JPH05308991A - ジペプチジル−アミノペプチダーゼ−１を使用する折り畳まれたインスリン前駆物質からｎ−末端伸長鎖の選択的な除去方法 - Google Patents
ジペプチジル−アミノペプチダーゼ−１を使用する折り畳まれたインスリン前駆物質からｎ−末端伸長鎖の選択的な除去方法Info
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- JPH05308991A JPH05308991A JP5027874A JP2787493A JPH05308991A JP H05308991 A JPH05308991 A JP H05308991A JP 5027874 A JP5027874 A JP 5027874A JP 2787493 A JP2787493 A JP 2787493A JP H05308991 A JPH05308991 A JP H05308991A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
Abstract
(57)【要約】
【目的】 折り畳まれたインスリン前駆物質からＮ−末
端ジペプチド伸長鎖を選択的に除去する。 【構成】 ジペプチジル−アミノペプチダーゼ−１（Ｄ
ＡＰ−１）の有効量で処理することによって折り畳まれ
たインスリン前駆物質からＮ−末端伸長鎖を除去する。
端ジペプチド伸長鎖を選択的に除去する。 【構成】 ジペプチジル−アミノペプチダーゼ−１（Ｄ
ＡＰ−１）の有効量で処理することによって折り畳まれ
たインスリン前駆物質からＮ−末端伸長鎖を除去する。
Description
【０００１】
【発明が解決しようとする課題】原核細胞におけるタン
パク質生合成への組換えＤＮＡ技術の適用は、一般にア
ミノ末端にメチオニン残基を有するタンパク質の発現を
もたらす。天然タンパク質へのメチオニンの付加は、そ
の生物学的活性、コンホメーション安定性、抗原性等を
変化させ得るから、もし可能であればこれを除くことが
最も望ましい。アミノ末端メチオニンと所望の天然タン
パク質の間へ切断部位を挿入することにより、理論上、
所望の天然タンパク質の生産を達成するために選ぶ方法
に融通性が一層増大する。しかし実際には、選択的な切
断を達成できる実用的な方法の種類はごく限られたもの
だけである。したがって最も重要な目的は、アミノ末端
メチオニンを取り除き、天然の生合成的に生産されるタ
ンパク質を生成し得る別法を見いだすことにある。Ｎ−
末端アミノ酸を除去するのに利用できると認められてい
る１方法として、ジペプチジル−アミノペプチダーゼ−
１（ＤＡＰ−１）とも呼ばれるカテプシンＣの利用があ
る。ＤＡＰ−１はタンパク質またはポリペプチドのアミ
ノ末端からジペプチドを（２個のアミノ酸を１単位とし
て）取り除く酵素である。ジペプチドの除去は、好適な
条件下で始まり、（１）Ｎ−末端アミノ酸のアミノ基が
封鎖されるか、（２）除去部位がプロリンのどちらかの
側にあるか、または（３）Ｎ−末端アミノ酸がリシンま
たはアルギニンであるまで続けられる。したがって初め
のメチオニンと所望の生産物の間にアミノ酸残基を含ん
でいる前駆物質分子を設計することにより、ＤＡＰ−１
は、前駆物質分子から所望の生合成的に生産されるタン
パク質を生産するのに若干の有用性を有し得る。前駆物
質分子をＤＡＰ−１で処理することにより、初めのジペ
プチドが除かれ、所望の生産物の生産を行なうことがで
きる。しかしこの方法は、上記の停止配列の１つに出会
うまでジペプチドの除去を連続的に続けるであろうと予
想されるので、その適用は極めて限定される。即ちＤＡ
Ｐ−１による手段は有用性が限られ、一般に所望の生産
物のＮ−末端配列がＤＡＰ−１停止配列を含んでいる場
合だけに限って適用されるべきである。
パク質生合成への組換えＤＮＡ技術の適用は、一般にア
ミノ末端にメチオニン残基を有するタンパク質の発現を
もたらす。天然タンパク質へのメチオニンの付加は、そ
の生物学的活性、コンホメーション安定性、抗原性等を
変化させ得るから、もし可能であればこれを除くことが
最も望ましい。アミノ末端メチオニンと所望の天然タン
パク質の間へ切断部位を挿入することにより、理論上、
所望の天然タンパク質の生産を達成するために選ぶ方法
に融通性が一層増大する。しかし実際には、選択的な切
断を達成できる実用的な方法の種類はごく限られたもの
だけである。したがって最も重要な目的は、アミノ末端
メチオニンを取り除き、天然の生合成的に生産されるタ
ンパク質を生成し得る別法を見いだすことにある。Ｎ−
末端アミノ酸を除去するのに利用できると認められてい
る１方法として、ジペプチジル−アミノペプチダーゼ−
１（ＤＡＰ−１）とも呼ばれるカテプシンＣの利用があ
る。ＤＡＰ−１はタンパク質またはポリペプチドのアミ
ノ末端からジペプチドを（２個のアミノ酸を１単位とし
て）取り除く酵素である。ジペプチドの除去は、好適な
条件下で始まり、（１）Ｎ−末端アミノ酸のアミノ基が
封鎖されるか、（２）除去部位がプロリンのどちらかの
側にあるか、または（３）Ｎ−末端アミノ酸がリシンま
たはアルギニンであるまで続けられる。したがって初め
のメチオニンと所望の生産物の間にアミノ酸残基を含ん
でいる前駆物質分子を設計することにより、ＤＡＰ−１
は、前駆物質分子から所望の生合成的に生産されるタン
パク質を生産するのに若干の有用性を有し得る。前駆物
質分子をＤＡＰ−１で処理することにより、初めのジペ
プチドが除かれ、所望の生産物の生産を行なうことがで
きる。しかしこの方法は、上記の停止配列の１つに出会
うまでジペプチドの除去を連続的に続けるであろうと予
想されるので、その適用は極めて限定される。即ちＤＡ
Ｐ−１による手段は有用性が限られ、一般に所望の生産
物のＮ−末端配列がＤＡＰ−１停止配列を含んでいる場
合だけに限って適用されるべきである。
【０００２】
【課題を解決するための手段】本発明は、ＤＡＰ−１を
利用して、折り畳まれたインスリン前駆物質（インスリ
ン様活性を有する化合物への前駆物質）から望ましくな
いＮ−末端アミノ酸を選択的に取り除く方法を提供す
る。本発明は、原核生物で生産されるインスリン前駆物
質のアミノ末端、および酵母発現系でしばしば使用され
る先導配列に存在するメチオニン残基のような望ましく
ないＮ−末端アミノ酸を選択的に除去することができ
る。したがって本発明は、インスリン様活性を有する化
合物の生産技術に著しい進歩をもたらす。本発明は、Ｄ
ＡＰ−１切断に先立ってインスリン前駆物質を折り畳む
と、インスリン前駆物質のＢ鎖のアミノ末端からのＮ−
末端ジペプチド伸長鎖の効率的な除去を生じるが、それ
以上のＤＡＰ−１消化からインスリン前駆物質を保護す
るという予想外な発見を開示し、これを権利範囲とす
る。マクドナルド(McDonald,J.K.)、カレハン(Calleha
n, P.X.)、およびエリス(Ellis, S.)［メソッズ・イン
・エンジモロジー(Mehtods in Enzymology)、２５Ｂ
巻、２７２〜２８１頁（１９７２年）］は、ヒト・イン
スリンＢ鎖と同一なＮ−末端配列（残基１〜２９）を有
する酸化したウシ・インスリン（システイン残基をシス
テイン酸へ酸化し、適切な折り畳みおよびジスルフィド
結合の生成を防止する）のＢ鎖はＤＡＰ−１によってジ
ペプチドを残基２７〜３０まで分解するが、プロリン２
８で配列特異的な停止の出現のため、それ以上分解され
ないことを報告した。即ち、ＤＡＰ−１はＮ−末端伸長
鎖の除去を超えてインスリン前駆物質を分解することが
予想されるが、本発明では、折り畳んだ状態で、ヒト・
インスリンはそれ以上分解されないことを提供する。恐
らくインスリン前駆物質を折り畳むことによって、イン
スリンＢ鎖の天然アミノ末端が立体障害によってＤＡＰ
−１切断から保護される３次構造を生じるのであろう。
したがってインスリン前駆物質のアミノ末端伸長鎖（ま
たは類似の停止構造を有する任意の他のタンパク質）
を、所望のタンパク質のかなり望ましくない消化を伴な
うことなく効率的に除去することができる。また遺伝子
技術によって発現系へ導入される先導配列も、これと同
様の態様で、ＤＡＰ−１を使用して選択的に除去するこ
とができる。
利用して、折り畳まれたインスリン前駆物質（インスリ
ン様活性を有する化合物への前駆物質）から望ましくな
いＮ−末端アミノ酸を選択的に取り除く方法を提供す
る。本発明は、原核生物で生産されるインスリン前駆物
質のアミノ末端、および酵母発現系でしばしば使用され
る先導配列に存在するメチオニン残基のような望ましく
ないＮ−末端アミノ酸を選択的に除去することができ
る。したがって本発明は、インスリン様活性を有する化
合物の生産技術に著しい進歩をもたらす。本発明は、Ｄ
ＡＰ−１切断に先立ってインスリン前駆物質を折り畳む
と、インスリン前駆物質のＢ鎖のアミノ末端からのＮ−
末端ジペプチド伸長鎖の効率的な除去を生じるが、それ
以上のＤＡＰ−１消化からインスリン前駆物質を保護す
るという予想外な発見を開示し、これを権利範囲とす
る。マクドナルド(McDonald,J.K.)、カレハン(Calleha
n, P.X.)、およびエリス(Ellis, S.)［メソッズ・イン
・エンジモロジー(Mehtods in Enzymology)、２５Ｂ
巻、２７２〜２８１頁（１９７２年）］は、ヒト・イン
スリンＢ鎖と同一なＮ−末端配列（残基１〜２９）を有
する酸化したウシ・インスリン（システイン残基をシス
テイン酸へ酸化し、適切な折り畳みおよびジスルフィド
結合の生成を防止する）のＢ鎖はＤＡＰ−１によってジ
ペプチドを残基２７〜３０まで分解するが、プロリン２
８で配列特異的な停止の出現のため、それ以上分解され
ないことを報告した。即ち、ＤＡＰ−１はＮ−末端伸長
鎖の除去を超えてインスリン前駆物質を分解することが
予想されるが、本発明では、折り畳んだ状態で、ヒト・
インスリンはそれ以上分解されないことを提供する。恐
らくインスリン前駆物質を折り畳むことによって、イン
スリンＢ鎖の天然アミノ末端が立体障害によってＤＡＰ
−１切断から保護される３次構造を生じるのであろう。
したがってインスリン前駆物質のアミノ末端伸長鎖（ま
たは類似の停止構造を有する任意の他のタンパク質）
を、所望のタンパク質のかなり望ましくない消化を伴な
うことなく効率的に除去することができる。また遺伝子
技術によって発現系へ導入される先導配列も、これと同
様の態様で、ＤＡＰ−１を使用して選択的に除去するこ
とができる。
【０００３】図１は、ヒト・プロインスリン（残基１〜
８６）のアミノ酸配列およびジスルフィド結合様式をＮ
−末端ジペプチド伸長鎖（残基−１〜０）とともに示
す。本発明は、折り畳まれたインスリン前駆物質からＤ
ＡＰ−１でアミノ末端残基を除去する改良方法を提供す
る。原核生物の遺伝子技術によって生産された対象とな
るポリペプチド生産物から、Ｎ−末端メチオニン残基を
除去するための環境上許容し得、しかも経済的に有効な
方法がないことは、組換えＤＮＡ技術の応用性を極度に
制約する。本発明は、インスリン前駆物質からＮ−末端
伸長鎖残基を除去するそのような方法を提供する。例示
的なインスリン前駆物質のアミノ酸配列およびジスルフ
ィド結合様式を図１に示す。図１から明らかなように、
ヒト・プロインスリンはＡ鎖（図１、アミノ酸残基６６
〜８６）、Ｂ鎖（図１、アミノ酸残基１〜３０）、およ
び連結ペプチド（図１、アミノ酸残基３１〜６５）から
なる。またＢ鎖のＮ−末端ジペプチド伸長鎖（残基−１
および０）を図１に示す。本明細書で用いる「インスリ
ン前駆物質」の語は、プロインスリン、プロインスリン
類似体、およびインスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、また
はその類似体を含んでおり、連結ペプチドによって連結
され、その連結ペプチドが１またはそれ以上のアミノ酸
残基を含んでいるその他のプロインスリン様分子のＮ−
末端伸長種をいう。「プロインスリン類似体」の語は、
Ａ鎖および／またはＢ鎖および／または連結ペプチド
で、置換、欠失および／または付加を作成したプロイン
スリン分子である。本発明で用いる「プロインスリン様
分子」の語は、プロインスリン、およびプロインスリン
類似体を含む。インスリン様の特性を有する多数のポリ
ペプチドが知られている。すべてを網羅したわけではな
いが、そのようなインスリン様分子のリストを表１に挙
げる。表１の化合物はインスリンまたはプロインスリン
類似体の何れかとして列挙したものである。当業者であ
れば、インスリン類似体がプロインスリン類似体と異な
る点は、単に連結ペプチド、またはＡ鎖およびＢ鎖を架
橋するのに利用した一連のアミノ酸の存在だけであると
いうことを理解し得よう。
８６）のアミノ酸配列およびジスルフィド結合様式をＮ
−末端ジペプチド伸長鎖（残基−１〜０）とともに示
す。本発明は、折り畳まれたインスリン前駆物質からＤ
ＡＰ−１でアミノ末端残基を除去する改良方法を提供す
る。原核生物の遺伝子技術によって生産された対象とな
るポリペプチド生産物から、Ｎ−末端メチオニン残基を
除去するための環境上許容し得、しかも経済的に有効な
方法がないことは、組換えＤＮＡ技術の応用性を極度に
制約する。本発明は、インスリン前駆物質からＮ−末端
伸長鎖残基を除去するそのような方法を提供する。例示
的なインスリン前駆物質のアミノ酸配列およびジスルフ
ィド結合様式を図１に示す。図１から明らかなように、
ヒト・プロインスリンはＡ鎖（図１、アミノ酸残基６６
〜８６）、Ｂ鎖（図１、アミノ酸残基１〜３０）、およ
び連結ペプチド（図１、アミノ酸残基３１〜６５）から
なる。またＢ鎖のＮ−末端ジペプチド伸長鎖（残基−１
および０）を図１に示す。本明細書で用いる「インスリ
ン前駆物質」の語は、プロインスリン、プロインスリン
類似体、およびインスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、また
はその類似体を含んでおり、連結ペプチドによって連結
され、その連結ペプチドが１またはそれ以上のアミノ酸
残基を含んでいるその他のプロインスリン様分子のＮ−
末端伸長種をいう。「プロインスリン類似体」の語は、
Ａ鎖および／またはＢ鎖および／または連結ペプチド
で、置換、欠失および／または付加を作成したプロイン
スリン分子である。本発明で用いる「プロインスリン様
分子」の語は、プロインスリン、およびプロインスリン
類似体を含む。インスリン様の特性を有する多数のポリ
ペプチドが知られている。すべてを網羅したわけではな
いが、そのようなインスリン様分子のリストを表１に挙
げる。表１の化合物はインスリンまたはプロインスリン
類似体の何れかとして列挙したものである。当業者であ
れば、インスリン類似体がプロインスリン類似体と異な
る点は、単に連結ペプチド、またはＡ鎖およびＢ鎖を架
橋するのに利用した一連のアミノ酸の存在だけであると
いうことを理解し得よう。
【０００４】 表１ インスリン類似体およびプロインスリン類似体 Ａ. １カ所だけのアミノ酸変化 Ｇｌｙ Ａ21 Ｇｌｕ Ａ21 Ｓｅｒ Ａ21 Ｔｈｒ Ｂ10 Ａｓｐ Ｂ25 Ｓｅｒ Ａ21 Ｌｅｕ Ａ21 Ｇｌｙ Ａ22 Ａｓｐ Ｂ10 Ｈｉｓ Ｂ25 Ａｌａ Ａ21 Ｍｅｔ Ａ21 Ａｌａ Ａ22 Ａｒｇ Ｂ10 Ｇｌｕ Ｂ26 Ｈｉｓ Ａ21 Ｔｙｒ Ａ21 Ａｓｐ Ｂ9 Ｉｌｅ Ｂ12 Ｇｌｕ Ｂ27 Ａｓｐ Ａ21 Ｖａｌ Ａ21 Ａｓｎ Ｂ9 Ｈｉｓ Ｂ16 Ａｓｐ Ｂ28 Ｔｈｒ Ａ21 Ｉｌｅ Ａ21 Ｈｉｓ Ｂ9 Ｇｌｎ Ｂ17 Ａｌａ Ｂ30 Ｇｌｎ Ａ21 Ｔｒｐ Ａ21 Ｇｌｕ Ｂ10 Ｇｌｎ Ｂ20 ｄｅｓ-Ｂ30 Ｔｈｒ Ａ30-ＮＨ2 Ａｌａ Ａ30-ＮＨ2 Ｂ. ２カ所のアミノ酸変化 Ｇｌｙ Ａ21およびＡｓｐ Ｂ10 Ｈｉｓ Ａ21およびＬｙｓ Ｂ27 Ｓｅｒ Ａ21およびＡｓｐ Ｂ10 Ａｓｐ Ａ21およびＬｙｓ Ｂ27 Ｔｈｒ Ａ21およびＡｓｐ Ｂ10 Ｇｌｙ Ａ21およびＡｒｇ Ｂ27 Ａｌａ Ａ21およびＡｓｐ Ｂ10 Ｓｅｒ Ａ21およびＡｒｇ Ｂ27 Ｈｉｓ Ａ21およびＡｓｐ Ｂ10 Ｔｈｒ Ａ21およびＡｒｇ Ｂ27 Ａｓｐ Ａ21およびＡｓｐ Ｂ10 Ａｌａ Ａ21およびＡｒｇ Ｂ27 Ｇｌｙ Ａ21およびＴｈｒ Ｂ10 Ｇｌｕ Ｂ27およびＧｌｕ Ｂ16 Ｓｅｒ Ａ21およびＴｈｒ Ｂ10 Ａｓｐ Ｂ5 およびＡｓｎ Ｂ10 Ｔｈｒ Ａ21およびＴｈｒ Ｂ10 Ｇｌｕ Ｂ12およびＧｌｎ Ｂ13 Ａｌａ Ａ21およびＴｈｒ Ｂ10 Ｓｅｒ Ｂ14およびＡｓｐ Ｂ17 Ｈｉｓ Ａ21およびＴｈｒ Ｂ10 Ｌｙｓ Ｂ28およびＰｒｏ Ｂ29 Ａｓｐ Ａ21およびＴｈｒ Ｂ10 Ｈｉｓ Ａ21およびＡｒｇ Ｂ27 Ｇｌｙ Ａ21およびＡｒｇ Ｂ10 Ａｓｐ Ａ21およびＡｒｇ Ｂ27 Ｓｅｒ Ａ21およびＡｒｇ Ｂ10 Ｇｌｕ Ｂ12およびｄｅｓ-Ｂ30 Ｔｈｒ Ａ21およびＡｒｇ Ｂ10 Ａｓｐ Ｂ10およびＳｅｒ Ｂ2 Ａｌａ Ａ21およびＡｒｇ Ｂ10 Ａｓｐ Ｂ10およびＡｓｐ Ｂ28 Ｈｉｓ Ａ21およびＡｒｇ Ｂ10 Ｇｌｕ Ｂ10およびＧｌｕ Ａ13 Ａｓｐ Ａ21およびＡｒｇ Ｂ10 Ｇｌｕ Ｂ27およびＳｅｒ Ａ13 Asp Ｂ10およびｄｅｓ-Ｂ30 Ｇｌｕ Ｂ27およびＡｓｐ Ａ21 Ｔｈｒ Ｂ10およびｄｅｓ-Ｂ30 Ｇｌｕ Ｂ27およびＧｌｕ Ｂ1 Ａｒｇ Ｂ10およびｄｅｓ-Ｂ30 Ｇｌｕ Ｂ27およびＡｓｐ Ｂ9 Ｇｌｙ Ａ21およびＬｙｓ Ｂ27 Ｇｌｙ Ａ21およびＡｌａ Ｂ30 Ｓｅｒ Ａ21およびＬｙｓ Ｂ27 Ｓｅｒ Ａ21およびＡｌａ Ｂ30 Ｔｈｒ Ａ21およびＬｙｓ Ｂ27 Ｔｈｒ Ａ21およびＡｌａ Ｂ30 Ａｌａ Ａ21およびＬｙｓ Ｂ27 Ａｌａ Ａ21およびＡｌａ Ｂ30 ｄｅｓ-Ｂ29およびｄｅｓ-Ｂ30 ｈＳｅｒ Ａ21およびＡｌａ Ｂ30 Ｃ. ３カ所のアミノ酸変化 Ｇｌｙ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17 Ｓｅｒ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17 Ｔｈｒ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17 Ａｌａ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17 Ｈｉｓ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17 Ａｓｐ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17 Ｇｌｙ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ｓｅｒ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ｔｈｒ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ａｌａ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ｈｉｓ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ａｓｐ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ｇｌｙ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17 Ｓｅｒ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17 Ｔｈｒ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17 Ａｌａ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17 Ｈｉｓ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17 Ａｓｐ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17 Ｇｌｙ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ｓｅｒ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ｔｈｒ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ａｌａ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ｈｉｓ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ａｓｐ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ａｓｐ Ｂ10＋Ｈｉｓ Ａ8 ＋Ｈｉｓ Ｂ25 Ｇｌｕ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ａ3 ＋Ｇｌｕ Ｂ22 Ｇｌｕ Ｂ27＋Ｓｅｒ Ｂ5 ＋Ａｓｐ Ｂ5 Ｇｌｕ Ｂ27＋Ｈｉｓ Ａ8 ＋Ａｓｐ Ｂ9 Ｇｌｕ Ｂ27＋Ａｓｐ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ9 ｄｅｓ-Ｂ28＋ｄｅｓ-Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｇｌｙ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋Ａｌａ Ｂ30 Ｓｅｒ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋Ａｌａ Ｂ30 Ｔｈｒ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋Ａｌａ Ｂ30 Ａｌａ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋Ａｌａ Ｂ30 Ｈｉｓ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋Ａｌａ Ｂ30 Ａｓｐ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋Ａｌａ Ｂ30 Ｇｌｙ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋Ａｌａ Ｂ30 Ｓｅｒ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋Ａｌａ Ｂ30 Ｔｈｒ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋Ａｌａ Ｂ30 Ａｌａ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋Ａｌａ Ｂ30 Ｈｉｓ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋Ａｌａ Ｂ30 Ａｓｐ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋Ａｌａ Ｂ30 Ｇｌｙ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋Ａｌａ Ｂ30 Ｓｅｒ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋Ａｌａ Ｂ30 Ｔｈｒ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋Ａｌａ Ｂ30 Ａｌａ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋Ａｌａ Ｂ30 Ｈｉｓ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋Ａｌａ Ｂ30 Ａｓｐ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋Ａｌａ Ｂ30 Ｇｌｙ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30Ｓｅｒ Ａ21＋
Ａｓｐ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｔｈｒ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ａｌａ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｈｉｓ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ａｓｐ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｇｌｙ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｓｅｒ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｔｈｒ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ａｌａ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｈｉｓ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ａｓｐ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｇｌｙ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｓｅｒ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｔｈｒ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ａｌａ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｈｉｓ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ａｓｐ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｒｇ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｓｐ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｒｇ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｇｌｙ Ａ21＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｓｅｒ Ａ21＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｔｈｒ Ａ21＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｌａ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｈｉｓ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｓｐ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Glu Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ａｒｇ Ｂ27＋Ｇｌｙ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ30-ＮＨ2 Ｄ. ４カ所のアミノ酸変化 Ｇｌｙ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ｓｅｒ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ｔｈｒ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ａｌａ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ａｓｐ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ｈｉｓ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ｇｌｙ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ｓｅｒ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ｔｈｒ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ａｌａ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ａｓｐ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ｈｉｓ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ｇｌｕ Ｂ10＋Ｈｉｓ Ａ8 ＋Ｈｉｓ Ｂ4 ＋Ｈｉｓ Ｂ27 ｄｅｓ-Ｂ27＋ｄｅｓ-Ｂ28＋ｄｅｓ-Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｇｌｙ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｓｅｒ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｔｈｒ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｌａ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｈｉｓ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｓｐ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｇｌｙ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｓｅｒ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｔｈｒ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｌａ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｈｉｓ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｓｐ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｇｌｙ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｓｅｒ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｔｈｒ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｌａ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｈｉｓ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｓｐ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｇｌｙ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｓｅｒ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｔｈｒ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｌａ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｈｉｓ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｓｐ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｇｌｙ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｓｅｒ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｔｈｒ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｌａ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｈｉｓ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｓｐ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｇｌｙ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｓｅｒ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｔｈｒ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｌａ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｈｉｓ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｓｐ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｇｌｙ Ａ21＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ｓｅｒ Ａ21＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ｔｈｒ Ａ21＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ａｌａ Ａ21＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ｈｉｓ Ａ21＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ａｓｐ Ａ21＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ｇｌｙ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ｓｅｒ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ｔｈｒ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ａｌａ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ｈｉｓ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ａｓｐ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ｇｌｙ Ａ21＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｓｅｒ Ａ21＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｔｈｒ Ａ21＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ａｌａ Ａ21＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｈｉｓ Ａ21＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ａｓｐ Ａ21＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｇｌｙ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｓｅｒ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｔｈｒ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ａｌａ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｈｉｓ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ａｓｐ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ａｓｐ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ａｒｇ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ａｓｐ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ａｒｇ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ａｓｐ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ａｒｇ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ａｓｐ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ａｒｇ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 ｄｅｓ-Ｂ27＋ｄｅｓ-Ｂ28＋ｄｅｓ-Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｅ. ５カ所のアミノ酸変化 ｄｅｓ-Ｂ26＋ｄｅｓ-Ｂ27＋ｄｅｓ-Ｂ28＋ｄｅｓ-Ｂ29
＋ｄｅｓ-Ｂ30
Ａｓｐ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｔｈｒ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ａｌａ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｈｉｓ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ａｓｐ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｇｌｙ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｓｅｒ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｔｈｒ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ａｌａ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｈｉｓ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ａｓｐ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｇｌｙ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｓｅｒ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｔｈｒ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ａｌａ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｈｉｓ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ａｓｐ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｒｇ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｓｐ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｒｇ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｇｌｙ Ａ21＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｓｅｒ Ａ21＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｔｈｒ Ａ21＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｌａ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｈｉｓ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｓｐ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Glu Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ａｒｇ Ｂ27＋Ｇｌｙ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ30-ＮＨ2 Ｄ. ４カ所のアミノ酸変化 Ｇｌｙ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ｓｅｒ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ｔｈｒ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ａｌａ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ａｓｐ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ｈｉｓ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ｇｌｙ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ｓｅｒ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ｔｈｒ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ａｌａ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ａｓｐ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ｈｉｓ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ27＋Ｇｌｎ Ａ17＋Ｇｌｎ Ｂ13 Ｇｌｕ Ｂ10＋Ｈｉｓ Ａ8 ＋Ｈｉｓ Ｂ4 ＋Ｈｉｓ Ｂ27 ｄｅｓ-Ｂ27＋ｄｅｓ-Ｂ28＋ｄｅｓ-Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｇｌｙ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｓｅｒ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｔｈｒ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｌａ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｈｉｓ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｓｐ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｇｌｙ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｓｅｒ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｔｈｒ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｌａ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｈｉｓ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｓｐ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｇｌｙ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｓｅｒ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｔｈｒ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｌａ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｈｉｓ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｓｐ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｇｌｙ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｓｅｒ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｔｈｒ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｌａ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｈｉｓ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｓｐ Ａ21＋Ａｓｐ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｇｌｙ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｓｅｒ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｔｈｒ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｌａ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｈｉｓ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｓｐ Ａ21＋Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｇｌｙ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｓｅｒ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｔｈｒ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｌａ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｈｉｓ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ａｓｐ Ａ21＋Ａｒｇ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29 Ｇｌｙ Ａ21＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ｓｅｒ Ａ21＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ｔｈｒ Ａ21＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ａｌａ Ａ21＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ｈｉｓ Ａ21＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ａｓｐ Ａ21＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ｇｌｙ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ｓｅｒ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ｔｈｒ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ａｌａ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ｈｉｓ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ａｓｐ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ｇｌｙ Ａ21＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｓｅｒ Ａ21＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｔｈｒ Ａ21＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ａｌａ Ａ21＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｈｉｓ Ａ21＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ａｓｐ Ａ21＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｇｌｙ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｓｅｒ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｔｈｒ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ａｌａ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｈｉｓ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ａｓｐ Ａ21＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ａｓｐ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ａｒｇ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ａｓｐ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ａｒｇ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋Ａｌａ Ｂ30 Ａｓｐ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ａｒｇ Ｂ10＋Ｇｌｕ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ａｓｐ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｔｈｒ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ａｒｇ Ｂ10＋Ｌｙｓ Ｂ28＋Ｐｒｏ Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 ｄｅｓ-Ｂ27＋ｄｅｓ-Ｂ28＋ｄｅｓ-Ｂ29＋ｄｅｓ-Ｂ30 Ｅ. ５カ所のアミノ酸変化 ｄｅｓ-Ｂ26＋ｄｅｓ-Ｂ27＋ｄｅｓ-Ｂ28＋ｄｅｓ-Ｂ29
＋ｄｅｓ-Ｂ30
【０００５】表１のヒト・インスリン様分子は生物学的
活性を有する［ブレンジ（Brange,J.）ら、ダイアビー
テス・ケア（Diabetes Care）、１９９０年、１３巻、
９号、９２３〜９５４頁、および米国特許第４９１６２
１２号（１９９０年４月１０日発行）参照］。本発明の
目的のため、インスリン前駆物質をそのような置換また
は欠失が起こったＡ鎖またはＢ鎖のアミノ酸の置換また
は欠失位置で表示することにより命名する。例えばＭｅ
ｔ−Ａｒｇ（Ｌｙｓ Ｂ28、Ｐｒｏ Ｂ29）プロインスリ
ンとは、Ｂ鎖の２８位でプロリンをリシンに置換し、Ｂ
鎖の２９位でリシンをプロリンで置換したヒト・プロイ
ンスリン分子で、Ｍｅｔ−Ａｒｇ Ｎ−末端伸長鎖を有
するインスリン前駆物質である。インスリンのようなホ
ルモンは、固有のホルモンまたはホルモン群に特異的な
受容体と相互作用することによって生物学的活性を表わ
す。表１のインスリン類似体の生物学的活性は、インス
リン受容体と相互作用することができる３次構造を維持
することによって起こる。したがって生物学的活性を保
有するインスリン類似体の３次構造は類似している。
活性を有する［ブレンジ（Brange,J.）ら、ダイアビー
テス・ケア（Diabetes Care）、１９９０年、１３巻、
９号、９２３〜９５４頁、および米国特許第４９１６２
１２号（１９９０年４月１０日発行）参照］。本発明の
目的のため、インスリン前駆物質をそのような置換また
は欠失が起こったＡ鎖またはＢ鎖のアミノ酸の置換また
は欠失位置で表示することにより命名する。例えばＭｅ
ｔ−Ａｒｇ（Ｌｙｓ Ｂ28、Ｐｒｏ Ｂ29）プロインスリ
ンとは、Ｂ鎖の２８位でプロリンをリシンに置換し、Ｂ
鎖の２９位でリシンをプロリンで置換したヒト・プロイ
ンスリン分子で、Ｍｅｔ−Ａｒｇ Ｎ−末端伸長鎖を有
するインスリン前駆物質である。インスリンのようなホ
ルモンは、固有のホルモンまたはホルモン群に特異的な
受容体と相互作用することによって生物学的活性を表わ
す。表１のインスリン類似体の生物学的活性は、インス
リン受容体と相互作用することができる３次構造を維持
することによって起こる。したがって生物学的活性を保
有するインスリン類似体の３次構造は類似している。
【０００６】本発明の方法は、折り畳まれたインスリン
前駆物質の３次構造における類似性を利用するものであ
って、それによってインスリン前駆物質から望ましくな
いアミノ末端伸長鎖を除去するのに広範囲な応用性のあ
る方法を提供する。本発明は極めて多数のインスリン前
駆物質分子に適用可能であるが、これらのインスリン前
駆物質分子の幾つかは他の前駆物質より一層好ましい。
哺乳動物種のインスリン分子は類似のアミノ酸配列を有
している。したがって本発明の方法は、さまざまな哺乳
動物種のこれらのインスリン前駆物質へ容易に適用でき
る。本発明の目的のためには、ヒト・インスリン前駆物
質が好ましい。本発明で使用するのに極めて好ましいイ
ンスリン前駆物質は、天然のヒト・Ｂ鎖配列である。た
だしＢ鎖に、下記の１またはそれ以上のアミノ酸修飾を
独立して含んでいる配列もまた好ましい。 （１）２８位のＰｒｏをＡｓｐ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌ
ｅ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、または
Ｇｌｙの何れかで置換。これらの置換のうち、Ｖａｌ、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓは一層
好ましく、そのうちＬｙｓは最も好ましい。 （２）２９位のＬｙｓをＰｒｏで置換。 （３）１位のＰｈｅをＡｓｐで置換。 （４）３位のＡｓｎをＡｓｐで置換。 （５）９位のＳｅｒをＡｓｐで置換。 （６）１０位のＨｉｓをＡｓｐで置換。 （７）３０位のＴｈｒをＡｌａで置換。 （８）３０位でＴｈｒの欠失。 （９）Ｂ鎖残基２８〜３０の欠失。 （１０）Ｂ鎖残基２７〜３０の欠失。 （１１）Ｂ鎖残基２６〜３０の欠失。 （１２）Ｂ鎖残基１の欠失。 （１３）Ｂ鎖残基１および２の欠失。 本発明で使用するのに好ましいインスリン前駆物質は、
天然のヒト・Ａ鎖配列を含む。ただしまたＡ鎖の２１位
でＡｓｎ（図１の８６位）をＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、またはＳｅｒで置換した配列
も好ましい。
前駆物質の３次構造における類似性を利用するものであ
って、それによってインスリン前駆物質から望ましくな
いアミノ末端伸長鎖を除去するのに広範囲な応用性のあ
る方法を提供する。本発明は極めて多数のインスリン前
駆物質分子に適用可能であるが、これらのインスリン前
駆物質分子の幾つかは他の前駆物質より一層好ましい。
哺乳動物種のインスリン分子は類似のアミノ酸配列を有
している。したがって本発明の方法は、さまざまな哺乳
動物種のこれらのインスリン前駆物質へ容易に適用でき
る。本発明の目的のためには、ヒト・インスリン前駆物
質が好ましい。本発明で使用するのに極めて好ましいイ
ンスリン前駆物質は、天然のヒト・Ｂ鎖配列である。た
だしＢ鎖に、下記の１またはそれ以上のアミノ酸修飾を
独立して含んでいる配列もまた好ましい。 （１）２８位のＰｒｏをＡｓｐ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌ
ｅ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、または
Ｇｌｙの何れかで置換。これらの置換のうち、Ｖａｌ、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓは一層
好ましく、そのうちＬｙｓは最も好ましい。 （２）２９位のＬｙｓをＰｒｏで置換。 （３）１位のＰｈｅをＡｓｐで置換。 （４）３位のＡｓｎをＡｓｐで置換。 （５）９位のＳｅｒをＡｓｐで置換。 （６）１０位のＨｉｓをＡｓｐで置換。 （７）３０位のＴｈｒをＡｌａで置換。 （８）３０位でＴｈｒの欠失。 （９）Ｂ鎖残基２８〜３０の欠失。 （１０）Ｂ鎖残基２７〜３０の欠失。 （１１）Ｂ鎖残基２６〜３０の欠失。 （１２）Ｂ鎖残基１の欠失。 （１３）Ｂ鎖残基１および２の欠失。 本発明で使用するのに好ましいインスリン前駆物質は、
天然のヒト・Ａ鎖配列を含む。ただしまたＡ鎖の２１位
でＡｓｎ（図１の８６位）をＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、またはＳｅｒで置換した配列
も好ましい。
【０００７】本発明で使用するインスリン前駆物質に
は、インスリン前駆物質のＡ鎖およびＢ鎖を結合する連
結ペプチドを含む。連結ペプチドは、ほかの場合だと、
Ａ鎖のアミノ末端をＤＡＰ−１で消化するのに利用でき
るはずであるから、本発明の実施の際に扱い易いインス
リン前駆物質の不可欠な部分である。連結ペプチドは広
範囲の任意のポリペプチド構造であり得る。連結ペプチ
ドの選択の際に本発明で必要な唯一の必要条件は、本発
明でＤＡＰ−１によるＮ−末端ジペプチド伸長鎖の除去
を進行させる折り畳み段階のあいだ、連結ペプチドがＡ
鎖とＢ鎖の間に適切なジスルフィド対合を保ち得なけれ
ばならないことである。連結ペプチドは、一般に少なく
とも２個、好ましくは約２〜約３５個、一層好ましくは
約６〜約３５個のアミノ酸残基を有する。最も好ましく
は、連結ペプチドはヒト・プロインスリンの「天然」連
結ペプチドである。ヒト・プロインスリンの「天然」連
結ペプチドのアミノ酸配列を図１に示す（残基３１〜６
５）。連結ペプチドは上記のような天然の連結配列が好
ましいが、広い範囲の一層短い任意のペプチド配列であ
ることができる。連結ペプチドとして有用な代表的なジ
ペプチドは−Ａｒｇ−Ａｒｇ−である。また連結ペプチ
ドは前記のジペプチド伸長鎖、即ち、式−Ａｒｇ−Ｘ'
−Ａｒｇ−（式中、Ｘ'は少なくとも１個のアミノ酸残
基を表わす）を有する配列であり得る。極めて好ましい
連結ペプチドは、−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ
−、および−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘ2−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−
（式中、Ｘ2は少なくとも１個のアミノ酸残基であり、
好ましくは少なくとも２個のアミノ酸残基である）の構
造を有する一層長鎖のペプチドである。これらの連結ペ
プチドには天然の連結ペプチドを含む。本発明の実施に
よってインスリン前駆物質から選択的に除去することが
できるＮ−末端伸長鎖は極めて多い。本発明の目的のた
め、Ｎ−末端伸長鎖はＢ鎖の１つの残基に先行する任意
のアミノ酸配列である。即ち、ヒト・プロインスリンの
構造（図１）に関していえば、Ｐｈｅ−１に先行する任
意の残基（複数もあり）はＮ−末端伸長鎖を構成する。
本発明の主な目的は、遺伝子工学的に操作した原核生物
起原のインスリン前駆物質から、Ｎ−末端メチオニン残
基を除去できる手段を提供することにある。
は、インスリン前駆物質のＡ鎖およびＢ鎖を結合する連
結ペプチドを含む。連結ペプチドは、ほかの場合だと、
Ａ鎖のアミノ末端をＤＡＰ−１で消化するのに利用でき
るはずであるから、本発明の実施の際に扱い易いインス
リン前駆物質の不可欠な部分である。連結ペプチドは広
範囲の任意のポリペプチド構造であり得る。連結ペプチ
ドの選択の際に本発明で必要な唯一の必要条件は、本発
明でＤＡＰ−１によるＮ−末端ジペプチド伸長鎖の除去
を進行させる折り畳み段階のあいだ、連結ペプチドがＡ
鎖とＢ鎖の間に適切なジスルフィド対合を保ち得なけれ
ばならないことである。連結ペプチドは、一般に少なく
とも２個、好ましくは約２〜約３５個、一層好ましくは
約６〜約３５個のアミノ酸残基を有する。最も好ましく
は、連結ペプチドはヒト・プロインスリンの「天然」連
結ペプチドである。ヒト・プロインスリンの「天然」連
結ペプチドのアミノ酸配列を図１に示す（残基３１〜６
５）。連結ペプチドは上記のような天然の連結配列が好
ましいが、広い範囲の一層短い任意のペプチド配列であ
ることができる。連結ペプチドとして有用な代表的なジ
ペプチドは−Ａｒｇ−Ａｒｇ−である。また連結ペプチ
ドは前記のジペプチド伸長鎖、即ち、式−Ａｒｇ−Ｘ'
−Ａｒｇ−（式中、Ｘ'は少なくとも１個のアミノ酸残
基を表わす）を有する配列であり得る。極めて好ましい
連結ペプチドは、−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ
−、および−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘ2−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−
（式中、Ｘ2は少なくとも１個のアミノ酸残基であり、
好ましくは少なくとも２個のアミノ酸残基である）の構
造を有する一層長鎖のペプチドである。これらの連結ペ
プチドには天然の連結ペプチドを含む。本発明の実施に
よってインスリン前駆物質から選択的に除去することが
できるＮ−末端伸長鎖は極めて多い。本発明の目的のた
め、Ｎ−末端伸長鎖はＢ鎖の１つの残基に先行する任意
のアミノ酸配列である。即ち、ヒト・プロインスリンの
構造（図１）に関していえば、Ｐｈｅ−１に先行する任
意の残基（複数もあり）はＮ−末端伸長鎖を構成する。
本発明の主な目的は、遺伝子工学的に操作した原核生物
起原のインスリン前駆物質から、Ｎ−末端メチオニン残
基を除去できる手段を提供することにある。
【０００８】本発明のもう１つの目的は、原核生物によ
って生産された以外のインスリン前駆物質の望ましくな
いＮ−末端アミノ酸を除去できる手段を提供することに
ある。分子生物学の技術の進歩によって、当業者は、組
換え体ＤＮＡ発現ベクターを組み立てて、目的とする多
数のポリペプチド生産物の発現を原核生物以外の宿主細
胞で達成することができる。本発明は、その生産に用い
た手段に関係なく、インスリン前駆物質のＮ−末端伸長
鎖の除去に適用することができる。しかも本発明は、組
換え技術によって発現させた好適な立体特性でＮ−末端
を有する任意のタンパク質またはペプチドに適用するこ
とができる。折り畳まれたインスリン前駆物質からのＮ
−末端ジペプチド除去の選択性は、恐らくインスリン前
駆物質分子のＢ鎖のアミノ末端がＤＡＰ−１へ接近し得
る近接能を制約する立体障害に起因するのであろう。し
たがって所望のＢ鎖またはその類似体の実質的な分解を
伴なうことなく、折り畳まれたインスリン前駆物質から
選択的に除去できるＮ−末端伸長鎖は、ＤＡＰ−１に対
する自然停止を含むアミノ酸配列を避けなければならな
いことを除けば、任意の個々のアミノ酸配列によって制
約されない。２〜約８個のアミノ酸からなるＮ−末端伸
長鎖が本発明の方法によって都合よく除去される。偶数
個のアミノ酸を好ましく含んでいるＮ−末端伸長鎖は、
それによってＮ−末端伸長鎖から完全に取り除かれ、所
望のインスリン前駆物質またはその類似体を生成するこ
とができる。特に好ましいＮ−末端伸長鎖は、Ｍｅｔ−
Ｔｙｒ、Ｍｅｔ−Ａｒｇ、およびＭｅｔ−Ｐｈｅであ
る。
って生産された以外のインスリン前駆物質の望ましくな
いＮ−末端アミノ酸を除去できる手段を提供することに
ある。分子生物学の技術の進歩によって、当業者は、組
換え体ＤＮＡ発現ベクターを組み立てて、目的とする多
数のポリペプチド生産物の発現を原核生物以外の宿主細
胞で達成することができる。本発明は、その生産に用い
た手段に関係なく、インスリン前駆物質のＮ−末端伸長
鎖の除去に適用することができる。しかも本発明は、組
換え技術によって発現させた好適な立体特性でＮ−末端
を有する任意のタンパク質またはペプチドに適用するこ
とができる。折り畳まれたインスリン前駆物質からのＮ
−末端ジペプチド除去の選択性は、恐らくインスリン前
駆物質分子のＢ鎖のアミノ末端がＤＡＰ−１へ接近し得
る近接能を制約する立体障害に起因するのであろう。し
たがって所望のＢ鎖またはその類似体の実質的な分解を
伴なうことなく、折り畳まれたインスリン前駆物質から
選択的に除去できるＮ−末端伸長鎖は、ＤＡＰ−１に対
する自然停止を含むアミノ酸配列を避けなければならな
いことを除けば、任意の個々のアミノ酸配列によって制
約されない。２〜約８個のアミノ酸からなるＮ−末端伸
長鎖が本発明の方法によって都合よく除去される。偶数
個のアミノ酸を好ましく含んでいるＮ−末端伸長鎖は、
それによってＮ−末端伸長鎖から完全に取り除かれ、所
望のインスリン前駆物質またはその類似体を生成するこ
とができる。特に好ましいＮ−末端伸長鎖は、Ｍｅｔ−
Ｔｙｒ、Ｍｅｔ−Ａｒｇ、およびＭｅｔ−Ｐｈｅであ
る。
【０００９】本発明を実施するのに最良な実施態様から
なる個々の段階を実施例に示す。本発明を用いてＮ−末
端を伸長したヒト前駆物質を生成する好ましい手段は、
エシェリキア・コリ（E. coli）のような原核生物の遺
伝子工学である。当業者であれば、その他の多数の原核
生物株が同様に宿主細胞として機能し得ることを理解し
得よう。分子生物学／遺伝子工学に関する科学的文献お
よび特許文献には、インスリン前駆物質発現ベクターを
組立てるための多くの別法が当業者に提供されている。
本発明の方法は、そのような折り畳まれた任意のＮ−末
端伸長インスリン前駆物質への応用が可能である。ジペ
プチジル−アミノペプチダーゼ−Ｉ（ＤＡＰ−１）は、
シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Company）、セン
トルイス（St. Louis）、ミズーリ（Miss-ouri）、６３
１７８−９９１６から商業的に入手できる。ＤＡＰ−１
は塩素イオン（Ｃｌ-）の存在によって活性化される。
したがって本発明の化合物を変換するには、Ｃｌ-を培
地へ添加する。塩素イオンの量は微量でよい。実際に
は、そのタンパク質のそれ以前の処理の結果として存在
する残留量、例えば塩化ナトリウムの存在で、まったく
十分である。即ち、少なくとも痕跡量の塩素イオンの存
在で十分である。同様に本発明の化合物を変換する方法
は酵素的であるから、ＤＡＰ−１は、インスリン前駆物
質の出発原料に対して比較的微量を使用する。一般にタ
ンパク質基質に対するモル換算で、ＤＡＰ−１は約１：
１００００〜約１：２０００００の割合で存在させる。
一般に反応は、約３.０〜約８.５のｐＨが得られ、これ
を維持し得るように好適に緩衝化した水性培地中で実施
する。好ましくは培地のｐＨは僅かに酸性〜中性で、約
６〜約７.５の範囲である。本発明の化合物の変換は、
スルフヒドリル部分を生成する試薬の存在によって促進
される。そのような試薬の代表的なものは、β−メルカ
プトエタノール、ジチオトレイトール、ジチオエリトリ
トール、β−メルカプトエチルアミン、システイン、シ
ステアミン等である。使用に好ましいスルフヒドリル試
薬は、β−メルカプトエタノール、システアミン、およ
びシステインであって、最も好ましくはシステインであ
る。一般にスルフヒドリル試薬は、約０.０１mM〜約２
００mM、好ましくは約０.１mM〜約２０mMのモル濃度で
最終反応培地に添加する。一般に反応は、約１０℃〜約
４５℃の温度で約１時間〜約２４時間実施する。
なる個々の段階を実施例に示す。本発明を用いてＮ−末
端を伸長したヒト前駆物質を生成する好ましい手段は、
エシェリキア・コリ（E. coli）のような原核生物の遺
伝子工学である。当業者であれば、その他の多数の原核
生物株が同様に宿主細胞として機能し得ることを理解し
得よう。分子生物学／遺伝子工学に関する科学的文献お
よび特許文献には、インスリン前駆物質発現ベクターを
組立てるための多くの別法が当業者に提供されている。
本発明の方法は、そのような折り畳まれた任意のＮ−末
端伸長インスリン前駆物質への応用が可能である。ジペ
プチジル−アミノペプチダーゼ−Ｉ（ＤＡＰ−１）は、
シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Company）、セン
トルイス（St. Louis）、ミズーリ（Miss-ouri）、６３
１７８−９９１６から商業的に入手できる。ＤＡＰ−１
は塩素イオン（Ｃｌ-）の存在によって活性化される。
したがって本発明の化合物を変換するには、Ｃｌ-を培
地へ添加する。塩素イオンの量は微量でよい。実際に
は、そのタンパク質のそれ以前の処理の結果として存在
する残留量、例えば塩化ナトリウムの存在で、まったく
十分である。即ち、少なくとも痕跡量の塩素イオンの存
在で十分である。同様に本発明の化合物を変換する方法
は酵素的であるから、ＤＡＰ−１は、インスリン前駆物
質の出発原料に対して比較的微量を使用する。一般にタ
ンパク質基質に対するモル換算で、ＤＡＰ−１は約１：
１００００〜約１：２０００００の割合で存在させる。
一般に反応は、約３.０〜約８.５のｐＨが得られ、これ
を維持し得るように好適に緩衝化した水性培地中で実施
する。好ましくは培地のｐＨは僅かに酸性〜中性で、約
６〜約７.５の範囲である。本発明の化合物の変換は、
スルフヒドリル部分を生成する試薬の存在によって促進
される。そのような試薬の代表的なものは、β−メルカ
プトエタノール、ジチオトレイトール、ジチオエリトリ
トール、β−メルカプトエチルアミン、システイン、シ
ステアミン等である。使用に好ましいスルフヒドリル試
薬は、β−メルカプトエタノール、システアミン、およ
びシステインであって、最も好ましくはシステインであ
る。一般にスルフヒドリル試薬は、約０.０１mM〜約２
００mM、好ましくは約０.１mM〜約２０mMのモル濃度で
最終反応培地に添加する。一般に反応は、約１０℃〜約
４５℃の温度で約１時間〜約２４時間実施する。
【００１０】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明する。実施例は発明を説明するためのものであっ
て、発明の範囲を制限するものではない。実施例１ ：折り畳まれたＭｅｔ−Ｔｙｒ−プロインスリ
ンからＤＡＰ−１によるＭｅｔ−Ｔｙｒジペプチドの除
去 Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−ヒト・プロインスリン（Ｍｅｔ−Ｔｙ
ｒ Ｎ−末端伸長鎖を有するヒト・プロインスリン）を
エシェリキア・コリで不溶性の顆粒または封入体として
発現した。Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−プロインスリン顆粒を尿素
７モル中で可溶化し、イオン交換クロマトグラフィーに
よって精製した。亜硫酸分解し、溶媒を交換したのち、
天然ジスルフィド結合対および天然３次構造を生成する
ため、Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−プロインスリンを折り畳んだ。
プロインスリン様分子の折り畳みは米国特許第４４３０
２６６号に報告されている。参考文献として米国特許第
４４３０２６６号の教示を本明細書に引用する。折り畳
まれたＭｅｔ−Ｔｙｒ−プロインスリンを、ついで逆相
クロマトグラフィーによって精製した。Ｍｅｔ−Ｔｙｒ
−プロインスリン画分をプールし、有機溶媒を蒸発によ
って除去した。ＤＡＰ−１添加の前に、精製したＭｅｔ
−Ｔｙｒ−プロインスリン（蒸発したカラム溶出物）の
ｐＨをＮａＯＨでｐＨ６.８へ調節した。ＤＡＰ−１の
濃度がＭｅｔ−Ｔｙｒ−プロインスリン１グラム当たり
１単位となるように、ＤＡＰ−１を添加した。ＤＡＰ−
１による切断反応は３７℃で６〜２０時間行なった。Ｈ
Ｃｌで反応をｐＨ２.５の酸性とすることにより、Ｍｅ
ｔ−Ｔｙｒ−プロインスリンからのＭｅｔ−Ｔｙｒ−ジ
ペプチドのＤＡＰ−１による除去を停止した。切断反応
物のＨＰＬＣ分析によって、Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−プロイン
スリンの８０〜１００％が所望の生産物、プロインスリ
ンへ変換したことを確かめた。変換率の範囲は、それぞ
れ６時間消化（８０％）および２０時間消化（１００
％）に対応した。
説明する。実施例は発明を説明するためのものであっ
て、発明の範囲を制限するものではない。実施例１ ：折り畳まれたＭｅｔ−Ｔｙｒ−プロインスリ
ンからＤＡＰ−１によるＭｅｔ−Ｔｙｒジペプチドの除
去 Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−ヒト・プロインスリン（Ｍｅｔ−Ｔｙ
ｒ Ｎ−末端伸長鎖を有するヒト・プロインスリン）を
エシェリキア・コリで不溶性の顆粒または封入体として
発現した。Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−プロインスリン顆粒を尿素
７モル中で可溶化し、イオン交換クロマトグラフィーに
よって精製した。亜硫酸分解し、溶媒を交換したのち、
天然ジスルフィド結合対および天然３次構造を生成する
ため、Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−プロインスリンを折り畳んだ。
プロインスリン様分子の折り畳みは米国特許第４４３０
２６６号に報告されている。参考文献として米国特許第
４４３０２６６号の教示を本明細書に引用する。折り畳
まれたＭｅｔ−Ｔｙｒ−プロインスリンを、ついで逆相
クロマトグラフィーによって精製した。Ｍｅｔ−Ｔｙｒ
−プロインスリン画分をプールし、有機溶媒を蒸発によ
って除去した。ＤＡＰ−１添加の前に、精製したＭｅｔ
−Ｔｙｒ−プロインスリン（蒸発したカラム溶出物）の
ｐＨをＮａＯＨでｐＨ６.８へ調節した。ＤＡＰ−１の
濃度がＭｅｔ−Ｔｙｒ−プロインスリン１グラム当たり
１単位となるように、ＤＡＰ−１を添加した。ＤＡＰ−
１による切断反応は３７℃で６〜２０時間行なった。Ｈ
Ｃｌで反応をｐＨ２.５の酸性とすることにより、Ｍｅ
ｔ−Ｔｙｒ−プロインスリンからのＭｅｔ−Ｔｙｒ−ジ
ペプチドのＤＡＰ−１による除去を停止した。切断反応
物のＨＰＬＣ分析によって、Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−プロイン
スリンの８０〜１００％が所望の生産物、プロインスリ
ンへ変換したことを確かめた。変換率の範囲は、それぞ
れ６時間消化（８０％）および２０時間消化（１００
％）に対応した。
【００１１】実施例２：折り畳まれたＭｅｔ−Ａｒｇ−
プロインスリンからＤＡＰ−１によるＭｅｔ−Ａｒｇジ
ペプチドの除去 Ｍｅｔ−Ａｒｇ−ヒト・プロインスリン（Ｍｅｔ−Ａｒ
ｇ Ｎ−末端伸長鎖を有するヒト・プロインスリン）を
エシェリキア・コリで不溶性の顆粒または封入体として
発現した。Ｍｅｔ−Ａｒｇ−プロインスリン顆粒を尿素
７モル中で可溶化し、イオン交換クロマトグラフィーに
よって精製した。亜硫酸分解し、溶媒を交換したのち、
天然ジスルフィド結合対および天然３次構造を生成する
ため、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−プロインスリンを折り畳んだ。
ＤＡＰ−１の添加の前に、精製したＭｅｔ−Ａｒｇ−プ
ロインスリンのｐＨをＨＣｌでｐＨ７.０へ調節した。
ＤＡＰ−１の濃度がＭｅｔ−Ａｒｇ−プロインスリン１
グラム当たり３単位となるように、ＤＡＰ−１を添加し
た。ＤＡＰ−１による切断反応は１５℃で１２時間行な
った。ＨＣｌで反応をｐＨ３.５の酸性とすることによ
り、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−プロインスリンからのＭｅｔ−Ａ
ｒｇ−ジペプチドのＤＡＰ−１による除去を停止した。
切断反応物のＨＰＬＣ分析によって、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−
プロインスリンの９５％が除去され、所望の生産物、プ
ロインスリンが生成したことを確かめた。
プロインスリンからＤＡＰ−１によるＭｅｔ−Ａｒｇジ
ペプチドの除去 Ｍｅｔ−Ａｒｇ−ヒト・プロインスリン（Ｍｅｔ−Ａｒ
ｇ Ｎ−末端伸長鎖を有するヒト・プロインスリン）を
エシェリキア・コリで不溶性の顆粒または封入体として
発現した。Ｍｅｔ−Ａｒｇ−プロインスリン顆粒を尿素
７モル中で可溶化し、イオン交換クロマトグラフィーに
よって精製した。亜硫酸分解し、溶媒を交換したのち、
天然ジスルフィド結合対および天然３次構造を生成する
ため、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−プロインスリンを折り畳んだ。
ＤＡＰ−１の添加の前に、精製したＭｅｔ−Ａｒｇ−プ
ロインスリンのｐＨをＨＣｌでｐＨ７.０へ調節した。
ＤＡＰ−１の濃度がＭｅｔ−Ａｒｇ−プロインスリン１
グラム当たり３単位となるように、ＤＡＰ−１を添加し
た。ＤＡＰ−１による切断反応は１５℃で１２時間行な
った。ＨＣｌで反応をｐＨ３.５の酸性とすることによ
り、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−プロインスリンからのＭｅｔ−Ａ
ｒｇ−ジペプチドのＤＡＰ−１による除去を停止した。
切断反応物のＨＰＬＣ分析によって、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−
プロインスリンの９５％が除去され、所望の生産物、プ
ロインスリンが生成したことを確かめた。
【００１２】実施例３：折り畳まれたＭｅｔ−Ａｒｇ
（Ｌｙｓ−Ｂ−２８、Ｐｒｏ−Ｂ−２９）プロインスリ
ンからＤＡＰ−１によるＭｅｔ−Ａｒｇ−ジペプチドの
除去 実質的に実施例１および２の方法にしたがって、Ｍｅｔ
−Ａｒｇ（Ｌｙｓ−Ｂ−２８、Ｐｒｏ−Ｂ−２９）ヒト
・プロインスリンのＭｅｔ−Ａｒｇ−ジペプチドを選択
的に除去した。ＤＡＰ−１消化の成績は、Ｎ−末端Ｍｅ
ｔ−Ａｒｇ−ジペプチドだけの選択的な除去の点で、実
施例１および２で達成された成績に匹敵した。
（Ｌｙｓ−Ｂ−２８、Ｐｒｏ−Ｂ−２９）プロインスリ
ンからＤＡＰ−１によるＭｅｔ−Ａｒｇ−ジペプチドの
除去 実質的に実施例１および２の方法にしたがって、Ｍｅｔ
−Ａｒｇ（Ｌｙｓ−Ｂ−２８、Ｐｒｏ−Ｂ−２９）ヒト
・プロインスリンのＭｅｔ−Ａｒｇ−ジペプチドを選択
的に除去した。ＤＡＰ−１消化の成績は、Ｎ−末端Ｍｅ
ｔ−Ａｒｇ−ジペプチドだけの選択的な除去の点で、実
施例１および２で達成された成績に匹敵した。
【００１３】実施例４：折り畳まれたＭｅｔ−Ｔｙｒ
（Ｌｙｓ−Ｂ−２８、Ｐｒｏ−Ｂ−２９）プロインスリ
ンからＤＡＰ−１によるＭｅｔ−Ｔｙｒ−ジペプチドの
除去 実質的に実施例１および２の方法にしたがって、Ｍｅｔ
−Ｔｙｒ（Ｌｙｓ−Ｂ−２８、Ｐｒｏ−Ｂ−２９）ヒト
・プロインスリンのＭｅｔ−Ｔｙｒ−ジペプチドを選択
的に除去した。ＤＡＰ−１消化の成績は、Ｎ−末端Ｍｅ
ｔ−Ｔｙｒ−ジペプチドだけの選択的な除去の点で、実
施例１および２で達成された成績に匹敵した。
（Ｌｙｓ−Ｂ−２８、Ｐｒｏ−Ｂ−２９）プロインスリ
ンからＤＡＰ−１によるＭｅｔ−Ｔｙｒ−ジペプチドの
除去 実質的に実施例１および２の方法にしたがって、Ｍｅｔ
−Ｔｙｒ（Ｌｙｓ−Ｂ−２８、Ｐｒｏ−Ｂ−２９）ヒト
・プロインスリンのＭｅｔ−Ｔｙｒ−ジペプチドを選択
的に除去した。ＤＡＰ−１消化の成績は、Ｎ−末端Ｍｅ
ｔ−Ｔｙｒ−ジペプチドだけの選択的な除去の点で、実
施例１および２で達成された成績に匹敵した。
【００１４】
【図１】ヒト・プロインスリン（残基１〜８６）のアミ
ノ酸配列、ジスルフィド結合様式、Ｎ−末端ジペプチド
伸長鎖（残基−１〜０）を示した模式図である。
ノ酸配列、ジスルフィド結合様式、Ｎ−末端ジペプチド
伸長鎖（残基−１〜０）を示した模式図である。
フロントページの続き (72)発明者 トーマス・チャールズ・ファーマン アメリカ合衆国46254インディアナ州イン ディアナポリス、シャイアトン・コート 4731番 (72)発明者 ジェイムズ・パトリック・マクドノウ アメリカ合衆国46033インディアナ州カー メル、シルバー・メイプル・コート3020番
Claims (10)
- 【請求項１】 折り畳まれたインスリン前駆物質をジペ
プチジル−アミノペプチダーゼ−１の有効量で処理する
ことからなる折り畳まれたインスリン前駆物質からＮ−
末端伸長鎖を除去する方法。 - 【請求項２】 Ｎ−末端伸長鎖がＮ−末端メチオニンを
含んでいる請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 Ｎ−末端メチオニンとプロインスリン様
分子の間に奇数個のアミノ残基が位置している請求項２
に記載の方法。 - 【請求項４】 Ｎ−末端メチオニンとプロインスリン様
分子の間に位置する奇数個のアミノ酸残基数が１〜７で
ある請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 Ｎ−末端メチオニンとプロインスリン様
分子の間に１個のアミノ酸残基が位置している請求項４
に記載の方法。 - 【請求項６】 Ｎ−末端メチオニンとプロインスリン様
分子の間に位置するアミノ酸残基がＡｒｇである請求項
５に記載の方法。 - 【請求項７】 Ｎ−末端メチオニンとプロインスリン様
分子の間に位置するアミノ酸残基がＴｙｒである請求項
５に記載の方法。 - 【請求項８】 Ｎ−末端メチオニンとプロインスリン様
分子の間に位置するアミノ酸残基がＰｈｅである請求項
５に記載の方法。 - 【請求項９】 プロインスリン様分子がヒト・プロイン
スリンである請求項６、７、または８に記載の方法。 - 【請求項１０】 プロインスリン様分子がＬｙｓＢ28Ｐ
ｒｏＢ29プロインスリンである請求項６、７、または８
に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US83701392A | 1992-02-18 | 1992-02-18 | |
| US837013 | 1992-02-18 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05308991A true JPH05308991A (ja) | 1993-11-22 |
Family
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP5027874A Withdrawn JPH05308991A (ja) | 1992-02-18 | 1993-02-17 | ジペプチジル−アミノペプチダーゼ−１を使用する折り畳まれたインスリン前駆物質からｎ−末端伸長鎖の選択的な除去方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0557076A1 (ja) |
| JP (1) | JPH05308991A (ja) |
| AU (1) | AU670562B2 (ja) |
| CA (1) | CA2089541A1 (ja) |
| HU (1) | HU216099B (ja) |
| IL (1) | IL104727A (ja) |
| MX (1) | MX9300816A (ja) |
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| DK0871474T4 (da) * | 1994-12-29 | 2012-01-09 | Ferring Int Ct Sa | Fremstilling af human insulin |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS582660U (ja) * | 1981-06-30 | 1983-01-08 | 三菱重工業株式会社 | 分析装置用加熱炉 |
| JPH0461051U (ja) * | 1990-09-29 | 1992-05-26 |
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| DK58285D0 (da) | 1984-05-30 | 1985-02-08 | Novo Industri As | Peptider samt fremstilling og anvendelse deraf |
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1993
- 1993-02-15 CA CA002089541A patent/CA2089541A1/en not_active Abandoned
- 1993-02-15 IL IL10472793A patent/IL104727A/xx not_active IP Right Cessation
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- 1993-02-16 MX MX9300816A patent/MX9300816A/es unknown
- 1993-02-17 EP EP93301157A patent/EP0557076A1/en not_active Ceased
- 1993-02-17 HU HUP9300435A patent/HU216099B/hu not_active IP Right Cessation
- 1993-02-17 JP JP5027874A patent/JPH05308991A/ja not_active Withdrawn
Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| JPS582660U (ja) * | 1981-06-30 | 1983-01-08 | 三菱重工業株式会社 | 分析装置用加熱炉 |
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| HU216099B (hu) | 1999-04-28 |
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