CH626051A5

CH626051A5 -

Info

Publication number: CH626051A5
Application number: CH792577A
Authority: CH
Inventors: Manfred Dr Zoltobrocki
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1976-07-01
Filing date: 1977-06-28
Publication date: 1981-10-30
Also published as: SE440507B; FI61490C; NO145692B; ZA773964B; NZ184516A; IE44766L; DK293277A; IE44766B1; ATA466377A; AU2660477A; GR78333B; NO145692C; NL188804B; FR2356630B1; ES460099A1; JPS535101A; FI61490B; AU509110B2; PT66751A; BE856385A

Description

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PATENTANSPRUCH Verfahren zur Reinigung von höhermolekularen, zur Assoziation neigenden Peptiden durch Ionenaustauscher-chromatographie in wässrigen, gepufferten Lösungsmitteln an sauren oder basischen Ionenaustauschern dadurch gekennzeichnet, dass in den gepufferten Lösungsmitteln nichtionische Detergentien aufgelöst sind.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Reinigung von höhermolekularen, zur Assoziation neigenden Peptiden durch Ionenaustauscherchromatographie in wässrigen, gepufferten Lösungsmitteln an sauren oder basischen Ionenaustauschern das dadurch gekennzeichnet ist, dass in den gepufferten Lösungsmitteln nichtionische Detergentien aufgelöst sind.

Es ist bereits bekannt, dass Peptide gleichen oder ähnlichen Molekulargewichtes, die sich in ihrer Basizität oder Azidität unterscheiden, an Ionenaustauschern getrennt werden können. Diese Methode versagt jedoch, wenn die unterschiedlichen Peptide miteinander Komplexe bilden, die während der Ionenaustauscherchromatographie erhalten bleiben. Um diese Schwierigkeiten zu umgehen, hat man in Elutionsmittel dissoziierende Bedingungen zu wählen. Bisher hat man zu diesem Zwecke in den zur Elution verwandten Puffern z. B. entweder Harnstoff oder Harnstoffderivate in hohen Konzentrationen (5 M-9 M) aufgelöst oder man hat in mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln gearbeitet. So wurde z. B. Insulin an dem Ionenaustauscher Amberlite IRC 50 in Phosphatpuffer mit 5 M-8 M Harnstoff chromatographiert (R. D. Cole, J. Biol. Chem. 235,2294 [I960]). Aus der englischen Patentschrift Nr. 881855 ist die Verwendung eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, beispielsweise Äthanol bekannt. Extreme pH-Werte, die ebenfalls dissoziierend wirken, sind wegen der Empfindlichkeit der Peptide gegen solche Bedingungen anwendbar. Die bisher bekannten Verfahren hatten aber verschiedene Nachteile. So ist die Isolierung der Substanzen aus harnstoffhaltigen Puffern schwierig und zeitraubend; ferner können im Harnstoff Verunreinigungen enthalten sein, die mit Peptiden wie Insulin reagieren. Bei der Verwendung von Äthanol als organisches Lösungsmittel bereitet die Wiederverwendbarkeit des Ionenaustauschers Schwierigkeiten, zum anderen ist die Ionenaustauscherchromatographie mit einem hohen Verlust an Peptid, z. B. Insulin verbunden. Schliesslich besteht die Gefahr des Denaturierens der höhermolekularen Peptide in organischen Lösungsmitteln wie das für Insulin in 60%igem Alkohol bei pH 7 bekannt ist.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass diese Schwierigkeiten durch die Verwendung von nichtionischen Detergentien zur Dissoziation der Peptide umgangen werden können.

Die Wiederverwendbarkeit der Austauscher bereitet keine Schwierigkeiten. Eine Denaturierung der Peptide ist nicht zu beobachten, die Isolierung ist einfach und erfolgt durch Fällung der Peptide mit geeigneten Fällungsmitteln und eventueller anschliessender Kristallisation. Die Ausbeuten sind deutlich grösser als bei der Verwendung von organischen Lösungsmittel als dissoziierendes Agens.

Das erfindungsgemässe Verfahren bezieht sich auf alle höhermolekularen Peptide, seien sie natürlichen Ursprungs oder synthetisch hergestellt, die zur Aggregation mit sich selbst oder anderen (ähnlichen) Verbindungen neigen wie z. B. Insuline aller Spezies, auch Humaninsulin, Insulinanaloge z. B. Des-Phe-Bl-Insulin, Insulinderivate z. B. Insulin-B-Kettensulfonat, natürliches adrenocorticotrophes Hormon, Wachstumshormon, Glucagon, Glykoproteidhormone des Hypophysenvorderlappens z. B. Thyreoidea stimulierendes

Hormon, luteotrophes Hormon, Follikel stimulierendes Hormon.

Diese Verbindungen können sowohl in verhältnismässig unreinem Zustand, als auch in vorgereinigter Form (z. B.

durch Gelchromatographie) eingesetzt werden. Insulin ist s nach mehrfacher Kristallisation und auch nach Gelchromatographie noch mit Insulin-ähnlichen Begleitstoffen sehr ähnlichen Molekulargewichtes verunreinigt, die sich bei passend gewähltem pH in ihrem Ladungszustand untereinander und vom Insulin unterscheiden, aber mit Insulin Komplexe bilden, io Beispiele solcher Substanzen sind: Desamidoinsuline, Arginin-und Diarginininsulin, Insulin-äthylester und andere. Sie sind weder durch Gelchromatographie, noch durch Ionenaustauscherchromatographie in nicht diisoziierend wirkenden Elutionsmitteln von Insulin abtrennbar.

1S Geeignete Ionenaustauscher für die Reinigung der oben genannten Peptide, besonders von Insulin und Insulinanalogen sind: Dowex 1, QAE-Sephadex, Biogel DM, DEAE-Sephadex, Amberlyst A 21 und A 29, DEAE-Sepharose CL 6B, DEAE-Cellulose, Dowex 50, CM-Sephadex, SP-Sephadex, CM-20 Sepharose CL 6B, Cellulosephosphat, Biogel CM, Amberlite CG 50, CM-Cellulose, Alginsäure u. a. Besonders gut eignen sich für die Reinigung von Insulin, Insulinanalogen und Insulinderivaten basische Ionenaustauscher auf Dextranbasis wie DEAE-Sephadex oder QAE-Sephadex.

Der Ionenaustauscherprozess wird in einem gepufferten wässrigen Lösungsmittel durchgeführt, in dem nichtionische Detergentien aufgelöst sind.

Als solche seien beispielsweise genannt: Palmitylsorbitan-30 polyäthylenglykoläther, Stearylsorbitanpolyäthylenglykoläther, 01eylsorbitanpolyäthylenglykoläther,Nonylphenolpolyglykol-äther (10-30 Mol Äthylenoxid/Mol Nonylphenol), Polymerisationsprodukte aus Propylenoxid und Äthylenoxid (10-80% Äthylenoxidanteil), Fettalkoholpolyglykoläther und Poly-35 glykoläther von synthetischen Fettalkoholen.

Von besonderem Vorteil sind Fettalkoholpolyglykoläther, da sie gut wirksam sind, leicht zu handhaben sind und keine UV-Absorption im Bereich der Absorption aromatischer Peptide zeigen, was die Erkennung der Peptide im Eluat 40 erleichtert. Ausserdem sind diese Verbindungen biologisch voll abbaubar, was ihre Verwendung im Hinblick auf die Umweltbelastung problemlos erscheinen lässt.

Die Elutionsmittel enthalten immer eine Puffersubstanz, um den pH-Wert des Elutionsmittels zu regeln. Vorzugsweise 45 wird bei einem konstanten pH-Wert gearbeitet. Bei Verwendung eines Kationenaustauschers kann der pH-Wert zwischen 3 und 6,5 (bei sauren Peptiden), vorzugsweise zwischen 4 und 6 liegen. Bei Verwendung eines Anionenaustauschers kann man pH-Werte zwischen 5,5 und 10 vorzugsweise zwi-50 sehen 6 und 9 verwenden.

Geeignete Puffersubstanzen sind literaturbekannt. Die Temperatur der Ionenaustauscherchromatographie muss konstant gehalten werden und liegt zwischen 0 und 50 ° C vorzugsweise zwischen 15 und 30°C. Die zur Elution verwandten 55 Lösungen enthalten ausser den Puffersubstanzen und Detergentien noch einen Elektrolyten, vorzugsweise ein Neutralsalz wie NaCl in Konzentrationen zwischen 0,01 M und 0,5 M vorzugsweise zwischen 0,05 M und 0,3 M oder man eluiert mit einem Elektrolytgradienten durch kontinuierliches Zu-60 mischen eines elektrolythaltigen Puffers zu dem Elutions-puffer ohne Elektrolyt, der ansonsten die gleiche Zusammensetzung hat, in der Weise, dass die Konzentration des verwendeten Elektrolyten in Abhängigkeit des Elutionsvolumens steigt und zwar vorzugsweise in linearer Abhängigkeit. Die End-65 konzentration an Elektrolyt liegt zwischen 0,1 M und 1M, vorzugsweise zwischen 0,3 M und 0,8 M.

Die erfindungsgemässe Reinigung von Peptiden wird an den nachfolgenden Beispielen veranschaulicht.

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Beispiel 1

Es wird ein Puffer folgender Zusammensetzung hergestellt:

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0,1 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan 1 % Genapol® SE 150 (Fettalkoholpolyglykoläther) Der pH-Wert wird mit HCl auf 7,0 eingestellt.

Ein Teil des obigen Puffers wird mit 0,5 Mol/1 NaCl versetzt. 450 g DEAE-Sephadex A 25 werden in obigem Puffer gequollen und die Suspension anschliessend in eine Säule von 0 5 cm und der Länge 100 cm gefüllt. Die Säule wird mit dem Puffer ins Gleichgewicht gebracht.

5 g Insulin, das aus Citratpuffer kristallisiert wurde, werden in 75 ml des obigen Puffers (ohne NaCl) gelöst. Der End-pH beträgt 8,3. Die klare Lösung wird auf die Säule gegeben und bei 25 °C mit einer Geschwindigkeit von 320 ml/Std. mit obigem Puffer (pH 7,0) eluiert, wobei ein linearer NaCl-Gradient in der Weise angelegt wird, dass die NaCl-Konzen-tration im Eluat bei Durchlauf von 5,51 Puffer von 0 auf 0,33 M steigt. Fraktionen von 22 ml werden gesammelt. Im Eluat wird kontinuierlich die UV-Extinktion bei 278 nm gemessen und aufgezeichnet. Der zentrale Teil des Insulinpeaks (von 0,1 M-0,24 M NaCl) (1540 ml) wird gesammelt und mit 70 ml 1 %iger ZnCh-Lösung versetzt. Das amorph ausgefällte Insulin wird abzentrifugiert und sodann in an sich bekannter Weise aus einem Aceton enthaltenden Citratpuffer kristallisiert.

Die Ausbeute an reinem Insulin beträgt 3,76 g (75,2%).

Beispiel 2

Es wird ein Puffer folgender Zusammensetzung hergestellt:

0,1 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan 0,12 M NaCl

1 % Genapol(R) ZDM110 (Polyglykoläther von geradkettigen, synthetischen Fettalkoholen (durchschnittliches Molekulargewicht 190)

mit 11 Mol Äthylenoxid/Mol Fettalkohol)

Der pH-Wert wird mit HCl auf 7,0 eingestellt.

13 g QAE-Sephadex A 25 werden in obigen Puffer gequollen und die Suspension wird in eine Säule von 0 1,5 cm und der Länge 30 cm gefüllt. Die Säule wird mit dem Puffer ins Gleichgewicht gebracht. 300 mg Insulin, das nach der Kristallisation noch durch Gelchromatographie an Sephadex G 50 in an sich bekannter Weise von höhermolekularen Bestandteilen weitgehend befreit worden war, werden in 15 ml des obigen Puffers gelöst (End-pH: 8,2). Die klare Lösung wird auf die Säule gegeben und bei 25 °C mit einer Geschwindigkeit von 48 ml/Std. mit dem obigen Puffer (pH 7) eluiert. Fraktionen von 7 ml werden gesammelt. Im Eluat wird kontinuierlich die UV-Extinktion bei 278 nm gemessen und aufgezeichnet. Der zentrale Teil des Insulinpeaks (620 ml) wird gesammelt und mit 28 ml 1 %iger ZnCh-Lösung versetzt. Das amorph ausgefallene Insulin wird abzentrifugiert und sodann in an sich bekannter Weise aus einem Aceton enthaltenden Citratpuffer kristallisiert. Die Ausbeute an reinem Insulin beträgt 185 mg (61,6%).

Beispiel 3

Es wird ein Puffer folgender Zusammensetzung hergestellt:

0,1 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan 2% Genapol(R) SE 150 (siehe Beispiel 1) Der pH-Wert wird mit HCl auf 7,0 eingestellt.

Anteile dieses Puffers werden mit 0,05 Mol/1,0,1 Mol/1, 0,2 Mol/1 und 0,3 Mol/1 NaCl versetzt.

450 g DEAE-Sephadex A 25 werden im obigen Puffer mit 0,05 M NaCl gequollen und die Suspension anschliessend in eine Säule von 0 5 cm und der Länge 100 cm gefüllt. Die Säule wird mit dem Puffer ins Gleichgewicht gebracht.

5 g Insulin (siehe Beispiel 2) werden in 100 ml des obigen Puffers (0,05 NaCl) gelöst (End-pH: 8,4), auf die Säule aufgetragen und bei 25 ° C mit einer Geschwindigkeit von 290 ml/ Std. eluiert. Es werden Fraktionen von 28 ml gesammelt.

Nach Durchlauf von 1,821 des Puffers mit 0,05 M NaCl werden 4,761 Puffer mit 0,1 M NaCl, 2,241 mit 0,2 M NaCl und schliesslich 5,31 mit 0,3 M NaCl aufgegeben. Die UV-Extinktion des Eluats wird kontinuierlich gemessen und aufgezeichnet. Die Hauptmenge des Insulins wird hier nach Aufgabe des Puffers mit 0,3 M NaCl eluiert. Der zentrale Teil des Insulinpeaks wird gesammelt (820 ml) und mit 37 ml 1 %iger ZnCk-Lösung versetzt. Der amorphe Niederschlag wird abzentrifugiert und das Insulin sodann in an sich bekannter Weise aus einem Aceton enthaltendem Citratpuffer kristallisiert.

Die Ausbeute an reinem Insulin beträgt 2,84 g (56,8%).

Beispiel 4

Es wird ein Puffer folgender Zusammensetzung hergestellt:

0,1 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan 5 % Genapol<R) SE 100 (Fettalkoholpolyglykoläther) Der pH-Wert wird mit HCl auf 7,0 eingestellt.

Ein Teil dieses Puffers wird mit 0,5 Mol/1 NaCl versetzt.

13 g DEAE Sephadex A 25 werden im obigen Puffer gequollen (ohne NaCl) und die Suspension anschliessend in eine Säule von 0 1,5 cm und der Länge 30 cm gefüllt. Die Säule wird mit dem Puffer ins Gleichgewicht gebracht. 300 mg Insulin (siehe Beispiel 2) werden in 15 ml des obigen Puffers (ohne NaCl) gelöst. (End-pH: 8,3). Die klare Lösung wird auf die Säule aufgetragen und bei 25 °C mit einer Geschwindigkeit von 48 ml/Std. eluiert, wobei ein linearer NaCl-Gradient in der Weise angelegt wird, dass die NaCl-Konzentration im Eluat bei Durchlauf von 500 ml Puffer von 0 auf 0,5 M ansteigt. Es werden Fraktionen von 7 ml gesammelt. Im Eluat wird kontinuierlich die UV-Extinktion bei 278 nm gemessen und aufgezeichnet. Der zentrale Teil des Insulinpeaks (von 0,09 M-0,22 M NaCl) (100 ml) wird gesammelt und mit 4,6 ml l%iger ZnCk-Lösung versetzt. Das amorph ausgefällte Insulin wird abzentrifugiert und sodann in an sich bekannter Weise aus einem Aceton enthaltenden Citratpuffer kristallisiert.

Die Ausbeute an reinem Insulin beträgt 160 mg (53,3%).

Beispiel 5

Wie Beispiel 4 nur unter Verwendung von 1 % Arkopal® N100 (Nonylphenolpolyglykoläther mit 10 Ml Äthylenoxid/ Mol Nonylphenol) als Detergenz.

Die kontinuierliche UV-Messung muss wegen der Eigenabsorption des Arkopal N100 als Differenzmessung durchgeführt werden.

Die Ausbeute an reinem Insulin beträgt 214 mg (71,3%).

Beispiel 6

Wie Beispiel 4 nur unter Verwendung von 2% Arkopal(R) N 300 (Nonylphenolpolyglykoläther mit 30 Mol Äthylen-oxid/Mol Nonylphenol) als Detergenz und von QAE-Sephadex A 25 als Ionenaustauscher.

Die Ausbeute an reinem Insulin beträgt 156 mg (52%).

Die kontinuierliche UV-Messung muss wegen der Eigen-

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absorption des Arkopal N 300 als Differenzmessung durch- delswaren der Firma Hoechst AG.

geführt werden. Die in den Beispielen verwandten Ionenaustauscher sind

Die in den Beispielen verwandten Detergentien sind Han- Handelswaren der Firma Pharmacia Fine Chemicals.

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