DE3689870T2

DE3689870T2 - Formulierung für rekombinantes beta-Interferon, Verfahren zur Gewinnung und Stabilisierung des beta-Interferons und dessen Verwendung.

Info

Publication number: DE3689870T2
Application number: DE3689870T
Authority: DE
Inventors: Peter Michael Fernandes; Wolfgang Helmut Hanisch; Terrance Taforo
Original assignee: Cetus Oncology Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1985-09-13
Filing date: 1986-09-12
Publication date: 1994-09-15
Anticipated expiration: 2006-09-13
Also published as: ATE106247T1; DE3689870D1; JPH064542B2; EP0215658A3; EP0215658A2; EP0215658B1; AU590896B2; JPS6267032A; CA1339707C; AU6264286A; US4992271A

Description

Diese Erfindung betrifft das allgemeine Gebiet der biochemisch-technischen Verfahren. Insbesondere betrifft der Gegenstand der Erfindung die Herstellung von biologisch aktivem rekombinantem β-HIFN. Ganz besonders betrifft der Gegenstand der Erfindung ein verbessertes Verfahren für die Herstellung und Gewinnung von rekombinantem β-HIFN aus genetisch transformierten Wirtsorganismen, Präparationen von verhältnismäßig hoher Reinheit und therapeutisch verträgliche Formulierungen davon.
Natürlich vorkommende Interferone (IFNe) sind artspezifische Proteine, oft Glycoproteine, die durch verschiedene Zellen nach Induktion durch Viren, doppelsträngige RNA's, andere Polynucleotide, Antigene und Mitogene hergestellt werden. Interferone zeigen vielfältige biologische Aktivitäten, wie antivirale, antiproliferative, immunmodulatorische und antizelluläre Wirkungen. Mindestens drei verschiedene Arten menschlicher Interferone wurden in Hinsicht auf ihre antiviralen, wachstumshemmenden Aktivitäten und die Aktivierung natürlicher Killerzellen (NK) identifiziert und charakterisiert. Sie werden durch Leucocyten, Lymphocyten, Fibroblasten und das Immunsystem hergestellt und werden als α-, β- und Γ-Interferone klassifiziert. Es sind wahrscheinlich unterschiedliche Proteine, die von verschiedenen Strukturgenen codiert werden.
Natives menschliches β-Interferon (β-HIFN) wird im allgemeinen durch Überinduktion menschlicher Fibroblasten- Kulturen mit poly-IC (poly-Riboinosinsäure und poly-Ribocytidinsäure), Isolierung und Reinigung des so hergestellten β-HIFNs durch chromatographische und elektrophoretische Techniken hergestellt. Proteine oder Polypeptide, die ähnliche Eigenschaften wie natives β-Interferon zeigen, können ebenfalls durch die Anwendung gentechnologischer Verfahren hergestellt werden; und zwar durch Extraktion poly-A-reicher 12S-messenger-RNA aus viral induzierten menschlichen Zellen, Synthese einer doppelsträngigen c-DNA unter Verwendung der m-RNA als Matrize, Einführung der c-DNA in einen geeigneten Clonierungsvektor, Transformation geeigneter Mikroorganismen mit dem Vektor, Ernte der Bakterien und Extraktion des β-HIFNs daraus. Nagola, S. et al., Nature 284 (1980), 316; Goeddel, D. V. et al., Nature 287 (1980), 411; Yelverton, E. et al., Nuc. Acid Res. 9 (1981), 731; Streuli, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (US) 78 (1981), 411; Europäische Patentanmeldungen Nr. 28033, veröffentlicht am 6. Mai 1981; 41313, veröffentlicht am 9. Dezember 1981; 34307, veröffentlicht am 26. August 1981 und Belgisches Patent 837397, erteilt am 1. Juni 1981, beschreiben verschiedene, gegenwärtig angewendete Verfahren für die Herstellung von β-Interferon, die gentechnologische Verfahren anwenden. Die exprimierten Proteine oder Polypeptide wurden gereinigt und getestet; es zeigte sich, daß sie ähnliche Eigenschaften wie native IFNe zeigen. Bakteriell hergestellte INFe scheinen zur potentiellen therapeutischen Verwendung als antivirale und Antitumor-Wirkstoffe geeignet zu sein und von der Herstellung des IFNs durch derartige bakterielle Fermentationen wird erwartet, ausreichend große Mengen von IFN bei verhältnismäßig niedrigen Kosten für die klinische Prüfung zu erzielen.
Proteinproben für klinische Studien müssen von verhältnismäßig hoher Reinheit sein und im wesentlichen nicht kontaminiert mit toxischen Bestandteilen der Wirtszelle, Zelltrümmern und anderen fremden Chemikalien, die während der Extraktion und den Reinigungsschritten eingeführt wurden. Es gibt verschiedene, gegenwärtig verfügbare Verfahren für die Herstellung, Gewinnung und Reinigung von bakteriell hergestellten Proteinen.
US-Patent 4,315,852 von Leibowitz et al. beschreibt und beansprucht ein Verfahren für die Säureextraktion von Leucocyten-Interferon aus Bakterienzellen und die Neutralisation des Extrakts, um das Interferon zu gewinnen.
Derynck et al., Nature 287 (1980), 193, lehren die Lyse transformierter E. coli-Zellen unter Verwendung einer Lösung, die 5 M Harnstoff, 1% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 1% 2-Mercaptoethanol enthält. Das Lysat, das durch Chromatographie gereinigt wurde, zeigt Interferonaktivität.
Scandella und Kornberg, Biochemistry 10 (1971), 4447, beschreiben die Herstellung einer Phospholipase aus E. coli durch Solubilisierung der Zellmembranen mit SDS und das Präzipitieren des solubilisierten Proteins mit 1-Butanol.
US-Patent 4,343,735 von Menge et al. beschreibt ein Verfahren zur Reinigung von Interferon durch Auftrennung in einem wäßrigen Mehrphasensystem in Gegenwart von Ionenaustauschern, die in diesem System löslich sind und Derivate von Polyethern sind.
US-Patent 4,343,736 von Uemura et al. offenbart ein Verfahren zur Gewinnung von Interferon durch Adsorption an wasserunlöslichem Heparin und anschließender Eluierung des Interferons mit einer wäßrigen Lösung eines anorganischen Salzes und Chondroitinsulfat.
US-Patent 4,289,689 von Friesen et al. offenbart, wie man menschliches natives β-Interferon durch die Anwendung von Affinitätschromatographie und Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie gewinnt und reinigt.
US-Patent 4,460,574 von Yabrov offenbart ein Arzneimittel, das native menschliche α- und β-Interferone umfaßt und für die rektale oder urogenitale Behandlung von Interferon-sensitiven Krankheiten des Menschen verwendet wird.
US-Patent 4,364,863 von Leibowitz et al. beschreibt ein Verfahren zur Extraktion von Fibroblasten-Interferon aus Bakterien bei einem niedrigen pH-Wert, gefolgt von einem Extraktionsverfahren bei einem hohem pH-Wert.
PCT WO 80/02229 von Benzon offenbart die Reinigung von alpha-(Leucocyten)-Interferon, das kein lipophiles Protein ist.
EP 42,246 offenbart, daß rekombinante Interferone in jedem pharmazeutisch verträglichen, nicht-toxischen Träger gelöst werden kann, der für die gewünschte Form der Verabreichung geeignet ist, ohne Angabe weiterer Details.
US-Patent 4,450,103 (siehe auch WO83/03103) offenbart die Solubilisierung des Proteins in einem wäßrigen Medium mit einem geeigneten Solubilisierungsmittel, die Extraktion des Proteins aus dem wäßrigen Medium mit 2-Butanol oder 2-Methyl-2-butanol und die Präzipitation des Proteins aus der Alkoholphase.
Cancer Treatment Reports 62 (1978), 1900-1906 und EP 89,245 offenbaren, daß natives beta-Interferon direkt mit menschlichem Serumalbumin in einem pharmazeutisch verträglichen Medium auf Wasserbasis bei einem pH-Wert von 7,2-7,8 formuliert werden kann.
Alpha-Interferone und natives beta-Interferon sind keine lipophilen Proteine. Deshalb können sie durch Zugabe eines Stabilisierungsmittels, wie menschliches Serumalbumin, direkt zur Formulierung bei einem physiologischen pH-Wert stabilisiert und solubilisiert werden. Im Gegensatz dazu werden lipophile Proteine wie rekombinantes beta-Interferon nicht durch die Zugabe von menschlichem Serumalbumin bei pH-Wert 6,8-7,8 solubilisiert.
Hauptproblem bei den bestehenden Verfahren zur Reinigung und Gewinnung lipophiler Proteine ist, daß das Protein nicht in einer genügend reinen Form und in genügend großen Mengen für klinische und therapeutische Zwecke hergestellt wird und weiter, daß die so erhaltenen Proteinpräparationen, besonders jene, die durch gentechnologische Verfahren hergestellt werden, toxische Restmengen von Chemikalien aufweisen, wie SDS und andere grenzflächenaktive Mittel oder Präzipitationsprodukte, die bei der Extraktion und den Reinigungsschritten verwendet werden. Deshalb sind diese Präparationen nicht für klinische Studien annehmbar, mit denen der Umfang der therapeutischen Verwendung und die Anwendungen dieser Proteine bestimmt wird. Es wäre deshalb wünschenswert, ein verfügbares Verfahren für die Gewinnung eines lipophilen Proteins in genügend großen Mengen und ohne toxische Mengen von SDS für klinische und therapeutische Anwendungen zur Verfügung zu haben.
EP 158,487, veröffentlicht am 15. Oktober 1985, offenbart ein Interleukin-2-Mittel, das menschliches Serumalbumin, eine reduzierende Verbindung oder eine Kombination davon umfaßt, und das als eine Lösung auf einen pH-Wert von 3 bis 6 eingestellt wird.
EP-A-0089245 beschreibt ein Verfahren zur Stabilisierung von β-Interferon durch Dialyse einer gereinigten β-Interferonlösung aus menschlichen Zellen gegen einen Acetatpuffer bei pH-Wert 3,5 und danach das Mischen der Lösung mit Polyvinylpyrrolidon als Stabilisierungsmittel.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Bereitstellung pharmazeutisch verträglicher Proben von rekombinantem β-Interferon, mit verhältnismäßig hoher Reinheit, idealerweise in genügend großen Mengen, für klinische und therapeutische Anwendungen.
Weiterhin ermöglicht die vorliegenden Erfindung die Bereitstellung von rekombinanten β-Interferon-Präparationen, die im wesentlichen frei sind von SDS, zum Beispiel in denen SDS in einer Menge von weniger als etwa 10 ppm vorliegt, idealerweise ohne Verlust ihrer biologischen Aktivität, oder in Mengen die therapeutisch verträglich sind.
US-Patent 4,462,940 beschreibt ein verbessertes Verfahren zur Herstellung, Gewinnung und Reinigung eines lipophilen Proteins, wie menschliches rekombinantes β-Interferon, das die Solubilisierung des Proteins in einem wäßrigen Medium mit einem geeigneten Solubilisierungsmittel umfaßt, die Extraktion des solubilisierten Proteins mit einem aliphatischen Alkohol, Präzipitation des Proteins aus der Alkoholphase mit einem wäßrigen Puffer und Diafiltration des Proteins bei einem pH-Wert von etwa 10,5 bis 12,5, vorzugsweise von etwa 12, gegen Wasser mit einem pH-Wert von etwa 10,5 bis 12,5, vorzugsweise etwa 12, oder gegen Gemische von Wasser und aliphatischen Alkoholen, vorzugsweise Ethanol und Glycerin, mit einem pH-Wert von etwa 10,5 bis 12,5, vorzugsweise etwa 12, um SDS im wesentlichen zu entfernen oder seine Konzentration auf therapeutisch verträgliche Mengen zu reduzieren. Die Proteinprobe wird gegebenenfalls vor der Diafiltration durch herkömmliche Verfahren, wie Chromatographie, gereinigt.
Eine bevorzugte Ausführungsform des vorstehenden Verfahrens umfaßt die Gewinnung bakteriell hergestellten menschlichen β-Interferons durch Aufbrechen der Bakterienzellen, Solubilisierung des Interferons mit einem aliphatischen Alkohol mit einer Kettenlänge von 2-6, vorzugsweise von 4-6 Kohlenstoffatomen, Präzipitieren des Interferons aus der Alkoholphase, weitere Reinigung des Interferons durch herkömmliche Verfahren, vorzugsweise durch Gelfiltrations-Chromatographie, und Diafiltration der Interferon-Fraktion bei einem pH-Wert von etwa 10,5 bis 12,5, vorzugsweise bei einem pH-Wert von etwa 11, gegen reines Wasser oder Gemischen aus Wasser und aliphatischen Alkoholen, vorzugsweise Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol, Glycerin und ähnlichen, ebenfalls auf einen pH-Wert von etwa 10,5 bis 12,5, vorzugsweise etwa 11, eingestellt.
Die vorliegende Erfindung stellt ein stabiles Arzneimittel bereit, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines biologisch aktiven rekombinanten β-HIFNs, gelöst in einem nicht-toxischen, inerten, therapeutisch verträglichen Trägermedium auf Wasserbasis bei einem pH-Wert von 2 bis 4, und ein Stabilisierungsmittel, ausgewählt aus menschlichem Serumalbumin, menschlichen Plasmaproteinfraktionen, Mannit, Sorbit, Glycerin, Dextrose oder einem Gemisch davon.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Zubereiten von rekombinantem beta-Interferon für eine therapeutisch verträgliche Formulierung, erhältlich aus einem zu seiner Produktion transformierten Wirt, wobei die Zellwand des Wirts aufgebrochen und das beta-Interferon in dem aufgebrochenen Material isoliert und gereinigt wird, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Einstellung des pH-Werts des Mediums, in dem das beta- Interferon enthalten ist, auf etwa 2 bis 4,
(b) Zugabe eines Stabilisierungsmittels für das Protein zu dem beta-Interferon-Medium, das vorher auf einen pH-Wert von etwa 2 bis 4 eingestellt wurde; und
(c) Gefriertrocknen des erhaltenen Mittels bei einem pH-Wert von etwa 2 bis 4.
Wurde der pH-Wert einmal auf etwa 2 bis 4 eingestellt, kann er auf einen pH-Bereich von vorzugsweise 6,8-7,8 erhöht werden.
Ferner kann das Verfahren die Zugabe eines nichttoxischen, inerten, therapeutisch verträglichen Trägers auf Wasserbasis zu dem Mittel umfassen.
Fig. 1 zeigt ein Flußdiagramm früher Verfahrensschritte, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, in denen der pH-Wert während der Diafiltration auf einen alkalischen pH-Bereich erhöht wird.
Fig. 2 zeigt eine graphische Darstellung des Prozentsatzes des insgesamt gewonnenen rekombinanten menschlichen β-Interferons und die Reinheit des Produkts während des Präzipitationsschritts als eine Funktion des pH-Werts im Bereich von etwa 4 bis 8.
Fig. 3 ist eine Wiedergabe eines chromatographischen Diagramms, das die Homogenität der, nach drei Durchläufen durch eine Vinylpolymergel-Säule eluierten, rekombinanten menschlichen β-lnterferon-Fraktion veranschaulicht.
Fig. 4 ist eine graphische Darstellung der antviralen Aktivität des rekombinanten menschlichen β-Interferons als eine Funktion des pH-Werts im Bereich von etwa 6 bis 12.
Die Fig. 5a und 5b veranschaulichen aufeinanderfolgend ein Flußdiagramm der Verfahrensschritte der vorliegenden Erfindung, in denen das Protein aus refraktilen Körpern gewonnen und der pH-Wert für die Zugabe des Stabilisierungsmittels auf einen sauren pH-Wert erniedrigt wird.
Fig. 6 veranschaulicht ein Flußdiagramm der Verfahrensschritte der vorliegenden Erfindung, in denen das Protein extrahiert, solubilisiert und der pH-Wert für die Zugabe des Stabilisierungsmittels auf einen sauren pH-Wert erniedrigt wird.
Der hier verwendete Begriff "lipophiles Protein" bezieht sich auf ein Protein, das in einem wäßrigen Medium nicht löslich oder nicht leicht löslich ist bei Raumtemperatur und atmosphärischem Druck als Umgebungsbedingungen, bei einem pH-Wert zwischen etwa 6,5 und 7,8. Beispiele für solche Proteine schließen menschliches rekombinantes β-Interferon und Immuntoxine, hergestellt durch Konjugation einer Cytotoxin- Einheit wie Ricin-A an einen Antikörper gegen einen pathologischen Zustand wie Brustkrebs, ein. Der Begriff "rekombinantes Protein" bezieht sich auf ein Protein, das durch gentechnologische Verfahren hergestellt wird, wobei im allgemeinen DNA in ein geeignetes Expressionsplasmid inseriert wird, das in einen Wirtsorganismus eingeführt wird, der nicht nativ für die DNA ist, die transformiert wird, um das heterologe Protein herzustellen. Wirt kann jeder Organismus sein, der gegenüber der DNA fremd ist, wie Bakterien, Hefe, Viren, Säugetiere, etc. Der Wirt ist vorzugsweise ein Mikroorganismus und besonders bevorzugt ein Bakterium.
Der hier verwendete Begriff "β-HIFN" bezieht sich auf menschliches β-Interferon oder β-Interferon-ähnliche Polypeptide, hergestellt durch gentechnologische Verfahren, deren Aminosäuresequenz gleich oder ähnlich oder im wesentlichen homolog zu der von nicht-glycosyliertem und/oder glycosyliertem nativen β-Interferon ist.
Die genaue chemische Struktur des Proteins hängt von einer Anzahl von Faktoren ab. Sind ionisierbare Amino- und Carboxylgruppen im Molekül vorhanden, kann ein einzelnes Protein als saures oder basisches Salz oder in neutraler Form erhalten werden. Alle Präparationen, die ihre Aktivität behalten, wenn sie sich in geeigneten Umgebungsbedingungen befinden, sind in die Definition des Proteins eingeschlossen. Die primäre Aminosäuresequenz des Proteins kann durch Derivatisierung unter Verwendung von Zuckereinheiten (Glycosylierung) oder durch andere ergänzende Moleküle, wie Lipide, Phosphat, Acetylgruppen und ähnliche, im allgemeinen durch Konjugation mit Sacchariden, verlängert sein. Bestimmte Formen einer solchen Verlängerung werden durch posttranslationale Processing-Systeme des herstellenden Wirts erreicht, andere Modifikationen können in vitro eingeführt werden. In jedem Fall sind derartige Modifikationen in der Definition des Proteins eingeschlossen, solange die Aktivität des Proteins, wie vorstehend angegeben, nicht zerstört wird. Natürlich wird erwartet, daß solche Modifikationen die Aktivität quantitativ oder qualitativ beeinflussen können, entweder durch Erhöhung oder Verminderung der Proteinaktivität in den verschiedenen Tests.
Ferner können einzelne Aminosäurereste in der Kette durch Oxidation, Reduktion oder eine andere Derivatisierung modifiziert sein und das Protein kann in Fragmente gespalten werden, die Aktivität zeigen. Solche Veränderungen, die die Aktivität nicht zerstören, schließen die Proteinsequenz nicht von der Definition aus.
Schließlich können Modifikationen der Primärstruktur selbst durch Deletion, Addition oder verändertem Einbau der Aminosäuren in die Sequenz während der Translation ohne Zerstörung der Proteinaktivität entstehen. Beispielsweise ist mindestens ein Cysteinrest, der nicht für die biologische Aktivität notwendig ist, im biologisch wirksamen Protein vorhanden, der eine Disulfidbrücke bilden kann; dieser kann entfernt oder durch eine andere Aminosäure ersetzt werden, um Stellen intermolekularer Vernetzung oder falscher intramolekularer Disulfidbrückenbildung zu eliminieren. Solche modifizierten Proteine, bekannt als "Muteine" werden im US-Patent 4,518,584, erteilt am 21. Mai 1985, beschrieben. In einem anderen Beispiel wird eine konservative Aminosäure eines biologisch wirksamen Proteins wie β-IFN für jeden Methioninrest, der empfindlich gegen Chloramin T oder Peroxidoxidation ist, substituiert, wobei zusätzlich nichtempfindliche Methinoninreste nicht substituiert werden. Eine Veränderung der konservativen Aminosäure wird in diesem Zusammenhang definiert als eine Änderung, die die biologische Aktivität nicht ungünstig beeinflußt und neutrale oder unpolare Aminosäuresubstitutionen oder Deletion des Methionins einschließt.
Das erfindungsgemäß verwendete Protein ist ein β-Interferon. Besonders bevorzugt ist ein unglycosyliertes β-HIFN, das durch einen Mikroorganismus hergestellt wird, der mit einem menschlichen β-IFN-Gen oder einer Modifikation des menschlichen β-IFN-Gens transformiert wurde, das ein Protein codiert, das folgende Merkmale aufweist:
(a) Eine Aminosäuresequenz, die mindestens im wesentlichen identisch ist mit der Aminosäuresequenz des nativen menschlichen β-IFNs; und
(b) eine biologische Aktivität, die gemeinsam ist mit nativem menschlichem β-IFN.
Wesentliche Übereinstimmung von Aminosäuresequenzen bedeutet, daß die Sequenzen identisch sind oder sich durch eine oder mehrere Aminosäureveränderungen (Deletionen, Additionen und Substitutionen) unterscheiden, die keine ungünstige funktionelle Ungleichheit zwischen dem synthetischen Protein und dem nativen menschlichen β-IFN verursachen. Beispiele für derartige Proteine sind die im US-Patent 4,518, 584 beschriebenen β-IFN-Proteine. Besonders bevorzugtes β-IFN ist ß-IFNser17, in dem der Cysteinrest an der Aminosäureposition 17 durch einen Serinrest ersetzt ist.
Der hier verwendete Begriff "physiologischer pH-Wert" bezieht sich auf einen pH-Wert, der für Säugetiere pharmazeutisch verträglich ist, zum Beispiel ein pH-Wert von etwa 7,2 bis 7,6.
Der hier verwendete Begriff "Stabilisierungsmittel", das für das lipophile Protein verwendet wird, bezieht sich auf nicht-toxische, nicht-therapeutische, nicht-immunogene Zusammensetzungen, die nicht nur das diafiltrierte Protein vor Denaturierung und Verlust der biologischen Aktivität schützen, sondern auch das lipophile Protein in einem wäßrigen Medium solubilisieren, so daß die pharmazeutische Formulierung eine wäßrige Lösung des diafiltrierten Proteins darstellt, bei einem pH-Wert von 6,8-7,8, bei dem das Protein nicht ausfällt. Solche Stabilisierungsmittel sind auf dem Fachgebiet für ihre solubilisierende Wirkung bekannt. In der vorliegenden Erfindung werden die Stabilisierungsmittel ausgewählt aus den Proteinen menschliches Serumalbumin (HSA), menschliche Plasmaproteinfraktion (PPF) und den Kohlenhydraten Mannit, Sorbit, Glycerin, Dextrose oder einem Gemisch davon.
Der Typ des verwendeten Stabilisierungsmittels und dessen Konzentration hängt im wesentlichen von dem pH-Verfahren, der verwendeten Formulierung und dem Protein ab. Zum Beispiel wird für Formulierungen bei niedrigem pH-Wert, die β-IFNser17 verwenden, PPF bevorzugt. PPF ist im Handel erhältlich und ist aus mindestens 83% Albumin und nicht mehr als 17% Globulinen (α- und β-Globulin) zusammengesetzt; nicht mehr als 1% der Proteine sind gamma-Globuline. Die α- und β-Globuline im Blutplasma dienen mehreren Funktionen; eine davon ist, verhältnismäßig unlösliche Blutbestandteile in einer stabilen wäßrigen Lösung zu halten, einschließlich Cholesterin, fettlöslichen Vitaminen und Hormonen. Stabilisierungsmittel für Kohlenhydrate können nur bei einem pH-Wert von 2-4 in Formulierungen gehalten und gefriergetrocknet werden.
Die Endkonzentration des Stabilisierungsmittels kann im allgemeinen im Bereich von 0,1-10% (w/v) liegen, im wesentlichen abhängig von dem Protein, der Art des Stabilisierungsmittels und dem verwendeten pH-Wert, höhere Konzentrationen werden bei einem niedrigen pH-Wert bevorzugt. Ein Bereich von 0,5 bis 10% (w/v) ist charakteristisch für HSA mit β-IFN und 0,1 bis 5% (w/v) für PPF mit β-IFN.
Viele Verfahren für die Gewinnung lipophiler rekombinanter Proteine, wie bakteriell hergestelltem β-HIFN, verwenden SDS oder ähnliche grenzflächenaktive Mittel für die Solubilisierung, die Isolierung des Proteins aus zellulärem Material und die folgende Säurepräzipitation, um das Protein zu erhalten. Durch weitere Reinigungsverfahren, durchgeführt bei oder nahe dem neutralen pH-Wert, werden die SDS-Mengen in den letzten Proteinpräparationen auf etwa 0,1% reduziert, aber selbst diese Restmengen erwiesen sich in Tierversuchen als toxisch und sind deshalb für therapeutische oder klinische Anwendungen nicht annehmbar. Weiteres Entfernen von SDS durch Diafiltrationstechniken im pH-Bereich 4-8 hat den fast vollständigen Verlust der β-HIFN-Aktivität, infolge von Aggregation und Präzipitation des Proteins, zur Folge. Die während der Diafiltration verlorengegangene biologische Aktivität von β-HIFN kann durch die Zugabe von SDS wieder hergestellt werden.
Für einen, in einem Gefäß gut gemischten, freien oder ungebundenen, gelösten Stoff folgt die Entfernungsrate während der Diafiltration der Kinetik erster Ordnung. Da ungebundenes SDS unterhalb seiner kritischen Micellenkonzentration ein Molekül ist, das klein genug ist, um ungehindert eine 10 000 Dalton-Trennmembran zu passieren, würde man erwarten, daß seine Entfernungsrate der Kinetik erster Ordnung folgt; und wenn dies der Fall wäre, sollte SDS bei einer Anfangskonzentration von etwa 1000 ug/ml nach etwa siebenmaligem Volumenaustausch auf weniger als 1 ug/ml reduziert werden. Es wurde jedoch festgestellt, daß die Entfernung von SDS aus β-HIFN nicht zu diesem theoretischen Modell paßt; dies deutet auf Protein-SDS-Wechselwirkungen hin, die die Kinetik der SDS-Entfernung erheblich beeinflussen und daß die SDS-Entfernung aus diesem gebundenen Zustand im pH-Bereich 4-8 Protein-Protein-Wechselwirkungen fördert, was Aggregation oder Präzipitation des Proteins zur Folge hat. Höhere oder niedrigere pH-Bereiche für die SDS-Entfernung wären nicht wünschenswert, da von einigen Proteinen bekannt ist, daß sie bei einem höheren oder niedrigeren pH-Wert denaturiert werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung jedoch führt die Erniedrigung des pH-Werts durch Zugabe von Säure nach der Entfernung von SDS durch Diafiltration bei niedriger Ionenstärke oder durch Entsalzen zur Solubilisierung des Proteins und stellt im wesentlichen seine biologische Aktivität in der Formulierung wieder her.
Auf diese Weise löst die vorliegende Erfindung das Problem der Aggregation, Präzipitation und des Verlusts der Proteinaktivität von rekombinantem β-HIFN durch die Entfernung von SDS.
Die beanspruchte Lösung des Problems schließt zu Beginn die Einstellung des pH-Werts des gereinigten Proteinpools auf etwa 2 bis 4 ein, Zugabe des Stabilisierungsmittels, das zuvor auf einen pH-Wert von 2 bis 4 eingestellt wurde, gegebenenfalls Inkubation des Gemisches und Erhöhung seines pH-Werts auf 6,8 bis 7,8. Die Inkubationszeit hängt hauptsächlich von der Art des Proteins, der Art des Stabilisierungsmittels, genauem pH-Wert und den Konzentrationen des Proteins und des Stabilisierungsmittels ab; und liegt typischerweise zwischen 0 bis 100 Minuten, vorzugsweise zwischen 10 bis 100 Minuten, stärker bevorzugt zwischen 15 bis 60 Minuten und besonders bevorzugt zwischen 15 bis 45 Minuten.
In einer anderen, weniger bevorzugten Form der beanspruchten Lösung des Problems ist der pH-Wert niedrig, das Stabilisierungsmittel und der Proteinpool werden miteinander vermischt, der pH-Wert des Gemisches wird auf 2 bis 4 eingestellt und dann stufenweise oder auf einmal auf 6,8 bis 7,8 erhöht.
Der Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Verfahren für die Gewinnung von lipophilem rekombinantem β-HIFN von verhältnismäßig hoher Reinheit, dessen Gehalt an SDS unter den toxischen Mengen von SDS liegt und das in therapeutisch verträgliche Formulierungen, in einem entsprechenden wäßrigen Trägermedium, zubereitet werden kann, und β-HIFN-Zusammensetzungen, in denen SDS in Mengen von weniger als 10 ppm vorliegt, meistens im Bereich von 2 bis 6 ppm.
Für die Ausführung der vorliegenden Erfindung sind unter den Mikroorganismen Bakterien die bevorzugten Wirte, E. coli wird besonders bevorzugt.
Im allgemeinen sind Proteine im stark alkalischen Bereich empfindlich gegenüber Denaturierung, Hydrolyse der Peptidbindung, Hydrolyse einzelner Aminosäuren, β-Eliminierung, Racemierung, Bildung von unterschiedlichen Aminosäuren und ähnlichen Reaktionen; aber bei β-HIFN werden keine der vorstehend aufgezählten Abbaureaktionen festgestellt. Wird andererseits das Protein bei einem pH-Wert von etwa 11 diafiltriert, ist das so erhaltene β-HIFN rein und homogen und zeigt eine hohe spezifische Aktivität, ähnlich der von nativem β-HIFN.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die aufgebrochenen Zellen behandelt, um das β-HIFN-Protein zu isolieren und zu reinigen, danach werden die folgenden Schritte durchgeführt:
(r) Entsalzen des Proteins durch G25-Chromatographie bei einem pH-Wert von 9,2 bis 11;
(s) Einstellung des pH-Werts des entsalzten Pools auf etwa 3,5;
(t) Einstellung des pH-Werts einer Lösung von menschlichem Serumalbumin oder Plasmaproteinfraktion auf 3,5;
(u) Zugabe des menschlichen Serumalbumins oder der Plasmafraktion zu dem entsalzten Pool und Inkubation für 15 bis 45 Minuten;
(v) Gefriertrocknen der Proteinprobe, wenn gewünscht; und
(w) Zubereiten der gefriergetrockneten Proteinprobe, wenn gewünscht.
In einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die aufgebrochenen Zellen behandelt, um das β-HIFN-Protein zu isolieren und zu reinigen, danach werden die folgenden Schritte durchgeführt:
(r) Entsalzen des Proteins durch G25-Chromatographie bei einem pH-Wert von 9,2 bis 11;
(s) Zugabe von menschlichem Serumalbumin oder Plasmafraktion zu dem entsalzten Pool, um ein Gemisch zu bilden;
(t) Erniedrigung des pH-Werts des Gemisches auf 3 bis 4;
(u) Inkubation des Gemisches für 15 bis 45 Minuten;
(v) Gefriertrocknen der Proteinprobe, wenn gewünscht; und
(w) Zubereiten der gefriergetrockneten Proteinprobe, wenn erwünscht.
Das β-HIFN wird vorzugsweise oxidiert, so daß seine Cysteinreste verknüpft werden um Cystine zu bilden, wie im US-Patent 4,530,787 von Shaked et al. beschrieben, das o-Iodosobenzoesäure verwendet oder im US-Patent 4,572,798 von Koths et al., mit dem Titel: "Method For Promoting Disulfide Bond Formation in Recombinant Proteins", das Kupferchlorid verwendet.
Das genaue Verfahren zur Gewinnung des Proteins folgt.
Die transformierten Mikroorganismen werden in einem geeigneten Wachstumsmedium gezüchtet, üblicherweise bis zu einer optischen Dichte (OD) von mindestens etwa 10 bei 680 nm und vorzugsweise zwischen etwa 50 und 100 bei 680 nm. Die Zusammensetzung des Wachstumsmediums wird von dem einzelnen beteiligten Mikroorganismus abhängen. Das wäßrige Wachstumsmedium enthält Verbindungen, die die Ernährungsbedürfnisse des gewählten Mikroorganismus erfüllen. Das Wachstumsmedium wird normalerweise assimilierbare Quellen, wie Kohlenstoff und Stickstoff, enthalten, Energiequellen, Magnesium-, Kalium- und Natriumionen und gegebenenfalls Aminosäuren, Purin- und Pyrimidinbasen (Review of Medical Microbiology, Lange Medical Publications, 14th Ed. (1980), 80-85). Wachstumsmedien für E. coli. sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Abhängig von dem in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten einzelnen Solubilisierungsmittel kann es wünschenswert sein, die Menge der Substanzen im Wachstumsmedium zu verringern, die die Löslichkeit des Solubilisierungsmittels in Wasser herabsetzen können. Zum Beispiel beeinflussen Kaliumionen die Löslichkeit von SDS und sollten deshalb bei einem Minimum gehalten werden, wenn in dem Verfahren SDS als Solubilisierungsmittel verwendet wird, oder durch Diafiltration nach dem Konzentrierungsschritt entfernt werden.
Hat die Kultur die gewünschte Zelldichte erreicht, werden die Zellen gegebenenfalls durch Erhitzen oder Zugabe eines cytotoxischen Mittels zum Medium, wie Chloroform oder Toluol, das nach dem Abtöten der Zellen einfach entfernt werden kann, abgetötet oder inaktiviert. Die Zellen werden danach gegebenenfalls durch Kreuzstromfiltration, Zentrifugation oder andere übliche Verfahren auf etwa 20 bis 150 mg/ml konzentriert, vorzugsweise auf 80 bis 100 mg/ml (OD 40 bis 300, vorzugsweise 160 bis 200, bei 680 nm).
Nach dem Konzentrierungsschritt werden die Zellmembranen der Mikroorganismen aufgebrochen, um die Solubilisierung der einzelnen Substanz in dem Konzentrat zu erleichtern. Proteintests für den Nachweis der biologischen Aktivität zeigen, daß ein großer Teil des Proteins mit der Zellmembran assoziiert ist (in der Zellmembran enthalten oder daran gebunden). Daher verstärkt das Aufbrechen der Zellmembran den Kontakt des Solubilisierungsmittels mit den Zellmembranen und erhöht dadurch die Rate, mit der das mit der Zellmembran assoziierte Interferon in Lösung geht. Für diesen Schritt des Verfahrens können übliche Verfahren zum Aufbrechen der Zellen, wie Homogenisierung, Beschallung oder periodischer Druck, angewendet werden. Ein bevorzugtes Verfahren verwendet eine Kugelmühle ("bead mill") oder einen Druckhomogenisator. Je nach Fall kann entweder vor oder nach dem Aufbrechen der pH-Wert gegebenenfalls auf einen Wert eingestellt werden, der die Auflösung des Solubilisierungsmittels und der einzelnen Substanz in dem Konzentrat oder in dem aufgebrochenen Material erleichtert. Der pH-Wert kann durch Zugabe geeigneter Puffer oder NaOH eingestellt werden. In den meisten Beispielen wird ein pH-Wert im Bereich von etwa 7 bis etwa 8 bevorzugt.
Verschiedene Verfahren können angewendet werden, um die aufgebrochenen Zellen zu behandeln. In einem Verfahren kann nach dem Aufbrechen der Zellen die einzelne Substanz aus der flüssigen Phase des aufgebrochenen Materials abgetrennt und in einem Medium, das für die Solubilisierung auf den optimalen pH-Wert gepuffert wurde, resuspendiert werden. Die Proteinkonzentration der Zellsuspension liegt nach der Solubilisierung im Bereich von etwa 2 bis etwa 15 mg/ml, vorzugsweise bei 6 bis 8 mg/ml.
Die Solubilisierung des einzelnen zellulären Materials, einschließlich des lipophilen rekombinanten Proteins, kann gleichzeitig mit dem Aufbrechen oder nach dem Aufbrechen durchgeführt werden. Sie wird vorzugsweise als Trennschritt nach dem Aufbrechen durchgeführt. Die Solubilisierung wird vorzugsweise bis zur Vollständigkeit durchgeführt, das bedeutet, daß im wesentlichen alle einzelnen Substanzen (zum Beispiel Proteine, Lipide, Nucleinsäuren und Phospholipide) aus dem aufgebrochenen Material in dem wäßrigen Medium gelöst sind. Eine im wesentlichen vollständige Auflösung der einzelnen Substanzen wird durch Zugabe eines entsprechenden Solubilisierungsmittels zu der wäßrigen Suspension erzielt. In dieser Erfindung können grenzflächenaktive Mittel (Detergenzien), die ein geeignetes hydrophob-hydrophil- Gleichgewicht aufweisen, um das Protein zu solubilisieren, und die einen Komplex mit dem Protein bilden können, der in die organische Phase extrahiert werden kann, verwendet werden. Es können starke natürliche oder synthetische, anionische grenzflächenaktive Mittel, wie Alkalimetallsalze von Fettsäuren oder Alkalimetallalkylsulfate, verwendet werden.
Derartige Mittel enthalten meistens 10 bis 24 Kohlenstoffatome. SDS und Natriumlaurat sind jeweils bevorzugte Solubilisierungsmittel. Beispiele für andere Solubilisierungsmittel, die in dem Verfahren verwendet werden können, schließen Natriumdodecylsulfonat, Natriumdecylsulfat, Natriumtetradecylsulfat, Natriumtridecylsulfonat, Natriummyristat, Natriumcaproylat und Natriumdodecyl-N-sarcosinat ein, aber, sie sind nicht darauf beschränkt.
Die bei der Solubilisierung verwendete Menge des Solubilisierungsmittels hängt von dem einzelnen Mittel und der Menge des zu solubilisierenden Proteins ab. In den meisten Beispielen genügen Gewichtsverhältnisse von Solubilisierungsmittel zu Protein im Bereich von etwa 1 : 1 bis 10 : 1. Wird SDS verwendet, wird ein Verhältnis von SDS zu Protein von etwa 1 : 1 bis etwa 5 : 1, vorzugsweise etwa 3 : 1, verwendet. Im allgemeinen werden für die Solubilisierung Temperaturen im Bereich von 15ºC bis 60ºC verwendet. Vermischen kann angewendet werden, um den Kontakt zwischen Lösung und der einzelnen Substanz zu erhöhen, so daß die Zeit zur Auflösung der zellulären Substanz herabgesetzt wird. Die Solubilisierung ist beendet, wenn die Lösung im wesentlichen klar ist. Optische Dichten von etwa 4,0 bis 8,0 bei 280 nm sind für den Endpunkt des Solubilisierungsverfahrens charakteristisch.
Nach der Solubilisierung wird die Ionenstärke der Lösung gegebenenfalls auf einen Wert eingestellt, bei dem die Lösung und das organische Extraktionsmittel im wesentlichen nicht mischbar sind. Die Ionenstärke liegt im Bereich von etwa 0,05 bis 0,15. Anorganische Salze, einschließlich NaCl und/oder anderer, werden für diesen Zweck der Lösung hinzugesetzt. Derartige Ionenstärken ermöglichen eine Phasentrennung nach der Extraktion. Die in dem Verfahren verwendeten Extraktionsmittel sind Alkohole, wie 2-Butanol, 2-Methyl-2- butanol oder Gemische davon. Die Gemische enthalten dann vorzugsweise weniger als 50 Vol.% 2-Methyl-2-butanol. 2-Butanol ist das bevorzugte Extraktionsmittel. Die Fähigkeit dieser Alkohole, das lipophile Protein aus der Solubilisat zu extrahieren, ist spezifisch. Das Extraktionsmittel wird normalerweise mit der wäßrigen Lösung des Proteins im Volumenverhältnis von etwa 0,8 : 1 bis etwa 3 : 1, vorzugsweise etwa 1 : 1 (Extraktionsmittel : wäßrige Lösung), vermischt. Die Extraktion kann mit üblichen Batch- oder kontinuierlichen Flüssig-Flüssig-Extraktionsverfahren und -geräten durchgeführt werden. Die Extraktion wird normalerweise bei etwa 20ºC bis 100ºC durchgeführt, mit Kontaktzeiten im Bereich von etwa einer Minute bis zu einer Stunde. Die optimale Kontaktzeit ist abhängig von der einzelnen Kombination von Solubilisierungsmittel und Extraktionsmittel. Wird SDS verwendet, können kürzere Zeiten innerhalb des vorstehenden Bereichs verwendet werden. Wird Natriumlaurat verwendet, müssen längere Zeiten innerhalb des Bereichs verwendet werden. Der pH-Wert des Extraktionsgemisches liegt etwa zwischen 6 und 9; wird SDS verwendet, wird ein pH-Wert von etwa 7,5 bevorzugt und bei Natriumlaurat ein pH-Wert von etwa 8,5.
Nach Abschluß der Extraktion werden die wäßrige Phase und die Extraktionsmittelphase voneinander getrennt und das Protein wird aus der Extraktionsmittelphase isoliert. Das einzelne Isolierungsverfahren hängt von dem verwendeten Solubilisierungsmittel und dem gewünschten Reinheitsgrad des Endproduktes ab. Verschiedene Isolierungstechniken, wie Präzipitation, Molekularsieb-Chromatographie, Affinitätschromatographie und Elektrophorese, können verwendet werden. In Beispielen, in denen SDS verwendet wird, wird das gewünschte lipophile Protein zusammen mit anderen Proteinen aus dem Extraktionsmittel präzipitiert, indem die Extraktionsmittellösung mit einem wäßrigen Puffer im Volumenverhältnis von etwa 2,0 : 1 bis etwa 5 : 1, vorzugsweise etwa 3 : 1, vermischt und der pH-Wert auf einen Bereich von etwa 5 bis 7 herabgesetzt wird. Wie in Fig. 2 dargestellt, nimmt der Gewinn von β-HIFN im pH-Bereich 4 bis 8 bei Erhöhung des pH-Werts ab, mit einen merklichen Verlust von mehr als 60% bei einem pH-Wert von etwa 8. Die Abtrennung des Präzipitats aus dem Überstand und die Entfernung des verbliebenen Extraktionsmittels aus dem Präzipitat liefert ein Produkt, das zu mehr als etwa 90% aus reinem Protein besteht, wenn der pH-Wert des Präzipitationsschritts höher als 5,5 ist. Dieses Produkt enthält auch geringfügige Mengen von Nucleinsäuren (< 1 bis 2 Gew.%) und SDS (< 1% ).
Nach weiterer Reinigung durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, einschließlich Chromatographie, aber nicht darauf beschränkt, kann in einer Ausführungsform der Erfindung SDS durch Diafiltration bei einem pH-Wert von etwa 10,5 bis 12,5, vorzugsweise etwa 12, entfernt werden. Der zweite Reinigungsschritt kann frei gewählt werden. Er ist nicht für die Entfernung von SDS durch Diafiltration erforderlich. Wird Natriumlaurat als Solubilisierungsmittel verwendet, fällt es, zusammen mit dem Protein, bei Erniedrigung des pH-Werts aus dem Extraktionsmittel aus. Natriumlaurat wird aus dem Protein durch die Verwendung von organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Methanol und ähnlichen, extrahiert. Vor der Diafiltration kann das Protein gegebenenfalls mit entsprechenden Reduktionsmitteln reduziert werden. Für diesen Zweck kann Mercaptoethanol, Glutathion, Cystein und Dithiothreit (DTT) verwendet werden, wobei DTT besonders bevorzugt wird.
Ein anderes Verfahren zur Behandlung der aufgebrochenen Zellen wird in den Fig. 5a und 5b dargestellt; diese skizzieren ein Verfahren zur Gewinnung von refraktilen Körpern, die heterologe Proteine enthalten, aus mikrobiellen Wirten. In diesem Verfahren wird das Protein aus den refraktilen Körpern extrahiert und mit einem Denaturierungsmittel wie SDS solubilisiert. In Übereinstimmung mit der Erfindung wird das SDS später durch eine entsalzende Säule entfernt und der pH-Wert des Eluats auf 2 bis 4 eingestellt; das Stabilisierungsmittel wird getrennt davon auf einen pH-Wert von 2 bis 4 eingestellt und dem Eluat zugegeben; das Gemisch wird gegebenenfalls im allgemeinen etwa 10 bis 100 Minuten inkubiert, abhängig von den vorstehend angegebenen Faktoren, und der pH-Wert wird zwischen 6,8 und 7,8 eingestellt.
In einem weiteren Verfahren, dargestellt in Fig. 6, wird das aufgebrochene Material mit einem chaotropen Mittel extrahiert; das Protein wird solubilisiert und reduziert und das reduzierte Protein wird isoliert, oxidiert, gereinigt und wiedergewonnen. Die Formulierung in Fig. 6 wird unter Verwendung eines Einstellungsverfahren für einen niedrigen pH-Wert, zusammen mit einem Inkubationszeitraum, erhalten.
Das für die therapeutische und klinische Anwendung der Formulierung verwendete Trägermedium kann jeder nichttoxische, inerte Träger auf Wasserbasis sein, der im allgemeinen dazu verwendet wird, um Arzneimittel zur Verabreichung an Tiere und Menschen zu formulieren. Der Träger wird so ausgewählt, daß er die biologische Aktivität des lipophilen Proteins nicht beeinträchtigt.
Beispiele solcher Träger schließen destilliertes Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Ringer-Lösung, Dextroselösung und Hank-Lösung ein. Die gleichen Träger können verwendet werden, um das gefriergetrocknete, lipophile Protein zuzubereiten.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, die die Erfindung veranschaulichen sollen, beschrieben. Wenn nicht anders spezifiziert, sind in den Beispielen alle Bestandteile und Prozentsätze bei festen Stoffen in Gewicht und bei flüssigen Stoffen in Volumen angegeben; alle Temperaturen werden in Grad Celsius angegeben.

Beispiel

IFN-βser17 ist ein mikrobiell hergestelltes Mutein von β-IFN, in dem der Cysteinrest an der Aminosäureposition 17 durch einen Serinrest ersetzt ist. IFN-βser17 weist zwei verbliebene Cysteinreste an der Position 31 und der Position 141 auf. Im nativen β-IFN treten die Cysteine an den Positionen 31 und 141 in Wechselwirkung, wobei sie eine Disulfidbrücke bilden. Der in diesem Beispiel verwendete, für die Produktion von β-IFN gentechnisch hergestellte E. coli- Stamm wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, am 18. November 1983 hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer 39,517.
Der vorstehend erwähnte gentechnische hergestellte E. coli-Stamm wurde in dem folgenden Medium gezüchtet:
Bestandteil Ungefähre Anfangskonzentration
Na&sub3;-Citrat·2H&sub2;O 3 mM
H&sub2;PO&sub4; 30 mM
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 74 mM
MgSO&sub4;·H&sub2;O 3 mM
MnSO&sub4;·H&sub2;O 46 uM
ZnSO&sub4;·7H&sub2;O 46 uM
CuSO&sub4;·5H&sub2;O 1-2 uM
L-Tryptophan 350 uM
FeSO&sub4;·7H&sub2;O 74 uM
Thiamin·HCl 0.002% (w/v)
Glucose 0.5% (w/v)
Bei Bedarf wurde eine 25%ige Lösung von "Dow Corning"- Antischaummittel B, eine 50%ige Glucoselösung und 5N KOH zugesetzt.
Die Temperatur wurde bei 37ºC ± 1ºC, der pH-Wert mit NaOH bei 6,5 ± 0,1 und der gelöste Sauerstoff bei 30% (w/w) Luftsättigung gehalten. Messungen der optischen Dichte und der Restglucosemenge wurden nach 14 Stunden und danach in ungefähr einstündigen Intervallen vorgenommen. Die Ernte erfolgte, wenn der Glucoseverbrauch 40 ± 6 g/l (OD bei 680 nm = 10 bis 11) erreichte.
Das geerntete Material wurde durch Zirkulation durch einen mikroporösen Kreuzstromfilter unter Druck auf ungefähr das Dreifache konzentriert. Die konzentrierten Zellen wurden gegen deionisiertes Wasser diafiltriert) bis das geerntete Material 4- bis 5fach konzentriert war. Die Zellen wurden dann mit einem Manton-Gaulin-Homogenisator bei 4,1-5,5·10&sup4; kpa (0,6-0,8 psi) aufgebrochen. Nach dem ersten Durchgang wurde Natriumdodecylsulfat-(SDS)-Natriumphosphatpuffer bis zu einer Endkonzentration von 2% (w/v) SDS und 0,08 M Natriumphosphat zugegeben und die Solubilisierung wurde eine Stunde fortgesetzt. Festes Dithiothreit (DTT) wurde dann bis zu einer Endkonzentration von 50 mM zugegeben und das Homogenat für 10 Minuten auf 90ºC ± 5ºC erhitzt. Die so erhaltene Zellsuspension wurde mit 2-Butanol in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 (2-Butanol : Suspension) in einem statischen Mixer extrahiert. Das Gemisch wurde dann zentrifugiert und die 2-Butanol-reiche Phase abgenommen.
Die 2-Butanol-reiche Phase wurde mit 2,5 Volumina einer 0,1%igen (w/v) Lösung von SDS in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gemischt. Festes DTT wurde bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben. Der pH-Wert des Gemisches wurde mit Eisessig auf 6,2 ± 0,1 eingestellt und dieses Gemisch wurde zentrifugiert. Die so erhaltene Paste wurde isoliert und in einem Gemisch aus PBS und 10%iger (w/v) SDS- Lösung, dessen pH-Wert mit 1N NaOH auf 8,5 ± 0,1 eingestellt wurde, resuspendiert. Festes DTT wurde bis zu einer Endkonzentration von 100 mM zugegeben und die Suspension 10 Minuten auf 90ºC ± 5ºC erhitzt. Die Suspension wurde dann auf etwa 25ºC abgekühlt, der pH-Wert mit Eisessig auf 5,5 ± 0,1 eingestellt und die Suspension filtriert.
Die Suspension wurde dann mit einem Puffer, bestehend aus 1% SDS, 50 mM Natriumacetat und 1 mM EDTA, pH 5,5, auf eine Sephacryl-S-200-Vorsäule aufgetragen. Die Fraktionen, die die höchsten Interferon-Aktivitäten enthielten, wurden gepoolt und durch Ultrafiltration mit einer Abtrennung von 10 kD Molekulargewicht konzentriert.
Das Protein wurde unter Anwendung des vorstehenden Verfahrens von Shaked et al. oxidiert, um Sulfhydrylbindungen zu erzeugen. Eine 1 mM o-Iodosobenzoesäure-Lösung wurde durch Vermischen der Säure mit Wasser, 5 Minuten Beschallung und Rühren des Gemisches hergestellt; durch langsame Zugabe von 2%igem NaOH wurde ein pH-Wert von 8,2 ± 0,2 erhalten (zusätzliche Beschallung kann eine Alternative zur Zugabe der Base sein).
Ein Reaktionspuffer-Medium wurde durch Auflösen von Na&sub4;P&sub2;O&sub7;·10H&sub2;O in Wasser in einer Konzentration von 2 mM hergestellt. Der pH-Wert dieser Lösung wurde durch Zugabe von 10%iger Essigsäure auf 9,0 eingestellt, der Lösung wurden 0,1% SDS, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 15 uM der o-Iodosobenzoesäure zugegeben.
Das Puffermedium wurde in ein mit einem Magnetrührer und einer auf pH 9 eingestellten pH-Elektrode ausgestattetem Reaktionsgefäß gegeben. Die β-IFNser17-Präparation und die o-Iodosobenzoesäurelösungen wurden dem Reaktionsgemisch aus Vorratsbehältern, unter Verwendung von peristaltischen Pumpen zugegeben, die so eingestellt wurden, daß sie äquivalente Molverhältnisse des IFNs und des Oxidationsmittel einleiten. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wurde bei 9,0 gehalten, gegebenenfalls durch Zugabe von 0,25 M NaOH (5 ml/Std.) über eine peristaltische Pumpe. Die β-IFN-Lösung (5 mg/ml in 50 mM Acetatpuffer, pH 5,5) wurde mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 2 ml/Std. (7,0 Mikromol/Std.) für etwa 5 Stunden zugegeben, o-Iodosobenzoesäure mit 7 ml/Std. (7 Mikromol/Std.) über den gleichen Zeitraum. Die Zugabe der Säurelösung wurde danach fortgesetzt, um am Ende einen Überschuß von 10-15 Mikromolar zu erhalten. Der Reaktion folgte Reversphasen-HPLC und die Bestimmung des verbliebenen Thiolgehalts des β-IFNs mit dem Ellman-Test. Nach 6,5 Stunden wurde die Reaktion durch Zugabe von 10%iger Essigsäure zu dem Reaktionsgemisch, bis zu einem pH-Wert von 5,5, beendet.
Das Produkt wurde dann unter Verwendung eines Puffers, bestehend aus 0,1% SDS, 1 mM EDTA und 50 mM Natriumacetat, pH 5,5, auf eine Sephacryl-200-Säule geladen. Der monomere Peak aus dieser Säule wurde gepoolt und unter Verwendung eines Puffers, bestehend aus 0,1% SDS, 1 mM EDTA und 50 mM Natriumacetat, pH 5,5, auf eine Sephadex G-75-Säule geladen.

I. PPF-Formulierung

Eine Gesamtmenge von 1,3 mg/ml β-IFN aus dem G-75-Pool wurde auf eine mit einem Puffer mit pH 11 äquilibrierte entsalzende G25-Sephadex-Säule geladen. Insgesamt wurden 2,2% Plasmaproteinfraktion (PPF) auf pH 3 eingestellt und zu 5,56 ml des entsalzten β-IFNs, das 0,25 mg/ml β-IFN enthält, zugegeben. PPF wird aus der Cohn-Fraktion-IV&sub1; gewonnen. PPF ist vergleichbar mit HSA, mit dem Unterschied, daß PPF mehr α- und β-Globuline aufweist. Fraktion-VI&sub1; weist den höchsten Gehalt an α- und β-Globulinen auf. Das Gemisch aus β-IFN und PPF wurde etwa 45 Minuten inkubiert und dann auf pH-Wert 7,5 eingestellt.

II. PPF/HSA-Formulierungen

Insgesamt wurden 30 ml des vorstehenden G-75-β-IFN-Pools auf 10,5 ml konzentriert und auf pH-Wert 11 eingestellt. Das Konzentrat wurde auf einer vollständig auf pH 11 äquilibrierten G25-Sephadex-Säule entsalzt. Der entsalzte IFN-Pool wurde in den folgenden Experimenten verwendet:
In jedem Experiment wurden insgesamt 3,33 ml des entsalzten β-IFNs, das 0,25 ml IFN pro ml enthält, verwendet und der pH-Wert jedes Gemisches wurde vor der Inkubation auf 3 und nach der Inkubation auf einen Wert zwischen 7,3 und 7,5 eingestellt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle dargestellt. Stabilisierungsmittel Menge des Stabilisierungsmittels Inkubationszeit (min) Klarheit bei pH-Wert leicht trüb sehr klar
Bei visueller Untersuchung wiesen die PPF-Formulierungen die beste Klarheit auf, gefolgt von 5,0%igem HSA und 2,5%igem HSA. Wurde jede Formulierung gefriergetrocknet und mit Wasser zubereitet, waren zubereitete PPF-Formulierungen klarer als die HSA-Formulierungen. Alle gefriergetrockneten Formulierungen wiesen β-IFN-Aktivität auf.
Bei pH-Wert 3-4 durchgeführte Experimente, ohne Inkubationszeit, zeigten keinen nennenswerten Unterschied zu Experimenten mit Inkubationszeit. Änderungen der PPF-Konzentration ergeben indessen einen deutlichen Unterschied in der Klarheit.
Experimente zur Optimierung der Formulierung bei pH-Wert 3 zeigten, daß die 5%ige HSA-Formulierung deutlich besser war als die 2,5%ige HSA-Formulierung. Auch die Erhöhung der Inkubationszeit von 15 Minuten auf 60 Minuten unterstützt die Solubilisierung. Jedoch erwies sich das 5%ige HSA bei 15 minütiger Inkubation als besser als das 2,5%ige HSA bei 60 minütiger Inkubation.
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß PPF für β-IFN ein besseres Stabilisierungsmittel ist als HSA. Zusätzlich zeigten Tests zur biologischen Aktivität der bei pH-Wert 3 formulierten Proteine, daß das β-IFN biologisch wirksam war.

III. Mannit-Formulierungen bei niedrigem pH-Wert

Stabilisierungsmittel können dazu verwendet werden, rekombinante beta- Interferon-Formulierungen bei einem niedrigen pH-Wert von 2 bis 4 zu stabilisieren, wenn der pH-Wert bei 2 bis 4 gehalten wird und das Gefriertrocknen bei einem pH-Wert von 2 bis 4 erfolgt. Wird der pH-Wert über 4 erhöht, wirken Kohlenhydratstabilisierungsmittel wie Mannit nicht solubilisierend auf das lipophile Protein. Nur Proteinstabilisierungsmittel wie HSA solubilisieren das Protein, wenn der pH-Wert auf einen physiologischen pH-Wert erhöht wird.

Zusammenfassung

Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, wie hierin beschrieben, ergeben eine rekombinante β-HIFN-Präparation von verhältnismäßig hoher Reinheit, mit verbliebenen SDS-Mengen von weniger als etwa 10 ppm, die in therapeutisch verträgliche Arzneimittel, in einem nichttoxischen, inerten, physiologisch verträglichen Trägermedium, für klinische und therapeutische Anwendungen formuliert werden kann. Der Hauptvorteil dieser Erfindung liegt in der Reduktion der SDS-Mengen in der Proteinpräparation (die bei einigen Patienten eine hepatische Toxizität verstärken können) auf etwa 2 bis 20 ppm, vorzugsweise auf weniger als etwa 10 ppm, besonders bevorzugt auf etwa 2 bis 6 ppm, die therapeutisch verträglich sind.

Claims

1. Stabiles Arzneimittel, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines biologisch aktiven rekombinanten β- HIFNs, gelöst in einem nicht-toxischen, inerten, therapeutisch verträglichen, Trägermedium auf Wasserbasis bei einem pH-Wert von 2 bis 4, und ein Stabilisierungsmittel, ausgewählt aus menschlichem Serumalbumin, menschlicher Plasmaproteinfraktion, Mannit, Sorbit, Glycerin, Dextrose oder einem Gemisch davon.

2. Mittel nach Anspruch 1, wobei das Stabilisierungsmittel menschliche Plasmaproteinfraktion ist und in einer Menge von 0,1 bis 5% (w/v) vorliegt oder das Stabilisierungsmittel menschliches Serumalbumin ist und in einem Konzentrationsbereich von etwa 0,5 bis 10% (w/v) vorliegt.

3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, wobei gegebenenfalls vorhandenes Natriumdodecylsulfat in einer Menge von weniger als 10 ppm vorliegt.

4. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das gefriergetrocknet ist.

5. Verfahren zum Zubereiten eines im wesentlichen von grenzflächenaktiven Mitteln freien rekombinanten β- HIFNs, erhältlich aus einem zu seiner Produktion transformierten Wirt für eine therapeutisch verträgliche Formulierung, wobei die Zellwand des Wirts aufgebrochen und das Protein in dem aufgebrochenen Material isoliert und gereinigt wird, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Einstellung des pH-Werts des Mediums, in dem das β- HIFN enthalten ist, auf etwa 2 bis 4,

(b) Zugabe eines Stabilisierungsmittels für das β-HIFN zu dem β-HIFN-Medium, das vorher auf einen pH-Wert von etwa 2 bis 4 eingestellt wurde; und

(c) Gefriertrocknen des erhaltenen Mittels bei einem pH- Wert von etwa 2 bis 4.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Stabilisierungsmittel Mannit ist.

7. Verfahren zum Zubereiten eines im wesentlichen von grenzflächenaktiven Mitteln freien rekombinanten β- HIFNs, erhältlich aus einem zu seiner Produktion transformierten Wirt für eine therapeutisch verträgliche Formulierung, wobei die Zellwand des Wirts aufgebrochen und das Protein in dem aufgebrochenen Material isoliert und gereinigt wird, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Einstellung des pH-Werts des Mediums, in dem das β- HIFN enthalten ist, auf etwa 2 bis 4;

(b) Zugabe eines Proteinstabilisierungsmittels für das β-HIFN-Protein zu dem β-HIFN-Medium, das vorher auf einen pH-Wert von etwa 2 bis 4 eingestellt wurde; und

(c) Erhöhung des pH-Werts des erhaltenen Mittels auf 6,8 bis 7,8.

8. Verfahren zum Zubereiten eines im wesentlichen von grenzflächenaktiven Mitteln freien rekombinanten β- HIFNs, erhältlich aus einem zu seiner Produktion transformierten Wirt für eine therapeutisch verträgliche Formulierung, wobei die Zellwand des Wirts aufgebrochen und das β-HIFN isoliert und gereinigt wird, umfassend:

(a) Kombination des β-HIFNs mit einem Proteinstabilisierungsmittel und Einstellung des pH-Wertes der Kombination auf etwa 2 bis 4; und

(b) Erhöhung des pH-Werts des erhaltenen Mittels auf 6,8 bis 7,8;

wobei das β-HIFN gegebenenfalls direkt vor Schritt (a) bei einem pH-Wert von 9,2 bis 11 durch Chromatographie entsalzt wird.

9. Verfahren zur Stabilisierung eines biologisch wirksamen rekombinanten β-HIFNs, umfassend die Auflösung des β- HIFNs in einem nicht-toxischen, inerten, therapeutisch verträglichen Trägermedium auf Wasserbasis bei einem pH- Wert von 2 bis 4, umfassend ein Stabilisierungsmittel, ausgewählt aus menschlichem Serumalbumin, menschlicher Plasmaproteinfraktion, Mannit, Sorbit, Glycerin, Dextrose oder einem Gemisch davon.

10. Verwendung eines biologisch wirksamen β-HIFNs, das durch ein Verfahren gemäß der Definition in Anspruch 9 stabilisiert worden ist, für die Herstellung eines Medikaments.