NO175004B - Fremgangsmåte til isolering av basiske insuliner fra proteinblandinger som inneholder slike basiske insuliner - Google Patents
Fremgangsmåte til isolering av basiske insuliner fra proteinblandinger som inneholder slike basiske insuliner Download PDFInfo
- Publication number
- NO175004B NO175004B NO883554A NO883554A NO175004B NO 175004 B NO175004 B NO 175004B NO 883554 A NO883554 A NO 883554A NO 883554 A NO883554 A NO 883554A NO 175004 B NO175004 B NO 175004B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- basic
- insulins
- elution
- alkanol
- mol
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 29
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 16
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 title claims description 15
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 title claims description 15
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 title claims description 10
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 25
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 claims description 12
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 11
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 11
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 10
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 claims description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 4
- -1 sulfopropyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 3
- 150000001447 alkali salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 3
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000012928 buffer substance Substances 0.000 claims description 2
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 claims description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 11
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 5
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N L-lactic acid Chemical compound C[C@H](O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 4
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 108010065691 Biphasic Insulins Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 229930182843 D-Lactic acid Natural products 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-N D-lactic acid Chemical compound C[C@@H](O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 229910006069 SO3H Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 229920006243 acrylic copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000003637 basic solution Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 230000021235 carbamoylation Effects 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- HAEPBEMBOAIUPN-UHFFFAOYSA-L sodium tetrathionate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[O-]S(=O)(=O)SSS([O-])(=O)=O HAEPBEMBOAIUPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for isolering av basiske insuliner fra proteinblandinger som inneholder slike basiske insuliner og som ble oppnådd ved enzymatisk spalting av proinsulin og/eller disses derivater av naturlig, semisyntetisk eller genteknisk opprinnelse.
Ved fremstillingen av humaninsulin med gentekniske metoder foregår insulinets biosyntese over et forløpermolekyl, proinsulinet. I dette er B-kjeden sammenknyttet ved hjelp av C-peptidet (=Connecting Peptide) med A-kjeden. Ved den gentekniske produksjon ved hjelp av Eschericia coli får man under tiden i første rekke et fusjonsprotein, hvori proinsulinet dessuten er forankoblet et fremmedprotein, for eksempel p<->galaktosidase. Dette fremmedprotein må i første rekke avspaltes før den videre opparbeidelse, for eksempel ved behandling med halogencyanid (se DE-OS 34 40 988). Efter halogencyanspaltingen overføres cysteinrestene ved hjelp av sulfitolyse (behandling med natriumsulfit og natriumtetrationat) i dets S-sulfonatform. Molekylet kan fra denne form ved reduktiv tilbakefolding (for eksempel ved behandling med merkaptoetanol i basisk oppløsning) under korrekt utformning av dets disulfidbroer, overføres i dets native romstruktur. Proinsulinet eller pre-proinsulinet (= derivat av proinsulinet "pre" refererer seg til en eller flere ekstra aminosyrer ved proinsulinets N-terminus), overføres ved enzymatisk spalting (for eksempel med trypsin), til en spaltings-blanding som inneholder et insulinfor-stadium, insulin-Arg-B31-B32, og C-peptidet. Ved siden av disse oppstår dessuten noen biprodukter som for eksempel insulin-Des-Thr-B30, Insulin-Arg-B31 samt ufullstendig spaltede mellomprodukter.
De nevnte insulinderivater og forbindelser som oppstår ved den kjemiske behandling av utgangsmaterialet i forstadiet må separeres fra hverandre. Spesielte vanskelig er det herved å separere insulinderivater av basisk karakter, som har derivatiseringer på aminosyrer, som efter utformning av tertiærstrukturen ligger i molekylets indre.
Dette viser seg i et sammenligningsforsøk (se del B): Anionbytte-fremgangsmåten som omtales i DE-PS 26 29 568 og som var blitt utviklet for rensning av insulin, har den særegenhet at for å unngå proteinaggregering, tilsettes elueringsvaesken et ikke-ionisk tensid. Denne fremgangsmåten som er godt egnet til rensning av insuliner, fører ved forsøk av spalting og isolering av basiske proteiner som for eksempel fåes ved tryptisk spalting av proinsulin av genteknisk opprinnelse, til en helt utilstrekkelig spalting. Dette tydeliggjøres ved den tilsvarende elueringsprofil (se del B). Man ser at toppene for de enkelte peptider går over i hverandre.
Det er også allerede kjent fremgangsmåter der oppdelingen av de nevnte proinsulin spaltingsprodukter skal oppnås. Steiner et al., omtaler i "Journ. of Biol. Chem.", 246 side 1365-1374 (1971) en fremgangsmåte til isolering av C-peptid fra en proinsulin-spaltingsblanding. Ved denne fremgangsmåte (utbytter angis ikke) kromatograferes en svakt sur karboksy-metylgruppeholdig (CM) kationbytter på cellulosebasls. Oppladnings- og elueringsoppløsningen tilsettes herved 7 mol/l urinstoff for å unngå en aggregering av proteinene. Nærvær av slike høye urinstoffkonsentrasjoner er uheldig fordi de fører til derivatisering av proteiner, fremfor alt til karbamoylering av fri aminogruppe. Markussen et al omtaler i "Protein Engineering" vol 1, nr. 3, side 205-213
(1987) en anionbytte-kromatografi-fremgangsmåte på dietyl-2-hydroksypropylaminoetyl-holdige (OAE) anionbyttere på en matarix av tredimensjonalt tverrbundet polysakkarid-nettverk. Ved denne fremgangsmåte - for anionbytte-kromatografien angis ingen utbytter - arbeides for hemming av proteinaggregering i 60^-ig etanoloppløsning. En ulempe ved slike konsentrerte etanoloppløsninger består i de nødvendige sikkerhetsforholds-regler som er nødvendige, spesielt ved arbeider med konsentrerte organiske oppløsningsmidler i teknisk målestokk. På den annen side opptrer det, slik det viste seg ved efter-arbeider, en denaturering av proteinene ved de nevnte alkoholkonsentrasjoner.
I bestrebelsene på å tilveiebringe en bedre separerings- og isoleringsfremgangsmåte for basiske insuliner fra slike basiske proteinholdige insulinblandinger, ble det overraskende funnet at dette mål lar seg oppnå ved kromatografi av insulinblandingene og en sterkt sur kationbytter og eluering ved hjelp av vandig alkanol, med bare en relativt liten mengde alkanol. Det er spesielt overraskende at man ved dette, i forhold til den kjente teknikk, både kan forbedre separeringsytelsen og i tillegg, i utstrakt grad, også forhindre de ytterligere derivatisering av proteinene under separeringen. Bemerkelsesverdig er det at man sågar kan separere derivater som inneholder derivatiseringer i det indre av proteinene som foreligger i tertiær strukturen og som er oppstått ved forbehandling av proinsulinet. Det observeres ingen aggregering av proteinene som skal separeres. Gjenanvendbarheten av ionebytterne byr ikke på vanskeligheter.
Gjenstand for foreliggende oppfinnelse er i henhold til dette en fremgangsmåten for isolering av basiske insuliner fra proteinblandinger som inneholder slike basiske insuliner og som ble oppnådd ved enzymatisk spalting av proinsulin og/eller disses derivater av naturlig, semisyntetisk eller genteknisk opprinnelse, og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at en sterkt sur kationbytter lades med proteinblandingen og man så eluerer de nevnte basiske proteiner med en vann:C^_ 4alkanolblanding som inneholder 10 til 50 volum-# alkanol, hvorved pH-verdien i elueringsoppløsningen med en ammonium-eller alkalisaltgradient mellom 0-1 mol/l og spesielt 0,15 til 0,35 mol/l, innstilles til mellom 2,5 og 5,5, idet oppladnings- og elueringsoppløsningen inneholder et buffer-stoff, fortrinnsvis på basis av en organisk syre og særlig melkesyre.
Med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan man, fra sepa-reringsblandinger, vilkårlige proinsuliner, eller deres derivater som for eksempel ape-preinsulin, isolere de basiske proteiner med høye utbytter. Som ionebyttere kommer det prinsippielt på tale alle sterkt sure kationbyttere. Foretrukket er sterkt sure kationutvekslere hvis funksjonelle gruppe, sulfogruppen spesielt er sulfopropylgruppen. -CE^-CHg-CE2-SO3H, for eksempel på en matrix av hydrofile hydroksy-gruppeholdige vinylpolymerer (for eksempel "Fractogel" TSK fra firma Merck, Darmstadt), akryl-kopolymere (for eksempel "SP Trisacryl" M fra Reactifs IBF, Villeneuve-la-Garenne, Frankrike) eller geler med en del av nettdannet agarose (for eksempel "S-Sepharose" fra firma Pharmacia, Upsala, Sverige); spesielt foretrukket er S-Sepharose.
Før oppladningen av den sterkt sure kationbytter med separeringsblandingen, skal denne ny-ekvilibreres med en bufferoppløsning. Denne pufferoppløsningen består av en vann/Ci_4-alkanolblanding med et alkanolinnhold på fortrinnsvis ca. 10-50 volum-#, spesielt foretrukket på ca. 20-40 volum-#, spesielt på ca. 30 volum-#. Foretrukkede er alkanoler, etanoler og isopropanoler, spesielt isopropanol. Ytterligere tilsetningsstoffer som kan tilsettes bufferopp-løsningen er for eksempel salt, fortrinnsvis fysiologisk godtagbart mineralsalt, en eller flere ønskelige organiske syrer, fortrinnsvis melkesyre, en base, fortrinnsvis NaOH og/eller konserveringsstoffer. Bufferoppløsningens fore-trukne pH-verdi ligger mellom ca. 2,5 og 5,5, helst mellom ca. 3,5 og 4,0.
Oppladningen fra den sterk sure kationbytter kan foregå idet separeringsblandingen oppløses i en bufferoppløsning, fortrinnsvis med en tidligere omtalte sammensetning, og den tidligere omtalte pH-verdi, og den således dannede oppløsning bringes i kontakt med den sterkt sure kationbytter.
Elueringsoppløsningen som prinsippielt kan ha en lignende sammensetning som den tidligere omtalte bufferoppløsning, har fortrinnsvis en pH-verdi på 3,54 - 5,0. Spesielt egnet er enelueringsfremgangsmåte hvor elueringsoppløsningen har en tidsmessig saltkonsentrasjongradient med fortrinnsvis lineært forløp. Denne konsentrasjonsgradient kan for eksempel anlegges idet det ved begynnelsen av elueringen foreligger en liten saltkonsentrasjon (i grensetilfelle mot 0) i eluerings-oppløsningen, og hvori saltkonsentrasjonen økes under elueringsprosessen. På denne måte kan det oppnås en spesielt virksom adskillelse av proteinblandingen. En foretrukket saltkonsentrasjonsgradient varierer fra nær 0 mol salt/liter (ved begynnelsen av elueringen), til ca. 1 mol salt/liter (ved slutten av elueringen), spesielt foretrukket på ca. 0,15 (ved begynnelsen av elueringen), til ca. 0,35 mol/liter (ved slutten av elueringen). For salttilsetningen kommer det på tale mange organiske og uorganiske salter. Foretrukket er fysiologisk godtagbare salter som ammonium- og alkalisalter, spesielt foretrukket natriumsaltet, spesielt natriumklorid.
Skillefremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan gjennomføres på forskjellig måte, foretrukket er søylefremgangsmåte eller i porsjonsfremgangsmåten. Temperaturen ved ioneutveksler-kromatografien som fortrinnsvis er å holde konstant, kan varieres innen et vidt område. Å foretrekke er et tempera-turintervall på ca. -10°C til ca. 50°C, spesielt på ca. 15 til ca- 25°C.
Med følgende utførelseseksempel (A) skal oppfinnelsen forklares nærmere. Ved den dertil følgende sammenligning (B) skal det vises overlegenheten av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen i henhold til en fremgangsmåte til insulinrens-ning i henhold til teknikkens stand (DE-PS 26 29 568).
A) Utførelseseksempel (ifølge oppfinnelsen).
6 liter S-Sepharose oppslemmes i en vandig bufferoppløsning som inneholder 50 mmol/1 melkesyre, 20$ isopropanol og 1 mol/l natriumklorid, og hvis pH-verdi ligger ved ca. 3,5, og fylles ca. 80 cm høy i en søyle med 10 cm diameter. Søylen ekvilibreres med 10 liter vandig startbufferoppløsning (50 mmol/1 melkesyre, 30$ isopropanol, 0,15 mol/l natriumklorid, pH ca. 3,5). 15 g krystallisert separeringsblanding som inneholder 6,2 g insulin-Arg-B31-32, 3 g insulin-Arg-B31 og insulin-Des-Thr-B30 samt ukjente spaltingsmellomprodukter samt derivater herav, danner fra tryptisk separeringen av preprohumaninsulin, oppløses i 3 liter startbuffer, og påføres på søylen. Derefter elueres det hele med en vandig oppløsning inneholdende 50 mmol/1 melkesyre, og 30$ isopropanol med en pH-verdi på 3,5 (innstillet med NaOH) og en gradient på 0,15 mol/liter til 0,35 mol/liter natriumklorid. Elueringsoppløsningen har et volum på 2 x 20 liter. Gjennom-strømningshastigheten er 1,5 liter/time. Fraksjoner hvis insulin-Arg-B31-32 innhold ifølge HPLC (High Pressuer Liquid Chromatography) er over 90% samles, fortynnes med HgO i forholdet 1:1 og utfelles ved tilsetning av 10 ml 10#-ig ZnClg-oppløsning/liter oppløsning, og innstilling av pH 6,8. Utbyttet er 5 g insulin-Arg-B31-32 som tilsvarer et trinnut-bytte, beregnet på insulin-Arg-B31-32, på 80$.
B) Sammenligning.
Sammenlingingseksempel I ble gjennomført ifølge DE-PS 26 29 568, og eksempel II ifølge oppfinnelsen. I tabell 1 er det oppstillet fremgangsmåteparametere av de oppnådde resultater. Fig. 1 viser under elueringen opptatt elueringsprofil av sammenligningseksempel I, fig. 2 den same for eksempel II ifølge oppfinnelsen. Absorbsjon A i UV-området med en bølgelengde på 278 nm (A278) °le oppført mot elueringstiden henholdsvis fraksjonsnummeret. Elueringsprofilen viser at fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fører til en bedre separering av de basiske proteiner enn den ifølge DE-PS 26 29 568 gjennomførte fremgangsmåte. Følgelig oppnår man også et høyere produktutbytte, og en høyere produktrenhet (se tabell 1) ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.
Claims (5)
1.
Fremgangsmåte til isolering av basiske insuliner fra proteinblandinger som inneholder slike basiske insuliner og som ble oppnådd ved enzymatisk spalting av proinsulin og/eller disses derivater av naturlig, semisyntetisk eller genteknisk opprinnelse, karakterisert ved at en sterkt sur kationbytter lades med proteinblandingen og man så eluerer de nevnte basiske proteiner med en vann:C^_ 4alkanolblanding som inneholder 10 til 50 volum-% alkanol, hvorved pH-verdien i elueringsoppløsningen med en ammonium-eller alkalisaltgradient mellom 0-1 mol/l og spesielt 0,15 til 0,35 mol/l, innstilles til mellom 2,5 og 5,5, idet oppladnings- og elueringsoppløsningen inneholder et buffer-stoff, fortrinnsvis på basis av en organisk syre og særlig melkesyre.
2.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som sterkt sur kationutveksler anvendes en slik med sulfogrupper, spesielt med sulfopropylgruppe.
3.
Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at oppladningen av den sterkt sure kationutveksler gjennomføres ved en pH-verdi mellom 2,5 og 5,5, fortrinnsvis mellom 3,5 og 4,0.
4.
Fremgangsmåte ifølge et eller flere av kravene 1-3, karakterisert ved at til eluering benyttes HgO: C]__4-alkanolblanding, som inneholder som C^_4 alkanol, etanol eller isopropanol, spesielt isopropanol.
5 .
Fremgangsmåte ifølge et eller flere av kravene 1-4, karakterisert ved at elueringsoppløsnings pH-verdi innestilles på 3,5-4,0.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19873726655 DE3726655A1 (de) | 1987-08-11 | 1987-08-11 | Verfahren zur isolierung basischer proteine aus proteingemischen, welche solche basischen proteine enthalten |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO883554D0 NO883554D0 (no) | 1988-08-10 |
| NO883554L NO883554L (no) | 1989-02-13 |
| NO175004B true NO175004B (no) | 1994-05-09 |
| NO175004C NO175004C (no) | 1994-08-17 |
Family
ID=6333496
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO883554A NO175004C (no) | 1987-08-11 | 1988-08-10 | Fremgangsmåte til isolering av basiske insuliner fra proteinblandinger som inneholder slike basiske insuliner |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5101013A (no) |
| EP (1) | EP0305760B1 (no) |
| JP (1) | JP2587867B2 (no) |
| KR (1) | KR0129539B1 (no) |
| AT (1) | ATE96447T1 (no) |
| AU (1) | AU609170B2 (no) |
| CA (1) | CA1340237C (no) |
| DE (2) | DE3726655A1 (no) |
| DK (1) | DK173502B1 (no) |
| ES (1) | ES2047007T3 (no) |
| FI (1) | FI91875C (no) |
| HU (1) | HU198218B (no) |
| IE (1) | IE61557B1 (no) |
| IL (1) | IL87385A (no) |
| NO (1) | NO175004C (no) |
| NZ (1) | NZ225746A (no) |
| PH (1) | PH26874A (no) |
| PT (1) | PT88230B (no) |
| ZA (1) | ZA885871B (no) |
Families Citing this family (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2097426T3 (es) * | 1992-12-02 | 1997-04-01 | Hoechst Ag | Procedimiento para la obtencion de proinsulina con puentes de cistina correctamente unidos. |
| DK0821006T3 (da) | 1996-07-26 | 2004-08-16 | Aventis Pharma Gmbh | Insulinderivater med öget zinkbinding |
| DE19652713C2 (de) * | 1996-12-18 | 2001-11-22 | Aventis Pharma Gmbh | Verfahren zur Reinigung von Insulin und Insulinderivaten durch Chromatographie an stark saurem Kationenaustauscher |
| KR100341297B1 (ko) * | 1997-03-29 | 2002-11-16 | 주식회사종근당 | 재조합활성형프로인슐린의분리.정제방법 |
| DE19726167B4 (de) | 1997-06-20 | 2008-01-24 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Insulin, Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende pharmazeutische Zubereitung |
| DE19825447A1 (de) | 1998-06-06 | 1999-12-09 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung |
| US6444788B1 (en) | 1999-03-15 | 2002-09-03 | Novo Nordisk A/S | Ion exchange chromatography of GLP-1, analogs and derivatives thereof |
| WO2000055203A1 (en) * | 1999-03-15 | 2000-09-21 | Novo Nordisk A/S | Ion exchange chromatographic separation of glp-1 and related peptides |
| US6451987B1 (en) * | 1999-03-15 | 2002-09-17 | Novo Nordisk A/S | Ion exchange chromatography of proteins and peptides |
| DE10114178A1 (de) | 2001-03-23 | 2002-10-10 | Aventis Pharma Gmbh | Zinkfreie und zinkarme Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität |
| DE10227232A1 (de) * | 2002-06-18 | 2004-01-15 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Saure Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität |
| DE10235168A1 (de) * | 2002-08-01 | 2004-02-12 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Verfahren zur Reinigung von Preproinsulin |
| US7193035B2 (en) * | 2002-10-29 | 2007-03-20 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Crystals of insulin analogs and processes for their preparation |
| SE0300791D0 (sv) * | 2003-03-20 | 2003-03-20 | Amersham Biosciences Ab | Use of ph-responsive polymers |
| KR20060106812A (ko) * | 2003-08-21 | 2006-10-12 | 노보 노르디스크 에이/에스 | 라세미화 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 분리 |
| EP1958879B1 (en) * | 2005-08-04 | 2012-07-11 | Toyo Seikan Kaisha, Ltd. | Method for sterilization of plastic bottle |
| DK2349324T3 (en) | 2008-10-17 | 2017-12-11 | Sanofi Aventis Deutschland | COMBINATION OF AN INSULIN AND A GLP-1 AGONIST |
| FR2947818B1 (fr) * | 2009-07-09 | 2011-07-29 | Inst Superieur Des Sciences Agronomiques Agroalimentaires Horticoles Et Du Paysage Agro Campus Ouest | Utilisation d'un coproduit issu d'un procede d'extraction du lysozyme a partir de blanc d'oeuf, pour l'obtention d'au moins une proteine basique de blanc d'oeuf |
| KR101836070B1 (ko) | 2009-11-13 | 2018-03-09 | 사노피-아벤티스 도이칠란트 게엠베하 | Ｇｌｐ－１ 작용제, 인슐린 및 메티오닌을 포함하는 약제학적 조성물 |
| JP5973918B2 (ja) | 2009-11-13 | 2016-08-23 | サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | Ｇｌｐ−１アゴニスト及びメチオニンを含む薬学的組成物 |
| PT2611458T (pt) | 2010-08-30 | 2016-12-16 | Sanofi Aventis Deutschland | Utilização de ave0010 para o fabrico de um medicamento para o tratamento da diabetes mellitus tipo 2 |
| US9821032B2 (en) | 2011-05-13 | 2017-11-21 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin |
| CN108079281A (zh) | 2011-08-29 | 2018-05-29 | 赛诺菲-安万特德国有限公司 | 用于2型糖尿病患者中的血糖控制的药物组合 |
| AR087744A1 (es) | 2011-09-01 | 2014-04-16 | Sanofi Aventis Deutschland | Composicion farmaceutica para uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa |
| EP2748181B1 (en) | 2011-09-30 | 2016-03-30 | GE Healthcare BioProcess R&D AB | Method for purification of cleaved pro-insulin |
| US10421795B2 (en) * | 2012-12-17 | 2019-09-24 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Process for purifying insulin and analogues thereof |
| EP3116531B1 (en) | 2014-03-14 | 2021-10-20 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Purifying insulin using cation exchange and reverse phase chromatography in the presence of an organic modifier and elevated temperature |
| CN107206058A (zh) | 2014-12-12 | 2017-09-26 | 赛诺菲-安万特德国有限公司 | 甘精胰岛素/利西拉来固定比率配制剂 |
| TWI748945B (zh) | 2015-03-13 | 2021-12-11 | 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患治療 |
| TW201705975A (zh) | 2015-03-18 | 2017-02-16 | 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患之治療 |
| WO2018147393A1 (ja) * | 2017-02-10 | 2018-08-16 | 三菱ケミカル株式会社 | ヒトインスリン精製用分離剤及びヒトインスリンの精製方法 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2629568C3 (de) * | 1976-07-01 | 1981-09-10 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | Verfahren zur Reinigung von Insulin, seinen Analogen und Derivaten |
| NL7713966A (nl) * | 1976-12-27 | 1978-06-29 | Univ Minnesota | Werkwijze voor het behandelen van insuline. |
| DK311477A (da) * | 1977-07-08 | 1979-01-09 | Leo Lab | Fremgangsmaade ved fremstilling af rent insulin |
| US4459226A (en) * | 1982-02-26 | 1984-07-10 | Eli Lilly And Company | Process for recovering insulin |
| DD247684A1 (de) * | 1983-04-14 | 1987-07-15 | Ulrich Krabiell | Verfahren zur isolierung von insulinderivaten |
| ATE95236T1 (de) * | 1983-04-25 | 1993-10-15 | Chiron Corp | Hybrid-dns-synthesis von reifen insulinaehnlichen wachstumsfaktoren. |
| DE3440988A1 (de) * | 1984-11-09 | 1986-07-10 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur spaltung von peptiden und proteinen an der methionyl-bindung |
| DE3511269A1 (de) * | 1985-04-12 | 1986-10-09 | Veb Berlin-Chemie, Ddr 1199 Berlin | Verfahren zur reinigung von insulin |
| JPS6379591A (ja) * | 1986-09-22 | 1988-04-09 | Mitsui Toatsu Chem Inc | ｔＰＡの精製方法 |
| AU607988B2 (en) * | 1987-04-21 | 1991-03-21 | Southern Cross Biotech Pty Ltd. | Production of proteins in active forms |
| EP0365858B1 (en) * | 1988-10-26 | 1994-11-30 | American Cyanamid Company | Process for reducing the aggregate content of growth hormone-like materials |
-
1987
- 1987-08-11 DE DE19873726655 patent/DE3726655A1/de not_active Withdrawn
-
1988
- 1988-08-04 AT AT88112661T patent/ATE96447T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-08-04 EP EP88112661A patent/EP0305760B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-04 ES ES88112661T patent/ES2047007T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-04 DE DE88112661T patent/DE3885214D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-09 PH PH37374A patent/PH26874A/en unknown
- 1988-08-09 NZ NZ225746A patent/NZ225746A/en unknown
- 1988-08-09 IL IL87385A patent/IL87385A/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-08-09 HU HU884131A patent/HU198218B/hu unknown
- 1988-08-09 KR KR1019880010123A patent/KR0129539B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-08-09 US US07/230,085 patent/US5101013A/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-09 FI FI883708A patent/FI91875C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-08-10 JP JP63198127A patent/JP2587867B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-10 CA CA000574320A patent/CA1340237C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-10 PT PT88230A patent/PT88230B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-08-10 IE IE244188A patent/IE61557B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-08-10 AU AU20591/88A patent/AU609170B2/en not_active Expired
- 1988-08-10 NO NO883554A patent/NO175004C/no not_active IP Right Cessation
- 1988-08-10 DK DK198804476A patent/DK173502B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-08-10 ZA ZA885871A patent/ZA885871B/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI91875B (fi) | 1994-05-13 |
| IE882441L (en) | 1989-02-11 |
| DK447688D0 (da) | 1988-08-10 |
| HU198218B (en) | 1989-08-28 |
| NZ225746A (en) | 1990-11-27 |
| DK173502B1 (da) | 2001-01-08 |
| FI883708A0 (fi) | 1988-08-09 |
| ZA885871B (en) | 1989-04-26 |
| AU609170B2 (en) | 1991-04-26 |
| DK447688A (da) | 1989-02-12 |
| NO883554L (no) | 1989-02-13 |
| IL87385A (en) | 1993-08-18 |
| JP2587867B2 (ja) | 1997-03-05 |
| FI91875C (fi) | 1994-08-25 |
| PH26874A (en) | 1992-11-16 |
| ES2047007T3 (es) | 1994-02-16 |
| IE61557B1 (en) | 1994-11-16 |
| FI883708A (fi) | 1989-02-12 |
| EP0305760A2 (de) | 1989-03-08 |
| JPS6486896A (en) | 1989-03-31 |
| HUT47958A (en) | 1989-04-28 |
| EP0305760B1 (de) | 1993-10-27 |
| CA1340237C (en) | 1998-12-15 |
| PT88230A (pt) | 1989-06-30 |
| ATE96447T1 (de) | 1993-11-15 |
| AU2059188A (en) | 1989-02-16 |
| DE3726655A1 (de) | 1989-02-23 |
| KR0129539B1 (ko) | 1998-04-04 |
| NO883554D0 (no) | 1988-08-10 |
| PT88230B (pt) | 1995-03-01 |
| DE3885214D1 (de) | 1993-12-02 |
| EP0305760A3 (en) | 1990-06-06 |
| NO175004C (no) | 1994-08-17 |
| KR890003799A (ko) | 1989-04-18 |
| US5101013A (en) | 1992-03-31 |
| IL87385A0 (en) | 1989-01-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO175004B (no) | Fremgangsmåte til isolering av basiske insuliner fra proteinblandinger som inneholder slike basiske insuliner | |
| US20100210815A1 (en) | Insulin production methods and pro-insulin constructs | |
| CA2220515C (en) | Process for producing erythropoietin containing no animal proteins | |
| US5157021A (en) | Insulin derivatives and pharmaceutical preparations containing these derivatives | |
| EP0397420B1 (en) | Enzymatic removal of a protein amino-terminal sequence | |
| EP0216833B1 (en) | Novel insulin derivatives and pharmaceutical preparations containing these derivatives | |
| US5977297A (en) | Process for isolating insulin by high-pressure liquid chromatography | |
| US5952461A (en) | Process for preparing human proinsulin | |
| EP0215625B1 (en) | Protein recovery | |
| AU696516B2 (en) | IGF-I purification process | |
| US4430266A (en) | Process for producing an insulin precursor | |
| KR100847883B1 (ko) | 인체 혈청알부민 다량체의 제거방법 | |
| EP0037255B1 (en) | Process for producing an insulin precursor | |
| EP3807306A2 (en) | Leader sequence for higher expression of recombinant proteins | |
| HU196218B (en) | Process for preparing quinoline carboxylic acid boric acid anhydrides | |
| KR100443890B1 (ko) | 재조합 대장균으로부터 인간 성장 호르몬의 정제 방법 | |
| US7608583B2 (en) | Process for the extraction and isolation of insulin from recombinant sources | |
| Itoh et al. | Synthesis of a novel peptide, galanin-like peptide (GALP), by a combination of recombinant DNA technology and chemical cleavage reactions | |
| US20020064835A1 (en) | Purification of human troponin I | |
| Rüegg et al. | 4-pyridylmethyl, a thiol-protecting group suitable for the partial synthesis of proteins | |
| US20030105017A1 (en) | Purification of human Troponin I |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK1K | Patent expired |