JPH11335392A - 可溶性タンパク質の回収方法 - Google Patents
可溶性タンパク質の回収方法Info
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- JPH11335392A JPH11335392A JP10144758A JP14475898A JPH11335392A JP H11335392 A JPH11335392 A JP H11335392A JP 10144758 A JP10144758 A JP 10144758A JP 14475898 A JP14475898 A JP 14475898A JP H11335392 A JPH11335392 A JP H11335392A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
-
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K1/145—Extraction; Separation; Purification by extraction or solubilisation
Abstract
(57)【要約】
【課題】可溶化させたタンパク質を含有する可溶化処理
液から変性剤を除去する際のタンパク質の凝集を抑える
ことにより、回収率がより高い可溶性タンパク質の回収
方法を提供すること、並びにタンパク質の凝集が抑制さ
れた、上記の可溶化処理液からの変性剤の除去方法を提
供すること。 【解決手段】不溶性タンパク質凝集体を変性剤を用いて
可溶化させた可溶化処理液から変性剤を除去して可溶性
タンパク質を回収する方法において、６０〜９９体積％
の濃度の二〜四価の多価アルコールの存在下に変性剤の
除去処理を行い、次いで該除去処理後の処理液を希釈液
で希釈することを特徴とする可溶性タンパク質の回収方
法、並びに不溶性タンパク質凝集体を変性剤を用いて可
溶化させた可溶化処理液から変性剤を除去する方法にお
いて、二〜四価の多価アルコールの存在下に変性剤の除
去処理を行うことを特徴とする変性剤の除去方法。
液から変性剤を除去する際のタンパク質の凝集を抑える
ことにより、回収率がより高い可溶性タンパク質の回収
方法を提供すること、並びにタンパク質の凝集が抑制さ
れた、上記の可溶化処理液からの変性剤の除去方法を提
供すること。 【解決手段】不溶性タンパク質凝集体を変性剤を用いて
可溶化させた可溶化処理液から変性剤を除去して可溶性
タンパク質を回収する方法において、６０〜９９体積％
の濃度の二〜四価の多価アルコールの存在下に変性剤の
除去処理を行い、次いで該除去処理後の処理液を希釈液
で希釈することを特徴とする可溶性タンパク質の回収方
法、並びに不溶性タンパク質凝集体を変性剤を用いて可
溶化させた可溶化処理液から変性剤を除去する方法にお
いて、二〜四価の多価アルコールの存在下に変性剤の除
去処理を行うことを特徴とする変性剤の除去方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は高い回収率を達成で
きる可溶性タンパク質の回収方法に関する。さらに本発
明はタンパク質の回収率の高い変性剤の除去方法に関す
る。
きる可溶性タンパク質の回収方法に関する。さらに本発
明はタンパク質の回収率の高い変性剤の除去方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】組換えＤＮＡ技術により異種遺伝子を細
菌等で大量に発現させた場合、生成するタンパク質が不
溶性の形態（封入体）で得られることがある。また、タ
ンパク質を化学修飾した場合にもタンパク質間で凝集が
起こり、不溶性の凝集体が生成することがある。このよ
うな不溶性の形態のタンパク質からタンパク質を精製す
る場合、変性剤を用いて封入体や凝集体を一旦可溶化さ
せる工程を経た後、透析により変性剤を除去してタンパ
ク質溶液を得る工程を経る方法が一般的に行われてい
る。
菌等で大量に発現させた場合、生成するタンパク質が不
溶性の形態（封入体）で得られることがある。また、タ
ンパク質を化学修飾した場合にもタンパク質間で凝集が
起こり、不溶性の凝集体が生成することがある。このよ
うな不溶性の形態のタンパク質からタンパク質を精製す
る場合、変性剤を用いて封入体や凝集体を一旦可溶化さ
せる工程を経た後、透析により変性剤を除去してタンパ
ク質溶液を得る工程を経る方法が一般的に行われてい
る。
【０００３】しかしながら、このような方法では、透析
中に大部分の目的タンパク質が再び凝集し、不溶性の凝
集体になることがあった。このような透析中の凝集体の
形成は可溶性タンパク質の回収率を低下させる要因とな
り得るため、タンパク質の凝集を抑える方法が望まれて
いた。
中に大部分の目的タンパク質が再び凝集し、不溶性の凝
集体になることがあった。このような透析中の凝集体の
形成は可溶性タンパク質の回収率を低下させる要因とな
り得るため、タンパク質の凝集を抑える方法が望まれて
いた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、可溶化させたタンパク質を含有する可溶化処理
液から変性剤を除去する際のタンパク質の凝集を抑える
ことにより、回収率がより高い可溶性タンパク質の回収
方法を提供することにある。さらに本発明の目的は、タ
ンパク質の凝集が抑制された、上記の可溶化処理液から
の変性剤の除去方法を提供することにある。
目的は、可溶化させたタンパク質を含有する可溶化処理
液から変性剤を除去する際のタンパク質の凝集を抑える
ことにより、回収率がより高い可溶性タンパク質の回収
方法を提供することにある。さらに本発明の目的は、タ
ンパク質の凝集が抑制された、上記の可溶化処理液から
の変性剤の除去方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】即ち、本発明の要旨は、
〔１〕 不溶性タンパク質凝集体を変性剤を用いて可溶
化させた可溶化処理液から変性剤を除去して可溶性タン
パク質を回収する方法において、６０〜９９体積％の濃
度の二〜四価の多価アルコールの存在下に変性剤の除去
処理を行い、次いで該除去処理後の処理液を希釈液で希
釈することを特徴とする可溶性タンパク質の回収方法、
〔２〕 不溶性タンパク質凝集体を変性剤を用いて可溶
化させた可溶化処理液から変性剤を除去する方法におい
て、６０〜９９体積％の濃度の二〜四価の多価アルコー
ルの存在下に変性剤の除去処理を行うことを特徴とする
変性剤の除去方法、に関するものである。
〔１〕 不溶性タンパク質凝集体を変性剤を用いて可溶
化させた可溶化処理液から変性剤を除去して可溶性タン
パク質を回収する方法において、６０〜９９体積％の濃
度の二〜四価の多価アルコールの存在下に変性剤の除去
処理を行い、次いで該除去処理後の処理液を希釈液で希
釈することを特徴とする可溶性タンパク質の回収方法、
〔２〕 不溶性タンパク質凝集体を変性剤を用いて可溶
化させた可溶化処理液から変性剤を除去する方法におい
て、６０〜９９体積％の濃度の二〜四価の多価アルコー
ルの存在下に変性剤の除去処理を行うことを特徴とする
変性剤の除去方法、に関するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明において可溶化の対象とな
る「不溶性タンパク質凝集体」とは、例えば、インタク
トのタンパク質、遺伝子操作により得られるタンパク
質、又は化学的に修飾されたタンパク質等の封入体、及
びこれらタンパク質等が凝集してなる凝集体等を言う。
る「不溶性タンパク質凝集体」とは、例えば、インタク
トのタンパク質、遺伝子操作により得られるタンパク
質、又は化学的に修飾されたタンパク質等の封入体、及
びこれらタンパク質等が凝集してなる凝集体等を言う。
【０００７】また、本発明で用いる変性剤としては、従
来よりタンパク質の可溶化に使用されている公知の変性
剤を制限されることなく使用することができる。例え
ば、グアニジン塩酸塩、尿素等のカオトロピック試薬等
が挙げられる。変性剤の濃度は不溶性タンパク質凝集体
が可溶化できる程度で良い。
来よりタンパク質の可溶化に使用されている公知の変性
剤を制限されることなく使用することができる。例え
ば、グアニジン塩酸塩、尿素等のカオトロピック試薬等
が挙げられる。変性剤の濃度は不溶性タンパク質凝集体
が可溶化できる程度で良い。
【０００８】不溶性タンパク質凝集体の可溶化は、変性
剤等を用いる公知の方法を採用することができる。可溶
化操作により、変性剤及び変性剤によって変性・可溶化
されたタンパク質を含有する可溶化処理液を得る。
剤等を用いる公知の方法を採用することができる。可溶
化操作により、変性剤及び変性剤によって変性・可溶化
されたタンパク質を含有する可溶化処理液を得る。
【０００９】可溶化処理液のタンパク質濃度としては特
に限定されるものではないが、以降の変性剤の除去工
程、希釈工程において沈澱物の生成を抑え、かつタンパ
ク質の安定性を保つという観点から０．１ｍｇ／ｍＬ以
上が好ましく、２ｍｇ／ｍＬ以上がより好ましい。ま
た、２００ｍｇ／ｍＬ以下が好ましく、２０ｍｇ／ｍＬ
以下がより好ましい。
に限定されるものではないが、以降の変性剤の除去工
程、希釈工程において沈澱物の生成を抑え、かつタンパ
ク質の安定性を保つという観点から０．１ｍｇ／ｍＬ以
上が好ましく、２ｍｇ／ｍＬ以上がより好ましい。ま
た、２００ｍｇ／ｍＬ以下が好ましく、２０ｍｇ／ｍＬ
以下がより好ましい。
【００１０】かかる不溶性タンパク質凝集体を可溶化す
る前に、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、
ＮＰ４０、デオキシコール酸等の、タンパク質を変性さ
せない性質を有する界面活性剤を含有する緩衝液等で、
対象の不溶性タンパク質凝集体を洗浄しても良い。
る前に、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、
ＮＰ４０、デオキシコール酸等の、タンパク質を変性さ
せない性質を有する界面活性剤を含有する緩衝液等で、
対象の不溶性タンパク質凝集体を洗浄しても良い。
【００１１】本発明においては、可溶化処理液からの変
性剤の除去処理を二〜四価の多価アルコールの存在下で
行う。可溶化処理液から変性剤を除去する方法としては
特に限定されるものではなく、例えば、該処理液を二〜
四価の多価アルコール含有液に対して透析する透析法、
二〜四価の多価アルコール含有液を該処理液に添加しつ
つ分画膜等を用いて除去する方法等が挙げられる。小ス
ケールで本発明を実施する場合には透析法が簡便であ
る。
性剤の除去処理を二〜四価の多価アルコールの存在下で
行う。可溶化処理液から変性剤を除去する方法としては
特に限定されるものではなく、例えば、該処理液を二〜
四価の多価アルコール含有液に対して透析する透析法、
二〜四価の多価アルコール含有液を該処理液に添加しつ
つ分画膜等を用いて除去する方法等が挙げられる。小ス
ケールで本発明を実施する場合には透析法が簡便であ
る。
【００１２】透析法を行う場合、透析中の沈澱物の生成
をできるだけ抑えるという観点から、予め、可溶化処理
液に等量の二〜四価の多価アルコールを添加した後、透
析することがより好ましい。
をできるだけ抑えるという観点から、予め、可溶化処理
液に等量の二〜四価の多価アルコールを添加した後、透
析することがより好ましい。
【００１３】二〜四価の多価アルコール含有液における
該多価アルコールの濃度は、変性剤の除去処理時にタン
パク質の凝集により生じる沈澱物の生成量を抑え、可溶
性タンパク質の回収率を向上させる観点から、６０体積
％以上であることが好ましく、７０体積％以上であるこ
とがより好ましい。また、変性剤除去処理後のタンパク
質の凝集を抑え、かつタンパク質の安定性を保持する観
点から、９９体積％以下であることが好ましく、９０体
積％以下であることがより好ましい。
該多価アルコールの濃度は、変性剤の除去処理時にタン
パク質の凝集により生じる沈澱物の生成量を抑え、可溶
性タンパク質の回収率を向上させる観点から、６０体積
％以上であることが好ましく、７０体積％以上であるこ
とがより好ましい。また、変性剤除去処理後のタンパク
質の凝集を抑え、かつタンパク質の安定性を保持する観
点から、９９体積％以下であることが好ましく、９０体
積％以下であることがより好ましい。
【００１４】二〜四価の多価アルコール含有液のｐＨと
しては特に限定されるものではないが、例えば、ｐＨ３
〜９の範囲が好ましい。また、除去処理時の該多価アル
コール含有液の温度は、タンパク質の変性を抑える観点
から−５〜２０℃の範囲が好ましい。また、二〜四価の
多価アルコール含有液には、緩衝剤、界面活性剤、キレ
ート化剤、還元剤、塩類等の他の成分を含んでいても良
い。
しては特に限定されるものではないが、例えば、ｐＨ３
〜９の範囲が好ましい。また、除去処理時の該多価アル
コール含有液の温度は、タンパク質の変性を抑える観点
から−５〜２０℃の範囲が好ましい。また、二〜四価の
多価アルコール含有液には、緩衝剤、界面活性剤、キレ
ート化剤、還元剤、塩類等の他の成分を含んでいても良
い。
【００１５】二〜四価の多価アルコールとしては、例え
ば、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリ
セリン、ブチレングリコール、エリスリトール等が挙げ
られる。なかでもグリセリンが好適である。これらの多
価アルコールは単独で用いても２種以上を混合して用い
ても良い。
ば、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリ
セリン、ブチレングリコール、エリスリトール等が挙げ
られる。なかでもグリセリンが好適である。これらの多
価アルコールは単独で用いても２種以上を混合して用い
ても良い。
【００１６】このようにして、変性剤は除去され、二〜
四価の多価アルコール含有液に溶解した状態でタンパク
質が回収される。回収されたタンパク質は、そのままフ
リーザ等で凍結・非凍結状態で０℃以下で低温保存する
ことができる。従って、本発明の一つの態様は、二〜四
価の多価アルコールの存在下に変性剤の除去処理を行
う、変性剤の除去方法を提供する。
四価の多価アルコール含有液に溶解した状態でタンパク
質が回収される。回収されたタンパク質は、そのままフ
リーザ等で凍結・非凍結状態で０℃以下で低温保存する
ことができる。従って、本発明の一つの態様は、二〜四
価の多価アルコールの存在下に変性剤の除去処理を行
う、変性剤の除去方法を提供する。
【００１７】本発明のさらなる態様は、このようにして
得られる除去処理後の処理液を、次いで、希釈液で希釈
して可溶性タンパク質を回収する、可溶性タンパク質の
回収方法を提供する。希釈液としては特に限定されず、
例えば、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液等の公知の
緩衝液が好ましいものとして挙げられる。
得られる除去処理後の処理液を、次いで、希釈液で希釈
して可溶性タンパク質を回収する、可溶性タンパク質の
回収方法を提供する。希釈液としては特に限定されず、
例えば、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液等の公知の
緩衝液が好ましいものとして挙げられる。
【００１８】希釈の程度としては、凝集体の生成を抑
え、二〜四価の多価アルコール濃度を所望の濃度とする
観点から、好ましくは除去処理後の処理液の３体積倍以
上、より好ましくは５体積倍以上の希釈液を用いて除去
処理後の処理液を希釈すれば良く、安定性および以降の
精製工程等の操作に差し支えない範囲のタンパク質濃度
の溶液を得る観点から、好ましくは該処理液の１００体
積倍以下、より好ましくは２０体積倍以下の希釈液を用
いて除去処理後の処理液を希釈すれば良い。このような
希釈により、二〜四価の多価アルコール濃度が０．５〜
３０体積％程度の溶液を得ることができる。
え、二〜四価の多価アルコール濃度を所望の濃度とする
観点から、好ましくは除去処理後の処理液の３体積倍以
上、より好ましくは５体積倍以上の希釈液を用いて除去
処理後の処理液を希釈すれば良く、安定性および以降の
精製工程等の操作に差し支えない範囲のタンパク質濃度
の溶液を得る観点から、好ましくは該処理液の１００体
積倍以下、より好ましくは２０体積倍以下の希釈液を用
いて除去処理後の処理液を希釈すれば良い。このような
希釈により、二〜四価の多価アルコール濃度が０．５〜
３０体積％程度の溶液を得ることができる。
【００１９】希釈操作の態様としては特に限定されるも
のではない。ただし、希釈を行う場合、凝集体の生成を
抑えるべく、できるたけ短時間で、例えば、希釈に要す
る時間として数分間以内に希釈することがより好まし
い。より短時間で希釈を行うためには、例えば、除去処
理後の処理液を希釈液に滴下しながら混合する操作等の
操作を行えば良い。
のではない。ただし、希釈を行う場合、凝集体の生成を
抑えるべく、できるたけ短時間で、例えば、希釈に要す
る時間として数分間以内に希釈することがより好まし
い。より短時間で希釈を行うためには、例えば、除去処
理後の処理液を希釈液に滴下しながら混合する操作等の
操作を行えば良い。
【００２０】このようにして、二〜四価の多価アルコー
ル含有液に溶解した状態の可溶性タンパク質が回収され
る。回収されたタンパク質は、そのままフリーザ等で凍
結・非凍結状態で０℃以下で低温保存することができ
る。本発明の方法によれば、従来の方法に比べて、変性
剤除去処理の過程で生成する、タンパク質を含む沈殿の
生成量を大幅に抑制することができるので、可溶性タン
パク質の回収率を大きく向上させることができる。本発
明の方法により回収された可溶性タンパク質を、そのま
ま公知の精製工程の試料として組み込むことにより、よ
り高収率でタンパク質を得ることができる。
ル含有液に溶解した状態の可溶性タンパク質が回収され
る。回収されたタンパク質は、そのままフリーザ等で凍
結・非凍結状態で０℃以下で低温保存することができ
る。本発明の方法によれば、従来の方法に比べて、変性
剤除去処理の過程で生成する、タンパク質を含む沈殿の
生成量を大幅に抑制することができるので、可溶性タン
パク質の回収率を大きく向上させることができる。本発
明の方法により回収された可溶性タンパク質を、そのま
ま公知の精製工程の試料として組み込むことにより、よ
り高収率でタンパク質を得ることができる。
【００２１】
【実施例】次に、本発明を実施例に基づいてさらに詳細
に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定される
ものではない。
に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定される
ものではない。
【００２２】実施例１〜６ ６種類のタンパク質について、可溶性タンパク質として
の回収を行った。実施例１〜５については、所定の塩基
配列を有するヌクレオチドを発現ベクターに組み込み、
宿主中で目的のタンパク質を大量に発現させ、封入体の
形態の試料を得た。また、実施例６については、ニワト
リ卵由来のアビジンをフルオレセインイソチオシアネー
ト（ＦＩＴＣ）で標識し、凝集体を形成したものを試料
として用いた。実施例１〜５におけるタンパク質は次の
とおりである。
の回収を行った。実施例１〜５については、所定の塩基
配列を有するヌクレオチドを発現ベクターに組み込み、
宿主中で目的のタンパク質を大量に発現させ、封入体の
形態の試料を得た。また、実施例６については、ニワト
リ卵由来のアビジンをフルオレセインイソチオシアネー
ト（ＦＩＴＣ）で標識し、凝集体を形成したものを試料
として用いた。実施例１〜５におけるタンパク質は次の
とおりである。
【００２３】実施例１：１３０〜３７４位のアミノ酸が
欠失したシグマ因子σ70変異体とその４つの誘導体（大
腸菌由来） 実施例２：Ｎ末端にグルタチオン−Ｓ−トランスフェラ
ーゼ（ＧＳＴ）を融合させた１７５アミノ酸残基からな
るＴＦＩＩＨホモログ（ショウジョウバエ（Drosophila
melanogaster ）由来） 実施例３：トランジットぺプチドを伴う葉緑体シグマ因
子ＳｉｇＡ（シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）
由来） 実施例４：トランジットぺプチドを除いた葉緑体シグマ
因子ＳｉｇＡ（シロイヌナズナ（Arabidopsis thalian
a）由来） 実施例５：Ｃ末端にヒスチジン６残基を結合した翻訳因
子（テトラヒメナ（Tetrahymena thermophilia）由来）
欠失したシグマ因子σ70変異体とその４つの誘導体（大
腸菌由来） 実施例２：Ｎ末端にグルタチオン−Ｓ−トランスフェラ
ーゼ（ＧＳＴ）を融合させた１７５アミノ酸残基からな
るＴＦＩＩＨホモログ（ショウジョウバエ（Drosophila
melanogaster ）由来） 実施例３：トランジットぺプチドを伴う葉緑体シグマ因
子ＳｉｇＡ（シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）
由来） 実施例４：トランジットぺプチドを除いた葉緑体シグマ
因子ＳｉｇＡ（シロイヌナズナ（Arabidopsis thalian
a）由来） 実施例５：Ｃ末端にヒスチジン６残基を結合した翻訳因
子（テトラヒメナ（Tetrahymena thermophilia）由来）
【００２４】上記のように用意された封入体又は凝集体
の試料を、ホモジナイザーを用いて表１に示す界面活性
剤を含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で
２回洗浄した。ここでの界面活性剤の濃度と種類は次の
とおりである。Ｔｘ：０．５重量％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ
−１００、Ｄ：２重量％のデオキシコール酸、Ｔｗ：
０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０。洗浄中、これら試料
は溶解することなく、懸濁液として得られた。
の試料を、ホモジナイザーを用いて表１に示す界面活性
剤を含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で
２回洗浄した。ここでの界面活性剤の濃度と種類は次の
とおりである。Ｔｘ：０．５重量％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ
−１００、Ｄ：２重量％のデオキシコール酸、Ｔｗ：
０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０。洗浄中、これら試料
は溶解することなく、懸濁液として得られた。
【００２５】洗浄された試料を、６Ｍグアニジン塩酸塩
を含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶
解させて可溶化処理液を得た。ここでのタンパク質の濃
度を、ＢＣＡタンパク質アッセイ法（ピアース社）で求
めたところ、２〜２０ｍｇタンパク質／ｍＬの範囲であ
った。
を含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶
解させて可溶化処理液を得た。ここでのタンパク質の濃
度を、ＢＣＡタンパク質アッセイ法（ピアース社）で求
めたところ、２〜２０ｍｇタンパク質／ｍＬの範囲であ
った。
【００２６】得られた可溶化処理液をエッペンドルフチ
ューブに移し、４℃で、１３０００ｒｐｍの遠心分離を
２０分間行った。上清を８／３２又は２０／３２の透析
チューブに移し、等容量のグリセリンをこれに加えた。
グリセリンとＴＥＭ緩衝液（１０ｍＭのトリス−塩酸
（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ及び１ｍＭの２−メ
ルカプトエタノールからなる。）を３：１の体積比で混
合した溶液を透析外液とし、この透析外液に対して可溶
化処理液を透析した。透析外液を４℃で、１０ｒｐｍの
回転数で攪拌した。透析外液を、２〜４時間毎に２回、
又は８時間目に１回、新しいものに交換した。透析終了
後、透析された溶液（除去処理後の処理液）をフリーザ
ー中で保存した。
ューブに移し、４℃で、１３０００ｒｐｍの遠心分離を
２０分間行った。上清を８／３２又は２０／３２の透析
チューブに移し、等容量のグリセリンをこれに加えた。
グリセリンとＴＥＭ緩衝液（１０ｍＭのトリス−塩酸
（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ及び１ｍＭの２−メ
ルカプトエタノールからなる。）を３：１の体積比で混
合した溶液を透析外液とし、この透析外液に対して可溶
化処理液を透析した。透析外液を４℃で、１０ｒｐｍの
回転数で攪拌した。透析外液を、２〜４時間毎に２回、
又は８時間目に１回、新しいものに交換した。透析終了
後、透析された溶液（除去処理後の処理液）をフリーザ
ー中で保存した。
【００２７】このようにして得られた、タンパク質濃度
が１〜１０ｍｇ／ｍＬの変性剤除去処理後の処理液を、
希釈液としての、０．１Ｍの塩化ナトリウムを含むＴＥ
Ｍ緩衝液に滴下して希釈し、グリセリン濃度が５体積％
のタンパク質溶液を得た。希釈液の量は、変性剤除去処
理後の処理液の１４体積倍とした。得られた可溶性タン
パク質溶液を氷上に置き、次いで、１００００×ｇ以上
で遠心分離に付して沈殿を取り除いた。このようにして
得られた可溶性タンパク質溶液について、可溶性タンパ
ク質としてどの程度回収できたかを明らかにするため、
各タンパク質の可溶化率を測定した。
が１〜１０ｍｇ／ｍＬの変性剤除去処理後の処理液を、
希釈液としての、０．１Ｍの塩化ナトリウムを含むＴＥ
Ｍ緩衝液に滴下して希釈し、グリセリン濃度が５体積％
のタンパク質溶液を得た。希釈液の量は、変性剤除去処
理後の処理液の１４体積倍とした。得られた可溶性タン
パク質溶液を氷上に置き、次いで、１００００×ｇ以上
で遠心分離に付して沈殿を取り除いた。このようにして
得られた可溶性タンパク質溶液について、可溶性タンパ
ク質としてどの程度回収できたかを明らかにするため、
各タンパク質の可溶化率を測定した。
【００２８】タンパク質の可溶化率は、次のようにして
求めた。上記可溶性タンパク質溶液、変性剤除去処理後
の処理液（７５体積％グリセリン溶液）及び封入体又は
凝集体の可溶化処理液（６Ｍグアニジン塩酸塩溶液）を
それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ．２９６，３００〜３０４に記載の方法によっ
て、電気泳動後のゲルを逆染色した。そして、各バンド
の強度を、種々の濃度の標準タンパク質（７５体積％グ
リセリン含有液）のバンド強度と比較し、各サンプルの
タンパク質の量を定量した。可溶性タンパク質溶液のタ
ンパク質の量と封入体又は凝集体の可溶化処理液のタン
パク質の量の比を求め、可溶化率とした。
求めた。上記可溶性タンパク質溶液、変性剤除去処理後
の処理液（７５体積％グリセリン溶液）及び封入体又は
凝集体の可溶化処理液（６Ｍグアニジン塩酸塩溶液）を
それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ．２９６，３００〜３０４に記載の方法によっ
て、電気泳動後のゲルを逆染色した。そして、各バンド
の強度を、種々の濃度の標準タンパク質（７５体積％グ
リセリン含有液）のバンド強度と比較し、各サンプルの
タンパク質の量を定量した。可溶性タンパク質溶液のタ
ンパク質の量と封入体又は凝集体の可溶化処理液のタン
パク質の量の比を求め、可溶化率とした。
【００２９】従来法と比較した可溶化率改善の程度は、
本発明の方法によって得られた可溶性タンパク質溶液中
の可溶性タンパク質の可溶化率（Ａ）と、以下に示す従
来法（対照実験）によって得られたタンパク質溶液中の
可溶性タンパク質の可溶化率（Ｂ）との比で示した。
本発明の方法によって得られた可溶性タンパク質溶液中
の可溶性タンパク質の可溶化率（Ａ）と、以下に示す従
来法（対照実験）によって得られたタンパク質溶液中の
可溶性タンパク質の可溶化率（Ｂ）との比で示した。
【００３０】対照実験は次のように行った。実施例と同
様にして得た封入体又は凝集体の可溶化処理液を用意し
た。この溶液をエッペンドルフチューブに移し、４℃
で、１３０００ｒｐｍの遠心分離を２０分間行った。上
清を５体積％のグリセリン濃度の、０．１Ｍの塩化ナト
リウムを含むＴＥＭ緩衝液に対して透析した。次いで、
透析された溶液を遠心分離に付した。得られた上清中の
可溶性タンパク質の可溶化率を求めた。表１に結果を示
す。
様にして得た封入体又は凝集体の可溶化処理液を用意し
た。この溶液をエッペンドルフチューブに移し、４℃
で、１３０００ｒｐｍの遠心分離を２０分間行った。上
清を５体積％のグリセリン濃度の、０．１Ｍの塩化ナト
リウムを含むＴＥＭ緩衝液に対して透析した。次いで、
透析された溶液を遠心分離に付した。得られた上清中の
可溶性タンパク質の可溶化率を求めた。表１に結果を示
す。
【００３１】
【表１】
【００３２】表１に示されるように、本発明の方法によ
れば、従来法に比べ１０〜１８０倍のタンパク質の可溶
化率の改善が達成され、極めて効率良く可溶性タンパク
質を回収することができた。
れば、従来法に比べ１０〜１８０倍のタンパク質の可溶
化率の改善が達成され、極めて効率良く可溶性タンパク
質を回収することができた。
【００３３】
【発明の効果】本発明の回収方法により、回収率の高い
可溶性タンパク質の回収方法が達成される。また、本発
明の変性剤の除去方法により、タンパク質の凝集を抑制
しながら変性剤を除去することができる。
可溶性タンパク質の回収方法が達成される。また、本発
明の変性剤の除去方法により、タンパク質の凝集を抑制
しながら変性剤を除去することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
Claims (7)
- 【請求項１】 不溶性タンパク質凝集体を変性剤を用い
て可溶化させた可溶化処理液から変性剤を除去して可溶
性タンパク質を回収する方法において、６０〜９９体積
％の濃度の二〜四価の多価アルコールの存在下に変性剤
の除去処理を行い、次いで該除去処理後の処理液を希釈
液で希釈することを特徴とする可溶性タンパク質の回収
方法。 - 【請求項２】 二〜四価の多価アルコール含有液に対す
る可溶化処理液の透析により変性剤の除去処理を行う請
求項１記載の回収方法。 - 【請求項３】 除去処理後の処理液を該処理液の３〜１
００体積倍の希釈液を用いて希釈する請求項１又は２記
載の回収方法。 - 【請求項４】 希釈液が緩衝液である請求項１〜３いず
れか記載の回収方法。 - 【請求項５】 二〜四価の多価アルコールが、エチレン
グリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ブチ
レングリコール、エリスリトールからなる群より選ばれ
る１種以上である請求項１〜４いずれか記載の回収方
法。 - 【請求項６】 不溶性タンパク質凝集体を変性剤を用い
て可溶化させた可溶化処理液から変性剤を除去する方法
において、６０〜９９体積％の濃度の二〜四価の多価ア
ルコールの存在下に変性剤の除去処理を行うことを特徴
とする変性剤の除去方法。 - 【請求項７】 二〜四価の多価アルコール含有液に対し
て可溶化処理液の透析を行う請求項６記載の除去方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10144758A JPH11335392A (ja) | 1998-05-26 | 1998-05-26 | 可溶性タンパク質の回収方法 |
| CA002329131A CA2329131A1 (en) | 1998-05-26 | 1999-05-17 | Method for recovering soluble protein |
| EP99919636A EP1081231A4 (en) | 1998-05-26 | 1999-05-17 | METHOD FOR OBTAINING SOLUBLE PROTEIN. |
| US09/701,005 US6861505B1 (en) | 1998-05-26 | 1999-05-17 | Method for recovering soluble protein |
| PCT/JP1999/002574 WO1999061649A1 (fr) | 1998-05-26 | 1999-05-17 | Procede de recuperation d'une proteine soluble |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10144758A JPH11335392A (ja) | 1998-05-26 | 1998-05-26 | 可溶性タンパク質の回収方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11335392A true JPH11335392A (ja) | 1999-12-07 |
Family
ID=15369722
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10144758A Pending JPH11335392A (ja) | 1998-05-26 | 1998-05-26 | 可溶性タンパク質の回収方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6861505B1 (ja) |
| EP (1) | EP1081231A4 (ja) |
| JP (1) | JPH11335392A (ja) |
| CA (1) | CA2329131A1 (ja) |
| WO (1) | WO1999061649A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3683308A1 (en) | 2015-06-10 | 2020-07-22 | Toyama Prefectural University | Active-form mutant enzyme production method, new active-form mutant enzyme, and solubilized mutant protein production method |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE428764T1 (de) | 2004-05-21 | 2009-05-15 | Exxonmobil Chem Patents Inc | Verfahren und vorrichtung zur steuerung der temperatur eines erhitzten einsatzstoffs für eine flashtrommel, deren überkopfprodukt einsatzstoff für das cracken liefert |
| US9296955B2 (en) | 2010-09-20 | 2016-03-29 | Exxonmobil Chemical Patents Inc. | Process and apparatus for co-production of olefins and electric power |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4450103A (en) | 1982-03-01 | 1984-05-22 | Cetus Corporation | Process for recovering human IFN-β from a transformed microorganism |
| JPH01168298A (ja) * | 1987-12-23 | 1989-07-03 | Tosoh Corp | 不溶性異種蛋白質の活性化法 |
| CA1340586C (en) * | 1988-09-23 | 1999-06-08 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interferon-beta |
| US5258496A (en) | 1990-07-10 | 1993-11-02 | Scios Nova Inc. | Isolation and purification of lung surfactant protein |
-
1998
- 1998-05-26 JP JP10144758A patent/JPH11335392A/ja active Pending
-
1999
- 1999-05-17 WO PCT/JP1999/002574 patent/WO1999061649A1/ja not_active Application Discontinuation
- 1999-05-17 CA CA002329131A patent/CA2329131A1/en not_active Abandoned
- 1999-05-17 EP EP99919636A patent/EP1081231A4/en not_active Withdrawn
- 1999-05-17 US US09/701,005 patent/US6861505B1/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3683308A1 (en) | 2015-06-10 | 2020-07-22 | Toyama Prefectural University | Active-form mutant enzyme production method, new active-form mutant enzyme, and solubilized mutant protein production method |
| US10730909B2 (en) | 2015-06-10 | 2020-08-04 | Toyama Prefectual University | Method of producing an active-form mutant enzyme |
| US11312747B2 (en) | 2015-06-10 | 2022-04-26 | Toyama Prefectural University | Method of producing an active-form mutant enzyme |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6861505B1 (en) | 2005-03-01 |
| EP1081231A1 (en) | 2001-03-07 |
| EP1081231A4 (en) | 2001-10-04 |
| WO1999061649A1 (fr) | 1999-12-02 |
| CA2329131A1 (en) | 1999-12-02 |
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