DE3887889T2

DE3887889T2 - Verfahren zur Gewinnung von mikrobiell hergestelltem Beta-Interferon.

Info

Publication number: DE3887889T2
Application number: DE3887889T
Authority: DE
Inventors: Susan Hershenson; Ze Ev Skaked Ze Ev Skaked; Jody Thomson
Original assignee: Cetus Oncology Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1988-09-23
Filing date: 1988-09-30
Publication date: 1994-08-25
Anticipated expiration: 2008-10-01
Also published as: EP0360937B1; EP0360937A1; CA1340586C; DE3887889D1; ATE101654T1; IE62661B1; AU631356B2; AU2284188A

Description

Technischer Hintergrund

Diese Erfindung liegt auf dem Gebiet der Biotechnologie. Insbesondere betrifft die Erfindung ein verbessertes biochemisches Trenn- oder Gewinnungsverfahren, in dem rekombinantes β-Interferon (β-rIFN) in im wesentlichen reiner Form aus transformierten Mikroorganismen, in denen es hergestellt wird, gewonnen, dann oxidiert und renaturiert wird.

Hintergrund

Natürlich vorkommende Interferone (IFNe) sind artspezifische Proteine, meistens Glycoproteine, die durch unterschiedliche Zellen nach Induktion durch Viren, doppelsträngige RNAs, andere Polynucleotide, Antigene und Mitogene produziert werden. Interferone zeigen vielfältige biologische Aktivitäten, wie antivirale, antiproliferative, immunmodulatorische und antizelluläre Wirkungen. Mindestens drei verschiedene Arten menschlicher Interferone wurden in Hinsicht auf ihre antiviralen, wachstumshemmenden Aktivitäten und auf ihre Aktivierung natürlicher Killerzellen (NK) identifiziert und charakterisiert. Sie werden durch Leucocyten, Lymphocyten, Fibroblasten und das Immunsystem produziert und als alpha-, beta- und gamma-Interferone klassifiziert. Es soll sich dabei um verschiedene Proteine handeln, die von verschiedenen Strukturgenen codiert werden.
Natives menschliches β-Interferon (β-HuIFN) wird im allgemeinen durch Superinduktion von menschlichen Fibroblastenkulturen mit poly-IC (Polyriboinosinsäure und Polyribocytidinsäure), Isolierung und Reinigung des so hergestellten β-HuIFN durch Chromatographie und elektrophoretische Techniken hergestellt. Proteine oder Polypeptide, die native, β-Interferon-ähnliche Eigenschaften zeigen, können ebenso unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie durch Extraktion von poly-A-reicher 12S-Messenger-RNA aus viral induzierten menschlichen Zellen, Synthese doppelsträngiger cDNA unter Verwendung der m-RNA als Matrize, Einschleusung der cDNA in einen geeigneten Clonierungsvektor, Transformation geeigneter Mikroorganismen mit dem Vektor, Ernte der Bakterien und Extraktion des β-HuIFN daraus, hergestellt werden. Nagola, S. et al., Nature 287 (1980), 411; Yelverton, E. et al., Nuc. Acid Res. 9 (1981), 731; Steuli, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78 (1981), 2848; Europäische Patentanmeldungen Nr. 28033, veröffentlicht am 6. Mai 1981, Nr. 321134, veröffentlicht am 15. Juli 1981, Nr. 34307, veröffentlicht am 26. August 1981 und Belgisches Patent 837397, erteilt am 1. Juli 1981, beschreiben verschiedene übliche Verfahren zur Herstellung von β-Interferon unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken. Die exprimierten Proteine oder Polypeptide wurden gereinigt und untersucht; es wurde festgestellt, daß sie ähnliche Eigenschaften wie native IFNe zeigen. Die auf diese Weise bakteriell produzierten IFNe scheinen zur potentiellen therapeutischen Verwendung, als Antivirus- und Antitumormittel, geeignet zu sein und von der Herstellung von INFen durch solche bakterielle Fermentationen werden ausreichend große Mengen von IFN bei verhältnismäßig niedrigen Kosten der klinischen Prüfung erwartet.
Ferner wurden β-HuIFN-Gene verändert, zum Beispiel durch oligonucleotid-gerichtete Mutagenese, um β-IFN-Proteinanaloge davon herzustellen, wie die menschlichen rekombinanten β-Interferonanaloge (Muteine), in denen Cysteine fehlen oder ersetzt sind, offenbart im US-Patent 4,588,585, erteilt am 13. Mai 1986 an Mark et al . . In diesem Patent ist spezifisch das rekombinante β-Interferon offenbart, in dem das Cystein an der Position 17 durch die neutrale Aminosäure Serin ersetzt ist. Dieses β-IFN-Analoge ist β-IFNser17.
Mikrobiell produziertes β-rIFN, das diese Erfindung betrifft, ist nicht glycolysiert und wird in einem denaturierten Zustand hergestellt. Es ist unlöslich und, wenn es in hohen Mengen exprimiert wird, fällt es intrazellulär in Form "refraktiler" oder "Einschluß"-Körper aus, die unter dem Phasenkontrastmikroskop bei 1000facher Vergrößerung als helle Punkte innerhalb der Zelle erscheinen.
Die bisher verfügbaren Verfahren zur Gewinnung von mikrobiell produziertem β-rIFN aus den es produzierenden Organismen werden nachstehend beschrieben.
Verfahren zur Gewinnung und Reinigung bakteriell produzierter IFNe sind in den US-Patenten 4,450,103, 4,315,852, 4,343,735 und 4,343,736; und in Derynch et al., Nature 287 (1980), 193-197, und Scandella und Kornberg, Biochemistry 10 (1971), 4447, beschrieben. Mit diesen Verfahren wird im allgemeinen das IFN nicht in einer genügend reinen Form und in genügend großen Mengen für klinische und therapeutische Zwecke produziert und die durch rekombinante DNA-Techniken erhaltenen IFN-Präparationen weisen Restmengen von Chemikalien auf, wie Natriumdodecylsulfat (SDS) und andere grenzflächenaktive Mittel oder Fällungsmittel, die bei der Extraktion und den Reinigungsschritten verwendet werden.
US-Patent 4,620,928 beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung von β-rINF aus einem β-rINF-produzierenden Mikroorganismus, bei dem die Zelle aufgebrochen wird; nicht-β-rINF-Proteine werden selektiv aus dem aufgebrochenen Material unter Verwendung einer wäßrigen Lösung eines chaotropen Mittels, wie Harnstoff oder Guanidin, extrahiert; β-rIFN wird in einer denaturierenden Umgebung, wie Guanidin, mit einem Reduktionsmittel solubilisiert; das Reduktionsmittel wird nach ausreichender Zeit aus der Lösung entfernt; das β-rIFN wird einer kontrollierten Oxidation unterzogen und das oxidierte β-rINF wird renaturiert, gegebenenfalls gefolgt von einer Kombination von HPLC und Gelfiltrationsschritten.
Die US-Patente 4,530,787 und 4,572,978 vom gleichen Inhaber beschreiben Techniken zur Durchführung des vorstehend erwähnten kontrollierten Oxidationsschritts. Das erste Patent verwendet o-Iodosobenzoesäure als Oxidationsmittel und das letztere verwendet Cu²&spplus;-Kationen als Oxidationsbeschleuniger.
Die Europäische Patentanmeldung Nr. 206,828 und das US-Patent Nr. 4,748,234, mit dem Titel "Process tor Recovering Refractile Bodies Containing Heterologous Proteins from Microbial Hosts", beschreiben Verfahren zur Gewinnung und Reinigung refraktiler Körper von verschiedenen Proteinen aus E. coli. Um das refraktile Material zu isolieren, schließen die Verfahren zu Beginn das Aufbrechen der Zellwand und Zellmembran der Wirtszelle ein, dann erfolgt die Entfernung von mehr als 99 Gew.-% der Salze aus dem aufgebrochenen Material, nochmaliges Aufbrechen des entsalzten aufgebrochenen Materials, Zusatz einer Substanz zu dem aufgebrochenen Material, um einen Dichte- oder Viskositätsgradienten in der Flüssigkeit des aufgebrochenen Materials zu erzeugen und Abtrennung des refraktilen Materials von den Zelltrümmern durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation. Das refraktile Protein wird dann mit einem Lösungsmittel, wie SDS, solubilisiert, chromatographiert, um hochmolekulare Verunreinigungen zu entfernen, oxidiert und durch HPLC, Ultrafiltration und Gelfiltration gereinigt. Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet einige der in diesen Anmeldungen offenbarten Techniken, um das solubilisierte β-IFN-Ausgangsmaterial zu erhalten.
Ergänzend hierzu beschreiben die US-Patente 4,511 502, 4,511,503, 4,512,922 und 4,518,526 und EP-A 114,506 ein ähnliches Verfahren zur allgemeinen Gewinnung heterologer Proteine aus refraktilen Körpern. In diesen Verfahren werden die Oxidation und die Renaturierung des rekombinanten Proteins n einem einzigen Schritt durchgeführt.
Insbesondere beschreibt EP 114,506 ein Verfahren zur Renaturierung eines bakteriell produzierten Proteins, zum Beispiel β-IFN, umfassend die Oxidation des Proteins in Anwesenheit eines chaotropen Mittels und die Entfernung des Mittels durch Verdünnung in einem Puffer, der eine Sulfhydrylverbindung enthält, um die Faltung des Proteins zu ermöglichen.
Reinigungsverfahren für in Bakterien rekombinant produziertes β-IFN wurden durch Lin, L.S. et al., Methods in Enzymology 119 (1986), 183 und Moscheva, J.A. et al., ibid., Seite 177, veröffentlicht.

Offenbarung der Erfindung

Die Erfindung ist eine Verbesserung eines Verfahrens zur Gewinnung von β-rIFN aus transformierten Mikroorganismen, die β-rIFN in unlöslichen Einschluß- oder refraktilen Körpern enthalten. Das β-rIFN wird aus der Masse der zellulären Bestandteile der Mikroorganismen isoliert und in reduzierter Form solubilisiert. In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die reduzierte, solubilisierte β-IFN-Präparation in einer chaotropen Umgebung oxidiert, danach in Gegenwart eines stabilisierenden Zusatzes renaturiert und dann zu hinsichtlich Pyrogenen und Endotoxinen klinisch verträglichen Präparaten gereinigt.
Die Erfindung umfaßt die Oxidation des denaturierten, aus Bakterien gewonnenen β-rIFNs durch Inkontaktbringen des in einer Lösung eines chaotropen Mittels (nach Entfernung aller Feststoffe aus der Lösung) vorliegenden β-rIFNs mit einem Oxidationsmittel und danach die Renaturierung des β-rIFN aus der Lösung in Gegenwart eines stabilisierenden Zusatzes. Auf diese Weise wird ein renaturiertes, oxidiertes, gereinigtes β-rIFN mit verbesserter Löslichkeit und Stabilität gewonnen.
So betrifft die Erfindung unter einem Gesichtspunkt ein Verfahren, um gereinigtes, biologisch aktives, bakteriell produziertes β-IFN zu erhalten, wobei man das reduzierte, solubilisierte, bakteriell produzierte β-IFN in einer chaotropen Umgebung oxidierenden Bedingungen aussetzt und dann die chaotrope Umgebung in Gegenwart einer wirksamen Menge eines solubilisierenden Zusatzes entfernt. Die oxidierte Form übersteht die Renaturierungsbedingungen und die Faltung in die richtige Form besser und kann durch den Zusatz eines stabilisierenden Zusatzes solubilisiert gehalten werden.
Andere Gesichtspunkte dieser Erfindung betreffen das renaturierte, oxidierte, gereinigte β-rIFN, das durch das vorstehend beschriebene verbesserte Verfahren hergestellt wird und Arzneimittel, die diese Substanz enthalten.

Ausführungsformen der Erfindung

A. Definitionen

Der hier verwendete Begriff "β-rIFN" bezieht sich auf rekombinantes β-IFN, hergestellt durch einen transformierten Mikroorganismus, dessen Aminosäuresequenz gleich, ähnlich oder im wesentlichen homolog ist mit nicht-glycosyliertem und/oder glycosyliertem nativen β-IFN.
Die hier besonders bevorzugten β-rIFN-Proteine sind die biologisch aktiven Muteine (Analoge) des menschlichen β-IFNs, in denen die Aminosäurereste, die nicht für die biologische Aktivität wesentlich sind, in einigen Fällen bewußt entfernt wurden (wie nachstehend aufgeführt) oder mit einer konservativen Aminosäure ersetzt wurden. Insbesondere schließen die bevorzugten β-rIFN-Proteine solche ein, in denen der Cysteinrest an der Position 17 durch eine andere Aminosäure, vorzugsweise neutral oder konservativ, ersetzt ist, um Stellen für intermolekulare Vernetzung oder inkorrekte intramolekulare Disulfidbrücken-Bildung zu eliminieren. Insbesondere sind die β-rIFN-Muteine in den erfindungsgemäßen Formulierungen bevorzugt, in denen der Cysteinrest an der Aminosäureposition 17 des nativen Gegenstücks durch einen Serinrest (bezeichnet als β-IFNser17) oder Alaninrest (bezeichnet als β-IFNala17) ersetzt ist.
Die genaue chemische Struktur des β-rIFNs hängt von einer Anzahl von Faktoren ab. Sind ionisierbare Amino- und Carboxylgruppen im Molekül vorhanden, kann ein bestimmtes β-rIFN als saures, als basisches Salz oder in neutraler Form erhalten werden. Alle Präparationen, die ihre Aktivität behalten, wenn sie in geeignete Umgebungsbedingungen gebracht werden, sind in der Definition "β-rIFN" eingeschlossen. Weiter kann die primäre Aminosäuresequenz des Proteins durch Derivatisierung unter Verwendung von Zuckereinheiten (Glycosylierung) oder durch andere zusätzliche Moleküle, wie Lipide, Phosphate, Acetylgruppen und ähnliche, meistens durch Konjugation mit Sacchariden, ergänzt werden. Bestimmte Aspekte dieser Ergänzung werden durch post-translationales Processing der produzierenden Wirtszelle erreicht, andere Modifikationen können in vitro eingeführt werden. In jedem Fall sind solche Modifikationen in der Definition von β-rIFN eingeschlossen, so lange die Aktivität des Proteins, wie vorstehend festgelegt ist, nicht zerstört wird. Es ist natürlich zu erwarten, daß solche Modifikationen quantitativ oder qualitativ die biologische Aktivität in den verschiedenen Tests beeinflussen können, entweder durch Steigerung oder Verminderung der Aktivität des Proteins.
Der hier verwendete Begriff "transformiert" in der Beschreibung von Zellkulturen von Wirtsmikroorganismen bedeutet einen Mikroorganismus, der gentechnisch hergestellt wurde, um β-IFN zu produzieren, das die Aktivität von nativem β-IFN besitzt. Bakterien sind bevorzugte Mikroorganismen, um β-rIFN zu produzieren. E. coli wird besonders bevorzugt. "Chaotrope Umgebung" verweist auf eine Umgebung, in der Proteine denaturiert werden oder ihre normale Konformationen verändert werden. Chaotrope Umgebungen können in Gegenwart geeigneter Konzentrationen chaotroper Mittel, wie nachstehend beschrieben, erzeugt werden oder können das Ergebnis von Wärme oder pH-Änderungen sein. Die entstandenen Umgebungen sind dazu in der Lage, die Wasserstoffbrücken des Proteins zu spalten und die Thermodynamik der Umgebungen so zu verändern, daß andere dreidimensionale Konformationen in der chaotropen Umgebung bevorzugt sind, verglichen mit solchen, die in mehr physiologisch verträglichen Umgebungen gefunden werden.
Der Begriff "chaotropes Mittel" verweist auf eine Verbindung oder Verbindungen, die in der Lage sind, in einer wäßrigen Lösung und in einer geeigneten Konzentration, eine chaotrope Umgebung zu erzeugen und die dazu in der Lage sind, β-rIFN zu denaturieren. Guanidinsalze (zum Beispiel das Hydrochlorid), Alkalimetall-Thiocyanate (zum Beispiel Natriumthiocyanat) und Harnstoff bei Konzentrationen im Bereich von etwa 4 bis 9 M, bevorzugt 6 bis 9 M, sind Beispiele für chaotrope Umgebungen, die β-rIFN auflösen und denaturieren können.
"Reduzierende Bedingungen" sind diejenigen, die dazu nötig sind, das β-IFN in Hinsicht auf die Cysteinreste in reduzierte Form zu bringen oder zu halten. Diese Bedingungen können meist einfach durch Verwendung eines geeigneten Reduktionsmittels geschaffen werden (besonders ein Thiol enthaltendes Reduktionsmittel) oder, wenn das β-IFN bereits reduziert ist (zum Beispiel in der zellulären Umgebung), kann bereits der Ausschluß von Luft und Oxidationskatalysatoren oder -Reagenzien ausreichen.
"Stabilisierender" Zusatz verweist auf einen Stoff oder ein Gemisch von Stoffen, das das erwähnte Protein (β-rIFN) in Lösung hält. Geeignete Zusätze schließen Alkohole und Polyole, wie Zucker und Detergenzien, wie nachstehend weiter beschrieben, ein.

B. Zellwachstum

Die β-rIFN-produzierenden, transformierten Mikroorganismen werden in einem geeigneten Wachstumsmedium gezüchtet, normalerweise bis zu einer optischen Dichte (OD) von mindestens etwa 10 bei 680 nm und vorzugsweise zwischen 20 und 40 bei 680 nm. Die Zusammensetzung des Wachstumsmediums hängt von dem verwendeten Mikroorganismus ab. Das Medium ist ein wäßriges Medium mit Verbindungen, die die Ernährungsbedürfnisse des Mikroorganismus erfüllen. Das Wachstumsmedium enthält normalerweise assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, Energiequellen, Magnesium-, Kalium- und Natriumionen und gegebenenfalls Aminosäuren und Purin- und Pyrimidinbasen (vgl. Review of Medical Biology, Lange Medical Publications, 14. Ed. (1980), 80-85). In Expressionsvektoren, die den trp-Promotor beinhalten, wird, wenn erwünscht, die Tryptophankonzentration im Medium sorgfältig kontrolliert, so daß sie zu dem Zeitpunkt limitiert wird, wenn Proteinexpression erwünscht ist oder wenn ein Inducer, wie IAA, verwendet wird. Expressionsvektoren, in denen die β-IFN- codierende Gensequenz unter der Kontrolle des PL-Promotors steht, werden in einem Stamm wie E. coli MC1000 oder DG116-gamma-Lysogene gehalten und die Kultur wird, bis Wachstum einsetzt, bei niedriger Temperatur gehalten. Dann steigt die Umgebungstemperatur bis zu einer geeigneten Temperatur für die Induktion an, ungefähr 40-43ºC, wodurch die Expression des β-IFN-codierenden Gens induziert wird. Wachstumsmedien für E. coli sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Nachdem die Zellen von der Kultur geerntet sind, können sie, wenn erwünscht, auf etwa 20 bis 150 mg/ml, vorzugsweise 80 bis 100 mg/ml (40 bis 300 OD, vorzugsweise 160 bis 200 OD bei 680 nm), durch Kreuzstromfiltration, Zentrifugation oder andere übliche Verfahren konzentriert werden. Es wird vorzugsweise eine Verbindung, die für Menschen ungiftig ist, wie 1-Octanol, in einer Menge von etwa 1 Gew.-% der Gesamtkomponenten dem Fermenter vor oder während der Zellkonzentration hinzugesetzt, um sicher zu stellen, daß keine lebensfähigen, rekombinanten Organismen verbleiben, bevor die Zellmembran aufgebrochen wird.

C. Aufbrechen der Zellen

Nach Konzentrierung der geernteten Kultur, werden die Zellmembranen der Mikroorganismen aufgebrochen. Herkömmliche Techniken zum Aufbrechen der Zellen, wie Homogenisieren, Beschallung, Spaltung mit Lysozym oder periodischem Druck, können in diesem Schritt des Verfahrens verwendet werden. Der Endpunkt des Aufbrechungsschritt kann durch Überwachung der optischen Dichte bestimmt werden; die Absorption der Lösung bei 260 nm nimmt normalerweise mit der steigender Zellyse zu. In jedem Fall sollten alle Zellen aufgebrochen werden, so daß keine intakten Zellen durch die folgenden Schritte geschleust werden.

D. Behandlung des aufgebrochenen Materials, um unlösliches β-rIFN zu isolieren

Nachdem die Zellen aufgebrochen wurden, wird dem aufgebrochenen Material vorzugsweise entionisiertes Wasser zugesetzt und mehr als 99 Gew.-% der Salze werden durch die Solubilisierung entfernt, da diese wasserlösliche, unterschiedlich geladene, niedermolekulare Ionen enthalten. Die Entfernung dieser Salze, um die Ionenstärke des aufgebrochenen Materials zu reduzieren, kann durch Diafiltration unter Verwendung von entionisiertem Wasser zum Herausspülen der Ionen oder durch Zentrifugation, um die Feststoffe zu pelletieren, gefolgt von Resuspendieren mit entionisiertem Wasser erzielt werden. Wird Diafiltration verwendet, wird vorzugsweise kontinuierlich entionisiertes Wasser zugesetzt, so daß die Menge des zugesetzten Wassers der Filtrationsrate entspricht.
Nachdem die Salze im wesentlichen entfernt sind, kann gegebenenfalls eine Verbindung, wie 1-Octanol, dem entsalzten aufgebrochenen Material zugesetzt werden, wenn es nicht vorher zugesetzt wurde, um sicher zu stellen, daß keine lebensfähigen, rekombinanten Organismen verbleiben, bevor die Zellen aufgebrochen werden. Das entsalzte aufgebrochene Material wird noch einmal, wie vorstehend für das erste Aufbrechen beschrieben, aufgebrochen.
Nach nochmaligem Aufbrechen ist die Dichte oder Viskosität gestiegen und/oder ein Gradient wird in der Flüssigkeit des aufgebrochenen Materials durch Zusatz einer Substanz zu dem aufgebrochenen Material während des Zentrifugierens aufgebaut. Es gibt mehrere Mittel, diese Wirkung zu erreichen, wobei alle auf den Sedimentationseigenschaften der Teilchen beruhen, nämlich durch Variation der Dichte und/oder der Viskosität der flüssigen Phase. Ein Mittel, um dieses Ziel zu erreichen, ist der Zusatz eines Stoffes, der die Dichte p der Flüssigkeit bis zu einem Wert von etwa 1,1 bis 1,3 g/ml, vorzugsweise 1,13 bis 1,17 g/ml, erhöht.
Substanzen, die verwendet werden können, um diesen Dichteanstieg zu erzielen, schließen einen Zucker oder ein Gemisch von Zuckern, wie zum Beispiel Saccharose, Dextrose, Fructose, Maltose, Maltotriose und andere Mono-, Di- oder Polysaccharide, ein. Der am meisten bevorzugte Zucker ist Saccharose. In einer anderen Ausführungsform kann ein Zweiphasensystem von Substanzen, wie ein Glycerin/Saccharose- Gemisch, verwendet werden, in dem die aufgebrochenen Teilchen sich an der Grenzfläche zwischen den schweren und leichten Phasen verteilen und durch eine Flüssig/Flüssig-Trennung eluiert werden können.
Ergänzend hierzu kann die Viskosität der flüssigen Phase von 5 cps auf 10 cps durch jedes geeignete Mittel, wie durch Zusatz einer viskosen Verbindung, zum Beispiel Saccharose oder Glycerin, erhöht werden. Es wird ebenfalls ein Gradient erzeugt, wenn die Partikel zum Beispiel in einer 60%igen wäßrigen Glycerin-Suspension vorliegen, während die Zentrifugenröhrchen 80%iges wäßriges Glycerin enthalten.
Die β-rIFN enthaltenden refraktilen Körper werden dann durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation von den Zelltrümmern abgetrennt. Mit Hochgeschwindigkeitszentrifugation ist die Drehung der Suspension in einer Zentrifuge bei etwa 10 000 bis 40 000facher Schwerkraft (g), vorzugsweise etwa 10 000-20 000·g, über einen geeigneten Zeitraum, abhängig vom Volumen, im allgemeinen etwa 10 Minuten bis 72 Stunden, gemeint. Am Ende dieses Schritts ist die Masse der zellulären Komponenten der Mikroorganismen von dem β-rIFN abgetrennt. Der durch die Zentrifugation erhaltene Teilchenrückstand oder die Teilchenpaste enthält ungefähr 10-80% β-IFN, bestimmt durch den Lowry-Test (Lowry et al., J. Biol. Chem. 193 (1951), 265-275) und das Scannen von mit Coomassie gefärbten SDS-Gelen.
In einer anderen Ausführungsform, die dem von Moscheva, J.A. et al., in Methods in Enzymology 170 (1986), 177-183 beschriebenen Verfahren folgt, wird gefrorene E. coli- Zellpaste in einer Suspension von 4 Volumenteilen Puffer, mit 0,1 M Tris-HCl, pH 7,9, 50 mM EDTA, 0,1 mM PMSF aufgetaut und 1 mg/ml Lysozym zugefügt. Die Suspension wird bei 4ºC für etwa eine Stunde unter Rühren inkubiert und die Suspension wird durch zwei Schichten Mulltuch gefiltert und durch einen Manton-Gaulin-Homogenisator bei 7000 psi geschickt. Die aus der Presse erhaltene Suspension wird mit einem Volumenteil Puffer, mit 10% PEG&sub6;&sub0;&sub0;&sub0;, 8% Kaliumphosphat, pH 7,9, zu 2 Volumenteilen Lysat verdünnt. Das Gemisch wird gerührt und in Zentrifugenröhrchen dekantiert; und in einer Sorvall RC-3B- Zentrifuge bei 3500 Upm 1-2 Stunden zentrifugiert. Der Rückstand kann dann als Ausgangsmaterial für die Solubilisierung verwendet werden.

E. Solubilisierung von β-rIFN

Der (die) β-rIFN-enthaltende Teilchenniederschlag oder -Paste wird durch Schaffung einer chaotropen Umgebung unter Reduktionsbedingungen, die ein Reduktionsmittel einschließen können, solubilisiert. Die chaotrope Umgebung kann durch eine wäßrige Lösung eines chaotropen Mittels erzeugt werden oder, als Alternative, durch eine wäßrige Lösung, in der andere chaotrope Bedingungen, wie Wärme oder hoher pH-Wert, eingesetzt werden. Bevorzugte chaotrope Umgebungen schließen 2-8 M Harnstoff, 3-7 M Thiocyanatsalze oder etwa 7 M Guanidinhydrochlorid ein. Etwa 7 M Guanidinhydrochlorid wird bevorzugt.
Das Solubilisierungsmedium stellt auch Reduktionsbedingungen bereit, um Disulfidbrücken auf zubrechen und um das solubilisierte β-IFN vor einer Oxidation in signifikantem Maß zu bewahren. Das Protein kann bereits reduziert sein und der Ausschluß einer Oxidation kann angebracht sein. Es kann jedoch günstig sein, Reduktionsmittel für Proteine, besonders Thiole, wie DTT und 2-Mercaptoethanol, zu verwenden. Die Konzentration des Reduktionsmittels, wie zum Beispiel DTT, im Medium liegt üblicherweise zwischen 5 bis 30 mM, vorzugsweise etwa 20 mM. Die Solubilisierung wird normalerweise bei Temperaturen im Bereich von 20ºC bis 25ºC unter Mischen durchgeführt. Der pH-Wert kann gegebenenfalls auf einen Bereich von 8 bis 9, besonders bevorzugt etwa 8,5, reguliert werden. Die Suspension kann für 5 bis 15 Minuten unter Stickstoff auf 50±5ºC erhitzt werden. Das Reaktionsgemisch wird dann auf etwa 25ºC abgekühlt.
Die Solubilisierung wird als vollständig beendet angesehen, wenn eine willkürliche Reaktionszeit, zum Beispiel mehrere Stunden, abgelaufen ist oder wenn die Lösung durchsichtig wird. Gegebenenfalls wird jedes unlösliche Material durch Zentrifugation oder Filtration nach Abschluß der Solubilisierung abgetrennt.

F. Entfernung des Reduktionsmittels

Wurde ein Reduktionsmittel verwendet, ist der nächste Schritt des Verfahrens, jedes Reduktionsmittel aus dem solubilisierten β-rIFN zu entfernen, so daß das solubilisierte β-rIFN oxidiert werden kann. Gelfilration ist eine bevorzugte Möglichkeit, das Reduktionsmittel zu entfernen. Gele, die in der Lage sind, den benötigten Grad der Auflösung bereit zustellen, um das Reduktionsmittel von dem solubilisiertem β-rIFN zu trennen, sind im Handel erhältlich. Wird DTT als Reduktionsmittel verwendet, ist Sephacryl®S-200 ein bevorzugtes Gel; Sephadex®G-25 kann ebenso verwendet werden. Die Gelfiltration wird normalerweise in gepufferter Lösung (pH 5,5 bis 7,0), mit etwa 0,5 bis 7 M des Denaturierungsmittels durchgeführt oder auf andere Weise unter Bedingungen, die die denaturierende Umgebung aufrechterhalten. Die Gelsäule ist entsprechendgroß, um eine geeignete Auflösung der Komponenten zu erlauben.
Diafiltration kann als Alternative zur Gelfiltration verwendet werden, um das Reduktionsmittel zu entfernen, bei Aufrechterhaltung der chaotropen Umgebung.

G. Oxidation von β-rIFN

Das β-rIFN wird als nächstes einer kontrollierten Oxidation unterzogen. Bevorzugte Oxidationsverfahren werden in den US-Patenten des gleichen Inhabers 4,572,798 (Verwendung eines Oxidationsbeschleunigers mit einem Cu²&spplus;-Kation, wie in CuCl&sub2;, Cu(NO&sub3;)&sub2;, etc.) und 4,530,787 (Verwendung von o-Iodosobenzoesäure) beschrieben. Die Cu²&spplus;-Oxidation umfaßt die Umsetzung der wäßrigen Lösung von β-rIFN bei einem pH-Wert zwischen 5,5 und 9, vorzugsweise 6 bis 8 und am meisten bevorzugt etwa 7,5, in Gegenwart von Luft, mit einer wirksamen Mindestmenge eines Oxidationsbeschleunigers, der ein Cu²&spplus;-Kation enthält. Kontrollierte Oxidation führt zur Erzeugung von Disulfidbrücken im β-rIFN, die mit den Brücken in nativem β-IFN übereinstimmen, ohne oder mit minimaler Überoxidation und Erzeugung von nichtübereinstimmenden Brücken oder Oligomeren. Eine solche Oxidation ermöglicht die Herstellung von großen Mengen des rekombinanten β-IFN mit der richtigen Disulfidbrückenbildung.
Die verwendete Menge Oxidationsmittel oder Oxidationsbeschleuniger, ist eine wirksame Mindestmenge für die Oxidation, zum Beispiel eine Menge, die mindestens notwendig ist, um wirksam die Oxidationsreaktion innerhalb eines geeigneten Zeitraums auszuführen. Eine wirksame Menge ist die Menge, die ungefähr äquivalent zu der Konzentration freier Sulfhydrylgruppen im β-rIFN ist, welche an der Bildung der erwünschten Disulfidbrücken beteiligt sind. Vorzugsweise wird die CuCl&sub2;-Menge bei etwa 5 bis 275 Micromolar liegen. Im Fall von o-Iodosobenzoesäure wird das Molverhältnis des Oxidationsmittels zu β-rIFN vorzugsweise im Bereich von etwa 0,05 : 1 bis etwa 5 : 1, besonders bevorzugt etwa 0,8 : 1 bis etwa 2 : 1, liegen. Die Konzentration von β-rIFN in dem Reaktionsgemisch wird niedrig gehalten, d. h. im allgemeinen weniger als etwa 5 mg/ml, vorzugsweise etwa 0,05 bis etwa 2 mg/ml und am meisten bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 1 mg/ml, um die Wahrscheinlichkeit der Oligomerbildung zu reduzieren. Der pH-Wert wird bei der o-Iodosobenzoesäure-Oxidation zwischen 5,5 und 9, vorzugsweise zwischen 7 und 8, gehalten.
Die bei der Oxidation verwendete Temperatur liegt normalerweise zwischen 20ºC und 40ºC, am günstigsten ist Raumtemperatur. Bei der Cu²&spplus;-Oxidation steigert die Erhöhung der Reaktionstemperatur die Reaktionsrate. Die Oxidationsreaktion kann durch Verfahren, wie Erniedrigung des pH-Werts bis zu einem Bereich, bei dem die Reaktion aufhört, Einfrieren der Lösung oder Zusatz von Chelatoren, wie EDTA, zu dem Reaktionsgemisch, wirksam beendet werden. Die Oxidationszeit liegt normalerweise im Bereich von etwa 4 Stunden bis etwa einem Tag.

I. Renaturierung von oxidiertem β-rIFN

Die chaotrope Umgebung wird unter Verwendung eines Ersatzmediums, das einen stabilisierenden Zusatz enthält, aus dem β-rIFN entfernt. Wird das chaotrope Mittel zum Beispiel durch Dialyse gegen einen wäßrigen Puffer, wie Phosphatpuffer, entfernt, erfolgt Aggregation und es kommt zu einem Verlust in der Ausbeute. Wird die Dialyse jedoch mit einer Lösung, die einen stabilisierenden Zusatz enthält, durchgeführt, wird dies verhindert. Folglich besteht die Renaturierung im allgemeinen aus der Entfernung der chaotropen Umgebung aus dem β-Interferon unter Bedingungen, bei denen das β-Interferon in Kontakt mit einem stabilisierenden Zusatz bleibt. Dialyse und Diafiltration sind geeignete Verfahren und wenn die denaturierende Umgebung durch erhöhte Temperaturen geschaffen wird, deren Erniedrigung. Dialyse und Diafiltration werden mit einem Medium, das den stabilisierenden Zusatz enthält, durchgeführt; die Erniedrigung der Temperatur wird nach Zugabe der stabilisierenden Substanzen zum Medium durchgeführt.
Stabilisierende Zusätze sind im wesentlichen zwei Arten: Detergentien und Nichtdetergentien. Die Detergentien zeigen bei relativ geringen Konzentrationen von ungefähr 0,001%-2% ein wirksames Verhalten; die Konzentrationen nichtdetergenter Zusätze liegen in der Größenordnung von mindestens 5%. Typische detergente Zusätze schließen zum Beispiel Trycol® bei 0,05-2%, Durfax®80 bei 0,05-2%, Plurafac®C17 bei 0,05-2% und Tween®80 bei 0,05-2% ein. Kombinationen dieser Detergentien können auch verwendet werden, wobei die Gesamtkonzentration in dem für die einzelnen Komponenten aufgelisteten Bereich liegt.
Nichtdetergente Zusätze, typischerweise Alkohole oder Polyole, einschließlich Zucker, sind in der vorliegenden Erfindung als stabilisierende Zusätze nützlich. Stellvertretende nichtdetergente Zusätze schließen Glycerin, Mannit, Inosit, Saccharose und Dextrose ein. Ebenfalls nützlich sind Polymere von Diolen, wie Polyethylenglycol. Bevorzugte Zusätze schließen Glycerin, Polyethylenglycol von 100-2000 MW, Saccharose und Isopropanol ein. Benötigte Konzentrationen liegen in der Größenordnung von mindestens 5%; ein bevorzugter Konzentrationsbereich ist 5-50%.
Nichtdetergente Zusätze können auch im Gemisch mit detergenten Zusätzen, bei angepaßten Konzentrationen gemäß der besonderen Auswahl der Zusätze, verwendet werden.
Exemplarische stabilisierende Zusätze schließen ein:
1. Ein Gemisch ethoxylierter Fettalkoholether und Laurylether mit der Formel:
CH&sub3;-(CH&sub2;)&sub1;&sub1;-(OCH&sub2;CH&sub2;)n-OH
wobei n eine ganze Zahl zwischen 10 und 14, einschließlich, ist.
2. Ein Gemisch modifizierter oxyethylierter und/oder oxypropylierter geradkettiger Alkohole mit den Formeln:
H-(OCH&sub2;CH&sub2;)p-(OCH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;)q-(CH&sub2;)r-OH
wobei p eine ganze Zahl zwischen 1 und 0, einschließlich, ist;
wobei q 0 oder eine ganze Zahl zwischen 1 und 10, einschließlich, ist; und
wobei r eine ganze Zahl zwischen 6 und 14, einschließlich, ist.
3. Eine Polysorbatverbindung mit der Formel:
in der R eine gesättigte oder ungesättigte Fettsäure mit 16 bis 20, einschließlich, Kohlenstoffatomen ist;
in der t eine ganze Zahl zwischen 10 und 30, einschließlich, ist; und
in der u eine ganze Zahl zwischen 10 und 20, einschließlich, ist.
4. Polyoxyethylen-(12)-laurylalkohol, wie Trycol®LAL-12 (Emery Chemicals, Mauldin, SC), Macol®LA-12 (Mazer Chemicals, Gournec, IL) und Siponic®L-12 (Alcolac, Ltd., Quebec, Kanada), die Gemische von ethoxylierten Fettalkoholethern und Lauryletherverbindungen sind mit den Formeln:
CH&sub3;-(CH&sub2;)&sub1;&sub1;(OCH&sub2;CH&sub2;)n-OH
wobei n eine Verteilung von 1-30 ist und vorzugsweise bei n 12 liegt und m eine Verteilung von 9-17 mit einem bedeutenden Anteil von m = 11 ist.
5. Plurafac®C-17 (BASF Wyandotte, Parsippany, NJ), das ein Gemisch aus modifizierten, oxyethylierten und/oder oxypropylierten, geradkettigen Alkoholen mit den Formeln:
H-(OCH&sub2;CH&sub2;)p-(OCH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;)q-(CH&sub2;)r-OH
in denen p eine ganze Zahl zwischen 1 und 5, einschließlich, ist; q 0 oder eine ganze Zahl zwischen 1 und 5, einschließlich, und r eine ganze Zahl zwischen 10 und 12, einschließlich, ist.
6. Durfax®80 (SCM Durkee Foods, Cleveland, OH) oder Tween®80 (ICI Americas, Inc. Wilmington, Delaware), die Polysorbat 80-Verbindungen sind mit der Formel:
Weitere biologisch abbaubare, nichtionische polymere Detergentien, mit den vorstehend aufgeführten Parametern, können in "Editions of McCutcheon's Emulsifiers & Detergents", veröffentlicht durch die McCutcheon Division of MC Publishing Co., 175 Rock Road, Glen Rock, NJ (USA), gefunden werden. Derartige nicht ionische polymere Detergentien können ebenfalls in dem Verfahren dieser Erfindung verwendet werden.
Folglich werden im allgemeinen die üblichen Verfahren zur Entfernung der chaotropen Umgebung, wie Dialyse oder Verdünnung, verwendet, aber die Umgebung wird durch eine einen stabilisierenden Zusatz enthaltende Umgebung ersetzt, wobei die Konzentration des stabilisierenden Zusatzes während der Entfernung des chaotropen Mittels im Bereich von 0,05-2% gehalten wird, um unerwünschte Aggregation und Ertragsverlust zu verhindern.
Wird ein β-rIFN renaturiert, dessen Cysteinrest an Position 17 nicht mit einer neutralen Aminosäure ersetzt ist (wie β-rIFN, das die Aminosäuresequenz von nativem β-IFN aufweist), wurde beobachtet, daß eine bedeutende Menge von β-IFN-Isomeren mit von nativem β-IFN verschiedenen Disulfidbrücken ausgebildet wurde. Aus diesem Grund wird die Durchführung dieses Verfahrens mit β-IFNen, in denen der Cysteinrest an Position 17 so ersetzt wurde, bevorzugt.

G. Weitere Reinigung

Nach der Renaturierung kann das renaturierte β-IFN weiter durch übliche Verfahren, wie Ionenaustauschchromatographie, gereinigt werden, um andere Proteinformen zu entfernen. Die Lösung des renaturierten β-rIFNs wird mit dem Austauscher unter geeigneten Bedingungen in Kontakt gebracht und das β-rIFN wird unter Abtrennung einiger Verunreinigungen eluiert. Ergänzende Reinigungsverfahren, die nützlich sein können, sind Größenfraktionierung unter Verwendung der Molekularsiebchromatographie, Affinitätschromatographie, zum Beispiel unter Verwendung von gegen die biologisch aktive Form des Proteins gerichteten Antikörpern, Adsorptionschromatographie unter Verwendung von nicht spezifischen Trägern und auch Gelelektrophorese.

H. Reinigung zur Entfernung der Endotoxine

Nach Oxidation und Renaturierung wird das β-rIFN gereinigt, um Pyrogene und Endotoxine bis zu einer Menge zu entfernen, die klinischen Erfordernissen entspricht (d. h. weniger als etwa 0,1 ng Endotoxin pro mg β-rIFN und im wesentlichen frei von Pyrogenen, gemessen mit dem U.S.P. Kaninchen-Pyrogentest, bei einer Dosis von 1,0·10³ Einheiten/kg). RP-HPLC und organische Extraktion sind bevorzugte Verfahren für eine solche Reinigung.

I. Formulierungen

Das gereinigte β-IFN wird in einer wäßrigen Lösung bei einer Konzentration im Bereich von etwa 0,01 bis 2 mg/ml formuliert. Ein wasserlöslicher Träger wird normalerweise bis zur gewünschten Menge hinzugesetzt. Der Träger wird normalerweise so zugesetzt, daß er in der Lösung mit etwa 1-10 Gew.-%, vorzugsweise etwa 5 Gew.-%, vorliegt. Die genaue Menge des zugesetzten Trägers ist nicht entscheidend. Übliche feste Füllstoffe, die bei der pharmazeutischen Tablettenformulierung verwendet werden, können als Träger verwendet werden. Diese Substanzen sind wasserlöslich, reagieren nicht mit dem β-rIFN und sind stabil. Sie sind auch vorzugsweise gegenüber Wasser nicht empfindlich (d. h. nichthygroskopisch). Spezifische Beispiele für Träger, die hinzugesetzt werden können, schließen Dextrose, Lactose, Mannit und andere reduzierte Zucker, wie Sorbit, Stärke und Stärkehydrolysate aus Weizen, Mais, Reis und Kartoffeln, microkristalline Cellulose und Albumin, wie menschliches Serumalbumin, ein. Mannit und Dextrose werden bevorzugt.
Der Träger gibt der Formulierung Volumen, so daß, wenn Dosiseinheitsmengen der Lösung in Behältern, wie sterilen Ampullen, gefriergetrocknet werden, der gefriergetrocknete Rückstand für das bloße Auge deutlich erkennbar ist. Im Hinblick darauf erzielt der bevorzugte Träger Mannit einen ästhetisch akzeptablen Rückstand (weiß, kristallin), der unempfindlich gegen Wasser ist. Die Unempfindlichkeit von Mannit gegen Wasser kann die Stabilität der Formulierung erhöhen.
Die Europäische Patentanmeldung Nr. 215,658, veröffentlicht am 25. März 1987, mit dem Titel: "An Improved Formulation for Lipophilic Proteins" (Hanisch et al.), beschreibt ein verbessertes Verfahren zur Gewinnung und Reinigung lipophiler rekombinanter Proteine, wie β-rIFN, aus Mikroorganismen, wobei eine Proteinpräparation erhalten wird, die in ein stabiles Arzneimittel formuliert werden kann. Ein solches Mittel, das eine therapeutisch wirksame Menge des biologisch aktiven rekombinanten lipophilen Proteins, gelöst in einem nichttoxischen, inerten, therapeutisch verträglichen Trägermedium auf Wasserbasis bei einem pH-Wert von 6,8 bis 7,8 enthält, enthält auch einen Stabilisator für das Protein, wie menschliches Serumalbumin, normales Serumalbumin und menschliche Plasmaproteinfraktion. Die Formulierungsvorschläge der EP 0 215,658 sind ein alternativer Formulierungsweg für das gereinigte β-IFN. EPO 215,658 beschreibt ein Formulierungsverfahren bei einem niedrigen pH-Wert. Das US-Patent 4,462,940 von Hanisch et al. beschreibt ein Formulierungsverfahren bei einem hohen pH-Wert und dessen Formulierungsvorschläge sind ebenfalls ein alternativer Formulierungsweg.
Nach Zugabe des Trägers werden die Dosiseinheitsmengen (d. h. für β-rIFN-Volumen, die 0,01 bis 2 mg, vorzugsweise 0,2 bis 0,3 mg, β-rIFN pro Dosis bereitstellen) der Lösung in Behälter verteilt; die Behälter werden mit einem Schlitzstopfen versehen und die Inhalte werden, unter Verwendung üblicher Gefriertrocknungs-Bedingungen und -Apparatur, gefriergetrocknet.
Das gefriergetrocknete, sterile Produkt besteht aus einem Gemisch von: (1) β-rIFN, (2) Träger (Dextrose oder Mannit), (3) gegebenenfalls anderen Excipienten, wie menschliches Serumalbumin, Tween®80 und ähnlichem, und (4) einer kleinen Menge Puffer, der einen physiologischen pH-Wert schafft, wenn das Gemisch aufgelöst wird. Das Produkt kann auch eine geringfügige Menge eines Konservierungsmittels enthalten, um die chemische Stabilität zu erhöhen. Das β-riFN macht normalerweise etwa 0,015% bis 3,85 Gew.-% des Gemisches, vorzugsweise etwa 0,4% bis 0,6 Gew.-% des Gemisches, aus.
Das gefriergetrocknete Gemisch kann durch Injizieren einer üblichen parenteralen, wäßrigen Injektion, die destilliertem Wasser zur Injektion, Injektion von Ringer- Lösung, Injektion von Hanks' Lösung, Dextroseinjektion, Dextrose- und Salzinjektion, Injektion von Kochsalzlösung oder ähnlichem, in die Ampulle aufgelöst werden. Die Injektion sollte an die Seite der Ampulle erfolgen, um übermäßiges Schäumen zu vermeiden. Die zugesetzte Injektionsmenge liegt normalerweise im Bereich von 1 bis 5 ml, vorzugsweise 1 bis 2 ml.
In einer anderen Formulierung, beschrieben in der gleichzeitig anhängigen Europäischen Patentanmeldung Nr. 206,828, veröffentlicht am 30. Dezember 1986, mit dem Titel: "Solubilization of Recombinant Proteins for Pharmaceutical Compositions Using Homopolymer Conjugation" von Knauf, M. et al., wird das β-IFN mit einem aktivierten Homopolymer, ausgewählt aus Polyetylenglycol, Polypropylenglycol oder Polybutylenglycol, umgesetzt, wobei das Polymer ein Molekulargewicht von 500 bis 20 000 Daltons, vorzugsweise 2000 bis 10 000 Daltons, aufweist. Das Homopolymer wird durch Konjugation mit einem Kupplungsmittel aktiviert, das terminale Gruppen aufweist, die sowohl mit dem freien Amin oder den Thiolgruppen des Proteins als auch mit der Hydroxylgruppe des Homopolymers reagieren. Beispiele für solche Kupplungsmittel schließen Hydroxynitrobenzolsulfonester, Cyanursäurechlorid und N-Hydroxysuccinimid ein. Das β-rIFN wird dann direkt mit dem wasserlöslichen Träger und Puffer wie vorstehend beschrieben formuliert, die Formulierung wird gefriergetrocknet und das gefriergetrocknete Gemisch kann wie vorstehend beschrieben aufgelöst werden.
Die wie vorstehend beschrieben hergestellte Formulierung ist für parenterale und orale Verabreichung an Menschen und andere Säugetiere in therapeutisch wirksamen Mengen (d. h. Mengen, die den pathologischen Zustand des Patienten beseitigen oder reduzieren) geeignet, um dadurch eine Therapie bereitzustellen. Beta-rIFN ist für antivirale und für Krebstherapien geeignet und kann auch in Kombination mit anderen Reagenzien zur Erhöhung von deren Nutzen nützlich sein.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen sind nützlich zur parenteralen Verabreichung, zum Beispiel zur intravenösen, subkutanen, intramuskulären, intraorbitalen, ophtalmologischen, intrakapsulären, intraspinalen, örtlichen Verabreichung, als intranasales Aerosol, Skarifizierung und auch zur oralen Verabreichung. Die bevorzugten Verabreichungswege sind durch intramuskuläre, subkutane und intravenöse Injektion und durch örtliche Verabreichung. Die Verwendung nichtionischer Detergentien ist für örtlich verabreichte Formulierungen aufgrund ihrer Fähigkeit, die Hautoberfläche zu durchdringen, besonders bevorzugt.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung weiter. Diese Beispiele sollen die Erfindung in keiner Weise begrenzen. In diesen Beispielen sind alle Temperaturangaben, wenn nicht anders bezeichnet, in Grad Celsius.

Beispiel 1

Dieses Beispiel veranschaulicht ein bevorzugtes Verfahren zur Gewinnung, Reinigung, Renaturierung und Formulierung von β-rIFN.
β-IFNser17 wurde aus E. coli gewonnen. Der in diesem Beispiel verwendete β-IFNser17-produzierende E. coli-Stamm (K12/MM294-1), der das Plasmid pSY2501 trägt, ist bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer 39,517 hinterlegt. Das Analog ist in den Cetus Corporation übertragenen US-Patenten Nr. 4,518,584 und 4,588,585 offenbart.
E. coli wurden in einem 1000-Liter Fermenter bei 37ºC gezüchtet. Der gelöste Sauerstoff wird, falls notwendig, durch (1) verstärktes Rühren, (2) Luftzufuhr und (3) Sauerstoffzufuhr bei etwa 40% gehalten.
Zuerst wird der Fermenter bis zum Betriebsvolumen mit Wasser gefüllt; die folgenden Spurenelemente werden hinzugesetzt:
ZnSO&sub4;·7H&sub2;O 30 uM
MnSO&sub4;·4H&sub2;O 30 uM
CuSO&sub2;·5H&sub2;O 3 uM
Na&sub3;-Citrat 2H&sub2;O 1,5 mM
KH&sub2;PO&sub4; 21 mM
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 72 mM
Die Fermenternahrung und zusätzliche Gefäße werden dann gemäß Standardbetriebsverfahren sterilisiert. Dann wurden die folgenden sterilen Zusätze zugefügt:
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 3 mM
FeSO&sub4;·7H&sub2;O 72 uM
L-Tryptophan 70 mg/l
Thiamin HCl 20 mg/l
Glucose 5 g/l
Tetracyclin 5 mg/l
Der Fermenter wurde gekühlt und mit 2 mg/l gefrorener oder gezüchteter E. coli-Kultur beimpft. Eine Glucosenahrung wird verwendet, um die Glucosekonzentration zwischen 5-10 g/l zu halten. Ungefähr 15 Stunden nach Fermentationsbeginn wird der pH-Wert mit KOH auf 6,8 eingestellt. Optische Dichtemessungen und Restglucosemessungen von Proben wurden nach 14-16 Stunden und danach in ungefähr einstündigen Intervallen gemacht.
Induktion der β-IFNser17-Produktion durch Entzug von L-Tryptophan aus dem Kulturmedium tritt bei etwa OD&sub6;&sub8;&sub0;=10 ein. Danach erfolgt Zusatz von Casaminosäuren bis zu einer Endkonzentration von 2% bei OD&sub6;&sub8;&sub0;=15. Die Kulturen wurden etwa 3-5 Stunden später geerntet.
Die refraktilen Körper mit dem β-IFNser17 wurden isoliert. Das geerntete Material wird etwa 5-10fach durch Zirkulation des geernteten Materials unter Druck durch UF-Kreuzstrom-Filtrationspatronen mit einer Molekulargewichtsgrenze von 100K konzentriert. Die Zellen werden in 3 Durchgängen durch eine Manton-Gaulin Presse bei etwa 6000-8000 psig aufgebrochen.
EDTA wurde bis zu einer Konzentration von 2 mM hinzugesetzt und die Suspension wurde gegen 5 Volumenteile deionisiertes Wasser diafiltriert. Octanol wurde in einer Konzentration von 1% (v/v) dem diafiltrierten Produkt hinzugesetzt, um alle verbliebenen lebenden Bakterien abzutöten. Nach mehreren Stunden wurde das diafiltrierte aufgebrochene Material nochmals mit einem Durchgang durch eine Manton-Gaulin Presse bei 6000-8000 psig aufgebrochen.
Saccharose wurde dem nochmals aufgebrochenen Material in einer Konzentration von 23% (Gew./Gew.) hinzugesetzt, um eine Enddichte zwischen 1,1 und 1,25 g/ml zu erreichen. Das Gemisch wurde bei 10 000 bis 20 000·g bei 1-2 lpm zentrifugiert und der Teilchenniederschlag oder die Teilchenpaste wurden gesammelt. Eine Temperatur von mindestens 20ºC wurde vor und während der Zentrifugation aufrechterhalten.
Die Teilchenpaste wurde dann in 7 M Guanidin-HCl (GuHCl) mit 50 mM DTT solubilisiert. Die solubilisierte Paste wurde dann bei 25 000-35 000·g zentrifugiert und der Überstand gewonnen.
Der Überstand wurde 20 Minuten unter Stickstoff bei einem pH-Wert von etwa 8,5 auf 50±5ºC erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf ungefähr 25ºC abgekühlt, dann wurde der pH-Wert des Gemisches unter Verwendung von Eisessig auf 5,5±0,1 eingestellt und die Lösung wurde durch einen 0,65 um Filter gefiltert.
Chromatographische Abtrennung der niedermolekularen Verunreinigungen wurde durch Verwendung einer Sephadex® G-25-Säule erreicht. Das solubilisierte und reduzierte Protein refraktiler Körper wurde auf die Säule gegeben und Fraktionen wurden in sauberen, pyrogenfrei gemachten Gefäßen unter Verwendung eines Elutionspuffers mit 7 M Guanidin-HCl bei pH 7,5 und 10 mM Natriumphophatpuffer pH 5 gesammelt. Die Peakfraktionen (jene, die innerhalb 70% der höchsten Peakhöhe liegen) wurden vereinigt und wie nachstehend erläutert oxidiert.
Die GuHCl-Konzentration von 7 M wurde während der Solubilisierung und der chromatographischen Trennungsverfahren aufrechterhalten.
Die Oxidation des β-rIFNs wurde durch Zugabe von CuCl&sub2; in einem molaren Verhältnis von 3 : 1 (CuCl&sub2; zu β-rIFN) gestartet. Die Oxidation wurde bei etwa 25ºC durchgeführt. Der pH-Wert wurde während der Oxidation mit 0,5 N NaOH bei pH 7,5±0,2 gehalten und nach Beendigung der Oxidation wurden 4 mM EDTA hinzugesetzt. Da oxidiertes β-rIFN hydrophiler ist als reduziertes β-rIFN, wurde der Oxidationsvorgang mit RP-HPLC überwacht. Oxidiertes β-rIFN wurde unter Verwendung einer Hohlfaser-Ultrafiltrationseinheit, mit einer Molekulargewichtsgrenze von 10K, konzentriert.

Beispiel 2

Zu diesem Zeitpunkt wurde ein stabilisierender Zusatz zu dem oxidierten β-IFN-Material hinzugesetzt, wobei Guanidin-HCl immer noch vorhanden ist und die Lösung wurde dialysiert, um das Guanidin zu entfernen. Das solubilisierte oxidierte Material wurde in Aliquots aufgeteilt und zu jedem Aliquot wurde ein anderes stabilisierendes Mittel oder ein nichtionisches Detergens hinzugesetzt. Eine Zusammenfassung der in diesem Beispiel verwendeten stabilisierenden Mittel und der nichtionischen Detergentien, sowie die verwendete Konzentration, ist in Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1

Reagenzien, um β-IFN in Lösung zu halten, wenn Guanidin-HCl entfernt wird

erfolgreich (+)/ohne Erfolg (-)
10 mM NaPi, pH 5
nichtionische Detergentien
Trycol® (0,3%) +
Trycol® (0,15%) +
Durfax®80 (0,1%) +
Plurafac®C17 (0,1%) +
Nopalco® + Triton X405 (0,05% + 0,1%)
Nichtdetergente Mittel
Ethylenglycol (20%)
Propylenglycol (20%)
PEG&sub6;&sub0;&sub0;&sub0; (10%)
PEG&sub3;&sub0;&sub0; (15%) +
PEG&sub3;&sub0;&sub0; (25%) +
Glycerin (25%) +
1,2-Butandiol (20%)
3-Phenoxy-1,2-propandiol (5%)
Glucose (50%)
Saccharose (50%) +
Isopropanol (20%) +
Isopropanol (50%) +
Jedes Aliquot wurde gegen 20-50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 5,0, mit dem entsprechenden Stabilisator oder Detergens dialysiert. Die Konzentration des stabilisierenden Zusatzes wurde während der Entfernung von Guanidin-HCl im Bereich von 0,05-2% gehalten. Die Dialyse erfolgte bei pH 5,0, da β-rIFN bei einem niedrigen pH-Wert löslicher ist als bei neutralem oder hohem pH-Wert. Während das Guanidin aus der Probe dialysiert wurde, bildete sich ein Niederschlag. Die Aliquots wurden 15 Minuten bei 5000·g zentrifugiert und der Überstand sowie der in 1% SDS resuspendierte Niederschlag aufbewahrt. Der Überstand und der Niederschlag wurden durch SDS-PAGE (PHAST-System von Pharmacia) und Silberfärbung analysiert, um das β-rIFN nachzuweisen.
Die Ergebnisse zeigen, daß drei nicht ionische Detergentien, Trycol®, Durfax®80 und Plurafac®C17 (alle bei 0,1-0,15% und pH 5) mehr als 50% des β-IFNs in Lösung halten. Vier nichtdetergente Stabilisatoren halten β-IFN ebenfalls in Lösung: 15%iges PEG&sub3;&sub0;&sub0;, 25%iges Glycerin, 50%ige Saccharose und 20%iger Isopropanol. Es wurde auch gezeigt, daß die Einstellung der Konzentration und/oder des pH-Werts für jeden dieser stabilisierenden Zusätze die Wirksamkeit verbessern kann. Tabelle 2 zeigt zum Beispiel die Ergebnisse der Konzentrations- und pH-Wert-Einstellung für Glycerin. Die Ergebnisse zeigen, daß steigende Glycerinkonzentrationen bis 50% und Erniedrigung des pH-Werts auf 4 eine größere β-IFN-Löslichkeit ergeben.

Tabelle 2

Glycerin (25 mM NaPi) % A&sub2;&sub8;&sub0; im Überstand
50%, pH 5 50
50%, pH 4 86
25%, pH 5 13
25%, pH 4 31
Ähnliche Ergebnisse erhält man mit PEG&sub3;&sub0;&sub0;.
Auch Kombinationen von Detergentien und nichtdetergenten Stabilisatoren wurden in dem vorliegenden Solubilisierungsverfahren verwendet. Zum Beispiel wurde 25%iges Glycerin bei pH 4 jeweils zu 0,01%igem Tween®80 und 0,01%igem Trycol® im Dialyseverfahren hinzugesetzt. Die Absorption bei 280 nm wurde gemessen und SDS-PAGE-Untersuchungen zeigten, daß beide dieser nichtionischer Detergentien die Wirksamkeit von Glycerin genügend steigern, um das meiste β-IFN in Lösung zu halten.

Beispiel 3

Dieses Beispiel stellt vier Reinigungsverfahren bereit, die einzeln oder in Kombination mit anderen Verfahren für die Reinigung von β-rIFN verwendet werden können.

Ionenaustauschchromatographie (IAC)

Eine β-rIFN enthaltende Lösung wird mit einem geeigneten Ionenaustauschmaterial unter Bedingungen in Kontakt gebracht, bei denen das β-rIFN durch den Austauscher zurückgehalten wird und Verunreinigungen entfernt werden. Das β-rIFN wird dann durch Änderung der Bedingungen, so daß die Wechselwirkung des β-rIFNs mit dem Austauscher aufgehoben wird, eluiert, zum Beispiel mit einem ansteigenden Salzund/oder pH-Gradienten. Verunreinigungen, die ebenfalls durch den Austauscher unter den Ausgangsbedingungen zurückgehalten werden, können während des Elutionsverfahrens abgetrennt werden. In einer anderen Ausführungsform wird die β-rIFN enthaltende Lösung mit dem Austauscher unter Bedingungen in Kontakt gebracht, bei denen Verunreinigungen zurückgehalten werden und das β-rIFN eluiert wird.

Hydrophobe Wechselwirkungschromatographie (HWC)

Eine beta-rIFN enthaltende Lösung wird mit einem geeigneten HWC-Träger unter Bedingungen in Kontakt gebracht, bei denen das β-rIFN durch den Träger zurückgehalten wird und Verunreinigungen eluiert werden. Dann wird durch Änderung der Bedingungen, zum Beispiel durch einen Gradient absteigender Salzkonzentrationen und/oder pH-Änderung, β-rIFN eluiert. In einer anderen Ausführungsform kann β-rIFN mit dem HWC-Träger unter Bedingungen in Kontakt gebracht werden, bei denen Verunreinigungen zurückgehalten werden und β-rIFN eluiert wird.

Größenausschlußchromatographie (SEC)

Eine beta-rIFN enthaltende Lösung wird über ein geeignetes Material eluiert, das auf der Basis der Molekülgröße trennt. Die β-rIFN enthaltenden Fraktionen werden gewonnen und vereinigt.

Affinitätschromatographie

Eine beta-rIFN enthaltende Lösung wird mit einem Trägermaterial in Kontakt gebracht, das mit einem Stoff derivatisiert wurde, der selektiv mit dem β-rIFN in Wechselwirkung tritt, wie ein monoclonaler Antikörper Beta-rIFN wird zurückgehalten, während Verunreinigungen eluiert werden. Beta-rIFN wird dann durch Aufheben der spezifischen Wechselwirkungen eluiert.
Modifikationen der vorstehend beschriebenen Weise zur Durchführung der Erfindung, die für wissenschaftliche und technische Fachleute auf der Erfindung verwandten Gebieten offensichtlich sind, sind in den Schutzbereich der folgenden Patentansprüche einbezogen.

Hinterlegungen

Wie vorstehend erwähnt, wurde eine Kultur von E coli K12/MM294-1 mit dem Plasmid pSY2501 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA, am 18. November 1983 unter der ATCC-Nr. 39,517 hinterlegt.
Die Hinterlegung erfolgte gemäß einem Vertrag zwischen der ATCC und dem Inhaber (Rechtsnachfolger), Cetus Corporation. Der Vertrag mit dem ATCC sichert der Öffentlichkeit die ständige Verfügbarkeit des besagten Stamms und dessen Nachkommen nach Erteilung eines US-Patents, das diese Anmeldung betrifft, die die Hinterlegung beschreibt und kennzeichnet, oder nach der Veröffentlichung oder Offenlegung gegenüber der Öffentlichkeit jeder US- oder ausländischen Patentanmeldung, je nachdem welche zuerst kommt, und die Verfügbarkeit des Stamms und der Nachkommen davon für jemanden, der durch den US-Commissioner of Patents and Trademarks bestimmt wird, daß er dazu gemäß 35 USC 122 und den entsprechenden Regeln des Commissioners dazu (einschließlich 37 CFR 1.14, mit besonderem Bezug auf 886 OG 638) berechtigt ist. Der Inhaber (Rechtsnachfolger) der vorliegenden Anmeldung hat zugestimmt, daß, wenn der hinterlegte Stamm sterben sollte, verloren ginge oder, wenn er unter geeigneten Bedingungen gezüchtet, zerstört würde, er sofort nach Benachrichtigung mit einer lebenden Kultur des gleichen Stamms ersetzt wird.
Die Hinterlegung unter den Bedingungen des Budapester Vertrags sichert, daß die hinterlegte Kultur in einem lebensfähigen und nichtkontaminierten Zustand für einen Zeitraum von mindestens 5 Jahren nach dem letzten Antrag an ATCC zur Herausgabe einer Probe des hinterlegten Mikroorganismus; und in jedem Fall für einen Zeitraum von mindestens 30 Jahren nach dem Hinterlegungsdatum.
Die Verfügbarkeit des hinterlegten Stamms kann nicht als Lizenz ausgelegt werden, die Erfindung entgegen den erteilten Rechten, unter der Autorität einer Regierung gemäß deren Patentrechten, auszuüben.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung eines gereinigten, biologisch aktiven, bakteriell produzierten β-Interferons, umfassend:

(a) Herstellung von oxidierenden Bedingungen für das reduzierte, solubilisierte, bakteriell produzierte β- Interferon, das in einer chaotropen Umgebung vorliegt, und

(b) Entfernung der chaotropen Umgebung in Gegenwart einer wirksamen Menge eines stabilisierenden Zusatzes.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das reduzierte, solubilisierte β-Interferon durch Auflösen von refraktilen Körpern, die von Bakterien geerntet wurden, die mit einem Expressionssystem für die Produktion von β-Interferon transformiert und für die Produktion induziert wurden, in einer wäßrigen Lösung eines chaotropen Mittels in Gegenwart eines Reduktionsmittels hergestellt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das chaotrope Mittel aus Harnstoff und einem Guanidiniumsalz ausgewählt ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Reduktionsmittel ein Thiol ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die oxidierenden Bedingungen durch Kupferionen oder o-Iodosobenzoesäure hergestellt werden.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der stabilisierende Zusatz ein Detergens ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Detergens ausgewählt ist aus Polyoxyethylen(12)-laurylalkohol, Gemischen von modifizierten oxyethylierten und/oder oxypropylierten geradkettigen Alkoholen und Polysorbat 80-Verbindungen.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der stabilisierende Zusatz etwa 5 bis 50% eines Alkohols, Polyols oder Zuckers ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der stabilisierende Zusatz ausgewählt ist aus Glycerin, PEG, Saccharose und Isopropanol.