KR100547922B1 - 아연결합이증가된인슐린유도체및이를함유하는약제학적제제 - Google Patents

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Abstract

아연 결합을 증가시킨 인슐린 유도체는 당뇨병을 치료하기 위한 약제학적 제제의 제조에 적합하다. 인슐린 6량체 및 6량체당 아연 약 5 내지 9몰을 함유하여 화학식 1의 인슐린은 아연과 복합체를 형성한다.
화학식 1
Figure pat00001
위의 화학식 1에서,
Z는 히스티딘 잔기이거나, 히스티딘 잔기 1개 내지 5개를 함유하는 유전적으로 암호화할 수 있는 아미노산 잔기 2개 내지 35개를 갖는 펩타이드 잔기이다.

Description

아연 결합이 증가된 인슐린 유도체
피하 투여된 인슐린의 약물동력학은 인슐린의 연합 거동(association behavior)에 좌우된다. 인슐린은 중성 수용액 속에서 6량체를 형성한다. 인슐린이 조직에서 혈류로 들어가 작용 부위에 도달하는 경우, 먼저 모세관벽을 통과해야 한다. 이는 인슐린이 단량체 또는 이량체인 경우에만 가능하고, 인슐린이 6량체이거나 비교적 고분자량의 연합체인 경우에는 불가능하거나 겨우 소량만 통과할 수 있다[문헌 참조: Brange et al., Diabetes Care: 13(1990), pages 923-954; Kang et al., Diabetes Care: 14(1991), pages 942-948)]. 따라서, 피하 조직에서 신속하게 혈류로 통과되기 위해서는 먼저 6량체가 해리되는 것이 요구된다.
인슐린의 연합 거동과 집합 거동은 Zn++에 영향을 받으며, Zn++은 6량체를 안정화시키고 중성 주위의 pH에서 침전될 때까지 비교적 고분자량의 집합체를 형성시킨다. 그러나, 완충시키지 않은 사람 인슐린 용액(pH 4)에 대한 첨가제로서 Zn++은 작용 프로필에 단지 약간의 영향을 미칠 뿐이다. 이러한 용액이 주사시 피하 조직에서 신속하게 중성화되고 인슐린-아연 복합체가 형성되더라도, 사람 인슐린과의 자연스러운 아연 결합이 6량체와 더 높은 집합체를 안정화시킬 만큼 충분하지 못하다. 따라서, Zn++을 첨가함으로써 사람 인슐린의 유리가 현저하게 지연되지 않으며, 강한 데포우(depot) 효과가 생기지 않는다. 인슐린 6량체는 인슐린 6량체 몰당 약 2몰의 Zn++을 함유한다고 공지되어 있다[문헌 참조: Blundell et al., Adv. Protein Chem.: 26(1972), pages 323-328]. 인슐린 6량체당 2개의 Zn++ 이온이 인슐린 6량체에 단단히 결합되어 있기 때문에 일반적인 투석으로 제거할 수 없다. 이른바 4-아연 인슐린 결정이 명백하게 기술되어 있지만, 이 결정은 인슐린 6량체 몰당 Zn++을 평균 3몰 미만으로 함유할 뿐이다[문헌 참조: G.D. Smith et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA: 81, pages 7093-7097].
본 발명의 목적은 아연 결합력을 증가시켜 인슐린 6량체와 Zn++을 함유하는 안정한 복합체를 형성시키며, 사람 인슐린과 비교하여 피하 주사시 지연된 작용 프로필을 나타내는 인슐린 유도체를 발견하는 것이다.
본 발명에 이르러, 상기 기준을 충족시키는 화학식 1의 인슐린 및/또는 생리학적으로 허용되는 이의 염이 발견되었다.
Figure pat00002
위의 화학식 1에서,
R1은 페닐알라닌 잔기 또는 수소 원자이고,
R3은 유전적으로 암호화할 수 있는 아미노산 잔기이며,
Y는 유전적으로 암호화할 수 있는 아미노산 잔기이고,
Z는 a) 아미노산 잔기 His, 또는 b) 히스티딘 잔기 1개 내지 5개를 함유하는 유전적으로 암호화할 수 있는 아미노산 잔기 2개 내지 35개를 갖는 펩타이드이며,
잔기 A2 내지 A20은 사람 인슐린, 동물 인슐린 또는 인슐린 유도체의 A쇄 아미노산 서열에 상응하고,
잔기 B2 내지 B29는 사람 인슐린, 동물 인슐린 또는 인슐린 유도체의 B쇄 아미노산 서열에 상응한다.
R1이 페닐알라닌 잔기이고, R3이 Asn, Gly, Ser, Thr, Ala, Asp, Glu 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터의 아미노산 잔기이며, Y가 Ala, Thr, Ser 및 His로 이루어진 그룹으로부터의 아미노산 잔기이고, Z가 a) 아미노산 잔기 His, 또는 b) 히스티딘 잔기 1개 또는 2개를 함유하는 아미노산 잔기 4개 내지 7개를 갖는 펩타이드인 화학식 1의 인슐린이 특히 바람직하다.
R1이 페닐알라닌 잔기이고, R3이 Asn, Gly, Ser, Thr, Ala, Asp, Glu 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터의 아미노산 잔기이며, Y가 Ala, Thr, Ser 및 His로 이루어진 그룹으로부터의 아미노산 잔기이고, Z가 a) 아미노산 잔기 His, 또는 b) 히스티딘 잔기 1개 또는 2개를 함유하는 아미노산 잔기 2개 내지 7개를 갖는 펩타이드인 화학식 1의 인슐린이 더욱 바람직하다.
Z가 히스티딘 잔기 1개 또는 2개를 함유하는 아미노산 잔기 1개 내지 5개를 갖는 펩타이드인 화학식 1의 인슐린이 특히 바람직하다.
R1이 페닐알라닌 잔기이고, R3이 Asn과 Gly로 이루어진 그룹으로부터의 아미노산 잔기이며, Y가 Thr과 His로 이루어진 그룹으로부터의 아미노산 잔기이고, Z가 히스티딘 잔기 1개 또는 2개를 함유하는 아미노산 잔기 1개 내지 5개를 갖는 펩타이드인 화학식 1의 인슐린이 특히 바람직하다.
R1이 페닐알라닌 잔기이고, R3이 글리신 잔기이며, Y가 트레오닌 잔기이고, Z가 히스티딘 잔기 1개 또는 2개를 함유하는 아미노산 잔기 1개 내지 5개를 갖는 펩타이드인 화학식 1이 인슐린이 더욱 더 바람직하다.
Z가 His His, His His Arg, Ala His His, Ala His His Arg, Ala Ala His His Arg 또는 Ala Ala His His 서열을 갖는 펩타이드인 화학식 1의 인슐린이 매우 특히 바람직하다.
펩타이드와 단백질의 아미노산 서열은 아미노산 쇄의 N-말단에서부터 전진하는 서열을 나타낸다. 화학식 1의 괄호 속에 주어진 항목, 예를 들어, A1, A6, A7, A11, A20, B1, B7, B19 또는 B30은 인슐린 A쇄 또는 B쇄의 아미노산 잔기 위치에 상응한다.
"유전적으로 암호화할 수 있는 아미노산 잔기"라는 표현은 아미노산 잔기 Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro 및 셀레노시스테인을 나타낸다. 동물 인슐린의 "잔기 A2 내지 A20"이라는 표현 및 "잔기 B2 내지 B29"라는 표현은 예를 들어, 소, 돼지 또는 닭의 인슐린의 아미노산 서열을 나타내는 것으로 이해하면 된다. 인슐린 유도체의 잔기 A2 내지 A20 및 잔기 B2 내지 B29라는 표현은 유전적으로 암호화할 수 있는 다른 아미노산으로 아미노산을 치환하여 형성된 사람 인슐린의 상응하는 아미노산 서열을 나타낸다.
사람 인슐린의 A쇄는 하기 서열 1을 갖는다:
[서열 1]
Figure pat00003
사람 인슐린의 B쇄는 하기 서열 2를 갖는다:
[서열 2]
Figure pat00004
화학식 1의 인슐린 유도체는 다양한 유전공학 작제물을 사용하여 미생물에서 형성시킬 수 있다[문헌 참조: 유럽 특허 제0 489 780호, 유럽 특허 제0 347 781호, 유럽 특허 제0 368 187호 및 유럽 특허 제0 453 969호]. 유전공학 작제물은 발효동안 대장균(Escherichia coli) 또는 연쇄상구균(Streptomycetes)과 같은 미생물에서 발현시킨다.
형성된 단백질은 미생물 내부에 저장되거나[참조 문헌: 유럽 특허 제0 489 780호] 발효 용액내로 분비된다.
화학식 1의 인슐린의 예는 다음과 같다:
Gly(A21)-사람 인슐린-His(B31)-His(B32)-OH
Gly(A21)-사람 인슐린-His(B31)-His(B32)-Arg(B33)-OH
Gly(A21)-사람 인슐린-Ala(B31)-His(B32)-His(B33)-OH
Gly(A21)-사람 인슐린-Ala(B31)-His(B32)-His(B33)-Arg(B34)-OH
Gly(A21)-사람 인슐린-Ala(B31)-Ala(B32)-His(B33)-His(B34)-OH
Gly(A21)-사람 인슐린-Ala(B31)-Ala(B32)-His(B33)-His(B34)-Arg(B35)-OH
화학식 1의 인슐린 유도체는 표준 방법에 따른 부위 지시된(site-directed) 돌연변이 유발 방법으로 유전공학적으로 주로 제조된다. 이를 위하여, 화학식 1의 목적하는 인슐린 유도체를 암호화하는 유전자 구조는 숙주 세포, 바람직하게는 대장균 또는 효모와 같은 세균, 특히 맥주 효모균(Saccharomyces cerevisiae)에서 작제하여 발현시키며, 유전자 구조가 융합 단백질을 암호화하는 경우, 화학식 1의 인슐린 유도체는 융합 단백질에서 유리된다. 유사한 방법이 예를 들어, 문헌[유럽공개특허공보 제0 211 299호, 유럽 공개특허공보 제0 227 938호, 유럽 공개특허공보 제0 229 998호, 유럽 공개특허공보 제 0 286 956호 및 독일 특허원 제P 38 21 159호]에 기술되어 있다.
세포 파괴 후, 융합 단백질 부분은 시아노겐 할라이드로 화학적으로 절단시키거나[문헌 참조: 유럽 공개특허공보 제0 180 920호], 리소스타핀 또는 트립신에 의해 효소적으로 절단시킬 수 있다[문헌 참조: 독일 공개특허공보 제37 39 347호].
이어서 인슐린 전구체를 문헌[참조: R.C. Marshall and A.S, Inglis in "Practical Protein Chemistry-A Handbook"(Editor A. Darbre) 1986, pages 49-53]에 기술된 방법에 따라 산화된 설피톨라이시스(Sulfitolysis)시킨 다음, 티올의 존재하에 정확한 디설파이드 브릿지를 형성시켜 재생시킨다[문헌 참조: G.H. Dixon and A.C. Wardlow in Nature(1960), pages 721-724]. 그러나, 인슐린 전구체를 직접 폴딩시킬 수도 있다[문헌 참조: 유럽 공개특허공보 제0 600 372호 및 유럽 공개 특허공보 제0 668 292호]
C 펩타이드 및, 경우에 따라, 프리서열(presequence)(화학식 2에 따르는 R2)은 트립신 절단으로 제거하고[문헌 참조: Kemmler et al., J.B.C.(1971), pages 6786-6791] 화학식 1의 인슐린 유도체를 크로마토그래피[문헌 참조: 유럽 공개특허 공보 제0 305 760호] 및 결정화와 같은 공지된 기술로 정제한다.
또한, 본 발명은 인슐린 6량체와 인슐린 6량체당 Zn++ 약 5 내지 9몰, 바람직하게는 인슐린 6량체당 Zn++ 5 내지 7몰을 함유하는 복합체에 관한 것이며, 인슐린 6량체는 화학식 1의 인슐린 분자 6개로 이루어진다.
인슐린 6량체에 대한 아연 결합은 매우 단단하여 인슐린 6량체당 Zn++ 5 내지 9몰은 일반적인 투석, 예를 들어, 수성 10mM 트리스/HCl 완충액(pH 7.4)으로 40시간 실시하여 제거할 수 없다.
피하 투여 후, 필수적으로 아연-비함유 제제(pH 4) 중 화학식 1의 인슐린은 사람 인슐린과 비교하여 매우 미세한 지연 작용을 나타낸다. 제제 ml 당 약 20㎍ Zn++을 가한 후에는, 피하 주사 후 보다 늦은 작용 개시가 관찰된다. 작용 지연은 40㎍ Zn++/ml에서 바람직하게 관찰된다. 아연 농도가 더 높을수록 이러한 효과는 증강된다.
또한, 본 발명은 화학식 2의 프리프로인슐린(preproinsulin)에 관한 것이다.
Figure pat00005
위의 화학식 2에서,
R3 및 Y는 특허청구범위 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에서 화학식 1에서 정의한 바와 같고,
R1은 페닐알라닌 잔기 또는 공유 결합이며,
R2는 a) 유전적으로 암호화할 수 있는 아미노산 잔기, 또는 b) 유전적으로 암호화할 수 있는 아미노산 잔기로 부터 선택된 2개 내지 45개의 아미노산 잔기로 이루어진 서열을 갖는 펩타이드이고, 잔기 A2 내지 A20과 잔기 B2 내지 B29는 사람 인슐린, 동물 인슐린 또는 인슐린 유도체의 A쇄 및 B쇄의 아미노산 서열에 상응하고,
Z1은 히스티딘 잔기 1개 내지 5개를 갖는 유전적으로 암호화할 수 있는 아미노산 잔기 2개 내지 40개를 갖는 펩타이드이다.
화학식 2의 프로인슐린은 화학식 1의 인슐린 제조에 있어서 중간체로서 유용하다.
R2가 유전적으로 암호화할 수 있는 아미노산 잔기로 부터 선택된 2개 내지 25개의 아미노산 잔기로 이루어진 서열을 갖는 펩타이드인 화학식 2의 프로인슐린이 바람직하다.
R2가 유전적으로 암호화할 수 있는 아미노산 잔기로 부터 선택된 2개 내지 15개의 아미노산 잔기로 이루어진 서열을 갖는 펩타이드(여기서, Met, Lys 및 Arg로 이루어진 그룹 중의 아미노산 잔기는 카복실 말단에 위치한다)인 화학식 2의 프로인슐린이 특히 바람직하다.
화학식 1의 인슐린 유도체 및/또는 인슐린 6량체 및 6량체당 Zn++ 5 내지 9몰을 함유하는 본 발명에 따른 복합체 및/또는 생리학적으로 허용되는 이의 염(예를들어, 알칼리 금속 또는 암모늄 염)은 주로 당뇨병, 특히 진성 당뇨병의 치료에 대한 약제학적 제제용 활성 화합물로서 사용한다.
약제학적 제제는 주사용의 액제 또는 현탁제가 바람직하며, 이는 용해되거나 무정형 및/또는 결정형의, 바람직하게는 용해된 화학식 1의 인슐린 유도체 및/또는 본 발명에 따르는 복합체 하나 이상 및/또는 생리학적으로 허용되는 이의 염 하나 이상을 포함한다.
바람직하게는 제제의 pH는 약 2.5 내지 8.5, 특히 약 4.0 내지 8.5이며, 적합한 등장화제, 적합한 보존제 및, 경우에 따라, 적합한 완충제를 함유하고, 또한 바람직하게는 모두 무균 수용액 중의 특정 아연 이온 농도를 함유한다. 활성 화합물은 별도로 하고 제제 성분 전체는 약물 담체 용액을 형성한다.
화학식 1의 인슐린 용액을 함유하는 제제의 pH는 2.5 내지 4.5, 특히 3.5 내지 4.5, 바람직하게는 4.0이다. 화학식 1의 인슐린 현탁제를 함유하는 제제의 pH는 6.5 내지 8.5, 특히 7.0 내지 8.0, 바람직하게는 7.4이다.
적합한 등장화제는 예를 들어, 글리세롤, 글루코즈, 만니톨, NaCl, CaCl2 또는 MgCl2와 같은 칼슘 화합물 또는 마그네슘 화합물이다.
등장화제 및/또는 보존제를 선택한 결과로, 인슐린 유도체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염의 용해도는 약산성 pH에서 효과적으로 된다.
적합한 보존제는 예를 들어 페놀, m-크레졸, 벤질 알콜 및/또는 p-하이드록시벤조산 에스테르이다.
사용할 수 있는 완충 물질, 특히 pH를 약 4.0 내지 8.5로 적정할 수 있는 완충 물질은 예를 들어, 아세트산나트륨, 시트르산나트륨 또는 인산나트륨이다. 한편, 생리학적으로 허용되는 희석산(통상 HCl) 또는 희석 염기(통상 NaOH)가 또한 pH를 조정하는데 적합하다.
제제가 Zn++ 함량을 갖는 경우, 1㎍ 내지 2mg Zn++/ml, 특히 5㎍ 내지 200㎍ Zn++/ml가 바람직하다.
본 발명에 따르는 제제의 작용 프로필을 다양하게 하기 위해서, 변형시키지 않은 인슐린, 바람직하게는 소, 돼지 또는 사람 인슐린, 특히 사람 인슐린, 또는 변형시킨 인슐린, 예를 들어, 단량체 인슐린, 속효성 인슐린 또는 Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)-사람 인슐린을 또한 혼합할 수 있다.
바람직한 활성 화합물 농도는 약 1 내지 1500 국제단위(I.U.)/ml, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 1000 I.U./ml, 특히 약 40 내지 400 I.U./ml에 상응하는 농도이다.
실시예 1
Gly(A21)-사람 인슐린-His(B31)-His(B32)-OH의 제조
발현 시스템의 제조는 필수적으로 미국 특허 제5,358,857호에 따라 실시한다. 벡터 plNT 90d 및 벡터 plNT 91d(실시예 17 참조), 및 PCR 프라이머 TIR 및 Insu11은 또한 이 문헌에 기술되어 있다. 이러한 4개의 성분은 특히 다음에 기술하는 벡터 작제물에 대한 출발 물질로서 사용한다.
먼저, Gly(A21)에 대한 코돈을 소형 프로인슐린을 암호화하는 서열에 삽입한다. 이렇게 하기 위해서, plNT 91d를 주형으로서 사용하고 PCR 반응을 프라이머 TIR과 Insu31(서열 10)로 실시한다.
[서열 10]
Figure pat00006
PCR 사이클은 다음과 같이 실시한다. 첫 번째 1분 94℃, 두 번째 1분 55℃, 세 번째 1분 72℃. 이 사이클을 25회 반복한 다음 혼합물을 72℃에서 7분 동안 항온처리하고 이어서 4℃에서 밤새 항온처리한다.
생성된 PCR 절편을 정제하기 위해서 에탄올에 침전시키고, 건조시킨 다음 제한 효소 NcO1과 Sal1을 제조원의 설명서에 따라 사용하여 제한 완충액 속에서 절단시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 겔 전기영동으로 분리하고 NcO1-프리-프로인슐린-Sal1 단편을 분리한다. 플라스미드 plNT90d의 DNA를 NcO1과 Sal1을 사용하여 동일하게 절단시키고 원숭이 프로인슐린 단편을 이런 식으로 plNT 잔류 플라스미드로부터 유리시킨다. 단편 둘다 겔 전기영동으로 분리하고 잔류 플라스미드 DNA를 분리한다. 이 DNA를 리가제 반응으로 NcO1-Sal1 PCR 단편과 반응시킨다. 따라서 플라스미드 plNT150d를 수득하며, 이는 대장균으로 형질전환시킨 후에 복제한 다음 재분리한다.
플라스미드 plNT150d의 DNA를 플라스미드 plNT302에 대한 출발 물질로서 사용하며, 목적하는 인슐린 변이체를 제조할 수 있게 한다.
이러한 플라스미드를 작제하기 위해서, 미국 특허 제5,358,857호(실시예 6 참조)에 기술되어 있는 경로를 취한다. 서로 독립적인 2개의 PCR 반응은 이러한 목적으로 실시되고, 이를 위하여 플라스미드 plNT150d의 DNA를 주형으로 사용한다. 한 반응은 프라이머 쌍 TIR과 plNT B5(서열 11)를 사용하여 실시하며,
[서열 11]
Figure pat00007
또 다른 반응은 프라이머 쌍 Insu11 및 plNT B6(서열 12)을 사용하여 실시한다.
[서열 12]
Figure pat00008
생성된 PCR 단편은 부분적으로 상보성이기 때문에, 세 번째 PCR 반응에서 이들은 B31과 B32 위치로 연장시킨 Gly(A21) 소형 프로인슐린을 암호화하는 단편을 생성시킨다. 이 단편을 NcO1과 Sal1을 사용하여 절단시킨 다음 리가제 반응으로 기술되어 있는 plNT90d 잔류 플라스미드의 DNA와 반응시켜 플라스미드 plNT302를 수득한다. 이 플라스미드로 형질전환시킨 대장균 K12 W3110을 발효시키고 미국 특허 제5,227,293호의 실시예 4와 같이 후처리한다. 중간체(트립신 절단 전)로서 수득된 프리프로인슐린 유도체는 다음과 같은 아미노산 서열(서열 3)을 갖는다:
[서열 3]
Figure pat00009
Figure pat00010
프리프로인슐린 1은 화학식 2의 인슐린에 상응하며, 이 경우에
R2는 유전적으로 암호화할 수 있는 아미노산 잔기로 부터 선택된 11개의 아미노산 잔기로 이루어진 서열을 갖는 펩타이드이고,
R1은 Phe(B1)이며,
Y는 Thr(B30)이고,
Z는 His His Arg(B31 내지 B33)이고,
R3은 Gly(A21)이며,
A2 내지 A20은 사람 인슐린 A쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 20)이고 B2 내지 B29는 사람 인슐린 B쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 29)이다.
프리프로인슐린 1은 실시예 4에 따라 미국 특허 제5,227,293호에서와 같이 트립신으로 절단시킨다. 이어서, 수득된 생성물을 실시예 11에 따라 카복시펩티다제 B와 반응시켜 인슐린 1을 수득한다. 인슐린 1은 화학식 1에 상응하며, 이 경우에
R1은 Phe(B1)이고,
Y는 Thr(B30)이며,
Z는 His His(B31 및 B32)이고,
R3은 Gly(A21)이며,
A2 내지 A20은 사람 인슐린 A쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 20)이고 B2 내지 B29는 사람 인슐린 B쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 29)이다.
인슐린 1은 다음과 같은 아미노산 서열(서열 4)을 갖는다:
[서열 4]
Figure pat00011
디설파이드 가교 결합은 화학식 1에 기술된 것과 같이 형성시킨다.
실시예 2
Gly(A21)-사람 인슐린-Ala(B31)-His(B32)-His(B33)-Ars(B34)-OH의 제조
발현 벡터를 실시예 1에 따라 작제한다. 플라스미드 plNT150d를 프라이머쌍 TIR 및 pINT B7(서열 13) 또는 Insu11 및 plNT B8(서열 14)을 사용하는, 서로 독립적인 2개의 PCR 반응에 대한 주형으로서 사용한다.
[서열 13]
Figure pat00012
[서열 14]
Figure pat00013
두 반응으로 생성되는 PCR 단편은 부분적으로 상보성이고 세 번째 PCR 반응에서 목적하는 인슐린 변이체를 암호화하는 완전한 서열을 수득한다. 반응 단편을 효소 NcO1과 Sal1로 처리한 다음, plNT90d DNA의 NcO1/Sal1-개환된 잔류 플라스미드로 재연결시킨다. 플라스미드 plNT303이 생성되며, 대장균 K12 W3110으로 형질 전환시킨 후 목적하는 소형의 프리-프로인슐린을 발현시키기 위한 기재로 사용한다. 발효와 후처리를 실시예 1에서와 같이 실시하고 카복시펩티다제 B 반응을 실시한다.
수득된 프리프로인슐린 유도체는 다음과 같은 아미노산 서열(서열 5)을 갖는다:
[서열 5]
Figure pat00014
프리프로인슐린 2는 화학식 2의 인슐린에 상응하며, 이 경우에
R1은 Phe(B1)이고,
R2는 유전적으로 암호화할 수 있는 아미노산 잔기로 부터 선택된 11개의 아미노산 잔기로 이루어진 서열을 갖는 펩타이드이며,
Y는 Thr(B30)이고,
Z1는 Ala His His Arg(B31 내지 B34)이며,
R3은 Gly(A21)이고,
A2 내지 A20은 사람 인슐린 A쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 20)이고 B2 내지 B29는 사람 인슐린 B쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 29)이다.
이어서, 프리프로인슐린 2를 트립신과 반응시켜 인슐린 2를 수득한다. 인슐린 2는 화학식 2의 인슐린에 상응하며, 이 경우에
R1은 Phe(B1)이고,
Y는 Thr(B30)이며,
Z1은 Ala His His Arg(B31 내지 B34)이고,
R3은 Gly(A21)이며
A2 내지 A20은 사람 인슐린 A쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 20)이고 B2 내지 B29는 사람 인슐린 B쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 29)이다.
인슐린 2는 다음과 같은 아미노산 서열(서열 6)을 갖는다:
[서열 6]
Figure pat00015
디설파이드 가교 결합은 화학식 1에 기술된 것과 같이 형성시킨다.
실시예 3
Gly(A21)-사람 인슐린-Ala(B31)-Ala(B32)-His(B33)-His(B34)-OH의 제조
발현 벡터를 실시예 1에 따라 작제한다. 플라스미드 plNT150d를 프라이머쌍 TIR 및 plNT316a(서열 15) 또는 Insu11 및 plNT316b(서열 16)를 사용하는, 서로 독립적인 2개의 PCR 반응에 대한 주형으로서 사용한다.
[서열 15]
Figure pat00016
[서열 16]
Figure pat00017
두 반응으로 생성되는 PCR 단편은 부분적으로 상보성이고 세 번째 PCR 반응에서 목적하는 인슐린 변이체를 암호화하는 완전한 서열을 수득한다. 반응 단편을 효소 NcO1과 Sal1로 처리한 다음, plNT90d DNA의 NcO1/Sal1-개환된 잔류 플라스미드로 연결시킨다. 플라스미드 plNT316이 생성되며, 대장균 K12 W3110으로 형질전환시킨 후 목적하는 소형의 프리-프로인슐린을 발현시키기 위한 기재로 사용한다. 발효와 후처리를 실시예 1에서와 같이 실시하고 카복시펩티다제 B 반응을 실시한다.
수득된 프리프로인슐린 3은 다음과 같은 아미노산 서열(서열 7)을 갖는다:
[서열 7]
Figure pat00018
프리프로인슐린 3은 화학식 2의 인슐린에 상응하며, 이 경우에
R1은 Phe(B1)이고,
R2는 유전적으로 암호화할 수 있는 아미노산 잔기로 부터 선택된 11개의 아미노산 잔기로 이루어진 서열을 갖는 펩타이드이며,
Y는 Thr(B30)이고,
Z는 Ala Ala His His Arg(B31 내지 B35)이며,
R3은 Gly(A21)이고,
A2 내지 A20은 사람 인슐린 A쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 20)이고 B2 내지 B29는 사람 인슐린 B쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 29)이다.
이어서, 프리프로인슐린 3을 트립신 및 실시예 11에 따라 카복시펩티다제 B와 반응시켜 인슐린 3을 수득한다. 인슐린 3은 화학식 1의 인슐린에 상응하며, 이 경우에
R1은 Phe(B1)이고,
Y는 Thr(B30)이며,
Z는 Ala Ala His His(B31 내지 B34)이고,
R3은 Gly(A21)이며,
A2 내지 A20은 사람 인슐린 A쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 20)이고 B2 내지 B29는 사람 인슐린 B쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 29)이다.
인슐린 3은 다음과 같은 아미노산 서열(서열 8)을 갖는다:
[서열 8]
Figure pat00019
Figure pat00020
디설파이드 가교 결합은 화학식 1에 기술된 것과 같이 형성시킨다.
실시예 4
실시예 2에 따라 제조한 인슐린 2를 실시예 11에 따르는 카복시펩티다제 B와 반응시켜 인슐린 4를 수득한다.
인슐린 4는 화학식 1의 인슐린에 상응하며 이 경우에
R1은 Phe(B1)이고,
Y는 Thr(B30)이며,
Z는 Ala His His(B31 내지 B33)이고,
R3은 Gly(A21)이며,
A2 내지 A20은 사람 인슐린 A쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 20)이고 B2 내지 B29는 사람 인슐린 B쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 29)이다.
인슐린 4는 다음과 같은 아미노산 서열(서열 9)을 갖는다:
[서열 9]
디설파이드 가교 결합은 화학식 1에 기술된 것과 같이 형성시킨다.
실시예 5
인슐린 유도체의 아연 결합
인슐린 제제(0.243mM 사람 인슐린, 0.13M NaCl, 0.1％ 페놀, Zn++ 80㎍/ml(1.22mM), 10mM 트리스/HCl, pH 7.4)를 15℃에서 10mM 트리스/HCl(pH 7.4)에 대해 총 40시간(16시간 후 완충제를 교환하고 24시간) 동안 투석시킨다. 투석액을 산성화하고 인슐린 농도는 HPLC로 결정하고 아연 농도는 원자흡수 분광기로 결정한다. 아연값은 인슐린을 함유하지 않는 대조 뱃치의 아연 함량을 사용하여 보정한다. 표 1에 결과를 나타내었다.
Figure pat00023
본 발명에 따르는 화학식 1의 인슐린:
Figure pat00024
실시예 6
개에서의 사람 인슐린의 작용 프로필의 아연 의존도
투여: 피하
용량: 0.3IU/kg; 제제의 pH 4.0
실험당 사용한 개의 수(n)는 6마리이다.
표 2에 혈중 글루코즈를 출발값에 대한 %로 나타내었다.
실시예 7
개에서의 Gly(A21)Ala(B31)His(B32),His(B33),Arg(B34) 사람 인슐린의 작용 프로필(인슐린 2)
실시예 2에 따라 제조한 인슐린 2를 다음 배합으로 사용한다.
글리세롤 20mg/ml, m-크레졸 2.7mg/ml, 인슐린 2 40IU/ml
IU는 국제단위를 나타내며 인슐린, 예를 들어 사람 인슐린 또는 화학식 1의 인슐린 약 6nmol에 상응한다. pH는 NaOH 또는 HCl을 사용하여 조정한다.
투여: 피하
용량: 0.3IU/kg
시험한 개의 수는 6마리이며 제제의 pH는 4.0이다.
표 3에 혈중 글루코즈를 출발값에 대한 %로 나타내었다.
실시예 8
개에서의 Gly(A21)Ala(B31)His(B32)His(B33) 사람 인슐린의 작용 프로필(인슐린 4)
실시예 4에 따라 제조한 인슐린 4를 실시예 7에서와 같이 배합하여 사용한다.
투여: 피하
용량: 0.3IU/kg
n=6
제제의 pH 4.0
표 4에 혈중 글루코즈를 출발값에 대한 %로 나타내었다.
실시예 9
개에서의 Gly(A21)His(B31)His(B32) 사람 인슐린의 작용 프로필(인슐린 1)
실시예 1에 따라 제조한 인슐린 1을 실시예 7에서와 같이 배합하여 사용한다.
투여: 피하
용량: 0.3IU/kg
n=6
제제의 pH 4.0
표 5에 혈중 글루코즈를 출발값에 대한 %로 나타내었다.
실시예 10
개에서의 Gly(A21)Ala(B31)Ala(B32)His(B33)His(B34) 사람 인슐린의 작용 프로필(인슐린 3)
실시예 1에 따라 제조한 인슐린 3을 실시예 7에서와 같이 배합하여 사용한다.
투여: 피하
용량: 0.3 IU/kg
n=6
제제의 pH 4.0
표 6에 혈중 글루코즈를 출발값에 대한 %로 나타내었다.
Figure pat00029
실시예 11
프리프로인슐린 1로부터의 인슐린 제조
실시예 1에 따라 제조한 B쇄의 카복시 말단에 하나의 Arg가 있는 인슐린 200mg을 10mM HCl 95ml에 용해시킨다. pH가 8인 1M 트리스/HCl(트리스(하이드록시메틸)아미노메탄) 5ml를 가한 후 pH를 HCl 또는 NaOH를 사용하여 8로 조정한다. 카복시펩티다제 B 0.1mg을 가한다. 90분 후, 아르기닌의 절단이 종결된다. 혼합물에 HCl을 가하여 pH를 3.5로 조정하고 역상 칼럼에 펌핑시킨다(PLRP-S RP 300 10 μ, 2.5×30cm, Polymer Laboratories Amherst, MA, USA). 이동상 A는 트리플루오로아세트산 0.1%를 함유하는 물이다. 상 B는 트리플루오로아세트산 0.09%를 함유하는 아세토니트릴로 이루어진다. 칼럼을 5ml/분의 유속으로 작동시킨다. 사용후, 칼럼을 A 150ml로 세척한다. 분획 용출을 400분 동안 40% B에 대해 22.5의 선형 농도 구배를 적용시켜 실시한다. 분획을 분석용 역상 HPLC로 각각 분석하고 충분한 순도의 Des-Arg-인슐린을 함유하는 분획을 합한다. NaOH를 사용하여 pH를 3.5로 조정하고 아세토니트릴을 회전식 증발기로 제거한다. pH를 6.5로 맞추어서 Des-Arg-인슐린을 침전시킨다. 침전물을 원심분리시키고, 물 50ml로 2회 세척하고 최종적으로 동결건조시킨다. 인슐린 1의 수율은 60 내지 80%이다.
본 발명은 아연 결합력을 증가시켜 인슐린 6량체와 Zn++을 함유하는 안정한 복합체를 형성하여, 피하 주사시 사람 인슐린 보다 지연된 작용 프로필을 나타내는 인슐린 유도체를 제공한다.
서열 목록
(1) 일반적 정보:
(ⅰ) 출원인:
(A) 이름: 훽스트 아크티엔게젤샤프트
(B) 거리: -
(C) 시: 프랑크푸르트 암 마인
(D) 주: -
(E) 국가: 독일연방공화국
(F) 우편번호: 65926
(G) 전화: 069-305-6047
(H) 텔레팩스: 069-35-7175
(I) 텔렉스: 041234-700 hod
(ⅱ) 발명의 명칭: 아연 결합이 증가된 아연 유도체
(ⅲ) 서열수: 16
(ⅳ) 컴퓨터 판독형:
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 양립식
(C) 운영 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: 페이턴트인 릴리즈(Patent In Release) #1.0, 버전 #1.25(EPO)
(2) 서열 1에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 21개의 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅵ) 기원:
(A) 미생물: 에스케리키아 콜라이
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/키: 단백질
(B) 위치: 1..21
[서열 1]
Figure pat00030
(2) 서열 2에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 30개의 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅵ) 기원:
(A) 미생물: 에스케리키아 콜라이
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/키: 단백질
(B) 위치: 1..30
[서열 2]
Figure pat00031
(2) 서열 3에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 65개의 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅵ) 기원:
(A) 미생물: 에스케리키아 콜라이
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/키: 단백질
(B) 위치: 1..65
[서열 3]
Figure pat00032
(2) 서열 4에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 53개의 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅵ) 기원:
(A) 미생물: 에스케리키아 콜라이
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/키: 단백질
(B) 위치: 1..53
[서열 4]
Figure pat00033
(2) 서열 5에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 66개의 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅵ) 기원:
(A) 미생물: 에스케리키아 콜라이
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/키: 단백질
(B) 위치: 1..66
[서열 5]
Figure pat00034
(2) 서열 6에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 55개의 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅵ) 기원:
(A) 미생물: 에스케리키아 콜라이
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/키: 단백질
(B) 위치: 1..55
[서열 6]
Figure pat00035
(2) 서열 7에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 67개의 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅵ) 기원:
(A) 미생물: 에스케리키아 콜라이
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/키: 단백질
(B)위치: 1..67
[서열 7]
Figure pat00036
(2) 서열 8에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 55개의 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅵ) 기원:
(A) 미생물: 에스케리키아 콜라이
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/키: 단백질
(B) 위치: 1..55
[서열 8]
Figure pat00037
(2) 서열 9에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 54개의 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅵ) 기원:
(A) 미생물: 에스케리키아 콜라이
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/키: 단백질
(B) 위치: 1..54
[서열 9]
Figure pat00038
(2) 서열 10에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 39개의 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/키: 엑손
(B) 위치: 1..39
[서열 10]
Figure pat00039
(2) 서열 11에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 31개의 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/키: 엑손
(B) 위치: 1..31
[서열 11]
Figure pat00040
(2) 서열 12에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 31개의 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/키: 엑손
(B) 위치: 1..31
[서열 12]
Figure pat00041
(2) 서열 13에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 34개의 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/키: 엑손
(B) 위치: 1..34
[서열 13]
Figure pat00042
(2) 서열 14에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 34개의 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/키: 엑손
(B) 위치: 1..34
[서열 14]
Figure pat00043
(2) 서열 15에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 37개의 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/키: 엑손
(B) 위치: 1..37
[서열 15]
Figure pat00044
(2) 서열 16에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 37개의 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈)
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/키: 엑손
(B) 위치: 1..37
[서열 16]
Figure pat00045

Claims (13)

  1. 화학식 1의 인슐린 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염.
    화학식 1
    Figure pat00046
    위의 화학식 1에서,
    R1은 페닐알라닌 잔기 또는 수소 원자이고,
    R3는 아미노산 잔기 Gly 이며, Y는 아미노산 잔기 Thr 이고,
    Z는 a) 아미노산 잔기 His, 또는 b) His His, His His Arg, Ala His His, Ala His His Arg, Ala Ala His His Arg 또는 Ala Ala His His 중에서 선택된 서열을 갖는 펩타이드이고,
    잔기 A2 내지 A20은 사람 인슐린, 소 인슐린, 돼지 인슐린 또는 닭 인슐린 중에서 선택된 인슐린의 A쇄 아미노산 서열에 상응하고,
    잔기 B2 내지 B29는 사람 인슐린, 소 인슐린, 돼지 인슐린 또는 닭 인슐린 중에서 선택된 인슐린의 B쇄 아미노산 서열에 상응한다.
  2. 제1항에 있어서, R1이 페닐알라닌 잔기이고, R3이 아미노산 잔기 Gly 이며, Y가 아미노산 잔기 Thr 이고, Z가 a) 아미노산 잔기 His, 또는 b) Ala His His Arg, Ala Ala His His Arg 또는 Ala Ala His His 중에서 선택된 서열을 갖는 펩타이드인 화학식 1의 인슐린.
  3. 제1항에 있어서, R1이 페닐알라닌 잔기이고, R3이 아미노산 잔기 Gly 이며, Y가 아미노산 잔기 Thr 이고, Z가 a) 아미노산 잔기 His, 또는 b) His His, His His Arg, Ala His His, Ala His His Arg, Ala Ala His His Arg 또는 Ala Ala His His 중에서 선택된 서열을 갖는 펩타이드인 화학식 1의 인슐린.
  4. 제3항에 있어서, Z가 a) 아미노산 잔기 His 또는 b) His His, His His Arg, 또는 Ala His His 중에서 선택된 서열을 갖는 펩타이드인 화학식 1의 인슐린.
  5. 제1항에 따르는 화학식 1의 인슐린 여섯 분자로 이루어진 인슐린 6량체와 인슐린 6량체당 Zn++ 5 내지 9몰을 함유하는 복합체.
  6. 제1항에 따르는 유효량의 화학식 1의 인슐린 하나 이상 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염 하나 이상을 용해된 형태, 무정형 또는 결정형으로서 함유하는, 당뇨병 치료용 약제학적 제제.
  7. 제6항에 있어서, 아연 1㎍ 내지 2mg/ml을 추가로 함유하는 약제학적 제제.
  8. 제9항 또는 제10항에 있어서, pH가 2.5 내지 8.5인 약제학적 제제.
  9. 제9항 또는 제10항에 있어서, pH가 2.5 내지 4.5인 약제학적 제제.
  10. 제9항 또는 제10항에 있어서, 서열 1의 A쇄 및 서열 2의 B쇄를 가진 사람 인슐린 또는 Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)-사람 인슐린을 추가로 함유하는 약제학적 제제.
  11. 화학식 2의 프로인슐린.
    화학식 2
    Figure pat00047
    위의 화학식 2에서,
    R3 및 Y는 제1항에서 화학식 1에서 정의한 바와 같고,
    R1은 페닐알라닌 잔기 또는 공유 결합이며,
    R2는 Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg 서열을 갖는 펩타이드이고,
    잔기 A2 내지 A20과 잔기 B2 내지 B29는 각각 사람 인슐린, 소 인슐린, 돼지 인슐린 또는 닭 인슐린의 A쇄 및 B쇄의 아미노산 서열에 상응하고,
    Z1은 His His, His His Arg, Ala His His, Ala His His Arg, Ala Ala His His Arg 또는 Ala Ala His His 중에서 선택된 서열을 갖는 펩타이드이다.
  12. 제5항에 있어서, 인슐린 6량체당 Zn++가 5 내지 7몰인 복합체.
  13. 제7항에 있어서, 아연이 5㎍ 내지 200㎍/ml인 약제학적 제제.
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