TW474944B

TW474944B - Insulin derivatives with increased zinc binding

Info

Publication number: TW474944B
Application number: TW086110516A
Authority: TW
Inventors: Johann Ertl; Paul Habermann; Karl Geisen; Gerhard Seipke
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1996-07-26
Filing date: 1997-07-24
Publication date: 2002-02-01
Also published as: CA2207078A1; NO317666B1; EP0821006B1; CN1362417A; IL121382A0; PT821006E; CZ237097A3; IL121381A; EP0821006A2; US6221837B1; RU2176646C2; DE59711533D1; HUP9701299A1; AU3017197A; ATE264871T1; PL321343A1; TR199700685A2; BR9704117B1; CZ292274B6; JP4046388B2

Description

474944 A7 B7 五、發明説明（i ) 欽述具增強之鋅結合力之胰島素衍皁物經皮下所投予胰島素之藥物代謝動力學係視其締合行為而定。胰島素於中性水溶液中形成六聚體。假設胰島素係得自於粗織而進入血流单抵達作用部位時，其必須先通過微血管壁。上面所作之假定係僅對於單體或二聚體之胰島素才有可能，但對於六聚體之胰島素或比較高分子量之缔合物則非為可能或僅稍微可能（勃蘭吉(Brange)等人，糖尿病照料(Diabetes Care) : 13 (1990)，第 923-954 頁；坎(Kang) 等人，辕尿病照料(DiabetesCare) ·· 14(1991)，第 942-948 頁）。因此六聚體之解離為使其快速自皮下組織通過而進入血流中之先決條件。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) «衣·

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製胰島素之締合與聚集行為係受到2n++的影響，其導致六聚體安定作用，且pH在中性點附近時，會引起比較高分子量之聚集體之形成，直到發生沈澱。然而，將Zn++作為未經緩衝之人類胰島素溶液之添加物時，僅稱微影響作用曲線。儘管該溶液於皮下組織注射中可經快速中和，並形成胰島素-鋅複合物，但此天然鋅對於人類胰島素之結合力尚不足以安定六聚體及更高之聚集體。因此，藉由W Zn++，使人類胰島素之釋放不教顯著地遲延，並^強儲存作用無法達成9已知每莫耳胰島素六聚體具有大約2莫耳本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公酱） 474944 A7 B7 五、發明説明（ 2

Zn++之含量（布朗代爾(Blundell)等人，高等蛋白質化學 (Adv· Protein Chem·) : 26 (1972)，第 323-328 頁）。每一胰島素六聚體上之二Zn++離子係牢牢地結合至胰島素六聚體，且無法以正常透析將其移除。所謂的4-鋅騰島素結晶雖已經公認地敘述，但是，此等結晶平均每莫耳胰島素六聚體僅包含少於三莫耳之Ζη++ ( S.D·史密斯(Smith)等人’美國國家科學院院刊(Proc. Natl. Acad. Sd. USA): 81，第 7093-7097 )。本發明之標的係在找尋具有增強鋅之結合能力之胰島素衍生物，以形成包括胰島素六聚體及Zn++之安定複合物，且經與人類胰島素比較，對於皮下注射具有遲延之作用曲線。式ί之胰島素 ,s- s ^1^11* 1—^— ^ϋϋ m^l n^i ϋϋ .—^1 11_-1 ϋ· % (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

Gly- (A1) (Α6)χ •Cys· •Cys -•(A 7) -Cys — (A 11) (A 20) Cys—

R3- OH 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 S^

S (I)

S

S R1 — (B 1) -Cys-(B 7) • Cys— (B19) •Y-Z (B 30) 4 ( CNS ) A4M,^ ( 210X297/^# ) 474944 A7 B7 五、發明説明（及/或現已發現之生理上可耐受之式I之胰島素之鹽類，其具備上述提及之條件且其中 R1為苯丙胺酸殘基或氫原子， R3 為遺傳上可編碼之胺基釀殘基， Y 為遺傳上可編碼之胺基酸殘基， Z 為 a) 胺基酸殘基His或 b) 具有2至35個遺傳上可編碼之胺基酸殘基之胜肽，包括1至S個組胺酸殘基，且殘基A2-A20對應至人類胰島素、動物胰島素或胰島素衍生物A鏈之胺基酸序列，而殘基B2-B29則是對應至人類胰島素、動物胰島素或胰島素衍生物B鏈之胺基酸序列0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製式I之胰島素，其中 R1 為苯丙胺酸殘基， R3 為來自於由 Asri ' Gly、Ser、Thr、Ala、Asp、 Glu及Gin所組成集團之胺基酸殘基， Y 為來自於由Ala、Thr、Ser及His所組成集團之胺基酸殘基， Z 為 a) 胺基酸殘基His或 b) 具有4至7個胺基酸殘基之胜肽，包括1 或2個組胺酸殘基時為特別較佳。 # 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21.0 X 297公釐） 474944 A7 B7 五、發明説明（式I之騰島素’其中 R1為苯丙胺酸殘基，來自於由 Asn、Gly、Ser、Thr、Ala Glu及Gin所組成集團之胺基酸殘基，來自於由Ala、Thr < Ser及His所組成集團之胺基酸殘基， a) 胺基酸殘基His或 b) 具有2至7個胺基酸殘基之胜肽，包括1 或2個組胺酸殘基 βίΤψ· 係更爲較佳。，酸殘基之胜肽，包括1或2個組胺酸殘基 Y 為 Z 為

Asp

時特别較隹式I之胰島素，其中 R1為苯丙胺酸殘基， R3 為來自於由Asn及Gly所組成集團之胺基酸殘基， Y 為來自於由Thr及His所姐成集團之胺基酸殘基， Z 為具有1至5値胺基鲮殘基之胜肽，包括1或2個組胺酸殘基時尤其較佳。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製式I之胰島素，其中 R1為苯丙胺酸殘基，R3為甘胺酸殘基，Y為蘇胺酸殘基且Z為具有1暴5個胺基酸殘基之胜肽，包括1或2個組胺酸殘基時係更為較佳。 Μι 6 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 474944 A7 B7 五、發明説明（經濟部中央標準局員工消費合作社印製式I之胰島素，其中 Z 為具有序列 His ilis、HisHisArg、AlaHisHis、AlaHis ifis Arg、Ala His His Arg 或 Ala Ala His His 之胜肽時係非常特別較佳。胜肽或蛋白質之胺基酸序列係指自胺基酸鏈之Ν-末端算起。式I括弧内所給的細目，例如Al、Α6、Α7、All、 A20、Bl、B7、B10或B30，係對應於胰島素A或B 鏈之胺基酸殘基位置。措詞“遺傳上可編碼之胺基酸殘基”，係代表胺基酸Gly、 Ala、Ser、Thr、Val、Leu、lie、Asp、Asn、Glu、 Gin、Cys、Met、Arg、Lys、His、Tyr、Phe、Trp v Pro及硒代半胱胺酸之殘基。動物胰島素之“殘基A2>A20 ”及“B2-B29 ”播詞，可經例如，意指來自於牛、豬或雞之胰島素之胺基酸序列而被瞭胰島素衍生物之殘基A2-A20及B2-B29措詞，代表與人類胰島素相應之胺基酸序列，其係藉由其他遺傳上可編碼胺基酸將胺基酸置換以形成。人類胰島素之A鏈具有下列序列(Seq Id No. 1): Gly，lie，Val，Glu，Gln，Cys，Cys，Thr，Ser，lie，Cys，S^r，Leu， Tyr, Gin, Leu, Glu, Am, Tyr9 Cys, Asn ° 雙::/ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -衣· 訂 7 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 474944 A7 ___ B7 五、發明説明（6 ) 人類胰島素之B鏈具有下列序列(Seq Id No. 2):

Phe, Val, Asn, Gin, His, Leu? Cys5 Gly, Ser? His, Leu, Val, Glu,

Ala, Leu? Tyr, Leu, Val, Cys, Gly? Glu, Arg, Gly, Phe, Phe, Tyr? Thr，Pro，Lys，Thr。式I之胰島素衍生物可在微生物内藉由大量遠傳工峩構建物的幫助而形成(EP G 4抑 780, EP 0 347 781，EP 0 368 187, EP 0 453 969)。此等遺傳工程構建物係在微生物，例如大腸桿函(Escherichia coli}或鍵微菌屬(Streptomycetes)於發酵斯間中被表現出。所形成之蛋白質則係儲存於微生物之内部(EP 0 489 780)或經分泌而進入發酵液中。作為代表性之式I之胰島素為：

Gly(A21)-人類胰島素-His(B3 l)-His(B32H)H Gly(A21)-人類胰島素-His(B31)-His(B32)-Arg(B33)-OH Gty(A21)-人類胰島素 _Ala(P3 l)-His(B32)-His(B33)-OH

Gly(A2l)-人類胰島素-施佴叫相邱邛砸你33)士g(B34H)H

Gly(A21)-人類騰島素-Alk(B3 l)-Ala(B32)-His(B33)-His(B34)-OH Gly(A21)-人類胰島素-Ala(B3 l)-AU(B32)-His(B33)-His(B34)-Arg(B35)-OH 式I之1¾島素衍生物主要係藉由遺傳工程根據標準方法以定位誘變而製備得。為此目的，將編碼所需式^之胰島素衍生物之基因結構構建並表現於宿主細胞—較佳地於細菌，例如大腸桿菌(E.coli)或酵母菌，尤其是釀酒酵母菌 s t 本紙張尺度適用中國A4規格（21Gx^^~ - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 474944 A7 _B7 五、經濟部中央標準局員工消費合作社印製發明説明（7 ) (Saccharomyces cervisiae)中一並一假定該基因結構編碼出融合蛋白質時一式I之胰島素衍生物則自融合蛋白質中釋放出；類似之方法經述於，例如，£?-八-0 211299，£1^ A-0 227 938，EP_A_0 229 998，EP_A-0 286 956，DE 專利申請P3821 159及USP5,358,857 (對應於臺灣發明專利號 59800 )。待經細胞分裂後，該融合蛋白質部分可經化學上藉助於鹵化氰一參見ΕΡ-Α-0 180 920或酵素學上以溶葡萄球菌素或胰蛋白酶一參見DE-A-37 39 347而斷裂。然後將胰島素先質根據所述，例如r· C·馬紹爾(Marshall) 及A. Sjp格利斯(inglis)於“實用蛋白質化學一手冊” (’’Practical Protein Chemical _ A Handbook”）（ A·達布雷 (Darbre)編輯）1986，第49-53頁之方法進行氧化亞硫酸解，之後根據G· H，迪克森(Dixon)及A. C.瓦達羅(Wardlow) 在自然(Nature) (i960)，第721-724頁中所述之方法，於硫 ' ) 醇之存在下’藉由形成正確的二硫鍵而復性。然而，亦可直接將此胰島素先質折疊(ΕΡ-Α-0 600 372; ΕΡ-Α-0 668 292)。將C胜肽及，若存在，前序列（根據式Π 2R2 )藉击胰蛋白酶斷裂一例如根據肯姆勒(Kemmler)等人，生物化學雜諸(J.B.C·) (1971)，第6786-6791頁之方法而去除，並以已

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 49 47

正充修_ 0 fu 月S.

A B 經濟部中决標準局賀工消费合作社印製五、發明説明（8 ) 專利申請案第8611〇5丨6號 ROC Patent Appln. No.86110516 中文說明書修正第10、16 and 19頁-附件二 Amended Pages 10,16 and 19 of the Chinese Specification- Encl.II (民國87年9月^日修正並送呈） (Amended & Submitted on Sep. 1998) 知技術，例_層析術一如EP-A“0 305 760 —及結晶將式I 之换島素衍生物純化c 本發明進一步相關於包括胰島素六聚體及每莫耳胰島素六聚體有大約5至9莫耳Zu++，較佳地每莫耳胰島素六聚體有5至7莫耳之複合物，而胰島素六聚體則係由式I之六個胰島素所組成。鋅結合至胰島素六聚體是如此牢固，以致於每莫耳胰島素六聚體之5至9莫耳之Zn++無法藉由40小時之正常透析，例如以水性lOmMtris/HCl緩衝液，pH7.4而移除。待經皮下投藥後，基本上不含鋅之式I之姨島素製劑(pH4) 與人類胰島素比較時，在作用時顯示出非常小的遲延。待經將大約20微克Zn++/毫升之製劑加入，經皮下扱藥後，可觀察到後來的起始作用。此作用上之環延，最好是在4〇微克毫升下觀察較高之·鋅濃度可增強此作用。本發明另相關於式Π之前胰島素原

RkRlBS-BS^Y-ZLGly-AS-ASO-R3 < (π) 其中R3及Υ如於式I，係經定義而陳述於申請專利範圍1 至6之一或更多中，且 R1為苯丙胺酸殘基或共償鍵結，且 10 本紙張尺度適川中國ϋ㈣"TrNS ) Λ4規格（210乂297公釐1 — - 11 —IV 1--- I - 1 ...... ......... Hi H (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 474944 A7 Β7 五、發明説明（9 ) R2為 a) 遺傳上可編碼之骇基酸殘基或 b) 具有2至45偭胺基酸殘基之胜肽，且 A2_A20及B2-B29對應至人類胰島素^ | 物胰島素或胰島素衍生物之A鍵及g _ 且， Zl為具有2至40個遺傳上可編碼胺基酸殘基之姓肽，含有1至5個組胺酸殘基。式II之前胰島素原適合於作為製備式I之胰島素< +$ 物0 較佳之式II之前胰島素原係，該等其中為具有2至25個胺基酸殘基之胜肽。 Γ請先閑讀背面之注意事項再填寫本頁j

•訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製特別較佳之式II之前胰島素原係，該等其中 R2 為具有2至15個胺基酸殘基之胜肽，其中來自於由Met、Lys及Arg所組成集團之胺基酸殘基係位於護端。式I之胰島素衍生物及/或根據本發明之複合物，包括胰島素六聚體友每莫耳胰島素六聚體含5至9莫耳Zn++，及/ 或其生理上可耐受之鹽類（例如鹼金屬或銨鹽），主要係作為用於醫藥製劑中之活性化合物，以治療多尿症 (diabetes)，尤其是糠尿病(diabetes mellitus)。 ''羞/ 11 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 474944 A7 B7 五、發明説明（ϊ0) 此醫藥製劑較佳地為注射目的之溶液劑或懸浮劑，·其包含至少一種式I之胰島素衍生物及/或根據本發弭之複合物及 /或其至少一種存於溶解、非蟲形及/或晶性，較佳地為溶解一形式之生理上可耐受之鹽類。此製劑較佳地具有自大约2.5至8.5之pH，尤其是自大約 4.0至8.5，並包括適合之等滲化劑、適宜乏保存劑及，若舍適，適當之緩衝液，又較佳地以及特定之鋅離子濃度，全部 ^然係於無囷水溶液中。除活性化合物之外，全部製劑之組成物形成藥品載體溶液。包括式ί之胰島素溶液之製劑，係具有自2.5至4.5之pH，特別是自3.5至4·5，較佳為4.0。包括式I之胰島素懸浮液之製劑，係具有自6 5至$ 5之 pH，特別是自7.0至8.0，較佳為7.4。適宜之等滲化劑為，例如，甘油、葡萄糖、甘露醇、Naci、鈣化合物或鎂化合物，如CaCl2或MgCl2。經濟部中央標準局員工消費合作社印製由於等滲化劑及/或保存劑選擇之結果，胰島素衍生物或其生理上可耐受之鹽類之溶解度’在弱酸性pH下受到影響。適宜之保存劑為，例如，酚、間-甲酚、芊醇及/或對·羥苄酸酉旨。 12 4/4944 - — B7 五、發明説明（u) 可經使用，特別是用於調整介於大約4.0至8.5間之pH之緩衝物質為’例如’醋酸鈉、檸檬酸鈉或鱗酸納。其他，生理上可接受之稀釋酸（一般為Ηα)或鹼（一般為 NaOH)亦適合於調整pH。假定製劑具有Zn++含量時，含自1微克至2微克Zn++/亳升者，尤其是含5微克至2〇〇微克Zn++/毫升者為較佳。為改變本發明製劑之作用曲線，亦可摻和未經修飾之胰島素，較佳地為牛、豬或人類胰島素，特別是人類胰島素，或經修飾之胰島素，例如單體胰島素、快速作用胰島素或 Gly(A21)-Arg(B31)_Arg(B32)-人類胰島素。較佳活性化合物冬濃度為對應於大約1-1500，另較佳為大約54000以及尤其是大約4-400國際單位/毫升之該者。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣、π 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

3 11 適一尺 I張紙釐公 7 9 . 2 474944 A7 B7 五、發明説明（12 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製實施例1 Gly(A21)-人類胰島素-His(B31>His(B32)-OH 之製備表現系統之製備基本上係如於US5,358,857中而完成。載體pINT 90d和pINT 9M (參見實施例17 )及PCR引物 TIR和Insu 11亦述於該處。此四假成分特別是在使甩作為起始物質，以用於如述於下之載體構建物。首先，將Gly(A21)之密碼子插入編碼小-胰島素原之序列中、為能將其完成，使用pINT91d作為模板，並以引物 TIR和Insu 31完成PCR反應。 Insu3l (SeqldNo. 10)： 5, TTT TTT GTC GAC CTA TTA QCC GCA GTA GTT CTC CAG CTG 3, PCR循環之完成如下。第1分鐘94 °c，第2分鐘55 °c，第3分鐘72 °C。令此循環重複25次，然後將此混合物於 72 °C下培養7分鐘並隨即於4 °C下隔夜。為將其純化，使結果之PCR片段於乙醇中沈澱、^^燥，然後於限制緣衝液中，使用根據製造者細目之限制_Ne〇1 及Sail消化。然後將反應混合物藉由凝膠電泳分離而單離出Nc01_前η胰島素原片段。同樣地，使用Nc〇1和SaU將

(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 訂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇χ297公釐） 474944 A7 B7 五、發明説明（13 ) 質體pINT 90d之DNA斷裂，則猴子胰島素原片段將以此方式自pINT殘餘質體釋放出。二者之片段均藉由凝膠電泳分離而單離得殘餘質體DNA。於連接酶反應中，將此 DNA與NcOl-Sall PCR片段反應。因此獲#質韓piNT 150d，待經藉由大腸桿菌(E, coli)轉化後，將其複製並再單離。質體pINT 150d之DNA係使用作為質體pINT 302之起始物質，其提供所需胰島素變體之製備。為構逡得此質體，採用US 5,358,857 (參見實施例6 )中所述之填徑。為邊此g的，進行二相互獨立之PCR反應，而質體plNT 150d之DNA係用作為模板。其中一反應之進行係使用引物對TIR和pINT B5 (Seq ldNo. 11)： 5, <iAT GCC GCG GTG GIG GOT CTT GGG TGT GTAG 3, 丨^--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂鲁經濟部中央標準局員工消費合作社印製而另一反應之進行則使甩引物對lnsu 11和pINT B6 (SeqldNo. 12)： 5* A CCC AAG ACC CAC CAC CGC GGC ATC GTG GAG 3* ° 結果所得之PCR片段係部份互補，以致於在第三PCR反 15 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 474944

五 __ 經孝部中决標率局貨J-消費合作社印來 A7 B7 發明説明（Μ· 應中，它們產生編碼Gly(A21)且經位置Β31和Β32增長之小胰島素原片段。使用NcOl和Sail將此片段斷裂，然後與所述之PINT 90d殘餘質艘之DNA於速接酶反應中進行反應以獲得質艘PINT302 〇然後將經此質體轉化之大腸桿菌(E. coli)K12 W3110進行發酵並如US 5,227,293之實施例4而完成。所得作為中間物（胰蛋白酶斷裂前）之前胰島素原其有下列胺基酸序列：前胰島素原1 (Seq IdNo.3) ··

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg

Phe Val Asn Gin His Leu Gys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu

Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Pile Tyr Thr Pro Lys Thr

His His Arg

Gly lie Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Gys Gly 前胰島素原1對應至式II，在此例中 R2為具有11個胺基酸殘基之胜肽，

Rl 為 Phe (B1)， Y 為 Tbr(B30)， Z1 為 His His Arg (B31-B33)，· R3 為 Gly(A21)且 A2-A20為人類胰島素A鏈之胺基酸序列（胺基酸殘基2 至20 )，而B2-B29則是人類胰島素b鏈之胺基酸序列（胺 -16 本紙張尺度適州中國國家標埤（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） --1------------訂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 474944 A7 B7 五、發明説明（I5 ) 基酸殘基2至29)。前姨島素原1係根據實施例4，以如US 5 227 293中之胰蛋白酶随^後將所得之產物，«實施例η，與羧狀酶6反應以獲得騰島素1。騰島素！對應至幻，在此例中

Rl 為 Phe (Β1)， Y 為 Thr (B30)， Z 為1^5 1^(831屯32)， R3 為 Gly(A21)且 A2-A2G為人醜島素a鏈之絲酸細（絲酸殘基2 至20 ) ’而B2-B29則是人類胰島素B鏈之胺基酸序列（胺基酸殘基2至29)。胰島素1具有底下胺基酸序列：胰島素 1 (Seq Id No. 4): B-鏈·· Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr His His 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A-鏈·· Gly lie Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Gly 二硫鍵係如式I中所述而形成。 17 本紙張尺度適用中國國家檩準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 474944 A7 B7 五、發明説明（16 ) 實施例2

Gly(A21)-人類胰島素-Ala(B31)-His(B32)-His(B33)-Arg(B34)-OH 之製備根據實施例1，構建得表現栽體。質體pINT 150d係經使用作為二互相獨立PCR反應之模板，具有弓ί 物對 TIR 和 pINT B7 (Seq W No· 13): 51 QAT GCC GCG GTG GTG CGC GGT CTT GGG TGT GTAG 3* 或 Insu 11 和 pINT B8 (Seq Id No· 14): 5, ACCC AAG ACC GCG CAQ £AC CGC GGC ATC GtG GAG 3,。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本覓) 二反應所產生之PCR片段係部份互補，並在第三PCR反應中提供編碼所需胰島素變體之完全序列。將此反應之片段以酵素NcOl和Sail處娌，然後連接至pINT 9Qd DNA 之NcOl/Sall-開放殘餘質體中。結果之質體piNT303，其待經大腸桿菌(E. coli)K12 W3110棘化徭，係經使用作為用於所需前小胰島素原表現之基礎。如於實施例1中進行發酵並完成，而幾肽酶B之反應則省去。所得之前胰島素原衍生物具有下列胺基酸序列：前胰島素原2(SeqIdNo* 5):

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 474944 A7 B7 五、發明説明（17 )! 年月 9Β7Λ2. 2^ 修正

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Giy Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His His Arg

Gly lie Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Gys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr C^s Gly 前胰島素原2對應至式Π，在此例中 Rl 為 Phe (B1)， R2為具有11個胺基酸殘基之胜肽， Y 為 Thr(B30)， Z1 為 Ala His His Arg (B31-B34)， R3 為 Gly(A21)且 A2-A20為人類胰島素A鏈之胺基酸序列（胺基酸殘基2 至20 )，而B2-B29則是人類胰島素B鏈之胺基酸序列（胺基酸殘基2至29 )。 • v 經濟部中决標率局負工消費合作社印^. — _1------Φ-I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 然後將前胰島素原2與胰蛋白酶反應以獲得胰島素2。胰島素2對應至式II，在此例中 Rl 為 Phe (B1)， Y 為 Thr(B30)， - Z1 為 Ala His His Arg (B31-B34), R3 為 Gly(A21)且 A2-A20為人類胰島素A鏈之胺基酸序列（胺基酸殘基2 -19 本紙張尺度適州中國國家標啤（（、NS ) Λ4規格（210X 297公釐） 474944 A7 B7 五、發明説明（18 至20 )，而B2-B29則是人類胰島素B鏈之胺基酸序列（胺基酸殘基2至29)。胰島素2具有底下胺基酸序列：跋島素 2 (Seq Id No· 6): B-鏈：？he Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His His Arg A-鏈：Gly lie Val Glu Gin Cys CyS Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Gly 二硫鍵係如式I争所述而形成。實施例3

Gly(A21)-人類胰島素-Ala(B31)-Ala(B32)-His(B33)-His(B34)-OH 之製備根據實施例1 ’構建得表現載體。經濟部中央標準局員工消費合作社印製質體pINT 150<1係經使用作為二互相獨立PCR反應之模板，具有引物對 TIR 和 pINT 316a (Sqq Id No. 15): 着 5’ GAT GCC GCG ATG ATG CGC CGC GGT CTT GGG TGT GTA 3，或 Insu 11 和 pINT 316b (Seq Id No· 16): 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 474944 A7 __ B7 五、發明説明（19 ) 51 A CCC AAG ACC GCG GCG CAT CAT CGC GGC ATC GTG GAG 3f 〇二反應所產生之PCR片段係部份互補，並在第三PCR反應中提供編碼所需胰島素變體之完全序列。將此反應之片段以酵素NcOl和Sail處理，然後連接至pINT %d DNA 之NcOl/Sall-開放殘餘質體中。結果之質體pINT316，其待經大腸桿菌(E.coli)K12W3110轉化後，係經使用作為用於所需前小胰島素原表現之基礎。如於實施例1中進行發酵並完成，而羧肽酶B之反應則省去。所得之前胰島素原3具有下列胺基酸序列：前胰島素原3 (Seq Id No. 7):

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala Ala His His Arg

Gly lie Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Gly 經濟部中央標準局員工消費合作社印製兪胰島素原3對應至式II，在此例中 Rl 為 Phe<Bl)， R2 為具有11個舷基酸殘基之胜肽， Y 為 Thr (B30)， Z 為 Ala Ala His His Arg (B31_B35)， r3 為 Gly(A21)且 21 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐) 474944 A7 B7五、發明説明（20 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A2-A20為人類胰島素A鏈之胺基酸序列（胺基酸殘基2 至20 )，而Β2·Β29則是人類胰島素B鏈之胺基酸序列（胺基酸殘基2至29)。然後根據實施例11，將前胰島素原3與胰蛋白酶及羧肽酶 Β反應，以獲得胰島素3。胰島素3對應至式I，在此例中 Rl 為 Phe (Β1)， Y 為 Thr (B30)， Z 為 Ala Ala His His (B31_B34)， R3 為 Gly(A21)且 A2-A20為人類胰島素A鏈之胺基酸序列（胺基酸殘基2 至20 )，而B2-B29則是人類胰島素B鏈之胺基酸序列（胺基酸殘基2至29)。胰島素3具有底下胺基酸序列：胰島素 3 (Seq Id No. 8): B-鏈：Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala Ala His His A-鏈：Gly lie Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Gly 二硫鍵係如式I中所述而形成。 22 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）五、經濟部中央標準局員工消費合作社印製發明説明（實施例4 =實施例11，將依據實_2所製備得之胰島素2與幾肽酶B反應，以獲得胰島素4。胰島素4對應至式I，在此例中 W 為 Phe (B1)， Y 為 Thr(B30)， Z 為 AlaHis His(B31-B33>， R3 為 Gly(A21)且 A2-A20為人類胰島素A鏈之胺基酸序列（胺基酸殘基2 至20 ) ’而B2-B29則是人類騰島素b鏈之胺基練序列（胺基酸殘棊2至29)。騰島素4具有底下胺基酸序列：騰島素 4 (SeqIdNo.9): 鏈：Phe Val Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Ghi Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His His ： Gly lie Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Gly 二硫鍵係如式I中所述而形成。實施例5 胰島素衍生物之鋅結合力 ν' ijrl 23 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） 474944

五、發明説明（22 ) 將胰島素製劑（〇.243mM人類胰島素、〇 13MNaC1、 01 %齡、80 微克/毫升(1·22 mM)之 Ζη++、1〇 tris/HCt、pH7·4 )透析至 ire，以對抗 1〇mMtris/HC1 pH7.4總共達40小時(待經16 h及24 h後，緩衝液交換）。然後將透析液酸化，並以HPLC測定胰島素之濃度，而以原子吸收光譜學測定鋅。鋅值係使用不含胰島素之控制批之辞含量校訂。表1顯示此結果：表1 ·· 胰島素比較 Zn莫耳數/胰島素六聚艎莫耳數人類胰島素(HI) 1.98 Gly(A21)Des(B30)-HI 1.8 Gly(A21)Arg(B3 l)-Arg(B32)-HI 2.1 根據本發明式I之胰島素：經濟部中央標準局員工消費合作社印製式I之胰島素 Zii莫耳數/胰島素六聚體莫耳數 Gly(A21)His(B3i)His(B32)-HI 6.53 Gly(A21)His(B3 l)His(B32)Arg(B33)-HI 5.29 Gly(A2 l)Ala(B3 l)His(B32)His(B33)-HI 6.73 Gly(A21)Ala(B31)His(B32)His(B33)Arg(B34).HI 5.01

24 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） 474944 A7 B7五、發明説明（23 ) 實施例6 於狗中辞依賴之人類胰島素之作用曲線投藥：皮下劑量： 0.3國際單位/公斤；製劑之pH為4.0 每次實驗狗隻數目(η)為6 奉2顯示血糠按％之起始值表2 —ί #丨丨 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製時間⑻ 無鋅 80微克Ζη/毫升 160亳克Ζη/微升 0 100 100 100 0.5 88.66 94.06 101.48 1 59.73 72.31 76.87 1.5 50.61 58.6 67.44 2 54.32 54.05 61.49 3 61.94 58.84 62.8 4 85.59 70.03 71.32 5 100.46 78.97 81.65 6 105.33 94.63 96.19 7 106 102.46 100.27 8 108.39 106.12 104.34 10 102.72 105.11 105.1 12 105.03 107.14 103.02

、11

25 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 474944 A7 五、發明説明（24 ) 實施例7 於狗中 Gly(A21)Ala(B3l)His(B32)，His(B33) , Arg(B34) 人類騰島素之侧曲線（騰島素2) 將根據實施例2所製備得之胰島素2使用於底下之配方中：甘油20毫克/毫升、間-甲紛、胰島素2 40 單位/毫升 IU代表國際單位且對應於大約6毫微莫耳之肤島素，例如，人類胰島素或式I之胰島素。使用Na〇 HC1調整 pH ° 投藥：皮下；劑量：〇.3國際單位/公斤；經測試之狗隻數目為6 ;製劑之pH為4.0 表3顯示血糖按％之起始值經濟部中央標準局員工消費合作社印製表3 時間(h) 無鋅 20微克Zn/毫升微克Zn/臺升 80微克Zn/毫升 0 100 100 100 100 1 74.38 95.24 95.6 102.06 2 48.27 90.11 78.74 97.44 3 57.67 89.96 84.81 90.44 4 74.2 81.35 74.66 88.69 5 91.68 74.43 75.71 79.7 6 100 J9 71.61 67.37 65.26 26 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

474944 A7 B7 五、發明说明（25 ) 時間⑻ 無鋅 2〇微束Zn/毫升 40微克Zn/亳升 80微克Zn/毫升 7 93.5 67.73 66.05 62.17 8 100.54 68.92 64.97 47.71 實施例8 於狗中 Gly(A21)Ala(B31)His(B32)，His(B33)人類胰島素之作用曲線（胰島素4) 將板據實施例4所製備得之胰島素4調配並如實施例7所使用。投藥：皮下；劑量： 0·3國際單位/公斤； η = 6 ;製劑之pH為4.0 表4顯示血糖按❹/❶之起始值經濟部中央標準局員工消費合作社印製表4 時間(h) — 丨_丨 ' 無鋅 20微克Zn/毫升 40微克Zn/毫升亳升 0 100 100 100 100 1 61.51 70 96.52 101.77 2 49.82 52.55 89.28 90.01 3 55.66 60.13 80.23 --— 70.79 4 78.09 78.46 70.03 68,48 5 94.27 97.7 70.3 ---^ 74.94 6 103.69 105.27 61.86

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） A7五 B7 、發明説明（ 26 A間㈨無鋅 2〇徼克Zn/毫升 40微克Zn/毫升 -- 80微克Zn/亳弁 7 ---- 105.51 106.48 62.28 76.42 8 108.05 104.51 81.68 88 實施例9 於狗中Gly(A21)His(B31)，His(B32)人類胰島素之作用曲線（胰島素1) 將板據實施例1所製備得之胰島素1調配並如實施例7所使用。投藥·· 皮下；劑量：〇·3國際單位/公斤； η = 6 ;製劑之ρΗ為4.0 表5顯示血糖按％之起始值表5 經濟部中央標準局員工消費合作社印製時間〇〇無鋅 20微克Zn/毫升 40微克Zn/毫升 80 微克 Zn/^t 0 100 100 100 100 _^ 1 L 60.71 73‘16 100.25 102.86___ 2 52.29 55.43 94.86 100.19_^ 3 61.74 61.6 89.37 89.12__ 4 79.93 81.53 81.55 79.19_ 5 96.17 96 84 73.06 70.67_^ 6 103.2 102.43 74,58 75.75__ 28

本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐）五 A7 B7 -------------—~發明説明（27 ) 時間⑻ 無辞 20微克Ζη/毫升 40微克Ζη/毫升 80微克Ζη/毫升 7 Π0.86 104.75 77.68 79.36 8 113.42 108.14 84.87 78.74 實施例10 於狗中 Gly(A21)Ala(B31)Ala(B32)His(B33>His(B34)人類胰島素之作用曲線（胰島素3) 將根據實施例丨所製備得之胰島素3調配並如實施例7所使用。投藥：皮下；劑董： 0.3國際單位/公斤； n = 6 ;製劑之pH為4.0 表6顯示血糖按％之起始值 IL-------¾衣II (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、π 經濟部中央標準局員工消費合作社印製表6 時間(h) 無鋅 20微克之η/亳升 40微克Ζη/毫升 80微克Ζη/亳升 0 100 100 100 100 1 75 99 101 99 2 S7 77 96 91 3 58 64 84 80 4 82 65 73 79 5 94 70 68 77

29 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 474944 A7 B7 五、發明説明（28 ) 時間Οχ) 無鋅 20微克Ζη/亳升 40微克Ζη/亳升 80微克Ζη/毫升 6 100 74 72 76 7 96 81 80 69 8 100 90 88 75 9 100 96 94 83 10 95 98 92 87 12 98 99 95 94 14 95 100 94 93 —i--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 實施例11 自前胰島素原1製備胰島素將根據實施例1所製備得之200毫克胰島素（其一 Arg位於B鏈之羧端）溶解於95毫升之IQ mM HC1中。待經將5 毫升lMtris/HCl (三(羥甲基)胺基甲烷）pH8加入後，使用HC1或NaOH調整pH。將0.1毫克羧肽酶B加入，待經90分鐘後，精胺酸之斷裂完全。藉由加入HC1將此混合物調整至pH 3.5並泵至反向管柱（PLRP-SRP300 1〇μ，2.5 X 30公分，聚合物實驗室(Polymer Laboratories)阿模斯特(Amherst)，麻薩諸塞，美國(MA，USA))。流動相A為含有0.1 %三氟醋酸之水。相 β係由含0,09%三氟醋酸之乙腈所組成。管柱係於流速5

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

/HV44 五 '發明説明（ 29 A7 B7 毫升/分鐘下操作。於400分鐘内，藉由將22.5至40%線性梯度之B加入以完成分溶析。藉由分析級反向HPLC各別地對流分進行分析，並將該等含有足夠純度之Des-Arg-胰島素組合。使用NaOH將pH調整至3.5，並以旋轉蒸發器移除乙腈。藉由將pH設定為6.5，然後沈澱出Des-Arg-胰島素。將沈澱物經離心取卞，以50毫升之水洗滌兩次，最後並經冷;東乾燥。產率為60至80 %之胰島素1。 (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣經濟部中央標準局員工消費合作社印製 31 474944 ^ 序列明細表 (1) 一般資料： 0)申請者： (A)姓名：Hoechst Aktiengesellschaft 道名：一 (C) 城市名：美茵河畔法蘭克福(Frankfortam

Main) (D) 州名：一 (E) 國名：德國(BundesrepublikDeutschland) (F) 郵遞區號：65926 (G) 電話·· 069-305-6047 (H) 光傳真：069-35-7175 (I) 電傳·· 041234-700 hod (ii) 申請標題：具增強之鋅結合力之胰島素衍生物 (iii) 序列數目：16 (iv) 電碯可讀取形式： (A) 媒介類型：軟碟 (B) 電滕：EBMPC可相容

(C) 操作系統：PODOS/MS-DOS (D) 軟體··專利許可#1.0，版本#1.25 (EP0) 474944 (2)序列鑑定第1號(SEQIDNO:l··)之資料： (i)序列特徵： (A) 長度：21胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 鏈型：單股 (D) 拓樸結構：線形 (ϋ)分子類型：蛋白質 (vi)原始來源： (A)有機體：大腸桿菌(Escherichia coli) (ix)特點： (A) 名稱/關鍵：蛋白質 (B) 位置：1··21 • V， (xi)序列說明··序列鑑定第1號：（SEQIDN0:1:)

Gin 15

Gly lie Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr 1 5 10

Leu Glu Asn Tyr Cys Ksn 20 2 474944 (2)序列鑑定第2號(SEQ ID NO:2:)之資料： (i) 序列特徵： (A) 長度：30胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 鏈型：單股 (D) 拓樸結構：線形 % (ii) 分子類型：蛋白質 (vi)原始來源： (A)有機體：大腸桿菌(Escherichia coli) (ix)特點： (A) 名稱/關鍵：蛋白質

(B) 位置：1..30 (xi)序列說明：序列鑑定第2號··（SEQIDNOA)

Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 - 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 474944 (2)序列鐘定第3號(SEQ Π)NO:3:)之資料： (0序列特徵： (A) 長度：65胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 鏈型：單股 (D) 拓樸結構：線形 (i〇分子類型：蛋白質 (vi)原始來源： (A)有機體：大腸桿菌(Escherichia coli) (ix)特點： (A) 名稱/關鍵：蛋白質 (B) 位置：1··65 • *； (xi)序列說明：序列鑑定第3號：（SEQIDNO:3:)

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gin His 1 5 10 15

Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu 20 25 30

Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr His His Arg Gly lie Val Glu 35 40 45

Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tvr Cys 50 55 60 "

Gly 65 4 474944 (2)序列遂定第4號(Seqh^noa)之資料： (i) 序列特徵： (A) 長度：53胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 鏈型：單股 (D) 拓樸結構：線形 (ii) 分子類型：蛋白質 (vi)原始來源： (A) 有機體：大腸桿菌(Escherichia c〇li) (ix)特點： (A>名稱/關鍵：蛋白質 (B) 位置：1..53 (xi)序列說明：序列鑑定第4號：（SEQIDNO:4:)

Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr His His 20 25 30

Gly lie Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu . 35 40 45

Glu Asn Tyr Cys Gly 50

5 474944 (2)序列鑑定第5號(SEQ Π)Ν〇:5:)之資料： (〇序列特徵： (Α)長度：66胺基酸 (Β)類型：胺基酸 (C) 鏈型：單股 (D) 拓樸結構：線形 (ii)分子類型：蛋白質 (vi)原始來源： (A)有機體：大腸桿菌(Escherichia coli) (ix)特點： (A)名稱/關鍵：蛋白質 .(B)位置：1.,66 (xi)序列說明：序列鑑定第5號：（SEQ1DNO:5〇

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gin His 1 5 10 15

Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu 20 25 30

Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His His Arg Gly lie Val 35 40 45

Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr 50 55 60 、

Cys Gly 65 6 474944 ⑺序列鑑定第6號(SEQ ID NO:6:)之資料： (i) 序列特徵： (A) 長度：55胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 鏈型：單股 (D) 拓樸結構：線形 (ii) 分子類型：蛋白質 (vi)原始來源： (A)有機體：大腸桿囷(Escherichia coli) (ix)特點： (A)名稱/關鍵··蛋白質 .(B)位置：1..55 (xi)序列說明：序列鑑定第6號：（SEQIDNO:6.)

Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His 20 25 30

His Arg Gly He Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr 35 40 45

Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Gly 50 55 474944 ⑺序列鑑定第7號(SEQ Π) NO:7:)之資料· (i) 序列特徵： (A) 長度：67胺基酸 (B) 類型··胺基酸 (C) 鏈型：單股 (D) 拓樸結構：線形 (ii) 分子類型：蛋白質 (vi)原始來源： (A)有機體：大腸桿菌(Escherichia eoli；) (ix)特點： (A) 名稱/關鍵：蛋白質 (B) 位置·· 1..67 • v (xi)序列說明：序列鑑定第7號：（SEQIDNO:7:)

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gin His 1 5 10 15

Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu 20 25 30

Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala Ala His His Arg Gly lie 35 40 45

Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn 50 55 60

Tyr Cys Gly 65 8 474944 (2)序列鑑定第8號(SEQ ID N0:8:)之資料： · (〇序列特徵： (A) 長度：55胺基酸 (B) 類型··胺基酸 (C) 鏈型：單股 (D) 拓樸結構：線形 · (ii)分子類型：蛋白質 (vi)原始來源： (A)有機體：大腸桿菌(Escherichia coli) (ix)特點： (A) 名稱/關鍵：蛋白質 (B) 位置：155 0^ (xi)序列說明··序列鑑定第8號：（SEQ IDNO:8:)

Glu Ala Leu Tyr 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr

Pro Lys Thr Ala Ala 30

His His Gly lie Val 35

Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie 40

Cys Ser Leu Tyr 45

Gin Leu 50

Glu Asn Tyr Cys Gly 55 474944 卩）序列鑑定第9號(SEQ ID ΝΟ:9·)之資料·· ❸序列特徵： (A)長度：54胺基酸㊉)類型：胺基酸 (C)鏈型：單股 (〇)拓樸結構：線形 (i〇分子類型：蛋白質 (vi)原始來源： (A)有機體：大腸桿菌(Escherichia coli) (ix)特點： (A)名稱/關鍵：蛋白質 • (B)位置：1"54

• V (xi)序列說明：序列鑑定第9號：（SEQIDN0:9:)

Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His 20 25 30

His Gly lie Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin 35 40 45

Leu Glu Asn Tyr Cys Gly 50 10 474944 (2)序列鑑定第10號(SEQIDNCUO:)之資料: (〇序列特徵： (A) 長度·· 39鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 鏈型：單股 (D) 拓樸結構：線形 (ii)分子類型：DNA (基因组） (ix)特點： (A) 名稱/關鍵：外顯子(exon) (B) 位置：1..39 (xi)序列說明：序列鑑定第10 : (SEQE)NO:10:)

TTTTTTGTCG ACCTATTAGC CGCAGTAGTT CTCCAGCTG • _v 39

(2)序列鑑定第11號(SEQIDNO:lh)之資料： (i)序列特徵： (A) 長度：31鹼基對 (B) 類型：核酸 11 474944 • (c)鏈型··單股 (D)拓樸結構：線形 (ii)分子類型：DNA (基因組） (ix)特點： (A) 名稱/關鍵：外顯子(exon) (B) 位置：1"31 (xi)序列說明：序列鑑定第11號：（SEQIDNO:11〇

GATGCCGCGG TGGTGGGTCT TGGGTGTGTA G (2)序列鑑定第12號(SEQEDNai2:)之資料： *. (i) 序列特徵： v (A) 長度：31鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 鏈型：單股 (D) 拓樸結構：線形 (ii) 分子類型：DNA (基因組） 12 474944 -(ix)特點· (A) 名稱/關鍵：外顯子(exon) (B) 位置：1..31 (xi)序列說明：序列鑑定第12號：（SEQIDNO:12:)

ACCCAAGACC CACCACCGCG GCATCGTGGA G (2)序列鑑定第13號(SEQIDNO:13〇之資料： (〇序列特徵： (A) 長度·· 34鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 鏈型：單股 :.(D)拓樸結構：線形

• V (ϋ)分子類型：DNA (基因組） (ix)特點. (A) 名稱/關鍵：外顯子(exon) (B) 位置：1··34 (xi)序列說明：序列鑑定第13號：（SEQIDNO:13:) 474944 34

GATGCCGCGG TGGTGCGCGG TCTTGGGTGT GTAG (2)序列鑑定第14號(SEQIDN0:14··)之資料： (i) 序列特徵： (A) 長度：34鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 鏈型：單股 (D) 拓樸結構：線形 (ii) 分子類型：DNA (基因組） (ix)特點： :.(A)名稱/關鍵：外顯子(exon) (B)位置：1..34 、 (xi)序列說明··序列鑑定第14號：（SEQIDNai4:) ACCCAAGACC GCGCACCACC GCGGCATCGT GGAG 34 (2)序列鑑定第15號(SEQ ©ΝΟ··15··)之資料·· 14

474944 • (0 序列特徵： (A) 長度：37鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 鏈型：單股 (D) 拓樸結構：線形 ⑻分子類型：DNA (基因组） (ix)特點： (A) 名稱/關鍵：外顯子(exon) (B) 位置：1..37 • (xi)序列說明：序列鑑定第15號：（SEQEDNai5:)

GATGCCGCGA TGATGCGCCG CGGTCTTGGG TGTGTAG (2)序列鑑定第16號(SEQ IDN0.16:)之資料： (〇序列特徵： (A) 長度：37鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 鏈型：單股 (D) 拓樸結構：線形 15

474944 • ⑼分子類型：DNA (基因組） (ix)特點： (A) 名稱/關鍵：外顯子(exon) (B) 位置：1..37 (xi)序列說明：序列鑑定第16號：（SEQIDNO:16:) ACCCAAGACC GCGGCGCATC ATCGCGGCAT CGTGGAG 37

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Claims

474944 A8 B8 C8 D8 A 六、申請專利範圍

專利申請案第86110516號 ROC Patent Appln. No.86110516 修正之申請專利範圍中文本-附件一 Amended Claims in Chinese - Enel.I (民國87年12月二今日送呈） (Submitted on December >3? 1998) 1. 一種具式I之胰島素

Cys— (A 11) s (A 20) TCys— r3-oh s (I) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) s s R彳 (B1) -Cys -(B 7) Cys— (B 19) ，Y-Z (B 30) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製或式I胰島素之生理上可耐受之鹽類，其中 R1為苯丙胺酸殘基， — R3為甘胺酸殘基（Gly)， Y為蘇胺酸殘基（Th〇， Z 為具有2至5個遺傳上可編碼之胺基酸殘基之胜肽，包括2個連續組胺酸殘基之結構，且殘基A2-A20對應至人類胰島素、動物胰島素或胰島素衍生物A鏈之胺基酸序列，而殘基B2-B29則是對應至人類胰島素、動物胰島素或胰島素衍生物B鏈之胺 -32- H86338-Claim-WC 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 474944 A8 * ' B8 C8 D8 、申請專利範圍 ' 基酸序列。 2. 根據申請專利範圍第1項之式I胰島素，其中 Z為具有His His序列之胜肽。 3. 根據申請專利範圍第1項之式I胰島素，其中 Z為具有His His Arg序列之胜肽。 4. 根據申請專利範圍第1項之式I胰島素，其中 Z為具有Ala His His序列之胜肽。 5. 根據申請專利範圍第1項之式I胰島素，其中 Z為具有Ala His His Arg序列之胜肽。 6. 根據申請專利範圍第1項之式I胰島素，其中 Z為具有Ala Ala His His序列之胜肽。 7. 根據申請專利範圍第1項之式I胰島素，其中 Z為具有Ala Ala His His Arg序列之胜肽。 8. —種複合物，其包括胰島素六聚體及5至9莫耳Ζιι++/ 每莫耳胰島素六聚體，特別是5至7莫耳Zn+V每莫耳胰島素六聚體，該胰島素六聚體係由六個根據申請專利範圍第1至7項中任一項之式I胰島素所組成。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 9. 一種用於治療糖尿病之醫藥組成物，其包含有效量存於溶解、非晶形及/或晶性形式之根據申請專利範圍第1至7項中任一項之至少一種式I胰島素及/或至少一種式I胰島素之生理上可财受之鹽類。 10. 根據申請專利範圍第9項之醫藥組成物，其含有額外量之1微克至2毫克之Zn/毫升。 -33- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 474944 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 … 11·根據申請專利範圍第ίο項之醫藥組成物，其含有額外量之5微克至200微克之Zn/毫升。 12·根據申請專利範圍第9或10項之醫藥組成物，其具有之pH值為2.5至8.5。 13·根據申請專利範圍第9或10項之醫藥組成物，其具有之pH值為2.5至4.5。 14·根據申請專利範圍第9或10項之醫藥組成物，其含有額外量之未經修飾胰島素，或經修飾之胰島素。 15.根據申請專利範圍第14項之醫藥組成物，其含有額外量之未經修飾之人類胰島素。 16·根據申請專利範圍第14項之醫藥組成物，其含有額外量之 Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)_人類胰島素。 17· —種具式II之前胰島素原 (Π) 其中R3及Υ如於式I，係經定義而陳述於申請專利範圍1至7之項中任一項者，且 R1為苯丙胺酸殘基，且 R2為具有11個胺基酸殘基之胜肽，且殘基Α2-Α2〇及Β2-Β29對應至人類胰島素、動物胰島素或胰島素衍生物之Α鏈及B鍵，且 Z1為具有2至5個遺傳上可編碼絲酸殘基之胜肤， (請先聞讀背面之注意事項真填寫本買) 訂 -34-

474944 A8 B8 C8 D8 、申請專利乾圍含有2個連續組胺酸殘基。18.根據申請專利範圍第17之式II前胰島素原，其中 R2内選自Met、Lys及Arg之胺基酸殘基係位於羧端 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）