oxidizes cysteine in an aqueous medium with a pH of at least 1/2 unit less than pKa of cysteine, where the concentration of the synthetic protein is reactive and the mixture is smaller by about 5 mg / ml and the molecular ratio of o-iodosobenzoate and protein is at least stoichiometric, provided that o-iodosobenzoate is excess in the last phase of the reaction. Selective oxidation produces a biologically active molecule. RP-HPLC purification of the selectively oxidized product may be carried out outside the conditions described above in the absence of a reducing agent and in the presence of a detergent in the same or less concentration than that used in the above-described gel filtration.
Чистотата на рекомбинантния IL-2 след хроматографията е поне около 95 % и обичайно е поне около 98%. Този високо чист материал съдържа поне около 5 нг ендотоксин, обикновено по-малко от 0,01 нг ендотоксин на 100,000 единици IL-2 активност.The purity of recombinant IL-2 after chromatography is at least about 95% and is usually at least about 98%. This highly pure material contains at least about 5 ng endotoxin, usually less than 0.01 ng endotoxin per 100,000 units of IL-2 activity.
Формирането на рекомбинантния IL-2 съгласно настоящето изобретение може да се извършва като отделни операции, използващи пречистване, селективно окисление на IL2 или една операция, която съчетава пречистване и селективно окисление на IL-2. Във втория случай началният материал за получаване е рекомбинантният IL-2, съдържащ продукт за обратната фаза с висок коефициент на течна хроматография /RP-HPLC/ третирана при селективно окислен продукт, предпочитане рекомбинантен IL-2, селективно окислен чрез RP-HPLC продукт, включващ разтвор от рекомбинантния IL-2 във водно органичен разтвор. Естеството на органичния разтвор зависи от системата разтворими вещества, използвани в RP-HPLC. Може да се използва комбинацията от органична киселина, каквато е оцетната киселина или трифлуор оцетната киселина и органично разтворим пропанол или ацетонитрил.The formation of recombinant IL-2 according to the present invention can be performed as separate operations using purification, selective oxidation of IL2 or one operation that combines purification and selective oxidation of IL-2. In the second case, the starting material for preparation is recombinant IL-2 containing a high-performance liquid phase chromatography (RP-HPLC) product treated with selectively oxidized product, preferably recombinant IL-2, selectively oxidized by RP-HPLC product comprising solution of recombinant IL-2 in aqueous organic solution. The nature of the organic solution depends on the system of solutes used in RP-HPLC. A combination of an organic acid such as acetic acid or trifluoroacetic acid and organically soluble propanol or acetonitrile may be used.
Първата стъпка при получаване на рекомбинантния IL-2 чрез RP-HPLC е да се превърне водната микстура чрез разреждане във воден буфер, съдържащ детергент, какъвто е SDS или саркозил, които увеличават разтворимостта на рекомбинантния IL-2 във вода. Следвайки това разреждане органичната съставка се очиства от рекомбинантния IL-2, съдържащ водна съставка и концентрацията на детергента се намалява чрез диафилтрация, използваща един определен буфер. Когато SDS се използва, SDS се редуцира до стойности от около 100 до 250 за предпочитане приблизително 200 /zr/мг 1L-2. Следвайки диафилтрацията, концентрацията на IL-2 се определя отново в порядъка от около 0,01 до 2 мг/мл и водният разтвор носител се добавя до желаното ниво. Носителят се добавя в такова количество, че присъствието му в разтвора да е около 1 до 10% тегл. за предпочитане около 5% тегл. Точното количество на добавения носител не е критично. Конвенционалните твърди вещества, използвани във фармацевтичните таблетки, могат да се използват като носители. Тези материали са водно разтворими, не влизат в реакция с IL-2 и сами по себе си са стабилни. Те също трябва да са нехигроскопични. Примери за носители, които могат да бъдат добавени, са лактоза, манитол и други редуцирани захари като сорбитол, скорбяла и хидролизата на скорбялата от пшеница, царевица, ориз и картофи, микрокристалинна целулоза, албумин какъвто е човешкият серумен албумин. Манитолът е за предпочитане.The first step in the preparation of recombinant IL-2 by RP-HPLC is to convert the aqueous mixture by dilution into an aqueous detergent containing detergent, such as SDS or sarcosil, which increases the solubility of the recombinant IL-2 in water. Following this dilution, the organic component is purified from the recombinant IL-2 containing aqueous component and the detergent concentration is reduced by diafiltration using one particular buffer. When SDS is used, the SDS is reduced to values from about 100 to 250, preferably about 200 / zr / mg 1L-2. Following diafiltration, the concentration of IL-2 was re-determined in the range of about 0.01 to 2 mg / ml and the aqueous vehicle solution was added to the desired level. The carrier is added in such an amount that its presence in the solution is about 1 to 10% by weight. preferably about 5% by weight. The exact amount of media added is not critical. Conventional solids used in pharmaceutical tablets can be used as carriers. These materials are water soluble, do not react with IL-2 and are inherently stable. They must also be non-hygroscopic. Examples of carriers that may be added are lactose, mannitol and other reduced sugars such as sorbitol, starch and hydrolysis of starch from wheat, corn, rice and potatoes, microcrystalline cellulose, albumin such as human serum albumin. Mannitol is preferred.
Носителят е добавен към формулата, така че когато единична доза от разтвора се лиофилизира в контейнерите или в стерилна ампула, замразеният сух остатък може ясно да се види с просто око. Предпочитаният носител манитол, произвеждащ бял кристален остатък, не е чувствителен към вода. Нечувствителността на манитола към водата подобрява стабилността на формулата. След добавяне на носителя-единица от дозата (обемите,които ще осигурят 0,01 до 2 мг, за предпочитане 0,2-0,3 мг IL-2 за доза) на разтвора са разпределени в контейнерите, покрити със запушалки, съдържанието се лиофилизира чрез конвенционално замразяване-изсушаване.The carrier is added to the formula so that when a single dose of the solution is lyophilized in the containers or in a sterile ampoule, the frozen dry residue can be clearly seen with the naked eye. The preferred carrier mannitol producing a white crystalline residue is not sensitive to water. The insensitivity of mannitol to water improves the stability of the formula. After adding the unit dose unit (the volumes that will provide 0.01 to 2 mg, preferably 0.2-0.3 mg IL-2 per dose) of the solution are distributed in the containers covered with stoppers, the contents are lyophilized by conventional freeze-drying.
Лиофилизираният стерилен продукт, съдържащ се в микстура от: 1) рекомбинантен IL-2, 2) носител (манитол) ,3)детергент (SDS), и 4) малко количество буфер, което обезпечава физиологично pH, когато микстурата е готова. Рекомбинантният 1L-2 съставлява около 0,015 до 3,85 % от теглото на микстурата, за предпочитане около 0,4 до 0,6 % от нея. Складираните тестове от този продукт показват, че 1L-2 е стабилен в тази форма за повече от три месеца при 2 до 8° С.The lyophilized sterile product contained in the medicine from: 1) recombinant IL-2, 2) carrier (mannitol), 3) detergent (SDS), and 4) a small amount of buffer, which ensures a physiological pH when ready. The recombinant 1L-2 constitutes about 0.015 to 3.85% by weight of the mixture, preferably about 0.4 to 0.6% by weight. The stored tests of this product show that 1L-2 is stable in this form for more than three months at 2 to 8 ° C.
Лиофилизираната микстура може да се възстанови чрез инжектиране на конвенционален парентерален воден разтвор, така както вода за инжекция, Рингер, декстроза, декстроза и натриев хлорид, или други подобни в ампулата. Ампулите съдържат 1 до 5 мл, за предпочитане 1 до 2 мл.The lyophilized medicine can be restored by injecting a conventional parenteral aqueous solution such as water for injection, Ringer, dextrose, dextrose and sodium chloride, or the like in the ampoule. The ampoules contain 1 to 5 ml, preferably 1 to 2 ml.
Създадената формула е подходяща за парентерално приложение при хора или други бозайници, за да обезпечи 1L-2 терапия. Тази терапия е пригодена за различни имуномодулиращи индикации, каквито са Т клетъчна мутагенеза, индукция на цитотоксични Т клетки, увеличаване на естествената килърна клетъчна активност, индукция на гама интерферон, възстановяване или повишаване на клетъчния имунитет /лечение на имунодефицитни състояния/, увеличаване на клетъчната антитуморна активност.The formula created is suitable for parenteral administration in humans or other mammals to provide 1L-2 therapy. This therapy is suitable for various immunomodulatory indications such as T cell mutagenesis, induction of cytotoxic T cells, increase of natural killer cell activity, induction of interferon gamma, restoration or increase of cellular immunity / treatment of immunodeficiency states / immunodeficiency states / activity.
Следващите примери илюстрират изобретението.The following examples illustrate the invention.
ПримерExample
Рекомбинантният IL-2, използван в този пример, е desala IL-2 serl25. Аминокиселинният ред на този 1L-2 се различава от аминокиселинния ред на нативния човешки IL-2 по това, че отсъства началният аланин от нативната молекула и цистеина на позиция 125 е заменен от серия. Проби от Е. коли, произвеждащи този IL-2, са били депозирани от Cetus Corporation the American Type Culture Collect., 12301 Parklawn Drive, Rockvile, Md., USA на 26 септември, 1983, под добавен №39626 под осигуряването на Budapest Treaty.The recombinant IL-2 used in this example is desala IL-2 serl25. The amino acid order of this 1L-2 differs from the amino acid order of native human IL-2 in that it lacks the starting alanine from the native molecule and cysteine at position 125 is replaced by a series. Samples from E. cars producing this IL-2 were deposited by Cetus Corporation the American Type Culture Collect., 12301 Parklawn Drive, Rockvile, Md., USA on September 26, 1983, under No. 39626 under the security of the Budapest Treaty .
329 мг от RP-HPLC пречистен цистеин окисляват IL-2 продукт (белтъчна концентрация 0,94 мг/мл в 60% 2-пропанолол, 6 % оцетна киселина разтворена 10 пъти в 50 мМ натриев ацетат, 1 мМ етилен диамин тетраоцетна киселина /ЕДТА/, 0,1% SDS с pH 5,5.329 mg of RP-HPLC purified cysteine oxidized the IL-2 product (protein concentration 0.94 mg / ml in 60% 2-propanol, 6% acetic acid dissolved 10 times in 50 mM sodium acetate, 1 mM ethylene diamine tetraacetic acid / EDTA /, 0.1% SDS with pH 5.5.
Разтвореният рекомбинантен IL-2 се концентрира, използвайки 10 атм куха нишковидна гилза (най-малко молекулно тегло 10,000 далтона) до обем от 600 мл и след това се диафилтрира за 3 обема срещу 50мМ натриев ацетат, 1 мМ ЕДТА, 0,1% SDS при 5,5. Материалът след това допълнително се диафилтрира срещу 10 мМ натриев фосфат, съдържащ 5 мкг SDS/мл протеин. Приблизително 255 мг IL-2 в концентрация от 0,6 мг/мл се възстановяват /425 мл/.The dissolved recombinant IL-2 was concentrated using a 10 atm hollow filament sleeve (at least molecular weight 10,000 daltons) to a volume of 600 ml and then diafiltered for 3 volumes against 50 mM sodium acetate, 1 mM EDTA, 0.1% SDS at 5.5. The material was then further diafiltered against 10 mM sodium phosphate containing 5 μg SDS / ml protein. Approximately 255 mg of IL-2 at a concentration of 0.6 mg / ml was recovered (425 ml).
Само 222 мг се използват за формиране, които се разпределят както следва: 370 мл от IL-2 разтвор /222 мг, 0,6 мг/мл/ се разреждат с 10 мМ натриев фосфат, pH 7,5 и 20 % манитол като крайна композиция:Only 222 mg is used for formulation, which is distributed as follows: 370 ml of IL-2 solution (222 mg, 0.6 mg / ml) are diluted with 10 mM sodium phosphate, pH 7.5 and 20% mannitol as a final composition:
0,25 мг/мл IL-2 В 10 мМ натриев фосфат,0.25 mg / ml IL-2 In 10 mm sodium phosphate,
5% манитол pH 7,55% mannitol pH 7.5
Разтворът след това се филтрира стерилно през 0,2μ филтър и се лиофилизира. Материалът се затваря под вакуум.The solution is then sterile filtered through a 0.2μ filter and lyophilized. The material was closed in vacuo.
Тази производствена формула е използвана клинично при хора и е добре понесена в дози до 2 милиона единици/м2, когато се прилага като продължителна интравенозна инфузия или до 1 милион единици/м2 при интравенозно или интрамускулно приложение. Подходящи индикации за използване на рекомбинантния IL-2 включват:This production formula has been used clinically in humans and is well tolerated at doses up to 2 million units / m 2 when administered as a continuous intravenous infusion or up to 1 million units / m 2 when administered intravenously or intramuscularly. Appropriate indications for the use of recombinant IL-2 include:
1. Лечение на имуннонедостатъчни състояния, придобити, вродени или предизвикани от хемотерапия, имунотерапия или облъчване (радиация).1. Treatment of immunodeficiency status acquired, congenital or induced by chemotherapy, immunotherapy or radiation (radiation).
2. Повишаване на клетъчно непряк имунен отговор при лечение на вирусни, паразитни, бактериални, злокачествени, гъбични, протозойни или микробактериални или други инфекциозни заболявания.2. Increase of cellular indirect immune response in the treatment of viral, parasitic, bacterial, malignant, fungal, protozoal or microbacterial or other infectious diseases.
3. Влияе на повишаването на имунологичния отговор на клетките ин виво при лечение на инфекциозни, малигнени, ревматични или автоимунни заболявания.3. Influence of enhancing the immunological response of cells in vivo in the treatment of infectious, malignant, rheumatic or autoimmune diseases.
4. Лечение на ревматоидни или други възпалителни артрити.4. Treatment of rheumatoid or other inflammatory arthritis.
5. Лечение на заболявания с анормален имунен отговор, като мултиплетна склероза, системен лупус еритематодес, гломерулонефрити или хепатити.5. Treatment of diseases with an abnormal immune response such as multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus, glomerulonephritis or hepatitis.
6. Регулация на хемопоетичната тъкан при хемопоетични тумори или пре-канцерози или апластични състояния.6. Regulation of haematopoietic tissue in haematopoietic tumors or pre-cancerous or aplastic conditions.
7. Използва се като помощно средство в индукцията на клетъчния или хуморален отговор на естествено присъстващи, естествено прилагани химически синтезирани или модифицирани рекомбинантни ваксини или други антигени, приложими за терапевтични цели.7. Used as an aid in inducing the cellular or humoral response to naturally occurring, naturally administered chemically synthesized or modified recombinant vaccines or other antigens useful for therapeutic purposes.
8. Използва се като медиатор на невротрансмисията или като психоактивен терапевтик, като енкефалин за терапевтични цели, или като модулатор на функцията на централната нервна система.8. Used as a mediator of neurotransmission or as a psychoactive therapist, as enkephalin for therapeutic purposes, or as a modulator of central nervous system function.
9. В локална апликация за лечение на по-горе споменатите заболявания.9. In a local application for the treatment of the aforementioned diseases.
10. В комбинация с цитотоксична хемотерапия или облъчване, или хирургическо ле чение на злокачествени заболявания или преканцерози в директна терапевтична или спомагателна среда.10. In combination with cytotoxic chemotherapy or radiation, or surgical treatment of malignancies or precanceroses in a direct therapeutic or adjuvant setting.
11. В комбинация с агенти с директно антивирусно, анти-гьбично, антибактериално или антипротозоино действие, или в комбинация с лекарства за лечение на типична или атипична туберкулоза.11. In combination with agents having direct antiviral, anti-fungal, antibacterial or antiprotozoal action, or in combination with drugs for the treatment of typical or atypical tuberculosis.
12. В комбинация с други имуномодулиращи лекарства, лимфокини /II-1, П-З, CSF1, алфа-интерферони, гама-интерферони/ естествено намиращи се или индуциращи антицелуларни токсини или молекули, които постигат разреждане или стаза, или малигнени клетки в лечението на злокачествени, инфекциозни, автоимунни или ревматични заболявания.12. In combination with other immunomodulatory drugs, lymphokines / II-1, II-3, CSF1, alpha-interferons, gamma-interferons / naturally occurring or inducing anti-cellular toxins or molecules that achieve dilution or stasis or malignant cells in the treatment of malignant, infectious, autoimmune or rheumatic diseases.
13. За профилактика на инфекциозни заболявания.13. For the prevention of infectious diseases.
По подобен начин рекомбинантният IL2 белтък от див тип, както е разкрит в ЕР 91 539 или окислително устойчиви мутеини, където метионинът е бил възстановен чрез друга амино киселина, разкрито в US 692 596, регистрирано 18 януари 1985 описанието на което е включено тук, може да се формулира съгласно настоящето изобретение. Всички форми на IL-2 от див тип или естествена форма или мутеини, са включени в настоящето изобретение.Similarly, the recombinant wild-type IL2 protein as disclosed in EP 91 539 or oxidation-resistant muteins, where methionine was recovered by another amino acid disclosed in US 692 596, registered January 18, 1985, the description of which is incorporated herein may to be formulated according to the present invention. All forms of wild-type IL-2 or native form or muteins are included in the present invention.
Claims (15)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BG096075A BG60405B2 (en) | 1992-03-16 | 1992-03-16 | Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BG096075A BG60405B2 (en) | 1992-03-16 | 1992-03-16 | Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BG60405B2 true BG60405B2 (en) | 1995-02-28 |
Family
ID=3924334
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG096075A BG60405B2 (en) | 1992-03-16 | 1992-03-16 | Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| BG (1) | BG60405B2 (en) |
-
1992
- 1992-03-16 BG BG096075A patent/BG60405B2/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4604377A (en) | Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 | |
| EP0268110B1 (en) | Pharmaceutical compositions of recombinant interleukin-2 and formulation processes | |
| EP0206828B1 (en) | Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts and the use thereof | |
| EP0217645B1 (en) | Stable formulation of biologically active proteins for parenteral injection | |
| US5004605A (en) | Low pH pharmaceutical compositions of recombinant β-interferon | |
| US5037644A (en) | Pharmaceutical compositions of recombinant interleukin-2 and formulation processes | |
| US5183746A (en) | Formulation processes for pharmaceutical compositions of recombinant β- | |
| EP0215658B1 (en) | Improved formulation for recombinant beta-interferon processes for recovery and stabilization of beta-interferon and the use thereof | |
| EP0270799A1 (en) | Pharmaceutical compositions of recombinant beta-interferon and formulation processes | |
| EP0211835B1 (en) | Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 | |
| EP0357645B1 (en) | Improved process for recovering microbially produced interleukin-2 | |
| US5643566A (en) | Formulation processes for lipophilic proteins | |
| US5162507A (en) | Process for recovering purified, oxidized, renatured recombinant interleukin-2 from microorganisms | |
| JP2955294B2 (en) | Method for recovering recombinant interleukin-2 purified, oxidized and regenerated from microorganism | |
| US4999339A (en) | Combination therapy of IL-2 and DTIC for the treatment of melanoma | |
| WO1989004665A2 (en) | Treatment of infections caused by a primary immunodeficiency with interleukin-2 | |
| BG60405B2 (en) | Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 | |
| CA1283356C (en) | Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 | |
| JPH08505042A (en) | Inhibition of retrovirus infection | |
| CA1337671C (en) | Process for recovering purified, oxidized, renatured recombinant interleukin-2 from microorganisms |