DK173502B1 - Fremgangsmåde til isolering af insulinderivater med basisk karakter fra proetinblandinger - Google Patents
Fremgangsmåde til isolering af insulinderivater med basisk karakter fra proetinblandinger Download PDFInfo
- Publication number
- DK173502B1 DK173502B1 DK198804476A DK447688A DK173502B1 DK 173502 B1 DK173502 B1 DK 173502B1 DK 198804476 A DK198804476 A DK 198804476A DK 447688 A DK447688 A DK 447688A DK 173502 B1 DK173502 B1 DK 173502B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- approx
- elution
- insulin
- derivatives
- mixture
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 28
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical class N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 23
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 25
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 13
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 13
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 10
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- -1 alkali metal salt Chemical class 0.000 claims description 8
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 5
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 3
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 claims description 2
- 239000012928 buffer substance Substances 0.000 claims 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 abstract description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 abstract description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 9
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 7
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 4
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 229910006069 SO3H Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229920006243 acrylic copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 239000003637 basic solution Substances 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 230000021235 carbamoylation Effects 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- HAEPBEMBOAIUPN-UHFFFAOYSA-L sodium tetrathionate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[O-]S(=O)(=O)SSS([O-])(=O)=O HAEPBEMBOAIUPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
v DK 173502 B1
Opfindelsen angår en fremgangsmåde til isolering af insulinderivater med basisk karakter fra proteinblandinger.
Ved fremstillingen af human insulin ved gentekniske metoder sker biosyntesen af insulinet via et precursor-5 eller forløbermolekyle, proinsulinet. I dette er B-kæden forbundet med A-kæden via C-peptidet (= "Connecting Peptide") . Ved den gentekniske produktion ved hjælp af Escherichia coli får man undertiden først et fusionsprotein, i hvilket der foran proinsulinet desuden er koblet et fremmed 10 protein, eksempelvis β-galactosidase.
Dette fremmede protein skal før den videre oparbejdning først fraspaltes, eksempelvis ved behandling med cyan-halogenid (jf. DE offentliggørelsesskrift nr. 3.440.988).
Efter cyanhalogenidfraspaltningen omdannes cysteingrupper 15 ved sulfitolyse (behandling med natriumsulfit og natrium-tetrathionat) til deres S-sulfonatform. Molekylet kan ud fra den form ved hjælp af reduktiv tilbagefoldning (dvs. ved behandling med mercaptoethanol i basisk opløsning) ved korrekt dannelse af dets disulfidbroer overføres til dets 20 naturlige rumstruktur. Proinsulinet eller præproinsulinet (- derivat af proinsulinet, forstavelsen "præ" refererer til en eller flere yderligere aminosyrer ved proinsulinets N-terminal) omdannes ved enzymatisk spaltning (eksempelvis med trypsin) til en blanding af spaltningsprodukter, som 25 indeholder en insulinforløber, insulin-Arg-B31-B32 og C-peptidet. Foruden disse dannes der desuden nogle biprodukter, såsom insulin-Des-Thr-B30, insulin-Arg-B31 samt ufuldstændigt spaltede mellemprodukter.
De nævnte insulinderivater og forbindelser, som dannes 3 0 i forstadier ved den kemiske behandling af udgangsmaterialet, skal separeres. I den forbindelse er det særligt vanskeligt at fraskille insulinderivater med basisk karakter, som udviser derivatiseringer i nærværelse af aminosyrer, som efter færdigdannelse af den tertiære struktur ligger i det indre 35 af molekylet.
2 DK 173502 B1
Dette viser sig i et sammenligningsforsøg (jf. del B) :
Den ionbytterfremgangsmåde, som er beskrevet i DE patentskrift nr. 2.629.568, og som er udviklet til rensning 5 af insulin, har den særegenhed, at der til undgåelse af proteinaggregationer til elueringsvæsken sættes et ikke--ionisk tensid. Denne fremgangsmåde, som er velegnet til rensning af insuliner, fører ved forsøg på separation og isolering af basiske proteiner, som eksempelvis fås ved 10 tryptisk spaltning af proinsulin af genteknisk oprindelse, til en fuldstændig utilstrækkelig separation. Dette tydeliggøres ved den tilsvarende elueringsprofil (jf. del B) .
Man erkender, at toppene for de enkelte peptider flyder sammen.
15 Man kender ligeledes allerede fremgangsmåder, hvorved man skal kunne opnå separation af de nævnte proinsulin-spaltningsprodukter .
I Journ. of Biol. Chem. 24£, 1365-1374 (1971) beretter Steiner et al. om en fremgangsmåde til isolering af C-peptid 20 ud fra en proinsulinspaltningsblanding. Ved denne fremgangsmåde (der er ikke angivet udbytter) chromatograferer man ved hjælp af en svagt sur carboxymethylgruppeholdig (CM) kationbytter på cellulosebasis. Til belastnings-og eluerings-opløsningen sættes der i den forbindelse 7 mol urinstof pr.
25 liter for at undgå en aggregation af proteinerne. Tilstedeværelsen af på den måde høje urinstofkoncentrationer er uheldig, fordi den fører til derivatisering af proteiner, frem for alt til carbamoylering af frie aminogrupper. I Protein Engineering, bd. 1, nr. 3, 205-213 (1987) beskriver 30 Markussen et al. en ionbytterchromatografifremgangsmåde ved hjælp af diethyl-2-hydroxypropylaminoethyl-holdige (QAE) anionbyttere på en matrix af tredimensionelt tværbundet polysaccharid-netværk.
Ved denne fremgangsmåde - for anionbytterchromato-35 grafien angives der ingen udbytter - arbejder man til in-hibering af proteinaggregationer i en 60%'s ethanolopløsning.
3 DK 173502 B1
En ulempe ved sådanne koncentrerede ethanolopløsninger består i de nødvendige sikkerhedsforanstaltninger, som især er nødvendige ved arbejde med koncentrerede organiske opløsningsmidler i teknisk målestok. På den anden side forekommer 5 der, som efterarbejder har vist det, denatureringer af proteinerne ved de nævnte alkoholkoncentrationer.
I bestræbelserne på at tilvejebringe en bedre separations- og isoleringsfremgangsmåde for insulinderivater med basisk karakter ud fra proteinblandinger - indeholdende 10 sådanne insulinderivater har det overraskende vist sig, at dette formål kan opnås ved chromatografi af proteinblandingerne på en stærkt sur kat ionbyt ter og eluering ved hjælp af en saltgradient med kun en relativt ubetydelig mængde alkanol. Det er især overraskende, at man derved i forhold 15 til teknikkens stade såvel kan forbedre separationseffekten samt i vid udstrækning undgå de yderligere derivatiseringer af proteinerne under separationen. Det er bemærkelsesværdigt, at man endog kan fraskille derivater, der er dannede ved forbehandlingen af proinsulinet og har derivatiseringer i det 20 indre af de i tertiærstrukturen foreliggende proteiner.
Der iagttages ikke aggregationer af de proteiner, der skal separeres. Genanvendeligheden af ionbytterne bereder ingen vanskeligheder.
Opfindelsen angår følgelig en fremgangsmåde til isole-25 ring af insulinderivater med basisk karakter fra proteinblandinger, som indeholder sådanne insulinderivater, og som er tilvejebragt ved enzymatisk spaltning af proinsulin og/eller dets derivater af naturlig, halvsyntetisk eller genteknisk oprindelse, ved ladning af en ionbytter med pro-30 teinblandingen og eluering, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man som ionbytter anvender en stærkt sur kationbytter, idet ladningen deraf gennemføres ved en pH-værdi mellem ca. 2,5 og ca. 5,5, fortrinsvis mellem ca. 3,5 og ca. 4,0, og at man gennemfører elueringen ved hjælp af 35 en blanding af vand og -alkanol, som indeholder fra ca.
10 til ca. 50%, fortrinsvis fra ca. 20 til ca. 40%, især 4 DK 173502 B1 ca. 30% alkanol, idet man indstiller elueringsopløsningens pH-værdi på fra ca. 3,5 til ca. 4,0 og eluerer med en ammonium- eller alkalimetalsaltgradient, der ligger mellem ca. 0 og ca. 1 mol pr. liter, især mellem ca. 0,15 og ca.
5 0,35 mol pr. liter.
Ved hjælp af den her omhandlede fremgangsmåde kan man ud fra spaltningsblandinger af vilkårlige proinsuliner, eller af derivater deraf, såsom af abepræproinsulin, isolere insulinderivaterne med basisk karakter i høje udbytter. Som 10 ionbyttere kommer i princippet alle stærkt sure kat ionbyttere på tale. Man foretrækker stærkt sure kationbyttere, hvis funktionelle gruppe er sulfogruppen, især sulfopropylgruppen -CH2-CH2-CH2-SO3H, eksempelvis på en matrix af hydrofile hydroxygruppeholdige vinylpolymere - eksempelvis "Fractogel 15 TSK", producent Fa. Merck. Darmstadt), acryl-copolymere (såsom "SP Trisacryl M", producent Réactifs IBF, Villeneuve-la-Garenne, Frankrig) eller geler med et indhold af tværbundet agarose (såsom "S-Sepharose'r, producent Fa. Pharmacia, Upsala, Sverige). Især foretrækkes "S-Sepharose".
20 Forud for ladningen af den stærkt sure kationbytter med blandingen af spalteprodukter skal denne nyækvilibreres med en pufferopløsning. Denne pufferopløsning består af en blanding af vand og Ci_4-alkanol med et alkanolindhold på fortrinsvis fra ca. 10 til ca. 50 volumenprocent, især for-25 trinsvis fra ca. 20 til ca. 40 volumenprocent, især på ca.
30 volumenprocent. Foretrukne alkanoler er ethanol og iso-propanol, især isopropanol. Yderligere tilsætningsstoffer, der kan sættes til pufferopløsningen, er eksempelvis salt, fortrinsvis fysiologisk acceptabelt mineralsalt, en eller 30 flere vilkårlige organiske syrer, fortrinsvis mælkesyre, en base, fortrinsvis NaOH, og/eller konserveringsmidler. pH-værdien for pufferopløsningen ligger mellem ca. 2,5 og ca.
5,5, især fortrinsvis mellem ca. 3,5 og ca. 4,0.
Ladningen af den stærkt sure kationbytter kan ske 35 ved, at man opløser blandingen af spaltningsprodukter i en pufferopløsning - med den ovenfor beskrevne sammensætning 5 DK 173502 B1 og den ovenfor beskrevne pH-værdi og bringer den således tilvejebragte opløsning i kontakt med den stærkt sure kat-ionbytter.
Elueringsopløsningen, som i princippet kan have en 5 lignende sammensætning som den ovenfor beskrevne pufferopløsning, har en pH-værdi fra 3,5 til 4,0. Især egnet er en elueringsfremgangsmåde, ved hvilken elueringsopløsningen har en tidsmæssig saltkoncentrationsgradient med fortrinsvis lineært forløb. Denne koncentrationsgradient kan eksempelvis 10 pålægges ved, at der i begyndelsen af elueringen foreligger en ubetydelig saltkoncentration (i grænsetilfældet gående mod 0) i elueringsopløsningen og ved, at saltkoncentrationen øges under elueringsforløbet. På denne måde kan man opnå en særlig virkningsfuld separation af proteinblandingen. En 15 foretrukken salt-koncentrationsgradient varierer fra tæt ved 0 mol salt/liter (i begyndelsen af elueringen) til ca.
1 mol salt/liter (ved slutningen af elueringen), især fortrinsvis fra ca. 0,15 (ved begyndelsen af elueringen) til ca. 0,35 mol/liter (i slutningen af elueringen). Til salt-20 tilsætningen kommer mange organiske og uorganiske salte på tale. Man foretrækker fysiologisk acceptable salte, såsom ammonium- og alkalimetalsalte, især fortrinsvis natriumsalte, især natriumchlorid.
Den her omhandlede separationsfremgangsmåde kan gen-25 nemføres på forskellig måde. Gennemførelsen ved søjlefremgangsmåden eller ved batch-fremgangsmåden er at foretrække. Temperaturen, som ved ionbytterchromatografien fortrinsvis skal holdes konstant, kan varieres indenfor et bredt område.
Man foretrækker et temperaturinterval fra ca. -10 til ca.
30 50°C, især fra ca. 15 til ca. 25°C.
Ved hjælp af det følgende udførelseseksempel (A) skal opfindelsen belyses nærmere. Ved hjælp af den dertil hørende sammenligning (B) skal man vise overlegenheden af den her omhandlede fremgangsmåde i forhold til en fremgangs-35 måde til rensning af insulin ifølge teknikkens stade (DE patentskrift nr. 2.629.568).
6 DK 173502 B1 A) Udføringseksempel (ifølge opfindelsen) 6 liter "S-Sepharose" opslæmmes en en vandig pufferopløsning, som indeholder 50 mmol mælkesyre pr. liter, 30% isopropanol og 1 mol natriumchlorid pr.
5 liter, og hvis pH-værdi ligger på ca. 3,5, og fyldes i en søjle med en diameter på 10 cm op til en højde på ca. 80 cm. Søjlen ækvilibreres med 10 liter vandig startpufferopløsning (50 mmol mælkesyre pr. liter, 30% isopropanol, 0,15 mol natriumchlorid pr. liter 10 pH-værdi lig med ca. 3,5). 15 g krystalliseret spalt ningsblanding, som indeholder 6,2 g insulin-Arg-B31--32, 3 g insulin-Arg-B31 og insulin-Des-Thr-B30 samt ukendte spaltningsmellemprodukter samt derivater, dannet ved tryptisk spaltning af præprohumaninsulin, 15 opløses i 3 liter startpuffer og sættes til søjlen.
Derpå elueres der med en vandig opløsning indeholdende 50 mmol mælkesyre pr. liter og 30% isopropanol ved en pH-værdi på 3,5 (indstillet med NaOH) og en gradient fra 0,15 mol natriumchlorid pr. liter til 0,35 20 natriumchlorid pr. liter. Elueringsopløsningen har et rumfang på 2 x 20 liter. Gennemstrømningshastigheden er 1,5 liter pr. time. Fraktioner, hvis insulin--Arg-B31-32-indhold ifølge HPLC (høj tryks væske chroma-tografi) er over 90%, opsamles, fortyndes med vand i 25 forholdet 1:1 og fældes ved tilsætning af 10 ml 10%'s
ZnCl2-opløsning pr. liter opløsning og indstilling til pH-værdi lig med 6,8. Udbyttet er 5 g insulin--Arg-B31-32, hvilket svarer til et udbytte pr. trin, beregnet på insulin-Arg-B31-32, på 80%.
30 B) Sammenligning
Sammenligningseksempel 1 gennemføres ifølge DE-patent-skrift nr. 2.629.568 og eksempel II ifølge opfindelsen. I tabel I er fremgangsmådeparametrene og de 35 opnåede resultater stillet overfor hinanden. I fig.
1 er vist elueringsprof il en, optaget under elueringen, 7 DK 173502 B1 for sammenligningseksempel l, fig. 2 den samme for eksempel II ifølge opfindelsen. Man overfører absorptionen A i UV-området ved en bølgelængde på 278 nm (A27ø) mod elueringstiden eller fraktionsnumrene.
5 Elueringsprofilerne viser, at den her omhandlede fremgangsmåde fører til en bedre separation af de basiske proteiner end den ifølge DE-patentskrift nr. 2.629.568 gennemførte fremgangsmåde. Tilsvarende opnås der ved den her omhandlede fremgangsmåde lige-10 ledes et højere produktudbytte og en højere produkt renhed (jf. tabel I) .
DK 173502 B1 8
4J
1 i 4) Ή
Η «Η Ό O
>i 0 C id <2 α ji g ->-» fe o ϋ μ OlM Σ ft ft W E „
o J> μ « I
IM U tJ Λ Λ s 3^i S " j?" . i 8 “3
* £ C β 2 & H- · S S
η ·η5λ|ι1 - ϋ£8* v li p c ti m »O Id Μ " ·Η 0> * fj JL ,
.s ^^3 7 o 2&S
y « ΰ ^ Ή S S -3 ? ? n ^ ^ 81 ®h 5¾ S S. g g» g1«
" * · § 8 § 8 °* fi I 3 * ? I
s» 3 2 5 -2 ί;^ ϊ ® £ 8* g _ 5 S S g ί -5¾ .2 8*3 å& S ? S μ h S 5 «η
δ'δϋΡί ”§?ϋΐί3ϋΗ rfP * μ A S 2 3 S
m^U««-l H Μ η Ή til ^ W O *β O 5^5.^ f jS i S H c ^ tJi ί3 nj CO z ro ro O σν ¢0 *h ·Η <w
l1*S
I ?a: 0 ? « « S » c * o m - d AJ I(J ji λ 5 « li —i w m ί 3 8 u · J Λ* £i » O Sot) X l(d2>
M I Æ d O ^ ^ S > * B
s 3 3 s £ & . § * sj 2 * o h io jj 0< ^ ^ 55 H w g 3 * o; p Vi s rr: £3 £ -5 m « ο _σ» · ο «< 2§μ
1 I &§ " S i §*s 1ΰ ό 85 |'s I
I li- i mi if il! »?g lp. 5 a: g ,sm..a ϊ m w o · S3§
1 ^ rH i ΰ o) x · [ίΝ η α« 5?«S
Mf® o 1 η μ ϊ ϊ ° 9* 2 •SS'u « .S . W S 3 f. I> Jj H 9 £ £ 3i« w 2 m å -2 ^ Q * No $ ^ S 3 * w d *jj * ft S O «H ,§ S S . - S S S H S S fi 3 8 ii? SXE π <λ *"B ti q 'i· op S> jj| Λ r-| c/5 3 ,β β Η ·Η Η O O <3 CF> ’ 1 55 3 _ u h w u ·μ j £ fe μ q fe o s § ?
ft * —' © > Q h Pi O— 0(¾ H O ® Hr^O
i n
X
<u w y
σ» S
•S ij a .§ .. II s § SS ,-2.· m I - 2 i >, «o« 'Siiie i -a »ss i -g i s.
H S S o 1 3 S S S
Claims (4)
1. Fremgangsmåde til isolering af insulinderivater med basisk karakter fra proteinblandinger, som indeholder sådanne insulinderivater, og som er tilvejebragt ved en- 5 zymatisk spaltning af proinsulin og/eller dets derivater af naturlig, halvsyntetisk eller genteknisk oprindelse, ved ladning af en ionbytter med proteinblandingen og eluering, kendetegnet ved, at man som ionbytter anvender en stærkt sur kationbytter, idet ladningen deraf gennemføres 10 ved en pH-værdi mellem ca. 2,5 og ca. 5,5, fortrinsvis mellem ca. 3,5 og ca. 4,0, og at man gennemfører elueringen ved hjælp af en blanding af vand og Ci_4-alkanol, som indeholder fra ca. 10 til ca. 50%, fortrinsvis fra ca. 20 til ca. 40%, især ca. 30% alkanol, idet man indstiller elueringsopløsnin-15 gens pH-værdi på fra ca. 3,5 til ca. 4,0 og eluerer med en ammonium- eller alkalimetalsaltgradient, der ligger mellem ca. 0 og ca. 1 mol pr. liter, især mellem ca. 0,15 og ca. 0,35 mol pr. liter.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendete g-20 net ved, at man som stærkt sur kationbytter anvender en kationbytter med sulfogrupper, især med sulfopropylgrupper.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at den til eluering anvendte blanding af vand og C1-4-alkanol som C^_4-alkanol indeholder ethanol 25 eller isopropanol, især isopropanol.
4. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 1--3, kendetegnet ved, at ladnings- og eluerings-opløsningen indeholder en puffersubstans, fortrinsvis på basis af en organisk syre, især mælkesyre. 30
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19873726655 DE3726655A1 (de) | 1987-08-11 | 1987-08-11 | Verfahren zur isolierung basischer proteine aus proteingemischen, welche solche basischen proteine enthalten |
| DE3726655 | 1987-08-11 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK447688D0 DK447688D0 (da) | 1988-08-10 |
| DK447688A DK447688A (da) | 1989-02-12 |
| DK173502B1 true DK173502B1 (da) | 2001-01-08 |
Family
ID=6333496
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK198804476A DK173502B1 (da) | 1987-08-11 | 1988-08-10 | Fremgangsmåde til isolering af insulinderivater med basisk karakter fra proetinblandinger |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5101013A (da) |
| EP (1) | EP0305760B1 (da) |
| JP (1) | JP2587867B2 (da) |
| KR (1) | KR0129539B1 (da) |
| AT (1) | ATE96447T1 (da) |
| AU (1) | AU609170B2 (da) |
| CA (1) | CA1340237C (da) |
| DE (2) | DE3726655A1 (da) |
| DK (1) | DK173502B1 (da) |
| ES (1) | ES2047007T3 (da) |
| FI (1) | FI91875C (da) |
| HU (1) | HU198218B (da) |
| IE (1) | IE61557B1 (da) |
| IL (1) | IL87385A (da) |
| NO (1) | NO175004C (da) |
| NZ (1) | NZ225746A (da) |
| PH (1) | PH26874A (da) |
| PT (1) | PT88230B (da) |
| ZA (1) | ZA885871B (da) |
Families Citing this family (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0600372B1 (de) * | 1992-12-02 | 1997-02-05 | Hoechst Aktiengesellschaft | Verfahren zur Gewinnung von Proinsulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
| ES2218622T3 (es) | 1996-07-26 | 2004-11-16 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Derivados de insulina con actividad de union al zinc incrementada. |
| DE19652713C2 (de) * | 1996-12-18 | 2001-11-22 | Aventis Pharma Gmbh | Verfahren zur Reinigung von Insulin und Insulinderivaten durch Chromatographie an stark saurem Kationenaustauscher |
| KR100341297B1 (ko) * | 1997-03-29 | 2002-11-16 | 주식회사종근당 | 재조합활성형프로인슐린의분리.정제방법 |
| DE19726167B4 (de) | 1997-06-20 | 2008-01-24 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Insulin, Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende pharmazeutische Zubereitung |
| DE19825447A1 (de) | 1998-06-06 | 1999-12-09 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung |
| WO2000055203A1 (en) * | 1999-03-15 | 2000-09-21 | Novo Nordisk A/S | Ion exchange chromatographic separation of glp-1 and related peptides |
| US6451987B1 (en) * | 1999-03-15 | 2002-09-17 | Novo Nordisk A/S | Ion exchange chromatography of proteins and peptides |
| US6444788B1 (en) | 1999-03-15 | 2002-09-03 | Novo Nordisk A/S | Ion exchange chromatography of GLP-1, analogs and derivatives thereof |
| DE10114178A1 (de) | 2001-03-23 | 2002-10-10 | Aventis Pharma Gmbh | Zinkfreie und zinkarme Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität |
| DE10227232A1 (de) | 2002-06-18 | 2004-01-15 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Saure Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität |
| DE10235168A1 (de) * | 2002-08-01 | 2004-02-12 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Verfahren zur Reinigung von Preproinsulin |
| US7193035B2 (en) * | 2002-10-29 | 2007-03-20 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Crystals of insulin analogs and processes for their preparation |
| SE0300791D0 (sv) * | 2003-03-20 | 2003-03-20 | Amersham Biosciences Ab | Use of ph-responsive polymers |
| KR20060106812A (ko) * | 2003-08-21 | 2006-10-12 | 노보 노르디스크 에이/에스 | 라세미화 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 분리 |
| AU2006276442A1 (en) * | 2005-08-04 | 2007-02-08 | Toyo Seikan Kaisha, Ltd. | Method for sterilization of plastic bottle |
| PT3228320T (pt) | 2008-10-17 | 2020-03-26 | Sanofi Aventis Deutschland | Combinação de uma insulina e de um agonista do glp-1 |
| FR2947818B1 (fr) * | 2009-07-09 | 2011-07-29 | Inst Superieur Des Sciences Agronomiques Agroalimentaires Horticoles Et Du Paysage Agro Campus Ouest | Utilisation d'un coproduit issu d'un procede d'extraction du lysozyme a partir de blanc d'oeuf, pour l'obtention d'au moins une proteine basique de blanc d'oeuf |
| AU2010317994B2 (en) | 2009-11-13 | 2014-03-06 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Pharmaceutical composition comprising a GLP-1 agonist and methionine |
| MY180661A (en) | 2009-11-13 | 2020-12-04 | Sanofi Aventis Deutschland | Pharmaceutical composition comprising a glp-1 agonist, an insulin and methionine |
| US20140148384A1 (en) | 2010-08-30 | 2014-05-29 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Use of ave0010 for the manufacture of a medicament for the treatment of diabetes mellitus type 2 |
| US9821032B2 (en) | 2011-05-13 | 2017-11-21 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin |
| BR112014004726A2 (pt) | 2011-08-29 | 2017-04-04 | Sanofi Aventis Deutschland | combinação farmacêutica para uso no controle glicêmico em pacientes de diabetes tipo 2 |
| AR087744A1 (es) | 2011-09-01 | 2014-04-16 | Sanofi Aventis Deutschland | Composicion farmaceutica para uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa |
| CN103827136B (zh) | 2011-09-30 | 2016-07-06 | 通用电气健康护理生物科学股份公司 | 纯化裂解的胰岛素原的方法 |
| WO2014099577A1 (en) | 2012-12-17 | 2014-06-26 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Process for purifying insulin and analogues thereof |
| US10407483B2 (en) | 2014-03-14 | 2019-09-10 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Purifying insulin using cation exchange and reverse phase chromatography in the presence of an organic modifier and elevated temperature |
| EP3229828B1 (en) | 2014-12-12 | 2023-04-05 | Sanofi-Aventis Deutschland GmbH | Insulin glargine/lixisenatide fixed ratio formulation |
| TWI748945B (zh) | 2015-03-13 | 2021-12-11 | 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患治療 |
| TW201705975A (zh) | 2015-03-18 | 2017-02-16 | 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患之治療 |
| WO2018147393A1 (ja) * | 2017-02-10 | 2018-08-16 | 三菱ケミカル株式会社 | ヒトインスリン精製用分離剤及びヒトインスリンの精製方法 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2629568C3 (de) * | 1976-07-01 | 1981-09-10 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | Verfahren zur Reinigung von Insulin, seinen Analogen und Derivaten |
| NL7713966A (nl) * | 1976-12-27 | 1978-06-29 | Univ Minnesota | Werkwijze voor het behandelen van insuline. |
| DK311477A (da) * | 1977-07-08 | 1979-01-09 | Leo Lab | Fremgangsmaade ved fremstilling af rent insulin |
| US4459226A (en) * | 1982-02-26 | 1984-07-10 | Eli Lilly And Company | Process for recovering insulin |
| DD247684A1 (de) * | 1983-04-14 | 1987-07-15 | Ulrich Krabiell | Verfahren zur isolierung von insulinderivaten |
| EP0561137B1 (en) * | 1983-04-25 | 2002-07-03 | Chiron Corporation | Hybrid DNA Synthesis of Mature Insulin-like Growth Factors |
| DE3440988A1 (de) * | 1984-11-09 | 1986-07-10 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur spaltung von peptiden und proteinen an der methionyl-bindung |
| DE3511269A1 (de) * | 1985-04-12 | 1986-10-09 | Veb Berlin-Chemie, Ddr 1199 Berlin | Verfahren zur reinigung von insulin |
| JPS6379591A (ja) * | 1986-09-22 | 1988-04-09 | Mitsui Toatsu Chem Inc | ｔＰＡの精製方法 |
| AU607988B2 (en) * | 1987-04-21 | 1991-03-21 | Southern Cross Biotech Pty Ltd. | Production of proteins in active forms |
| ATE114668T1 (de) * | 1988-10-26 | 1994-12-15 | American Cyanamid Co | Verfahren zur verringerung des aggregatinhaltes in wachstumshormonen gleichenden stoffen. |
-
1987
- 1987-08-11 DE DE19873726655 patent/DE3726655A1/de not_active Withdrawn
-
1988
- 1988-08-04 DE DE88112661T patent/DE3885214D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-04 ES ES88112661T patent/ES2047007T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-04 AT AT88112661T patent/ATE96447T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-08-04 EP EP88112661A patent/EP0305760B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-09 HU HU884131A patent/HU198218B/hu unknown
- 1988-08-09 NZ NZ225746A patent/NZ225746A/en unknown
- 1988-08-09 IL IL87385A patent/IL87385A/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-08-09 US US07/230,085 patent/US5101013A/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-09 FI FI883708A patent/FI91875C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-08-09 KR KR1019880010123A patent/KR0129539B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-08-09 PH PH37374A patent/PH26874A/en unknown
- 1988-08-10 ZA ZA885871A patent/ZA885871B/xx unknown
- 1988-08-10 CA CA000574320A patent/CA1340237C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-10 NO NO883554A patent/NO175004C/no not_active IP Right Cessation
- 1988-08-10 AU AU20591/88A patent/AU609170B2/en not_active Expired
- 1988-08-10 JP JP63198127A patent/JP2587867B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-10 IE IE244188A patent/IE61557B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-08-10 PT PT88230A patent/PT88230B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-08-10 DK DK198804476A patent/DK173502B1/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI91875C (fi) | 1994-08-25 |
| NO175004B (no) | 1994-05-09 |
| NO883554L (no) | 1989-02-13 |
| KR0129539B1 (ko) | 1998-04-04 |
| EP0305760B1 (de) | 1993-10-27 |
| ATE96447T1 (de) | 1993-11-15 |
| CA1340237C (en) | 1998-12-15 |
| KR890003799A (ko) | 1989-04-18 |
| US5101013A (en) | 1992-03-31 |
| DK447688D0 (da) | 1988-08-10 |
| IE61557B1 (en) | 1994-11-16 |
| IL87385A0 (en) | 1989-01-31 |
| NZ225746A (en) | 1990-11-27 |
| PH26874A (en) | 1992-11-16 |
| JP2587867B2 (ja) | 1997-03-05 |
| DE3726655A1 (de) | 1989-02-23 |
| IE882441L (en) | 1989-02-11 |
| IL87385A (en) | 1993-08-18 |
| NO175004C (no) | 1994-08-17 |
| NO883554D0 (no) | 1988-08-10 |
| PT88230A (pt) | 1989-06-30 |
| FI91875B (fi) | 1994-05-13 |
| ZA885871B (en) | 1989-04-26 |
| EP0305760A3 (en) | 1990-06-06 |
| AU609170B2 (en) | 1991-04-26 |
| HUT47958A (en) | 1989-04-28 |
| FI883708A0 (fi) | 1988-08-09 |
| HU198218B (en) | 1989-08-28 |
| DK447688A (da) | 1989-02-12 |
| EP0305760A2 (de) | 1989-03-08 |
| AU2059188A (en) | 1989-02-16 |
| JPS6486896A (en) | 1989-03-31 |
| PT88230B (pt) | 1995-03-01 |
| ES2047007T3 (es) | 1994-02-16 |
| DE3885214D1 (de) | 1993-12-02 |
| FI883708A (fi) | 1989-02-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK173502B1 (da) | Fremgangsmåde til isolering af insulinderivater med basisk karakter fra proetinblandinger | |
| ES2552055T3 (es) | Método para purificar FSH biotecnológica | |
| JP4975895B2 (ja) | 高圧液体クロマトグラフィーによるインシュリンの単離方法 | |
| KR0126767B1 (ko) | 계면활성제를 이용한 단백질 회수방법 | |
| US8298789B2 (en) | Orthogonal process for purification of recombinant human parathyroid hormone (rhPTH) (1-34) | |
| JPH0334995A (ja) | タンパク質アミノ末端配列の酸素的除去 | |
| FI77876B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av humaninsulin eller en treoninb30-ester av humaninsulin eller ett salt eller komplex daerav. | |
| AU6425490A (en) | Production of biologically active insulin-like growth factor i from high expression host cell systems | |
| JPH04230699A (ja) | クロマトグラフィーによるインスリンの精製方法 | |
| DK149778B (da) | Analogifremgangsmaade til fremstilling af des-pheb1-humaninsulin eller derivater deraf | |
| US5334532A (en) | PDGF-B fusion protein, vectors, and host cells for use in production thereof | |
| EP1493747A1 (en) | Process for producing modified peptide | |
| HU196218B (en) | Process for preparing quinoline carboxylic acid boric acid anhydrides | |
| US20020064835A1 (en) | Purification of human troponin I | |
| ES2572629T3 (es) | Método para purificar FSH o un mutante de FSH | |
| Itoh et al. | Synthesis of a novel peptide, galanin-like peptide (GALP), by a combination of recombinant DNA technology and chemical cleavage reactions | |
| US20030105017A1 (en) | Purification of human Troponin I | |
| JP2887063B2 (ja) | グリセンチンの製造方法 | |
| JP2598024B2 (ja) | シグナルペプチドをコードしているｄｎａ | |
| JPH02195896A (ja) | 融合タンパク質の選択的切断方法 | |
| JPH0698790A (ja) | 無細胞蛋白質合成系によるポリペプチド の製造法 | |
| JPH05308991A (ja) | ジペプチジル−アミノペプチダーゼ−１を使用する折り畳まれたインスリン前駆物質からｎ−末端伸長鎖の選択的な除去方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| PUP | Patent expired |