PT88230B - Processo para o isolamento de proteinas basicas a partir de proteinas que as contem - Google Patents
Processo para o isolamento de proteinas basicas a partir de proteinas que as contem Download PDFInfo
- Publication number
- PT88230B PT88230B PT88230A PT8823088A PT88230B PT 88230 B PT88230 B PT 88230B PT 88230 A PT88230 A PT 88230A PT 8823088 A PT8823088 A PT 8823088A PT 88230 B PT88230 B PT 88230B
- Authority
- PT
- Portugal
- Prior art keywords
- elution
- process according
- proteins
- alkanol
- insulin
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 17
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title claims description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 20
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 claims description 13
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000004992 fission Effects 0.000 claims description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 9
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 claims description 7
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 4
- -1 sulfopropyl groups Chemical group 0.000 claims description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 3
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 159000000011 group IA salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 claims description 2
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 claims 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 claims 1
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 6
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 6
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 6
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N L-lactic acid Chemical compound C[C@H](O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N glycolonitrile Natural products N#CC#N JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 229930182843 D-Lactic acid Natural products 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-N D-lactic acid Chemical compound C[C@@H](O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229920006243 acrylic copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003637 basic solution Substances 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000021235 carbamoylation Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 108010005636 polypeptide C Proteins 0.000 description 1
- 235000021395 porridge Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- HAEPBEMBOAIUPN-UHFFFAOYSA-L sodium tetrathionate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[O-]S(=O)(=O)SSS([O-])(=O)=O HAEPBEMBOAIUPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
DESCRIÇÃO
Na preparaçao de insulina humana por métodos de engenharia genética efectua-se a biossíntese da in sulina através de uma molécula precursora, a pró-insulina. Nesta, a cadeia B encontra-se ligada à cadeia A através do péptido de conexão (péptido-C).
Na produção por engenharia genética por meio de Escherichia Coli obtém-se por vezes em primeiro lugar uma proteína de fusão, na qual, antes da pró-insulina, se encontra também uma proteína estranha, por exemplo ajb-galactosidase. Esta proteína estranha tem de ser logo separada antes dos passos seguintes do processo, por exemplo por tratamento com halogeneto de cianogénios (vide DE-OS 34 40 988). Após a cisão com halogeneto de cianogénio transformam-se os grupos
CR.
cisterna por meio de sulfitólise (tratamento com sulfito de sódio e tetrationato de sódio) na respectiva forma de S-sulfonato. A molécula pode transformar-se, a partir desta forma, na sua estrutura espacial nativa, por meio de regeneração redutiva ( por exemplo por tratamento com mercaptoetanol em solução básica), formando-se correctamente as suas pontes di-sulfureto. A pró-insulina ou a pré-pró-insulina (=derivado da proinsulina; o prefixo pré refere-se a um ou a mais aminoácidos adicionais no terminal azotado da proinsulina)transforma-se por meio de cisão enzimática (por exemplo com tripsji na) numa mistura de cisão, que contém um precursor da insulina, a insulina-Arg-B31-B32, e o péptido-C. Para além destes formam-se ainda alguns produtos secundários, como por exemplo a insulina-Des-Thr-B30, a insulina-Arg-B31, bem como intermediários de cisão incompleta.
Os derivados de insulina referidos e os compostos que se formam por tratamento químico dos reagen tes de partida nos passos iniciais, têm de ser separados uns dos outros. É particularmente difícil a separação de derivados de insulina com carácter básico, que apresentam derivatização em aminoácidos, que permanecem no interior da molécula após a formação da estrutura terciária.
Isto pode comprovar-se num ensaio comparativo (vide parte B):
processo de permuta aniónica, descrito na DE-PS 26 29 568 e desenvolvido para a purificação da insulina, apresenta a particularidade de, para evitar agregações de proteína, se adicionar ao líquido eluente um agente tensioactivo não iónico. Este processo, particularmente bem adequado à purificação de insulina, conduz, no caso da separação e do isolamento de pro teínas básicas, que se obtêm por exemplo por cisão com tripsi^ na da pró-insulina de origem genética, a uma separação muito incompleta. Isto é comprovado pelo respectivo perfil de eluição (vide parte B) ; verifica-se que os picos dos péptidos individuais se sobrepõem.
Conhecem-se contudo processos por meio dos quais se consegue efectuar a separação dos referidos produtos de cisão da pró-insulina.
Steiner et al. descreveram no Journ.of.Biol.Chem., 246, pág. 1365-1374 (1971) um processo para o isolamento de péptido-C a partir de uma mistura de cisão da pró-insulina. Neste processo (rendimentos não mencionados) efectua-se uma cromato grafia num permutador catiónico, fracamente ácido, contendo grupos carboximetilo (CM), suportado numa base de celulose.
Às soluções de carga e de eluição adiciona-se 7 mol/1 de ureia para evitar a agregação das proteínas. A presença de uma concentração tao elevada de ureia é desvantajosa porque leva à derivatização das proteínas, principalmente ã carbamoilação dos grupos amino livres. Markussen et al. descreveram em Pr£ tein Engineering Vol.l, n°.3, pág.205-213 (1987) um processo de cromatografia de permuta aniónica em permutadores aniónicos contendo grupos dietil-2-hidroxipropilaminoetilo (QAE) sobre uma matriz de polissacárido de estrutura em sede tridimensional. Neste processo - para a cromatografia de permuta aniónica não se indicam rendimentos - trabalha-se numa solução de etanol a 60£ para impedir a agregação das proteínas. Uma desvantagem destas concentrações de etanol tão elevadas consiste nas condições de segurança exigidas, particularmente importan tes quando se trabalha com solventes orgânicos concentrados numa escala industrial. Por outro lado ocorrem desnaturações das proteínas às concentrações de álcool referidas, como se mostrou em trabalhos posteriores. Com o objectivo de desenvol_ ver um melhor processo de separação e isolamento de proteínas básicas a partir de misturas de proteínas que as contenham, descobriu-se surpreendentemente que se pode atingir este obje ctivo por meio de cromatografia das misturas de proteínas num permutador catiónico fortemente ácido e eluição com uma solução aquosa de um alcanol apenas com quantidades relativamente baixas de alcanol. É particularmente surpreendente que, em relaçao ao estado actual da técnica, se consiga não só uma me lhor capacidade de separação como também evitar as derivatiza çoes adicionais das proteínas durante a separação. É de salientar que se podem mesmo separar derivados que apresentam derivatizações - formadas no tratamento prévio da pró-insulina- nas proteínas existentes no interior da estrutura terciária. Não se verificam agregações das proteínas a separar.
Não há qualquer problema em voltar a utilizar os permutadores.
Em consequência disso, um objectivo da invenção é um processo para o isolamento de proteínas básicas a partir de misturas de proteínas que as contêm, obtidas por cisão enzimática de pró-insulina e/ou dos seus derivados naturais, semi-sintêticos ou preparados por engenharia genética, por meio da aplicação da mistura de proteínas a um permutador iónico e eluição , caracterizado por se utilizar como permuta, dor iónico um permutador catiónico fortemente ácido e se efe£ tuar a eluição com uma mistura l^O/alcanol C^-C^, que contém cerca de 10 a 50% em volume de alcanol, de preferência cerca de 20 a 40% em volume, em especial cerca de 30% em volume de alcanol. Com o processo de acordo com a invenção podem separar-se as proteínas básicas com um alto rendimento, a partir de misturas de cisão de pró-insulinas ou dos seus derivados, como por exemplo pré-pró-insulina de macaco. Como permutadores iónicos referem-se em princípio todos os permutadores catióni. cos fortemente ácidos. Preferem-se os permutadores catiónicos fortemente ácidos cujos grupos funcionais sejam o grupo sulfo, em particular o grupo sulfopropilo - Cl^-CH^-C^-SO^H, por exemplo, sobre uma matriz de polímeros vinílicos contendo grupos hidroxilo hidrófilos (por exemplo v 1 Fractogel TSK, produzido pela firma Merck, Darmstadt) , de copolímeros acríli. (R) cos (por exemplo SP 2 Trisacryl M, produtor Réactifs IBF,
Villeneuve- la-Garenne, França) ou de geles com um teor em í R) agarose ramificada (por exemplo S- ' Sepharose, produtor fir ma Pharmacia, Upsala, Suécia),preferindo-se em especial a S-Sepharose.
Antes da carga do permutador catiónico fortemente ãcido com a mistura de cisão teve de se equilibrar esta de fresco com uma solução tampão. Esta solução tampão é constituída de preferência por uma mistura de água/alcanol
C^-C^, com um teor em alcanol de cerca de 10 a 50% em volume de preferência de cerca de 20 a 40% em volume, em particular de cerca de 30% em volume. Os alcanois preferidos são o etanol e o isopropanol, em especial o isopropanol. Outros aditivos, que se podem adicionar à solução tampão, são por exemplo, sais, de preferência sais minerais fisiológicamente assimilá4
veis, um ou mais ácidos orgânicos adequados, de preferência ácido láctico, uma base, de preferência NaOH, e/ou agentes conservantes. 0 valor de pH preferencial da solução tampao situa-se entre cerca de 2,5 e 5,5, muito de preferência entre cerca de 3,5 e 4,0.
A carga de permutador catiónico fortemente ácido pode efectuar-se dissolvendo a mistura de cisão numa solução tampão - de preferência com a composição anteriorj mente descrita e com o valor de pH anteriormente referido - e pondo em contacto a solução obtida com o permutador catiónico fortemente ãcido.
A solução de eluição, que em princípio pode ter a mesma composição que a solução tampão anteriormente mencionada, tem de preferência um valor de pH de 3,5 a 4,0. É particularmente adequado um processo de eluição em que a solução de eluição tem um gradiante de concentração de sal temporário de preferência com um precurso linear. Este gradiante de concentração pode estabelecer-se por exemplo, existin do no início da eluição uma baixa concentração de sal (perto de zero) na solução de eluição e aumentando a concentração de sal durante o decurso da eluição. Deste modo pode obter-se uma separação da mistura de proteínas particularmente eficaz. Um gradiante de concentração preferencial varia de perto de 0 mol de sal/1 (no início da eluição) até cerca de 1 mol de sal/1 (no fim da eluição), muito de preferência de cerca de 0,15 (no início da eluição) até cerca de 0,35 mol/1 (no fim da eluição). Para a adição de sal referem-se vários sais orgâ nicos ou inorgânicos. Preferem-se os sais fisiológicamente assimiláveis como sais de amónio e alcalinos, muito de prefe rência sais de sódio e em especial cloreto de sódio.
processo de separação de acordo com a invenção pode efectuar-se de várias maneiras diferentes. Prefere-se a execução em processos de coluna ou em processos descontínuos (batch).
A temperatura, que se deve manter de preferência constante na cromatografia de permuta iónica, pode variar numa gama larga. Prefere-se um intervalo de tempera tura de cerca de -10QC a cerca de 50°C, em particular de cer5 ca de 15 a cerca de 25QC.
exemplo de execução (A) seguinte destina-se a esclarecer mais detalhadamente a invenção. A comparação (B) que se segue destina-se a mostrar a superioridade do processo de acordo com a invenção em relação a um processo para a purificação de insulina de acordo com o estado actual da técnica (DE-PS 26 29 568).
A) Exemplo de execução (de acordo com a invenção)
Incorporam-se (de modo a formar uma papa) 6 1 de S-Sepha rose numa solução tampão aquosa contendo 50 mmol/1 de ácido láctico, 30Z de isopropanol e 1 mol/1 de cloreto de sódio e cujo valor de pH se situa a cerca de 3,5 e co loca-se numa coluna de 80cm de altura e 10 cm de diâmetro. Equilibra-se a coluna com 10 1 de solução tampão aquosa inicial (50 mmol/1 de ácido láctico, 30^ de isopropanol, 0,15 mol/1 de cloreto de sódio, pH cerca de 3,5). Dissolvem-se 15g de mistura de cisão cristalizada, contendo 6,2 g de insulina-Arg-B31-32, 3g de insulina-Arg-B31 e de insulina-Des-Thr-B30, bem como intermediários decisão desconhecidos e respectivos derivados, resultantes da cisão do pré-pró-insulina humana com tripsi. na, em 3 1 do tampão inicial, e aplicam-se (carregam-se) à coluna. Elui-se em seguida com uma solução aquosa contendo 50 mmol/1 de ácido láctico e 30^ de isopropanol, a um valor de pH de 3,5 (ajustado com NaOH) e com um gradiante de cloreto de sódio de 0,15 mol/1 a 0,35 mol/1. A solução de eluição tem um volume de 2x20 1.
A velocidade de fluxo é de 1,5 1/hora. Recolhem-se conjuntamente as fracções cujo teor em insulina-Arg-B31-32, segundo HPLC (cromatografia líquida de alta pressão), é superior a 90Z, diluem-se com água na proporção 1:1 e precipitam-se por adição de 10 ml/1 de uma solução de ZnCl2 a 10Z após ajustar o pH a 6,8. 0 rendimento é de 5g de insulina-Arg-B31-32, que constitui um rendimento parcial de 80Z em relação à insulina-Arg-B31-32.
B) Comparação
Efectuou-se o exemplo de comparação I de acordo com a DE - PS 26 29 568 e o exemplo II de acordo com a invenção .
Na Tabela 1 apresentam-se comparativamente os parâmetros do processo e os resultados obtidos. A Figura 1 mostra o perfil de eluição obtido no decurso do exemplo de comparação I, a figura 2 mostra a mesma coisa para o exemplo II de acordo com a invenção. Representou-se a absorpção A na zona do UV (ultra violeta), a um comprimento de onda de 278 nm (A2yg) em função do tempo de eluição ou dos números das fracções. Os perfis de eluição mostram que o processo de acordo com a invenção conduz a uma melhor separação das proteínas básicas do que o processo efectuado de acordo com a DE-PS 26 29 568. Correspondentemente, obtém-se ainda, segundo o processo de acordo com a invenção, um maior rendimento do produto e uma mais elevada pureza do produto (vide Tabela 1).
COMPARAÇÃO
Cromatografia de permuta iónica de uma mistura de proteínas obtida por tratamento de pró-insulina (pró-insulina
ι de separação ocnpleta mtre Insulina-Arg-B31-32, Separação das linhas de base entre Iipjlina-Arg-Arg-B31i-Arg-BJL e iirpurezas básicas -B32, Insulina-Arg-BÓl e irrpunezas básicas.
Claims (1)
- REIVINDICAÇÕES- ia.Processo para o isolamento de proteínas básicas a partir de misturas de proteínas que contêm as referidas proteínas básicas obtidas por cisão enzimática de proinsulina e/ou os respectivos derivados de origem natural, semi-sintética ou de engenharia genética, por tratamento de um permutador iónico com a mistura de proteínas seguido de eluição, caracterizado por se utilizar como permutador iónico um permutador catiónico fortemente ácido e por se efectuar a eluição com uma mistura de l^O/ alcanol-C-^-C^, contendo cer ca de 10 a 50%, de preferência cerca de 20 a 40%, em particular cerca de 30% de alcanol.- 2a.Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se utilizar como permutador catiónico fortemente ácido um permutador com grupos sulfo, em particular com grupos sulfopropilo.- 3ã. Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por se efectuar a carga do permutador catiónico fortemente ácido a um valor de pH entre cerca de 2,5 e 5,5, de preferência entre cerca de 3,5 e 4,0.- 4ê. Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a mistura de I^O/alcanol-C^-C^ utilizada para a eluição, conter alcanol-C-^-C^ o etanol ou o isopropanol, em particular o isopropanol.- 5a. Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 4, caracterizado por se ajustar o valor de pH da solução de eluição a cerca de 3,5 a 4,0.- 6â. Processo de acordo com Uma ou mais das reivindicações 1 a 5, caracterizado por as soluçoes de carga e de eluição conterem uma substância tampao, de preferência à base de um ácido orgânico, em particular o ácido láctico.- 7ê. Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 6, caracterizado por se proceder ã eluição com um gradiante de um sal de amónio ou de um sal alcalino, entre cerca de 0 e 1 Mol/1, em particular com cerca de 0,15 a 0,35 Mol/1.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19873726655 DE3726655A1 (de) | 1987-08-11 | 1987-08-11 | Verfahren zur isolierung basischer proteine aus proteingemischen, welche solche basischen proteine enthalten |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PT88230A PT88230A (pt) | 1989-06-30 |
| PT88230B true PT88230B (pt) | 1995-03-01 |
Family
ID=6333496
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PT88230A PT88230B (pt) | 1987-08-11 | 1988-08-10 | Processo para o isolamento de proteinas basicas a partir de proteinas que as contem |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5101013A (pt) |
| EP (1) | EP0305760B1 (pt) |
| JP (1) | JP2587867B2 (pt) |
| KR (1) | KR0129539B1 (pt) |
| AT (1) | ATE96447T1 (pt) |
| AU (1) | AU609170B2 (pt) |
| CA (1) | CA1340237C (pt) |
| DE (2) | DE3726655A1 (pt) |
| DK (1) | DK173502B1 (pt) |
| ES (1) | ES2047007T3 (pt) |
| FI (1) | FI91875C (pt) |
| HU (1) | HU198218B (pt) |
| IE (1) | IE61557B1 (pt) |
| IL (1) | IL87385A (pt) |
| NO (1) | NO175004C (pt) |
| NZ (1) | NZ225746A (pt) |
| PH (1) | PH26874A (pt) |
| PT (1) | PT88230B (pt) |
| ZA (1) | ZA885871B (pt) |
Families Citing this family (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2097426T3 (es) * | 1992-12-02 | 1997-04-01 | Hoechst Ag | Procedimiento para la obtencion de proinsulina con puentes de cistina correctamente unidos. |
| DK0821006T3 (da) | 1996-07-26 | 2004-08-16 | Aventis Pharma Gmbh | Insulinderivater med öget zinkbinding |
| DE19652713C2 (de) * | 1996-12-18 | 2001-11-22 | Aventis Pharma Gmbh | Verfahren zur Reinigung von Insulin und Insulinderivaten durch Chromatographie an stark saurem Kationenaustauscher |
| KR100341297B1 (ko) * | 1997-03-29 | 2002-11-16 | 주식회사종근당 | 재조합활성형프로인슐린의분리.정제방법 |
| DE19726167B4 (de) | 1997-06-20 | 2008-01-24 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Insulin, Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende pharmazeutische Zubereitung |
| DE19825447A1 (de) | 1998-06-06 | 1999-12-09 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung |
| US6444788B1 (en) | 1999-03-15 | 2002-09-03 | Novo Nordisk A/S | Ion exchange chromatography of GLP-1, analogs and derivatives thereof |
| WO2000055203A1 (en) * | 1999-03-15 | 2000-09-21 | Novo Nordisk A/S | Ion exchange chromatographic separation of glp-1 and related peptides |
| US6451987B1 (en) * | 1999-03-15 | 2002-09-17 | Novo Nordisk A/S | Ion exchange chromatography of proteins and peptides |
| DE10114178A1 (de) | 2001-03-23 | 2002-10-10 | Aventis Pharma Gmbh | Zinkfreie und zinkarme Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität |
| DE10227232A1 (de) * | 2002-06-18 | 2004-01-15 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Saure Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität |
| DE10235168A1 (de) * | 2002-08-01 | 2004-02-12 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Verfahren zur Reinigung von Preproinsulin |
| US7193035B2 (en) * | 2002-10-29 | 2007-03-20 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Crystals of insulin analogs and processes for their preparation |
| SE0300791D0 (sv) * | 2003-03-20 | 2003-03-20 | Amersham Biosciences Ab | Use of ph-responsive polymers |
| KR20060106812A (ko) * | 2003-08-21 | 2006-10-12 | 노보 노르디스크 에이/에스 | 라세미화 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 분리 |
| EP1958879B1 (en) * | 2005-08-04 | 2012-07-11 | Toyo Seikan Kaisha, Ltd. | Method for sterilization of plastic bottle |
| DK2349324T3 (en) | 2008-10-17 | 2017-12-11 | Sanofi Aventis Deutschland | COMBINATION OF AN INSULIN AND A GLP-1 AGONIST |
| FR2947818B1 (fr) * | 2009-07-09 | 2011-07-29 | Inst Superieur Des Sciences Agronomiques Agroalimentaires Horticoles Et Du Paysage Agro Campus Ouest | Utilisation d'un coproduit issu d'un procede d'extraction du lysozyme a partir de blanc d'oeuf, pour l'obtention d'au moins une proteine basique de blanc d'oeuf |
| KR101836070B1 (ko) | 2009-11-13 | 2018-03-09 | 사노피-아벤티스 도이칠란트 게엠베하 | Ｇｌｐ－１ 작용제, 인슐린 및 메티오닌을 포함하는 약제학적 조성물 |
| JP5973918B2 (ja) | 2009-11-13 | 2016-08-23 | サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | Ｇｌｐ−１アゴニスト及びメチオニンを含む薬学的組成物 |
| PT2611458T (pt) | 2010-08-30 | 2016-12-16 | Sanofi Aventis Deutschland | Utilização de ave0010 para o fabrico de um medicamento para o tratamento da diabetes mellitus tipo 2 |
| US9821032B2 (en) | 2011-05-13 | 2017-11-21 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin |
| CN108079281A (zh) | 2011-08-29 | 2018-05-29 | 赛诺菲-安万特德国有限公司 | 用于2型糖尿病患者中的血糖控制的药物组合 |
| AR087744A1 (es) | 2011-09-01 | 2014-04-16 | Sanofi Aventis Deutschland | Composicion farmaceutica para uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa |
| EP2748181B1 (en) | 2011-09-30 | 2016-03-30 | GE Healthcare BioProcess R&D AB | Method for purification of cleaved pro-insulin |
| US10421795B2 (en) * | 2012-12-17 | 2019-09-24 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Process for purifying insulin and analogues thereof |
| EP3116531B1 (en) | 2014-03-14 | 2021-10-20 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Purifying insulin using cation exchange and reverse phase chromatography in the presence of an organic modifier and elevated temperature |
| CN107206058A (zh) | 2014-12-12 | 2017-09-26 | 赛诺菲-安万特德国有限公司 | 甘精胰岛素/利西拉来固定比率配制剂 |
| TWI748945B (zh) | 2015-03-13 | 2021-12-11 | 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患治療 |
| TW201705975A (zh) | 2015-03-18 | 2017-02-16 | 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患之治療 |
| WO2018147393A1 (ja) * | 2017-02-10 | 2018-08-16 | 三菱ケミカル株式会社 | ヒトインスリン精製用分離剤及びヒトインスリンの精製方法 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2629568C3 (de) * | 1976-07-01 | 1981-09-10 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | Verfahren zur Reinigung von Insulin, seinen Analogen und Derivaten |
| NL7713966A (nl) * | 1976-12-27 | 1978-06-29 | Univ Minnesota | Werkwijze voor het behandelen van insuline. |
| DK311477A (da) * | 1977-07-08 | 1979-01-09 | Leo Lab | Fremgangsmaade ved fremstilling af rent insulin |
| US4459226A (en) * | 1982-02-26 | 1984-07-10 | Eli Lilly And Company | Process for recovering insulin |
| DD247684A1 (de) * | 1983-04-14 | 1987-07-15 | Ulrich Krabiell | Verfahren zur isolierung von insulinderivaten |
| ATE95236T1 (de) * | 1983-04-25 | 1993-10-15 | Chiron Corp | Hybrid-dns-synthesis von reifen insulinaehnlichen wachstumsfaktoren. |
| DE3440988A1 (de) * | 1984-11-09 | 1986-07-10 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur spaltung von peptiden und proteinen an der methionyl-bindung |
| DE3511269A1 (de) * | 1985-04-12 | 1986-10-09 | Veb Berlin-Chemie, Ddr 1199 Berlin | Verfahren zur reinigung von insulin |
| JPS6379591A (ja) * | 1986-09-22 | 1988-04-09 | Mitsui Toatsu Chem Inc | ｔＰＡの精製方法 |
| AU607988B2 (en) * | 1987-04-21 | 1991-03-21 | Southern Cross Biotech Pty Ltd. | Production of proteins in active forms |
| EP0365858B1 (en) * | 1988-10-26 | 1994-11-30 | American Cyanamid Company | Process for reducing the aggregate content of growth hormone-like materials |
-
1987
- 1987-08-11 DE DE19873726655 patent/DE3726655A1/de not_active Withdrawn
-
1988
- 1988-08-04 AT AT88112661T patent/ATE96447T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-08-04 EP EP88112661A patent/EP0305760B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-04 ES ES88112661T patent/ES2047007T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-04 DE DE88112661T patent/DE3885214D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-09 PH PH37374A patent/PH26874A/en unknown
- 1988-08-09 NZ NZ225746A patent/NZ225746A/en unknown
- 1988-08-09 IL IL87385A patent/IL87385A/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-08-09 HU HU884131A patent/HU198218B/hu unknown
- 1988-08-09 KR KR1019880010123A patent/KR0129539B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-08-09 US US07/230,085 patent/US5101013A/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-09 FI FI883708A patent/FI91875C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-08-10 JP JP63198127A patent/JP2587867B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-10 CA CA000574320A patent/CA1340237C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-10 PT PT88230A patent/PT88230B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-08-10 IE IE244188A patent/IE61557B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-08-10 AU AU20591/88A patent/AU609170B2/en not_active Expired
- 1988-08-10 NO NO883554A patent/NO175004C/no not_active IP Right Cessation
- 1988-08-10 DK DK198804476A patent/DK173502B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-08-10 ZA ZA885871A patent/ZA885871B/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI91875B (fi) | 1994-05-13 |
| IE882441L (en) | 1989-02-11 |
| DK447688D0 (da) | 1988-08-10 |
| HU198218B (en) | 1989-08-28 |
| NZ225746A (en) | 1990-11-27 |
| NO175004B (no) | 1994-05-09 |
| DK173502B1 (da) | 2001-01-08 |
| FI883708A0 (fi) | 1988-08-09 |
| ZA885871B (en) | 1989-04-26 |
| AU609170B2 (en) | 1991-04-26 |
| DK447688A (da) | 1989-02-12 |
| NO883554L (no) | 1989-02-13 |
| IL87385A (en) | 1993-08-18 |
| JP2587867B2 (ja) | 1997-03-05 |
| FI91875C (fi) | 1994-08-25 |
| PH26874A (en) | 1992-11-16 |
| ES2047007T3 (es) | 1994-02-16 |
| IE61557B1 (en) | 1994-11-16 |
| FI883708A (fi) | 1989-02-12 |
| EP0305760A2 (de) | 1989-03-08 |
| JPS6486896A (en) | 1989-03-31 |
| HUT47958A (en) | 1989-04-28 |
| EP0305760B1 (de) | 1993-10-27 |
| CA1340237C (en) | 1998-12-15 |
| PT88230A (pt) | 1989-06-30 |
| ATE96447T1 (de) | 1993-11-15 |
| AU2059188A (en) | 1989-02-16 |
| DE3726655A1 (de) | 1989-02-23 |
| KR0129539B1 (ko) | 1998-04-04 |
| NO883554D0 (no) | 1988-08-10 |
| DE3885214D1 (de) | 1993-12-02 |
| EP0305760A3 (en) | 1990-06-06 |
| NO175004C (no) | 1994-08-17 |
| KR890003799A (ko) | 1989-04-18 |
| US5101013A (en) | 1992-03-31 |
| IL87385A0 (en) | 1989-01-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PT88230B (pt) | Processo para o isolamento de proteinas basicas a partir de proteinas que as contem | |
| Hirs | [6] Determination of cystine as cysteic acid | |
| US5952461A (en) | Process for preparing human proinsulin | |
| Habermann et al. | Bee venom neurotoxin (apamin): iodine labeling and characterization of binding sites | |
| Bergqvist et al. | Chemical composition of basophil granules from isolated rat mast cells | |
| US4043997A (en) | Method for isolating albumin using insoluble supports coupled to a dye | |
| Huebner et al. | Wheat glutenin subunits. I. Preparative separation by gel-filtration and ion-exchange chromatography | |
| Ichikawa et al. | The effect of chronic atypical antipsychotic drugs and haloperidol on amphetamine-induced dopamine release in vivo | |
| EP1301279B1 (en) | Adsorption method and ligands | |
| Kurcbart et al. | Chemical and biological effects associated with the iodination of angiotensin II | |
| EP0013826A1 (en) | Process for purifying insulin and insulin so prepared | |
| Sabatier et al. | Reduction and reoxidation of the neurotoxin II from the scorpion Androctonus australis Hector | |
| CA1155109A (en) | Process for producing an insulin | |
| RU2816581C2 (ru) | Очистка аналогов глюкагоноподобного пептида-1 | |
| Gibbons | The determination of glycolloyl in substances containing neuraminic acid | |
| PT85956B (pt) | Processo para a purifucacao de proteinas | |
| Buchanan et al. | Water Elution Chromatography of Amino Acids on Ion Exchange Materials | |
| US20020064835A1 (en) | Purification of human troponin I | |
| OZAWA et al. | A kinetic study of the thiol-disulfide exchange reaction between aminothiols and 5, 5'-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid) | |
| AU2020219480A1 (en) | Purification of GLP-1 analogues | |
| EP1026505B1 (en) | A complex buffer system for the CZE analysis of hirudin | |
| US20030105017A1 (en) | Purification of human Troponin I | |
| Titova et al. | Effect of organic solvent modifier and ion-pair reagent (tetrabutylammonium salt) on the chromatographic behaviour of protected peptides in reversed-phase high-performance liquid chromatography | |
| Sada et al. | Adsorption of Aromatic Molecules on Hydrophilic Gel Chromatography Media. Effect of Various Salts | |
| PT90490B (pt) | Processo para a preparacao de acidos aromaticos e do dispositivo que os utiliza |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG3A | Patent granted, date of granting |
Effective date: 19940809 |
|
| PC3A | Transfer or assignment |
Free format text: 20010322 AVENTIS PHARMA DEUTSCHLAND GMBH DE |
|
| MM4A | Annulment/lapse due to non-payment of fees, searched and examined patent |
Free format text: MAXIMUM VALIDITY LIMIT REACHED Effective date: 20090809 |