JP2587867B2 - 塩基性タンパク質を含有するタンパク質混合物から塩基性タンパク質を単離する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子工学方法によるヒトインシユリンの調製におい
ては、インシユリンの生合成はプロインシユリンと呼ば
れる前駆体分子を経て行なわれる。これにおいて、Ｂ鎖
はＣペプチド（結合ペプチド）によりＡ鎖に結合され
る。大腸菌による遺伝子工学的生産においては、別の外
来性タンパク、例えばβ−ガラクトシダーゼがプロイン
シユリンに先行するような融合タンパクが時には最初に
得られる。この外来性タンパク質は例えばハロゲン化シ
アンによる処理により、まず開裂させた後に、さらに後
処理を行なわなければならない（西独国特許公開344098
8号参照）。ハロゲン化シアンでの開裂の後、システイ
ン残基を亜硫酸分解（sulfitolysis,亜硫酸ナトリウム
およびナトリウムテトラチオネートによる処理）により
のｓ−スルホネート型に変換する。分子はこの型から、
還元的折り返し（reductive folding back,例えば塩基
性溶液中メルカプトエタノールを用いた処理による）に
より、そのジスルフイド架橋の正しい型を有する天然の
立体構造に変換することができる。プロインシユリンま
たはプレプロインシユリン（即ち、プロインシユリンの
誘導体であり、接頭辞の「プレ」という語はプロインシ
ユリンのＮ末端上の１つまたはそれより多い付加的なア
ミノ酸にかかるものである）は酵素的開裂により（例え
ばトリプシンにより）、インシユリン前駆体、インシユ
リン−Arg−B31−B32、およびＣペプリドを含有する開
裂物混合物へ変換される。これに加え、いくつかの副生
成物、例えば、インシユリン−Des−Thr−B30、インシ
ユリン−Arg−B31および不完全開裂中間体も形成され
る。

上記したインシユリン誘導体および出発物質の化学処
理により予備段階で形成された化合物はお互いに分離さ
れなければならない。３次構造の形成後に分子内に生じ
る酸上での誘導基を有する塩基性インシユリン誘導体を
分離することが、ここで特に困難になる。

比較試験（Ｂ部を参照）によりわかつた点によれば、
西独国特許2629568号に記載されインシユリン精製用に
開発された陰イオン交換方法は、溶離液のタンパク凝集
を回避する為に非イオン系界面活性剤を添加するという
特殊性を有する。インシユリンの精製に特に適するこの
方法では、例えば遺伝子工学起源のプロインシユリンの
トリプシン分解により得られた塩基性タンパクの分離お
よび単離の試みにおいては、完全な分離を充分行うこと
はできない。これは相当する溶離特性（Ｂ部を参照）に
より説明され、個々のペプチドのピークが他のものと重
なり合うことからもわかる。

上記したプリインシユリン開裂生成物の分離を達成し
たとしている方法がすでにいくつか知られている。Stei
ner等は「Journ.of Biol.Chem.」,246,1365〜1374ペー
ジ（1971年）において、プロインシユリン開裂混合物か
らの（ペプチドの単離方法を記載している。この方法
（収率の記載なし）では、カルバキシメチル基（CM）を
含む弱酸セルロース系カチオン交換剤上でクロマトグラ
フイーを行なつている。ここでは尿素７モル／を充填
溶離溶液に添加し、これにより、タンパク質の凝集を回
避している。このような高濃度尿素の存在はタンパク質
の誘導体化、特に遊離アミノ基のカルバモイル化をもた
らすことから、不利である。Markussen等は「Protein E
ngineering」，第１巻,No.3,205〜213ページ（1987年）
で、３次元交叉結合多糖類網目構造マトリツクス上のジ
エチル−２−ヒドロキシプロピルアミノエチル含有（QA
E）陰イオン交換体上での陰イオン交換クロマトグラフ
イー法を記載している。

陰イオン交換クロマトグラフイーに対して収率の記載
のないこの方法は、タンパク質の凝集を抑制するため60
％濃度のエタノール溶液中で行なう。工業的規模で濃有
機溶媒を用いて作業をする際に特に安全措置を必要とす
る点が、このような濃度のエタノール溶液の不利な点で
ある。一方、再処理が示すとおり、上記したアルコール
濃度ではタンパク質の変性が起こる。

このような塩基性タンパクを含有するタンパク質混合
物からの塩基性タンパクの良好な分離・単離方法を得る
試みにおいて、意外にも、強酸型カチオン交換体上のタ
ンパク質混合物のクロマトグラフイーおよび比較的少量
のアルカノールのみを含む水性アルカノールを用いた溶
離によりこの目的が達成できることがわかつた。従来方
法に比較して分離能力の向上が可能であり、かつ、分離
中のタンパク質の不必要な誘導体化を大きく回避するこ
とが可能である点は、特に以外である。プロインシユリ
ンの前処理の間に生じた誘導部分を３次構造として存在
するタンパク質の内部に有する誘導体さえ、意外にも分
離できるのである。分離されるタンパク質の凝集は観察
されない。イオン交換体の再利用も問題なく行なうこと
ができる。

従つて本発明は、イオン交換体として強酸型カチオン
交換体を用いること、および、アルカノール約10〜50体
積％、好ましくは約20〜40体積％、特に約30体積％を含
有する水/C₁〜C₄アルカノール混合物を用いて溶離を行
なうことを包含する、イオン交換体をタンパク質混合物
と共に装填し、そして溶離することによる、塩基性タン
パクを含有し、プロインシユリンおよび／または天然、
半合成または遺伝子工学由来のその誘導体酵素的分解に
より得られたタンパク質混合物からの塩基性単離方法に
関する。塩基性タンパク質は、どのような所望のプロイ
ンシユリンまたはその誘導体例えばサルプレプロインシ
ユリンの分解混合物から、本発明の方法により高収率で
単離できる。使用できるイオン交換体は原則として全て
の強酸型カチオン交換体である。官能基がスルホ基、特
にスルホプロピル基−CH₂−CH₂−CH₂−SO₃Hであり、そ
れが例えば水酸基を有する親水性ビニル重合体（例えば
^(R)フラクトゲルTSK,Merck製 Dar−mstadt），アクリル
系共重合体（例えばSP^(R)トリス−アクリルM,Ractifs
IBF製,Villeneuve−la−Garenne,フランス）または交
叉結合アガロースを有するゲル（例えばＳ−^(R)セフア
ロース、Pharmacia製,Upsala,スエーデン）のマトリク
ス上に存在するような強酸型カチオン交換体が好まし
く、Ｓ−セフアロースが特に好ましい。

分解混合物とともに強酸型カチオン交換体を充填する
前に、これを新たに緩衝溶液で平衡させなければならな
い。この緩衝溶液は好ましくは水/C₁〜C₄アルカノール
混合物よりなり、そのアルカノール含有率は好ましくは
約10〜50容量％、特に好ましくは約20〜40容量％、とり
わけ約30体積％である。好ましいアルカノールはエタノ
ールおよびイソプロパノールであり、特にイソプロパノ
ールが好ましい。緩衝溶液中に添加できる別の添加剤と
しては、例えば塩、好ましくは生理学的耐性のある無機
塩、１つまたはそれより多い所望の有機酸、好ましくは
乳酸、塩基好ましくはNaOH、および／または保存料であ
る。緩衝溶液の好ましいpHは約2.5〜5.5、特に好ましく
は約3.5〜4.0である。

強酸型カチオン交換体の充填は、好ましくは前記した
組成およびpHを有する緩衝溶液中に分解混合物を溶解す
ること、および生成した溶液を強酸型カチオン交換体と
接触させることにより行なう。

原則として前記した緩衝溶液と同様の組成を有する溶
離溶液は、好ましくは3.5〜4.0のpHを有する。溶離溶液
の塩の濃度／時間勾配が好ましくは直線となるような溶
離工程が特に適している。この濃度勾配は例えば、溶離
開始時には溶離溶液が低い塩濃度（限られた例において
０に近いものでもよい）を有し、有離過程の間に塩濃度
を上昇させるように設定することができる。タンパク混
合物の特に効果的な分離は、この方法により達成でき
る。好ましい塩濃度勾配は約０モル塩／（溶離開始
時）〜約１モル塩／（溶離終了時）、好ましくは、約
0.15（溶離開始時）〜約0.35モル／（溶離終了時）に
変化する。塩の添加には多くの有機および無機の塩を使
用できる。アンモニウム塩およびアルカリ金属塩のよう
な生理学的耐性を有する塩が好ましく、ナトリウム塩特
に塩化ナトリウムがとりわけ好適である。

本発明の分離方法は種々の工程で行うことができる。
カラム工程またはバツチ工程による方法が好ましい。イ
オン交換クロマトグラフイーの間一定であるのが好まし
い温度は、広範囲の温度であることができる。約−10℃
〜約50℃、特に約15℃〜約25℃の温度が好ましい。

本発明を以下の実施例（Ａ）により、さらに詳細に説
明する。従来のインシユリン精製法（西独国特許262956
8号）と比較した場合の本発明の方法の優秀性は、その
次の比較例（Ｂ）により明らかにされる。

Ａ）実施例（本発明） Ｓ−セフアロース６を、50ミリモル／乳酸、30％
イソプロパノールおよび／モル／塩化ナトリウムを含
有するpH約3.5の緩衝水溶液中に懸濁し、直径10cmのカ
ラムを約80cmの高さまで懸濁物で充填した。カラムを出
発緩衝水溶液（50ミリモル／乳酸、30％イソプロパノ
ール、0.15モル／塩化ナトリウム、pH約3.5）10で
平衡させた。インシユリン−Arg−B31−32を6.2g、イン
シユリン−Arg−B31を3gそして、インシユリン−Des−T
hr−B30および未知の分解中間体および誘導体を含有
し、ヒトプレプロインシユリンのトリプシン分解により
得た結晶化した開裂混合物15gを出発緩衝液３に溶解
し、溶液をカラムに適用した。次にカラムを、50ミリモ
ル／乳酸、30％イソプロパノール、および濃度勾配0.
15モル／〜0.35モル／の塩化ナトリウムを含有する
pH3.5（NaOHで調整）の水溶液で溶離させた。溶離液は
容量２×20とした。流速は1.5／時とした。HPLC
（高速流体クロマトグラフイー）で90％より高いインシ
ユリン−Arg−B31−32含有率を有する画分を集め、水で
1:1の比で希釈し、そして、10％濃度塩化亜鉛溶液／
溶液10mlを添加してpHを6.8にすることにより沈殿させ
た。インシユリン−Arg−B31−32の収量は5gであり、こ
れはインシユリン−Arg−B31−32に基づき段階収率80％
に相当する。

Ｂ）比較例 比較実施例１を西独国特許2629568号に従つて行な
い、実施例IIを本発明に従つて行なつた。方法の条件お
よび得られた結果は表１で比較してある。第１図は溶離
の間に記録された比較実施例Ｉの溶離特性を示したもの
であり、第２図は本発明の実施例IIの特性を示したもの
である。波長278nmにおけるUV領域の吸光度（A₂₇₈）を
溶離時間と画分番号に対してプロツトした。溶離特性に
よれば、本発明の方法では、西独国特許2629568号によ
る方法と比較して塩基性タンパク質の分離が良好に行な
われている。従つて、本発明の方法によれば、より高い
生成物収率おびより高い生成物純度も達成されている
（表１参照）。

【図面の簡単な説明】

第１図は比較実施例Ｉの溶離特性を示したものであり、
第２図は本発明の実施例IIの溶離特性を示したものであ
る。

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】イオン交換体として強酸型カチオン交換体
   を用い、そして、アルカノール10〜50容量％を含有する
   水/C₁〜C₄アルカノール混合物を用いて溶離を行うこと
   を含有する、イオン交換体をタンパク質混合物と共に装
   填しそして溶離することによる、塩基性タンパクを含有
   し、プロインシユリンおよび／または天然、半合成また
   は遺伝子工学由来のその誘導体の１つの酵素的分解によ
   り得られたタンパク質混合物からの塩基性タンパク質単
   離方法。
2. 【請求項２】使用される強酸型カチオン交換体がスルホ
   基を有するものである請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】強酸型カチオン交換体の装填をpH2.5〜5.5
   で行う請求項１または２記載の方法。
4. 【請求項４】溶離溶液のpHを3.5〜4.0とする請求項１〜
   ３のいずれか１項に記載の方法。
5. 【請求項５】装填および溶離溶液が緩衝物質を含有する
   請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 【請求項６】溶離を、約０〜１モル／の勾配で、アン
   モニウムまたはアルカリ金属の塩を用いて行う、請求項
   １〜５のいずれか１項に記載の方法。