KR0129539B1 - 염기성 단백질이 함유된 혼합물로부터 염기성 단백질을 분리하는 방법 - Google Patents
염기성 단백질이 함유된 혼합물로부터 염기성 단백질을 분리하는 방법Info
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Abstract
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Description
제1도는 비교실시예 I 의 용출 프로필을 나타내는 그래프이다.
제2도는 본 발명에 따른 실시예 Ⅱ의 용출 프로필을 나타내는 그래프이다.
본 발명은 염기성 단벡질이 함유된 단백질 혼합물로부터 염기성 단백질을 분리하는 방법에 관한 것이다.
유전공학 방법에 의한 사람 인슐린의 제조시, 인슐린의 생합성은 프로인슐린이라 일컫는 전구체 분자를 경유하여 수행된다. 여기에서, B쇄는 C 펩타이드(연결 펩타이드)에 의해 A쇄에 연결된다. 에스케리키아 콜라이(E. coli)를 이용한 유전공학적 제조방법에서는, 때때로 프로인슐린 앞에 다른 외래 단백질(예, β-갈락토시다제)이 위치한 융합 단백질이 일차로 수득된다. 이러한 외래 단백질은, 추가의 후처리에 앞서서, 예를들면 시아노겐 할라이드의 처리방법에 의해 일차로 분리된다(참조 : 독일연방공화국 공개 특허공보 제 34 40 988호). 시아노겐 할라이드 분해후, 시스테인 라디칼은 가설파이트 분해(아황산나트륨 및 나트륨 테트라티오네이트로 처리)에 의해 그의 S-설포네이트 형태로 전환시킨다. 이러한 분자형태를, 환원적 역 폴딩(예 : 염기성 용액중에서 머캅토에탄올로 처리)으로 디설파이드 브리지가 정확히 형성되도록 하여, 천연 3차 구조로 전환시킬 수 있다. 프로인슐린 또는 프리프로인슐린(프로인슐린의 유도체 ; 접두사 프리는 프로인슐린의 N 말단에 추가로 연결된 하나 이상의 아미노산을 의미한다)은 효소적 분해(예, 트립신에 의한 처리)에 의해 인슐린 전구체, 인슐린-Arg-B31-B32 및 C 펩타이드가 함유된 분해 혼합물로 전환된다. 이들 외에도, 몇가지 부산물, 예를들면 인슐린-Des-Thr-B30, 인슐린-Arg-B31 및 불완전하게 분해된 중간물질이 형성된다.
언급된 인슐린 유도체, 및 출발물질의 화학적 처리에 의해 예비단계에서 형성된 화합물은 서로로부터 분리되어야 한다.
3차 구조의 형성후, 분자내에 존재하는 아미노산 상에서의 유도체화의 기본특성을 갖는 인슐린 유도체를 분리하는 것은 특히 어렵다.
이 사실은 비교 실험(B항 참조)에서 밝혀졌다: 독일연방공화국 특허 제2629568호에 기술되어 있으며 인슐린의 정제를 위해 개발된 음이온 교환체 방법은 용리액의 단백질 응집을 방지하기 위하여 비이온성 계면활성제를 가하는 특성을 갖는다. 인슐린의 정제에 특히 적합한 이 방법은, 예를들어 유전공학적 방법으로 수득한 프로인슐린을 트립신으로 분해시켜 수득한 염기성 단백질을 분리하고 단리하고자 하는 시도에서 전혀 불충분한 분리를 유도한다. 이 사실은 상용하는 용출 프로파일(B항 참조)에 의해 입증된다 ; 여기에서는 각각의 펩타이드에 대한 피크가 서로 겹침을 알 수 있다.
언급된 프로인슐린 분해 생성물을 분리하기 위한 방법들은 또한 이미 공지되어 있다. 문현[Steiner et al, in Journ. of Biol. Chem., 246, pages 1365-1374(1971)]에는 프로인슐린 분해 혼합물로부터 C 펩타이드를 분리하는 방법이 기술되어 있다. 이 방법(수율은 기술되어 있지 않다)에서는 카복실메틸 그룹(CM)을 함유한 약산 셀룰로조계 양이온 교환체상에서 크로마토그래피를 수행한다.
단백질의 응집을 방지하기 위하여 요소 7mol/1를 충전 및 용출용액에 가한다. 이러한 고농도의 요소의 존재는 단백질의 유도체화, 특히 유리 아미노 그룹의 카바모일화를 초래하기 때문에 하나의 단점이 된다. 문헌[참조 : Markussen et al., in Protein Engineering Volume 1 Vo.3, pages 205-213(1987)]에는 3차원적으로 가교결합된 다당류 네트워크의 매트릭스상의 디에틸-2-하이드록시프로필아미노에틸-함유(QAE) 음이온 교환체상에서의 음이온 교환 크로마토그래피 방법이 기술되어 있다.
이 방법-음이온 교환 크로마토그래피의 수율은 나타나 있지 않다-은 단백질 응집을 억제하기 위하여 60% 에탄올 용액중에서 수행한다. 산업적 규모로 농축된 유기용매를 사용하여 처리할 때 특히 필수적으로 필요한 안정성이 상기 농도의 에탄올 용액의 하나의 단점이다. 한편, 재처리시 언급된 알코올 농도에서 단백질의 변성이 일어나는 것으로 나타났다.
염기성 단백질이 함유된 단백질 혼합물로부터 염기성 단백질의 좀더 양호한 분리 및 단리 방법을 제공하기 위한 노력의 결과로, 이 목적은 놀랍게도 강산 양이온 교환체상에서의 단백질 혼합물의 크로마토그래피 및 단지 비교적 소량의 알칸올을 함유하는 수정 알칸올을 사용한 용출에 의해 달성될 수 있음이 밝혀졌다. 특히 놀라운 점은 선행기술에 비해 분리능력을 향상시킬 수 있으며 분리 동안에 단백질의 추가 유도체화를 상당히 방지할 수 있다는데 있다. 3차 구조로 존재하는 단백질 내에 유도체화-프로인슐린의 전처리 동안에 형성됨-를 포함하는 유도체 조차도 놀랍게도 분리시킬 수 있다. 분리될 단백질의 응집은 전혀 관찰되지 않는다. 교환체의 재사용에도 전혀 어려움이 없다.
따라서, 본 발명은 염기성 단백질을 함유하며 프로인슐린 및/또는 이의 천연, 반합성 또는 유전공학기원 유도체의 효소적 분해에 의해 수득된 단백질 혼합물을 이온 교환체에 충전시키고 용출시켜 단백질 혼합물로부터 염기성 단백질을 분리하는 방법으로 이온 교환체로서 강산 양이온 교환체를 사용하고 용출단계를 약 10 내지 50용적%, 바람직하게는 약 20 내지 40용적%, 특히 약 30용적%의 알칸올이 함유된 H2O/C1-C4-알칸올 혼합물을 사용하여 수행함을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의해 목적하는 모든 프로인슐린 또는 이의 유도체(예 : 원숭이 프리프로인슐린)의 분해 혼합물로부터 염기성 단백질을 고수율로 단리 할 수 있다. 사용가능한 이온 교환체는 원칙적으로 모든 강산 양이온 교환체다. 예를들어, 하이드록실 그룹을 함유하는 친수성 비닐 중합체(예 :(R)Fractogel TSK ; 제조원 : 다름슈타트 소재의 Merck), 아크릴 공중합체(예 : SP(R)트리스-아크릴 M ; 제조원 : 프랑스 Villeneuveu-La-Garenne 소재의 R
actifs IBF) 또는 특정량의 가교결합된 아가로즈를 갖는 겔(예 : S-(R)) 세파로즈 ; 제조원 : 스웨덴 웁살라 소재의 Pharmacia)의 매트릭스상의, 작용그룹이 설포 그룹, 특히 설포프로필 그룹 -CH2-CH2-CH2-SO3H 인 강산 양이온 교환체가 바람직하다 ; S-세파로즈가 특히 바람직하다.
분해 혼합물에 의한 강산 양이온 교환체의 충전 전에, 이는 반드시 완충용액으로 새로 평형화시켜야 한다. 이 환충용액은 바람직하게는 알칸올 함량이 약 10 내지 50용적%, 특히 바람직하게는 약 20 내지 40용적%, 더욱 특히 바람직하게는 약 30용적%인 물/C1-C4-알칸올 혼합물로 구성되는 것이 바람직하다. 바람직한 알칸올은 에탄올 및 이소프로판올, 특히 이소프로판올이다. 추가로 완충용액에 첨가될 수 있는 첨가제는 예를들면 염, 바람직하게는 생리학적으로 허용되는 무기염, 하나 아니상의 목적하는 유기산, 바람직하게는 락트산, 염기, 바람직하게는 NaOH, 및/또는 보존체이다. 완충용액의 바람직한 pH는 약 2.5 내지 5.5, 특히 바람직하게는 약 3.5 내지 4.0이다.
강산 양이온 교환체의 충전은 바람직하게는 상술한 조성 및 상술한 pH를 갖는 완충용액중에 분해 혼합물을 용해키시고 생성된 용액을 강산 양이온 교환체와 접촉시켜 수행할 수 있다.
원칙적으로 상술한 완충용액과 유사한 조성을 가질 수 있는 용출용액은 pH 3.5 내지 4.0인 것이 바람직하다. 용출용액이 바람직하게는 직선으로 나타나는 염의 농도/시간 구배를 갖는 용출방법이 특히 적합하다. 이러한 농도 구배는, 예를들면 용출용액이 용출 시발점에서 저염농도(한계 상태에서는 0에 가깝다)로 존재하고 용출의 진행 동안에 염의 농도가 증가되도록 설정할 수 있다. 이러한 방법에 의해 단백질 혼합물의 특히 효과적인 분리가 달성될 수 있다. 바람직한 염 농도구배는 거의 0몰의 염/ℓ(용출 시발점에서)로부터 약 1몰의 염/ℓ(용출 종결점에서)까지 변할 수 있으며, 특히 약 0.15(용출 출발점에서) 내지 약 0.35몰/ℓ(용출 종결점에서)가 바람직하다. 염의 첨가시 많은 유기 및 무기염이 사용될 수 있다. 생리학적으로 허용되는 염(예 : 암모늄 및 알칼리 금속염)이 바람직하며, 특히 나트륨 염, 더욱 특히 염화나트륨이 바람직하다.
본 발명에 따른 분리방법은 여러가지 방법으로 수행할 수 있다. 연속식 또는 뱃치석 방법이 바람직하다. 이온교환 크로마토그래피 동안에 온도는 일정하게 유지됨이 바람직하고, 넓은 범위에서 변할 수 있다. 바람직한 온도범위는 약 -10℃ 내지 약 50℃, 특히 약 15 내지 약 25℃이다.
하기의 실시양태(A)로 본 발명을 좀더 상세히 설명하고자 한다. 선행기술에 따른 인슐린 정제방법(독일연방공화국 특허 제2629568호)에 비한 본 발명 방법의 우수성은 하기의 비교예(B)에서 밝혀진다.
A) (본 발명에 따른) 실시양태
락트산 50mmol/1, 30% 이소프로판올 및 염화 나트륨 1몰/ℓ가 함유된 완충수 용액(pH 약 3.5)중에 6ℓ의 S-세파로즈를 현탁시키고, 직경 10㎝의 컬럼에 현탁액을 약 80㎝의 높이까지 채운다. 컬럼을 10ℓ의 출발 완충 수용액(락트산 50mmol/1, 30% 이소프로판올, 염화 나트륨 0.15mol/1, pH 약 3.5)으로 평형시킨다. 6.2g의 인슐린-Arg-B31-32, 3g의 인슐린-Arg-B31 및 인슐린-Des-Thr-B30, 및 미지의분해 중간체 및 유도체를 함유하고 사람 프리프로인슐린의 트립신 분해에 의해 형성된 15g의 결정화된 분해 혼합물을 출발 완충액 3ℓ에 용해시키고, 이 용액을 컬럼에 적용시킨다. 이어서, 컬럼을 락트산 50mmol/1 및 30% 이소프로판올, 및 0.15몰/ℓ 내지 0.35몰/ℓ 구배의 염화나트륨이 함유된 수용액(NaOH로 조정된 pH3.5)으로 용출시킨다. 용출 용액의 용량은 2×20ℓ이다. 용출속도는 1.5ℓ/시간이다. HPLC(고압 액체 크로마토그래피)에 의한 90% 이상의 인슐린-Arg-B31-32 함량을 갖는 분획을 수거하고, 이를 1 : 1의 비율로 H2O로 희석시킨 다음 10㎖의 10% ZnCl2용액/용액 ℓ를 가하고 pH를 6.8로 조정하여 침전 시킨다. 수득물은 5g의 인슐린-Arg-B31-32로서 이 양은 인슐린-Arg-B31-32를 기본으로 80%의 단계 수율에 상응한다.
B) 비교예
독일연방공화국 특허 제2629568호에 따라 비교 실시예 I을 수행하고 본 발명에 따라 실시예 Ⅱ를 수행한다. 방법의 파라미터 및 수득된 결과를 표 1에 비교하여 기술하였다. 제1도는 용출 동안에 기록된 비교 실시예 I의 용출 프로필을 도시한 것이며 제2도는 본 발명에 따른 실시예 Ⅱ의 용출 프로필을 도시한 것이다. 용출 시간 및 분획수에 대한 자외선 범위[278nm의 파장(A278)]에서의 흡광도 A로 플롯팅한다. 용출 프로필에서, 본 발명의 방법이 독일연방공화국 특허 제2629568호에 따라 수행된 방법보다 더욱 양호한 염기성 단백질 분리를 유도함을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 생성물의 좀더 높은 수율 및 좀더 높은 순도가 얻어진다(표 1 참조).
트립신으로 프로인슐린(이. 콜리이를 이용한 유전공학방법에 의해 제조된 원숭이 프로인슐린)을 처리하여 수득한 단백질 혼합물의 이온 교환 크로마토그래피의 비교
[표 1]
Claims (7)
- 염기성 단백질을 함유하며 프로인슐린 또는 이의 천연, 반합성 또는 유전공학 기원 유도체의 효소적 분해에 의해 수득된 단백질 혼합물을 이온교환체에 충전시키고 용출시켜 단백질 혼합물로부터 염기성 단백질을 분리하는 방법에 있어서, 이온 교환체로서 강산 양이온 교환체를 사용하고 용출 단계를 10 내지 50용적%의 알칸올이 함유된 H2O/C1-C4-알칸올 혼합물을 사용하여 수행함을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 사용되는 강산 양이온 교환체가 설포 그룹을 갖는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 강산 양이온 교환체의 충전을 pH 2.5 내지 5.5에서 수행하는 방법.
- 제1항에 있어서, 용출에 사용되는 H2O/C1-C4-알칸올 혼합물이 C1-C4-알칸올로서 에탄올 또는 이소프로판올을 함유하는 방법.
- 제1항에 있어서, 용출 용액의 pH를 3.5 내지 4.0으로 조정하는 방법.
- 제1항에 있어서, 충전 및 용출 용액이 완충물질을 함유하는 방법.
- 제1항에 있어서, 용출을 0 내지 1몰/ℓ의 암모늄 또는 알칼리 금속염 구배로 수행하는 방법.
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