DE2629568A1 - Verfahren zur reinigung von hoeher molekularen peptiden - Google Patents
Verfahren zur reinigung von hoeher molekularen peptidenInfo
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Description
Verfahren zur Reinigung von höherxmolekularen Peptiden
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Reinigung von höhermolekularen, zur Assoziation neigenden Peptiden durch Ionenaustauscherchromatographie
in wäßrigen, gepufferten Lösungsmitteln an sauren oder basischen Ionenaustauschern das dadurch gekennzeichnet
ist, daß in den gepufferten Lösungsmitteln nichtionische Detergentien aufgelöst sind.
Es ist bereits bekannt, daß Peptide gleichen oder ähnlichen Molekulargewichtes, die sich in ihrer Basizität oder Azidität
unterscheiden, an Ionenaustauschern getrennt werden können. Diese Methode versagt jedoch, wenn die unterschiedlichen Peptide
miteinander Komplexe bilden, die während der Ionenaustauscherchromatographie erhalten bleiben. Um diese Schwierigkeiten zu
umgehen, hat man im Elutionsmittel dissoziierende Bedingungen
zu wählen. Bisher hat man zu diesem Zwecke in den zur Elution
verwandten Puffern z.B. entweder Harnstoff oder Harnstoffderivate ^.
in ^ in hohen Konzentrationen (5 M- 9 M) aufgelöst oder man hat mit
709882/oUi
Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln gearbeitet. So wurde z.B. Insulin an dem Ionenaustauscher Amberlite IRC 50 in
Phosphatpuffer mit 5 M - 8 M Harnstoff chromatographiert (R.D. Cole, J. Biol. Chem. 235, 2294 (1960)). Aus der englischen Patentschrift
Nr. 881 855 ist die Verwendung eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, beispielsweise Äthanol bekannt.
Extreme pH-Werte, die ebenfalls dissoziierend wirken, sind wegen der Empfindlichkeit der Peptide gegen solche Bedingungenvanwendbar.
Die bisher bekannten Verfahren hatten aber verschiedene Nachteile. So ist die Isolierung der Substanzen aus harnstoffhaltigen
Puffern schwierig und zeitraubend; ferner können im Harnstoff Verunreinigungen enthalten sein, die mit Peptiden wie
Insulin reagieren. Bei der Verwendung von Äthanol als organisches Lösungsmittel bereitet die Wiederverwendbarkeit des Ionenaustauschers
Schwierigkeiten, zum anderen ist die Ionenaustauscherchromatographie mit einem hohen Verlust an Peptid, z.B.
Insulin verbunden. Schließlich besteht die Gefahr des Denaturierens der höhermolekularen Peptide in organischen Lösungsmitteln
wie das für Insulin in 60 %-igem Alkohol bei pH 7 bekannt ist.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß diese Schwierigkeiten
durch die Verwendung von nichtionischen Detergentien zur Dissoziation der Peptide umgangen werden können.
Die Wiederverwendbarkeit der Austauscher bereitet keine Schwierigkeiten-
Eine Denaturierung der Peptide ist nicht zu beobachten, die Isolierung ist einfach und erfolgt durch Fällung der
Peptide mit geeigneten Fällungsmitteln und eventueller anschließender Kristallisation. Die Ausbeuten sind deutlich größer
als bei der Verwendung von organischen Lösungsmittel als dissoziierendes Agens.
Das erfindungsgemäße Verfahren bezieht sich auf alle höhermolekularen
Peptide, seien sie natürlichen Ursprungs oder synthetisch hergestellt, die zur Aggregation mit sich selbst
oder anderen (ähnlichen) Verbindungen neigen wie z.B. Insuline aller Spezies, auch Humaninsulin, Insulinanaloge z.B. Des-Phe-
7Ü8882/01U /3 .
Bi-Insulin, Insulinderivate z.B. Insulin-B-Kettensulfonat, natürliches
adrenocorticotrophes Hormon, Wachstumshormon, Glucagon,
Glykoproteidhormone des Hypophysenvorderlappens z.B. Thyreoidea
stimulierendes Hormon, luteotrophes Hormon, Foilikel stimulierendes
Hormon.
Diese Verbindungen können sowohl in verhältnismäßig unreinem Zustand,
als auch in vorgereinigter Form (z.B. durch Gelchromatographie) eingesetzt werden. Insulin ist nach mehrfacher Kristallisation
und auch nach Gelchromatographie noch mit Insulin-ähnlichen Begleitstoffen sehr ähnlichen Molekulargewichtes verunreinigt, die
sich bei passend gewähltem pH in ihrem Ladungszustand untereinander und vom Insulin unterscheiden, aber mit Insulin Komplexe bilden.
Beispiele solcher Substanzen sind: Desamidoinsuline, Arginin- und Diarginininsulin, Insulin-äthy!ester und andere. Sie sind
weder durch Gelchromatcgraphie, noch durch Ionenaustauscher-Chromatographie
in nicht dissoziierend wirkenden Elutionsmitteln von Insulin abtrennbar.
Geeignete Ionenaustauscher für die Reinigung der oben genannten Peptide, besonders von Insulin und Insulinanalogen sind: Dowex 1,
QAE-Sephadex, Biogel DM, DEAE-Sephadex, Amberlyst A 21 und A 29,
DEAE-Sepharose CL 6B, DEAE-Cellulose, Dowex 50, CM-Sephadex,
SR-Sephadex,. CM-Sepharose CL 6B, Cellulosephosphat, Biogel CM,
Amberlite CG 50, CM-Cellulose, Alginsäure u.a. Besonders gut eignen
sich für die Reinigung von Insulin, Insulinanalogen und Insulinderivaten basische Ionenaustauscher auf Dextranbasis wie
DEAE-Sephadex oder QAE-Sephadex.
Der Ionenaustauscherprozeß wird in einem gepufferten, wäßrigen Lösungsmittel durchgeführt, in dem nichtionische Detergentien
aufgelöst sind.
Als solche seien beispielsweise genannt: Palmitylsorbitanpolyäthylenglykoläther,
Stearylsorbitanpolyäthylenglykoläther,
Oleylsorbitanpolyäthylenglykoläther, Nonylphenolpolyglykoläther
TOS 882/QU* /4
(10 - 30 Mol Äthylenoxid/Mol Nonylphenol), Polymerisationsprodukte
aus Propylenoxid und Äthylenoxid (10 - 80 % Äthylenoxidanteil), Fettalkoholpolyglykoläther und Polyglykoläther von synthetischen
Fettalkoholen.
Von besonderem Vorteil sind Fettalkoholpolyglykoläther, da sie gut wirksam sind, leicht zu handhaben sind und keine UV-Absorption
im Bereich der Absorption aromatischer Peptide zeigen, was die Erkennung der Peptide im Eluat erleichtert. Außerdem sind diese
Verbindungen biologisch voll abbaubar, was ihre Verwendung im Hinblick auf die Umweltbelastung problemlos erscheinen läßt.
Die Elutionsmittel enthalten immer eine Puffersubstanz, um den
pH-Wert des Elutionsmittels zu regeln. Vorzugsweise wird bei einem konstanten pH-Wert gearbeitet. Bei Verwendung eines Kationenaustauschers kann der pH-Wert zwischen 3 und 6,5 (bei sauren Peptiden)
, vorzugsweise zwischen 4 und 6 liegen. Bei Verwendung eines Anionenaustauschers kann man pH-Werte zwischen 5,5 und 10
vorzugsweise zwischen 6 und 9 verwenden.
Geeignete Puffersubstanzen sind literaturbekannt. Die Temperatur
der Ionenaustauscherchromatographie muß konstant gehalten werden und liegt zwischen 0 und 500C vorzugsweise zwischen 15 und 300C.
Die zur Elution verwandten Lösungen enthalten außer den Puffersubstanzen
und Detergentien.noch einen Elektrolyten, vorzugsweise
ein Neutralsalz wie NaCl in Konzentrationen zwischen 0,01 M und 0,5 M vorzugsweise zwischen 0,05 M und 0,3 M oder man eluiert
mit einem Elektrolytgradienten durch kontinuierliches Zumischen eines elektrolythaltigen Puffers zu dem Elutionspuffer ohne
Elektrolyt, der ansonsten die gleiche Zusammensetzung hat, in der Weise, daß die Konzentration des verwendeten Elektrolyten in
Abhängigkeit des Elutionsvolumens steigt und zwar vorzugsweise in linearer Abhängigkeit. Die Endkonzentration an Elektrolyt liegt
zwischen 0,1 M. und 1 M, vorzugsweise zwischen 0,3 M und 0,8 M.
Die erfindungsgemäße Reinigung von Peptiden wird an den nachfolgenden
Beispielen veranschaulicht.
7Ö9882/01U /5
Es wird ein Puffer folgender Zusammensetzung hergestellt;
A 1 \f T-p ΐ c — Γ]-\λγΑ τ rs ν "VT-Tn^ *f-Τιλτ-Ί ^ — ·η in ΐ η r\rn <± i~ V\ ti τη
1°6 Genapol^ SE 150 (Fettalkoholpolyglykolät
Der pH-Wert wird rait HCl auf 7,0 eingestellt.
Ein Teil des obigen Puffers wird mit 0,5 Mol/l NaCl versetzt. 450 g DEAE-Sephadex A 25 werden in obigem Puffer gequollen und
die Suspension anschließend in eine Säule von 0 5 cm und der Länge 100 cm gefüllt. Die Säule wird mit dem Puffer ins
Gleichgewicht gebracht.
5 g Insulin, das aus Citratpuffer kristallisiert wurde, werden in 75 ml des obigen Puffers (ohne NaCl) gelöst. Der End-pH
beträgt 8,3. Die klare Lösung wird auf die Säule gegeben und bei 25°C mit einer Geschwindigkeit von 320 ml/Std. mit obigem
Puffer (pH 7,0) eluiert, wobei ein linearer NaCl-Gradient in
der Weise angelegt wird, daß die NaCl-Konzentration im Eluat bei
Durchlauf von 5,5 1 Puffer von 0 auf 0,33 M steigt. Fraktionen von 22 ml werden gesammelt. Im Eluat wird kontinuierlich die
UV-Extinktion bei 278 nm gemessen und aufgezeichnet. Der zentrale Teil des Insulinpeaks (von 0,1 M - 0,24 M NaCl)
(1540 ml) wird gesammelt und mit 70 ml 1a-iger ZnCl2-Lösung
versetzt. Das amorph ausgefällte Insulin wird abzentrifugiert und sodann in an sich bekannter Weise aus einem Aceton enthaltenden
Citratpuffer kristallisiert. Die Ausbeute an reinem Insulin beträgt 3,76 g (75,2%).
Es wird ein Puffer folgender Zusammensetzung hergestellt:
0,1 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan 0,12 M NaCl
1% Genapol^ ZDM 110 (Polyglykoläther von geradkettigen, synthetischen Fettalkoholen
(durchschnittliches Molekulargewicht 190) /6
709882/01U '
mit 11 Mol Äthylenoxid/Mol Fettalkohol) Der pH-Wert \tfird mit HCl auf 7,0 eingestellt.
13 g QAE-Sephadex A 25 werden in obigen Puffer gequollen und die Suspension wird in eine Säule vom 0 1,5 cm und der
Länge 30 cm gefüllt. Die Säule wird mit dem Puffer ins Gleichgewicht gebracht. 300 mg Insulin, das nach der
Kristallisation noch durch Gelchromatographie an Sephadex G
in an sich bekannter Weise von höhermolekularen Bestandteilen weitgehend befreit worden war, werden in 15 ml des obigen
Puffers gelöst (End-pH: 8,2). Die klare Lösung wird auf die Säule gegeben und bei 250C mit einer Geschwindigkeit von
48 ml/Std. mit dem obigen Puffer (pH 7) eluiert. Fraktionen von 7 ml werden gesammelt. Im Eluat wird kontinuierlich die
UV-Extinktion bei 278 nm gemessen und aufgezeichnet. Der zentrale Teil des Insulinpeaks (620 ml) wird gesammelt und mit
28 ml 1%-iger ZnCl2-Lösung versetzt. Das amorph ausgefallene
Insulin wird abzentrifugiert und sodann in an sich bekannter Weise aus einem Aceton enthaltenden Citratpuffer kristallisiert.
Die Ausbeute an reinem Insulin beträgt 185 mg (61,6%).
Es wird ein Puffer folgender Zusammensetzung hergestellt:
0,1 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
21 Genapol^-^ SE 150 (siehe Beispiel 1)
<■
Der pH-Wert wird mit HCl auf 7,0 eingestellt.
Anteile dieses Puffers werden mit 0,05 Mol/l, 0,1 Mol/l, 0,2 Mol/l und 0,3 Mol/l NaCl versetzt.
450 g DEAE-Sephadex A 25 werden im obigen Puffer mit 0,05 M
NaCl gequollen und die Suspension anschließend in eine Säule von 0 5.cm und der Länge 100 cm gefüllt. Die Säule wird mit
dem Puffer ins Gleichgewicht gebracht.
709882/OU*
5 g Insulin (siehe Beispiel 2) werden in 100 ml des obigen Puffers (0,05 M NaCl)" gelöst (End-pH: 8,4), auf die Säule
aufgetragen und bei 250C mit einer Geschwindigkeit von 290 ml/Std. eluiert. Es werden Fraktionen von 28 ml gesammelt.
Nach Durchlauf von T,82 1 des Puffers mit 0,05 M NaCl werden
4,76 1 Puffer mit 0,1 M NaCl, 2,24 1 mit 0,2 M NaCl und schließlich 5,3 1 mit 0,3 M NaCl aufgegeben. Die UV-Extinktion
des Eluats wird kontinuierlich gemessen und aufgezeichnet.
Die Hauptmenge des Insulins wird hier nach Aufgabe des Puffers mit 0,3 M NaCl eluiert. Der zentrale Teil des Insulinpeaks wird
gesammelt (820 ml) und mit 37 ml 1%-iger ZnCl^-Lösung versetzt.
Der amorphe Niederschlag wird abzentrifugiert und das Insulin sodann in an sich bekannter Weise aus einem Aceton enthaltendem
Citratpuffer kristallisiert.
Die Ausbeute an reinem Insulin beträgt 2,84 g (56,81).
Die Ausbeute an reinem Insulin beträgt 2,84 g (56,81).
Es wird ein Puffer folgender Zusammensetzung hergestellt:
0,1 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
51 Genapol^ SE 100 (Fettalkoholpolyglykoläther) Der pH-Wert wird mit HCl auf 7,0 eingestellt.
Ein Teil dieses Puffers wird mit 0,5 Mol/l NaCl versetzt.
13 g DEAE Sephadex A 25 werden im obigen Puffer gequollen (ohne NaCl) und die Suspension anschließend in eine Säule von
0 1,5 cm und der Länge 30 cm gefüllt. Die Säule wird mit dem Puffer ins Gleichgewicht gebracht. 300 mg Insulin (siehe
Beispiel 2) werden in 15 ml des obigen Puffers (ohne NaCl) gelöst. (End-pH: 8,3). Die klare Lösung wird auf die Säule aufgetragen
und bei 25°C mit einer Geschwindigkeit von 48 ml/Std. eluiert," wobei .ein linearer NaCl-Gradient in der Weise angelegt
wird, daß die NaCl-Konzentration im Eluat bei Durchlauf von
500 ml Puffer von 0 auf 0,5 M ansteigt. Es werden Fraktionen von 7 ml gesammelt. Im Eluat ,wird kontinuierlich die UV-
709882/OU* /8
Extinktion bei 278 mn gemessen und aufgezeichnet. Der zentrale
Teil des Insulinpeaks (von 0,09 M - 0,22 M NaCl) (100 ml) x\'ird
gesammelt und mit 4,6 ml 11-iger ZnCl2-Lb'sung versetzt. Das
amorph ausgefällte Insulin wird abzentrifugiert und sodann in an sich bekannter Weise aus einem Aceton enthaltenden Citratpuffer
kristallisiert.
Die Ausbeute an reinem Insulin beträgt 160 mg (53,3 o).
Die Ausbeute an reinem Insulin beträgt 160 mg (53,3 o).
Wie Beispiel 4 nur unter Verwendung von \% Arkopal1· J N 100
(Nonylphenolpolyglykoläther mit 10 Mol Äthylenoxid/Mol Nonylphenol) als Detergenz.
Die kontinuierliche UV-Messung muß wegen der Eigenabsorption des Arkopal N 100 als Differenzmessung durchgeführt lverden.
Die Ausbeute an reinem Insulin beträgt 214 mg (71,3%).
Wie Beispiel 4 nur unter Verwendung von 2% Arkopal *■ ' N 300
(Nonylphenolpolyglykoläther mit 30 Mol Äthylenoxid/Mol
Nonylphenol) als Detergenz und von QAE-Sephadex A 25 als Ionenaustauscher.
Die Ausbeute an reinem Insulin beträgt 156 mg (521).
Die Ausbeute an reinem Insulin beträgt 156 mg (521).
Die kontinuierliche UV-Messung muß wegen der Eigenabsorption des Arkopal N 300 als Differenzmessung durchgeführt werden.
Die in den Beispielen verwandten Detergentien sind Handelswaren der Firma Hoechst AG.
Die in den Beispielen verwandten Ionenaustauscher sind Handelswaren
der Firma Pharmacia Fine Chemicals.
Ϊ09882/01Μ /9
Claims (1)
- HOE 76/F 155PATENTANSPRUCH:Verfahren zur Reinigung von höhermolekularen, zur Assoziation neigenden Peptiden durch lonenauStauscherchromatographie in wäßrigen, gepufferten Lösungsmitteln an sauren oder basischen Ionenaustauschern dadurch gekennzeichnet, daß in den gepufferten Lösungsmitteln nichtionische Detergentien aufgelöst sind.7D9882/01U
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