EP0305760A2 - Verfahren zur Isolierung basischer Proteine aus Proteingemischen - Google Patents

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EP0305760A2
EP0305760A2 EP88112661A EP88112661A EP0305760A2 EP 0305760 A2 EP0305760 A2 EP 0305760A2 EP 88112661 A EP88112661 A EP 88112661A EP 88112661 A EP88112661 A EP 88112661A EP 0305760 A2 EP0305760 A2 EP 0305760A2
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elution
basic proteins
alkanol
insulin
strongly acidic
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Michael Dr. Dörschug
Rainer Dr. Obermeier
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Sanofi Aventis Deutschland GmbH
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Hoechst AG
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography

Definitions

  • the insulin is biosynthesized via a precursor molecule, proinsulin.
  • a fusion protein is initially obtained, in which the proinsulin also contains a foreign protein, e.g. ß-lactosidase, is connected upstream. This foreign protein must first be split off before further processing, e.g. by treatment with cyanogen halogen (cf. DE-OS 34 40 988).
  • cysteine residues are converted into their S-sulfonate form by sulfitolysis (treatment with sodium sulfite and sodium tetrathionate).
  • the molecule can be converted from this form into its native spatial structure by reductive refolding (e.g. by treatment with mercaptoethanol in basic solution) with the correct formation of its disulfide bridges.
  • enzymatic cleavage eg with trypsin
  • some by-products are created, such as Insulin-Des-Thr-B30, Insulin-Arg-B31 and incompletely cleaved intermediates.
  • the insulin derivatives and compounds mentioned which result from the chemical treatment of the starting material in preliminary stages, must be separated from one another. Especially It is difficult here to separate off insulin derivatives of a basic character which have derivatizations of amino acids which lie inside the molecule after the tertiary structure has been formed.
  • the subject of the invention is accordingly a process for isolating basic proteins from protein mixtures which contain such basic proteins and which have been obtained by enzymatic cleavage of proinsulin and / or its derivatives of natural, semi-synthetic or of genetic engineering origin, by loading an ion exchanger with the protein mixture and elution, which is characterized in that a strongly acidic cation exchanger is used as the ion exchanger and that the elution is carried out using an H2O / C1-C4alkanol mixture which contains approx. 10 to 50% by volume , preferably contains about 20 to 40% by volume, in particular about 30% by volume, of alkanol.
  • the basic proteins can be isolated in high yields from cleavage mixtures of any proinsulins or their derivatives, such as, for example, monkey preproinsulin.
  • all strongly acidic cation exchangers can be used as ion exchangers.
  • Strongly acidic cation exchangers are preferred, the functional group of which is the sulfo group, in particular the sulfopropyl group -CH2-CH2-CH2-SO3H, for example on a matrix of hydrophilic hydroxyl group-containing vinyl polymers (for example (R) Fractogel TSK, manufacturer Merck, Darmstadt ), Acrylic copolymers (e.g.
  • This buffer solution preferably consists of a water / C1-C4 alkanol mixture, with an alkanol content of preferably approximately 10 to 50 vol.%, Particularly preferably approximately 20 to 40 vol.%, In particular approximately 30 vol. %.
  • Preferred alkanols are ethanol and isopropanol, especially isopropanol.
  • Further additives that can be added to the buffer solution are, for example, salt, preferably physiologically compatible mineral salt, one or more arbitrary organic acids, preferably lactic acid, a base, preferably NaOH, and / or preservatives.
  • the preferred pH of the buffer solution is between approximately 2.5 and 5.5, particularly preferably between approximately 3.5 and 4.0.
  • the strongly acidic cation exchanger can be loaded by dissolving the cleavage mixture in a buffer solution - preferably with the composition and pH described above - and bringing the solution thus obtained into contact with the strongly acidic cation exchanger.
  • the elution solution which in principle can have a similar composition to the buffer solution described above, preferably has a pH of 3.5 to 4.0.
  • An elution method in which the elution solution has a temporal salt concentration gradient with a preferably linear course is particularly suitable.
  • This concentration gradient can e.g. can be created by having a low salt concentration (in the limit against 0) in the elution solution at the beginning of the elution and by increasing the salt concentration during the elution process. In this way, a particularly effective separation of the protein mixture can be achieved.
  • a preferred salt concentration gradient varies from close to 0 mol salt / l (at the beginning of the elution) to approx.
  • the separation process according to the invention can be carried out in different ways. It is preferable to use the column process or the batch process.
  • the temperature which is preferably to be kept constant in ion exchange chromatography, can be varied within a wide range. A temperature interval of approx. -10 ° C to approx. 50 ° C, in particular from approx. 15 to approx. 25 ° C, is preferred.

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Abstract

Basische Proteine werden aus Proteingemischen, welche solche basischen Proteine enthalten und welche erhalten werden durch enzymatische Spaltung von Proinsulin und/oder dessen Derivaten natürlicher, semisynthetischer oder gentechnischer Herkunft, durch Ionenaustauscherchromatographie an stark sauren Kationenaustauschern isoliert.

Description

  • Bei der Herstellung von Humaninsulin mit gentechnischen Methoden erfolgt die Biosynthese des Insulins über ein Vorläufermolekül, das Proinsulin. In diesem ist die B-Kette durch das C-Peptid (= Connecting Peptide) mit der A-Kette verknüpft. Bei der gentechnischen Produktion mittels Escherichia coli erhält man mitunter zunächst ein Fusionsprotein, bei dem dem Proinsulin noch ein Fremdprotein, z.B. ß-Glactosidase, vorgeschaltet ist. Dieses Fremdprotein muß vor der weiteren Aufarbeitung zunächst abgespalten werden, z.B. durch die Behandlung mit Halogencyan (vgl. DE-OS 34 40 988). Nach der Halogencyanspaltung werden Cysteinreste durch Sulfitolyse (Behandlung mit Natriumsulfit und Natriumtetrathionat) in ihre S-Sulfonatform überführt. Das Molekül kann aus dieser Form durch reduktive Rückfaltung (z.B. durch Behandlung mit Mercaptoethanol in basischer Lösung) unter korrekter Ausbildung seiner Disulfidbrücken in seine native Raumstruktur überführt werden. Das Proinsulin bzw. Präproinsulin (= Derivat des Proinsulins; die Vorsilbe "Prä" bezieht sich auf eine oder mehrere zusätzliche Aminosäuren am N-Terminus des Proinsulins) wird durch enzymatische Spaltung (z.B. mit Trypsin) in ein Spaltungsgemisch überführt, das einen Insulinvorläufer, das Insulin-Arg-B31-B32, und das C-Peptid enthält. Neben diesen entstehen noch einige Nebenprodukte, wie z.B. Insulin-Des-Thr-B30, Insulin-Arg-B31 sowie unvollständig gespaltene Intermediate.
  • Die genannten Insulinderivate und Verbindungen, die durch die chemische Behandlung des Ausgangsmaterials in Vorstufen entstehen, müssen voneinander getrennt werden. Besonders schwierig ist es hierbei, Insulinderivate basischen Charakters abzutrennen, die Derivatisierungen an Aminosäuren aufweisen, die nach Ausbildung der Tertiärstruktur im Inneren des Moleküls liegen.
  • Dies zeigt sich in einem Vergleichsversuch (s. Teil B): Das Anionenaustauscherverfahren, das in der DE-PS 26 29 568 beschrieben und für die Reinigung von Insulin entwickelt worden ist, weist die Besonderheit auf, daß zur Vermeidung von Proteinaggregationen der Elutionsflüssigkeit ein nichtionisches Tensid zugegeben wird. Dieses Verfahren, das zur Reinigung von Insulinen gut geeignet ist, führt beim Versuch der Trennung und Isolierung von basischen Proteinen, die z.B. durch tryptische Spaltung von Proinsulin gentechnischer Herkunft erhalten werden, zu einer völlig unzureichenden Trennung. Dies wird durch das entsprechende Elutionsprofil (s. Teil B) verdeutlicht; man erkennt, daß die Peaks für die einzelnen Peptide ineinander übergehen.
  • Es sind auch bereits Verfahren bekannt, mit denen die Auftrennung der genannten Proinsulin-Spaltungsprodukte erreicht werden soll.
    Steiner et al. berichten im "Journ. of Biol. Chem.", 246, pp. 1365-1374 (1971) über ein Verfahren zur Isolierung von C-Peptid aus einem Proinsulinspaltungsgemisch. Bei diesem Verfahren (Ausbeuten werden nicht angegeben) wird über einen schwach sauren, Carboxymethylgruppen-haltigen (CM) Kationenaustauscher auf Cellulosebasis chromatographiert. Der Beladungs- und Elutionslösung werden hierbei 7 Mol/l Harnstoff zugesetzt, um eine Aggregation der Proteine zu vermeiden. Die Gegenwart derartig hoher Harnstoffkonzentrationen ist nachteilig, weil sie zur Derivatisierung von Proteinen, vor allem zur Carbamoylierung freier Aminogruppen führt. Markussen et al. beschreiben in "Protein Engineering " Vol. 1 No. 3, pp. 205-213 (1987) ein Anionenaustauscherchromatographie-­Verfahren an Diethyl-2-hydroxypropylaminoethyl-haltigen (QAE) Anionenaustauschern auf einer Matrix aus dreidimensional vernetztem Polysaccharid-Netzwerk.
    Bei diesem Verfahren - für die Anionenaustauscherchromato­graphie werden keine Ausbeuten angegeben - wird zur Hemmung von Proteinaggregationen in 60 %iger Ethanollösung gearbeitet. Ein Nachteil derartig konzentrierter Ethanollösungen besteht in den nötigen Sicherheitsvorkehrungen, die insbesondere beim Arbeiten mit konzentrierten organischen Lösungsmitteln in technischem Maßstab nötig sind. Andererseits treten, wie sich beim Nacharbeiten zeigte, bei den genannten Alkoholkonzentrationen Denaturierungen der Proteine auf.
  • In dem Bestreben, ein besseres Trenn- und Isolierverfahren für basische Proteine aus - solche basischen Proteine enthaltenden - Proteingemischen bereitzustellen, wurde überraschenderweise gefunden, daß sich dieses Ziel durch Chromatographie der Proteingemische an einem stark sauren Kationenaustauscher und Elution mittels wäßrigem Alkanol mit nur einer relativ geringen Menge Alkanol erreichen läßt. Es ist besonders überraschend, daß sich damit gegenüber dem Stand der Technik sowohl die Trennleistung verbessern als auch die zusätzlichen Derivatisierungen der Proteine während der Trennung weitgehend vermeiden lassen. Bemerkenswerterweise können sogar Derivate abgetrennt werden, die - bei der Vorbehandlung des Proinsulins entstandene - Derivatisierungen im Inneren der in der Tertiärstruktur vorliegenden Proteine aufweisen. Aggregationen der zu trennenden Proteine werden nicht beobachtet. Die Wiederverwendbarkeit der Austauscher bereitet keine Schwierigkeiten.
  • Erfindungsgegenstand ist demzufolge ein Verfahren zur Isolierung basischer Proteine aus Proteingemischen, welche solche basischen Proteine enthalten und welche erhalten wurden durch enzymatische Spaltung von Proinsulin und/oder dessen Derivaten natürlicher, semisynthetischer oder gentechnischer Herkunft, durch Beladung eines Ionenaustauschers mit dem Proteingemisch und Elution, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Ionenaustauscher einen stark sauren Kationenaustauscher verwendet und daß man die Elution mittels eines H₂O/C₁-C₄Alkanolgemisches, das ca. 10 bis 50 Vol.-%, vorzugsweise ca. 20 bis 40 Vol.-%, insbesondere ca. 30 Vol.-% Alkanol enthält, durchführt. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können aus Spaltungsgemischen beliebiger Proinsuline, bzw. von deren Derivaten, wie z.B. von Affenpräproinsulin, die basischen Proteine mit hohen Ausbeuten isoliert werden. Als Ionenaustauscher kommen im Prinzip alle stark sauren Kationenaustauscher in Frage. Bevorzugt sind stark saure Kationenaustauscher, deren funktionelle Gruppe die Sulfogruppe, insbesondere die Sulfopropylgruppe -CH₂-CH₂-CH₂-SO₃H, ist, z.B. auf einer Matrix aus hydrophilen Hydroxygruppen-haltigen Vinylpolymeren (z.B. (R)Fractogel TSK, Hersteller Fa. Merck, Darmstadt), Acryl-Copolymeren (z.B. SP (R)Trisacryl M, Hersteller Réactifs IBF, Villeneuve- la-Garenne, Frankreich) oder Gelen mit einem Anteil an vernetzter Agarose (z.B. S-(R)Sepharose, Hersteller Fa. Pharmacia, Upsala, Schweden); besonders bevorzugt ist S-Sepharose.
  • Vor der Beladung des stark sauren Kationenaustauschers mit dem Spaltungsgemisch sollte derselbe mit einer Pufferlösung frisch equilibriert werden. Diese Pufferlösung besteht vorzugsweise aus einem Wasser/C₁-C₄-Alkanolgemisch, mit einem Alkanolgehalt von vorzugsweise ca. 10 bis 50 Vol.-%, besonders bevorzugt von ca. 20 bis 40 Vol.-%, insbesondere von ca. 30 Vol.-%. Bevorzugte Alkanole sind Ethanol und Isopropanol, insbesondere Isopropanol. Weitere Zusatzstoffe, die der Pufferlösung zugesetzt werden können, sind z.B. Salz, vorzugsweise physiologisch verträgliches Mineralsalz, eine oder mehrere beliebige organische Säuren, vorzugsweise Milchsäure, eine Base, vorzugsweise NaOH, und/oder Konservierungsstoffe. Der bevorzugte pH-Wert der Pufferlösung liegt zwischen ca. 2,5 und 5,5, besonders bevorzugt zwischen ca. 3,5 und 4,0.
  • Die Beladung des stark sauren Kationenaustauschers kann erfolgen, indem das Spaltungsgemisch in einer Pufferlösung - ­vorzugsweise mit der zuvor beschriebenen Zusammensetzung und dem zuvor beschriebenen pH-Wert - gelöst wird und die so erhaltene Lösung mit dem stark sauren Kationenaustauscher in Kontakt gebracht wird.
  • Die Elutionslösung, die im Prinzip eine ähnliche Zusammensetzung wie die zuvor beschriebene Pufferlösung haben kann, hat vorzugsweise einen pH-Wert von 3,5 bis 4,0. Besonders geeignet ist ein Elutionsverfahren, bei dem die Elutionslösung einen zeitlichen Salz-Konzentrations­gradienten mit vorzugsweise linearem Verlauf aufweist. Dieser Konzentrationsgradient kann z.B. angelegt werden, indem zu Beginn der Elution eine geringe Salzkonzentration (im Grenzfall gegen 0) in der Elutionslösung vorliegt und indem die Salzkonzentration während des Elutionsvorgangs gesteigert wird. Auf diese Weise kann eine besonders wirksame Trennung des Proteingemisches erreicht werden. Ein bevorzugter Salz-Konzentrationsgradient variiert von nahe 0 Mol Salz/l (zu Anfang der Elution) bis ca. 1 Mol Salz/1 (zu Ende der Elution), besonders bevorzugt von ca. 0,15 (zu Anfang der Elution) bis ca. 0,35 Mol/l (zu Ende der Elution). Für den Salzzusatz kommen viele organische und anorganische Salze in Frage. Bevorzugt sind physiologisch verträgliche Salze wie Ammonium- und Alkalisalze, besonders bevorzugt Natriumsalze, insbesondere Natriumchlorid.
  • Das erfindungsgemäße Trennverfahren kann auf unterschiedliche Weise durchgeführt werden. Zu bevorzugen ist die Durchführung im Säulenverfahren oder im Batchverfahren. Die Temperatur, die bei der Ionenaustauscherchromatographie vorzugsweise konstant zu halten ist, kann in einem weiten Bereich variiert werden. Vorzuziehen ist ein Temperaturintervall von ca. -10°C bis ca. 50°C, insbesondere von ca. 15 bis ca. 25°C.
  • Durch das nachfolgende Ausführungsbeispiel (A) soll die Erfindung näher erläutert werden. Durch den daran anschließenden Vergleich (B) soll die Überlegenheit des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber einem Verfahren zur Insulinreinigung gemäß dem Stand der Technik (DE-PS 26 29 568) gezeigt werden.
    • A) Ausführungsbeispiel (erfindungsgemäß)
      6 l S-Sepharose werden in einer wäßrigen Pufferlösung, die 50 mmol/l Milchsäure, 30 % Isopropanol und 1 Mol/l Natriumchlorid enthält und deren pH-Wert bei ca. 3,5 liegt, aufgeschlämmt und ca. 80 cm hoch in eine Säule mit 10 cm Durchmesser gefüllt. Die Säule wird mit 10 l wäßriger Startpufferlösung (50 mmol/l Milchsäure, 30 % Isopropanol, 0,15 Mol./l Natriumchlorid, pH ca. 3,5) äquilibriert. 15 g kristallisiertes Spaltungsgemisch, das 6,2 g Insulin-Arg-B31-32, 3 g Insulin-Arg-B31 und Insulin-Des-Thr-B30 sowie unbekannte Spaltungsintermediate sowie Derivate enthält, entstanden aus tryptischer Spaltung von Präprohumaninsulin, werden in 3 l Startpuffer gelöst und auf die Säule aufgetragen. Anschließend wird mit einer wäßrigen Lösung, enthaltend 50 mmol/l Milchsäure und 30 % Isopropanol bei einem pH-Wert von 3,5 (eingestellt mit NaOH) und einem Gradienten von 0,15 Mol./l bis 0,35 Mol/l Natriumchlorid eluiert. Die Elutionslösung hat ein Volumen von 2 x 20 1. Die Durchflußgeschwindigkeit beträgt 1,5 l/Stunde. Fraktionen, deren Insulin-Arg-B31-32-Gehalt laut HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) über 90% ist, werden gesammelt, mit H₂O im Verhältnis 1:1 verdünnt und durch Zugabe von 10 ml 10 %iger ZnCl₂-Lösung/l Lösung und Einstellung auf pH 6,8 gefällt. Die Ausbeute beträgt 5 g Insulin-Arg-B31-32, was einer Stufenausbeute, bezogen auf Insulin-Arg-B31-32, von 80 % entspricht.
    • B) Vergleich
      Vergleichsbeispiel I wurde gemäß DE-PS 26 29 568 und Beispiel II erfindungsgemäß durchgeführt. In Tabelle 1 sind die Verfahrensparameter und die erzielten Ergebnisse gegenübergestellt. Figur 1 zeigt das während der Elution aufgenommene Elutionsprofil des Vergleichsbeispiels I, Figur 2 dasjenige des erfindungsgemäßen Beispiels II. Es wurde die Absorption A im UV-Bereich bei einer Wellenlänge von 278 nm (A₂₇₈) gegen die Elutionszeit bzw. die Fraktions- Nrn. aufgetragen. Die Elutionsprofile zeigen, daß das erfindungsgemäße Verfahren zu einer besseren Trennung der basischen Proteine führt als das nach der DE-PS 26 29 568 durchgeführte Verfahren. Dementsprechend wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren auch eine höhere Produktausbeute und eine höhere Produktreinheit erzielt (s. Tabelle 1)
    Figure imgb0001

Claims (7)

1. Verfahren zur Isolierung basischer Proteine aus Proteingemischen, welche solche basischen Proteine enthalten und welche erhalten wurden durch enzymatische Spaltung von Proinsulin und/oder dessen Derivaten natürlicher, semisynthetischer oder gentechnischer Herkunft, durch Beladung eines Ionenaustauschers mit dem Proteingemisch und Elution, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ionenaustauscher einen stark sauren Kationen­austauscher verwendet und daß man die Elution mittels eines H₂O/C₁-C₄-Alkanol-Gemisches, das ca. 10 bis 50 %, vorzugsweise ca. 20 bis 40 %, insbesondere ca. 30 % Alkanol enthält, durchführt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als stark sauren Kationenaustauscher einen solchen mit Sulfogruppen, insbesondere mit Sulfopropylgruppen verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Beladung des stark sauren Kationenaustauschers bei einem pH-Wert zwischen ca. 2,5 und 5,5, vorzugsweise zwischen ca. 3,5 und 4,0, durchführt.
4. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das zur Elution benutzte H₂O/­C₁-C₄-Alkanol-Gemisch als C₁-C₄-Alkanol Ethanol oder Isopropanol, insbesondere Isopropanol, enthält.
5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert der Elutionslösung auf ca. 3,5 bis 4,0 einstellt.
6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Beladungs- und Elutionslösung eine Puffersubstanz, bevorzugt auf Basis einer organischen Säure, insbesondere Milchsäure, enthält.
7. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß mit einem Ammonium- oder Alkalisalzgradienten zwischen ca. 0 bis 1 Mol/l, insbesondere mit ca. 0,15 bis 0,35 Mol/l, eluiert wird.
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PH (1) PH26874A (de)
PT (1) PT88230B (de)
ZA (1) ZA885871B (de)

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0600372A1 (de) 1992-12-02 1994-06-08 Hoechst Aktiengesellschaft Verfahren zur Gewinnung von Proinsulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken
US6221837B1 (en) 1996-07-26 2001-04-24 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Insulin derivatives with increased zinc binding
US6221633B1 (en) 1997-06-20 2001-04-24 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Insulin derivatives having a rapid onset of action
US6686177B1 (en) 1998-06-06 2004-02-03 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Insulin analogs with enhanced zinc binding
US7476652B2 (en) 2002-06-18 2009-01-13 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Acidic insulin preparations having improved stability
WO2011004129A1 (fr) * 2009-07-09 2011-01-13 Institut Supérieur Des Sciences Agronomiques, Agroalimentaires, Horticoles Et Du Paysage (Agro Campus Ouest) Utilisation d'un coproduit issu d'un procede d'extraction du lysozyme a partir de blanc d'oeuf, pour l'obtention d'au moins une proteine basique de blanc d'oeuf
EP2348044A1 (de) * 1999-03-15 2011-07-27 Novo Nordisk A/S Ionenaustauschchromatographie von GLP-1, Analoga und Derivate davon
US8067554B2 (en) 1999-03-15 2011-11-29 Novo Nordisk A/S Ion exchange chromatography of GLP-1, analogs and derivatives thereof
US9526764B2 (en) 2008-10-17 2016-12-27 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Combination of an insulin and a GLP-1-agonist
US9707176B2 (en) 2009-11-13 2017-07-18 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical composition comprising a GLP-1 agonist and methionine
US9821032B2 (en) 2011-05-13 2017-11-21 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin
US9950039B2 (en) 2014-12-12 2018-04-24 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Insulin glargine/lixisenatide fixed ratio formulation
US9981013B2 (en) 2010-08-30 2018-05-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Use of AVE0010 for the treatment of diabetes mellitus type 2
US9987332B2 (en) 2011-09-01 2018-06-05 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical composition for use in the treatment of a neurodegenerative disease

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19652713C2 (de) * 1996-12-18 2001-11-22 Aventis Pharma Gmbh Verfahren zur Reinigung von Insulin und Insulinderivaten durch Chromatographie an stark saurem Kationenaustauscher
KR100341297B1 (ko) * 1997-03-29 2002-11-16 주식회사종근당 재조합활성형프로인슐린의분리.정제방법
US6451987B1 (en) * 1999-03-15 2002-09-17 Novo Nordisk A/S Ion exchange chromatography of proteins and peptides
DE10114178A1 (de) 2001-03-23 2002-10-10 Aventis Pharma Gmbh Zinkfreie und zinkarme Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität
DE10235168A1 (de) * 2002-08-01 2004-02-12 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Verfahren zur Reinigung von Preproinsulin
US7193035B2 (en) * 2002-10-29 2007-03-20 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Crystals of insulin analogs and processes for their preparation
SE0300791D0 (sv) * 2003-03-20 2003-03-20 Amersham Biosciences Ab Use of ph-responsive polymers
PL1664108T3 (pl) * 2003-08-21 2010-03-31 Novo Nordisk As Rozdzielanie polipeptydów zawierających racemizowany aminokwas
KR101039353B1 (ko) * 2005-08-04 2011-06-08 도요 세이칸 가부시키가이샤 플라스틱 보틀 살균 방법
KR101972301B1 (ko) 2009-11-13 2019-04-25 사노피-아벤티스 도이칠란트 게엠베하 Ｇｌｐ－１ 작용제, 인슐린 및 메티오닌을 포함하는 약제학적 조성물
HUE027989T2 (en) 2011-08-29 2016-11-28 Sanofi Aventis Deutschland A pharmaceutical composition for use in glycemic control in patients with type 2 diabetes
CN103827136B (zh) * 2011-09-30 2016-07-06 通用电气健康护理生物科学股份公司 纯化裂解的胰岛素原的方法
US10421795B2 (en) * 2012-12-17 2019-09-24 Merck Sharp & Dohme Corp. Process for purifying insulin and analogues thereof
WO2015138548A1 (en) 2014-03-14 2015-09-17 Merck Sharp & Dohme Corp. Purifying insulin using cation exchange and reverse phase chromatography in the presence of an organic modifier and elevated temperature
TWI748945B (zh) 2015-03-13 2021-12-11 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 第２型糖尿病病患治療
TW201705975A (zh) 2015-03-18 2017-02-16 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 第２型糖尿病病患之治療
JPWO2018147393A1 (ja) * 2017-02-10 2019-11-21 三菱ケミカル株式会社 ヒトインスリン精製用分離剤及びヒトインスリンの精製方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2375193A1 (fr) * 1976-12-27 1978-07-21 Univ Minnesota Procede de stabilisation, de concentration et de purification de l'insuline
EP0000439A1 (de) * 1977-07-08 1979-01-24 Laboratorios Leo S.A. Verfahren zur Reinigung eines Insulin enthaltenden, wässerig-äthanolischen Rohextraktes aus Pankreasdrüsen
EP0087932A1 (de) * 1982-02-26 1983-09-07 Eli Lilly And Company Verfahren zur Wiedergewinnung von Insulin
GB2173503A (en) * 1985-04-12 1986-10-15 Berlin Chemie Veb Purification of insulin
DD247684A1 (de) * 1983-04-14 1987-07-15 Ulrich Krabiell Verfahren zur isolierung von insulinderivaten

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2629568C3 (de) * 1976-07-01 1981-09-10 Hoechst Ag, 6000 Frankfurt Verfahren zur Reinigung von Insulin, seinen Analogen und Derivaten
ATE95236T1 (de) * 1983-04-25 1993-10-15 Chiron Corp Hybrid-dns-synthesis von reifen insulinaehnlichen wachstumsfaktoren.
DE3440988A1 (de) * 1984-11-09 1986-07-10 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Verfahren zur spaltung von peptiden und proteinen an der methionyl-bindung
JPS6379591A (ja) * 1986-09-22 1988-04-09 Mitsui Toatsu Chem Inc ｔＰＡの精製方法
AU607988B2 (en) * 1987-04-21 1991-03-21 Southern Cross Biotech Pty Ltd. Production of proteins in active forms
DE68919647T2 (de) * 1988-10-26 1995-05-11 American Cyanamid Co Verfahren zur Verringerung des Aggregatinhaltes in Wachstumshormonen gleichenden Stoffen.

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2375193A1 (fr) * 1976-12-27 1978-07-21 Univ Minnesota Procede de stabilisation, de concentration et de purification de l'insuline
EP0000439A1 (de) * 1977-07-08 1979-01-24 Laboratorios Leo S.A. Verfahren zur Reinigung eines Insulin enthaltenden, wässerig-äthanolischen Rohextraktes aus Pankreasdrüsen
EP0087932A1 (de) * 1982-02-26 1983-09-07 Eli Lilly And Company Verfahren zur Wiedergewinnung von Insulin
DD247684A1 (de) * 1983-04-14 1987-07-15 Ulrich Krabiell Verfahren zur isolierung von insulinderivaten
GB2173503A (en) * 1985-04-12 1986-10-15 Berlin Chemie Veb Purification of insulin

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEMICAL ABSTRACTS, Band 108, 1988, Seite 336, Zusammenfassung Nr. 226915n, Columbus, Ohio, US; U. KRABIELL et al.: "Separation and purification of insulin from its B-components (proinsulin) on ion-exchange resins consisting of crosslinked acrylic acid polymers", & DD-A-247 684 (15-07-1987) *

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0600372A1 (de) 1992-12-02 1994-06-08 Hoechst Aktiengesellschaft Verfahren zur Gewinnung von Proinsulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken
US6221837B1 (en) 1996-07-26 2001-04-24 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Insulin derivatives with increased zinc binding
US6221633B1 (en) 1997-06-20 2001-04-24 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Insulin derivatives having a rapid onset of action
US6686177B1 (en) 1998-06-06 2004-02-03 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Insulin analogs with enhanced zinc binding
EP2348044A1 (de) * 1999-03-15 2011-07-27 Novo Nordisk A/S Ionenaustauschchromatographie von GLP-1, Analoga und Derivate davon
US8067554B2 (en) 1999-03-15 2011-11-29 Novo Nordisk A/S Ion exchange chromatography of GLP-1, analogs and derivatives thereof
US7476652B2 (en) 2002-06-18 2009-01-13 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Acidic insulin preparations having improved stability
US9526764B2 (en) 2008-10-17 2016-12-27 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Combination of an insulin and a GLP-1-agonist
US10117909B2 (en) 2008-10-17 2018-11-06 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Combination of an insulin and a GLP-1 agonist
FR2947818A1 (fr) * 2009-07-09 2011-01-14 Inst Superieur Des Sciences Agronomiques Agroalimentaires Horticoles Et Du Paysage Agro Campus Ouest Utilisation d'un coproduit issu d'un procede d'extraction du lysozyme a partir de blanc d'oeuf, pour l'obtention d'au moins une proteine basique de blanc d'oeuf
WO2011004129A1 (fr) * 2009-07-09 2011-01-13 Institut Supérieur Des Sciences Agronomiques, Agroalimentaires, Horticoles Et Du Paysage (Agro Campus Ouest) Utilisation d'un coproduit issu d'un procede d'extraction du lysozyme a partir de blanc d'oeuf, pour l'obtention d'au moins une proteine basique de blanc d'oeuf
US9707176B2 (en) 2009-11-13 2017-07-18 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical composition comprising a GLP-1 agonist and methionine
US10028910B2 (en) 2009-11-13 2018-07-24 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical composition comprising a GLP-1-agonist and methionine
US9981013B2 (en) 2010-08-30 2018-05-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Use of AVE0010 for the treatment of diabetes mellitus type 2
US9821032B2 (en) 2011-05-13 2017-11-21 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin
US9987332B2 (en) 2011-09-01 2018-06-05 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical composition for use in the treatment of a neurodegenerative disease
US9950039B2 (en) 2014-12-12 2018-04-24 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Insulin glargine/lixisenatide fixed ratio formulation

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