NO167187B

NO167187B - Fremgangsmaate til fremstilling av et legemiddel.

Info

Publication number: NO167187B
Application number: NO842978A
Authority: NO
Inventors: Ulrich Grau
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1983-07-22
Filing date: 1984-07-20
Publication date: 1991-07-08
Also published as: CA1236012A; FI79786C; PT78941A; ES8504456A1; IL72468A0; DK172456B1; IE841890L; ATE31625T1; IL72468A; JPS6042334A; NO167187C; AU3091784A; HUT34889A; ES534488A0; PH21328A; US4608364A; GR81550B; DK358384D0; ZA845621B; NZ208960A

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte til fremstilling av et legemiddel av en fysiologisk bærer og en kombinasjon av aktive forbindelser.

Diabetes mellitus er en stoffskifteforstyrrelse, som gir forhøyet blodsukkerspeil som det vesentligste symptom. Den har sin årsak i at bukspyttkjertelformålet insulin ikke frigjøres i tilstrekkelig mengde. Erstatningen av det naturlig forekommende hormonet skjer idag hovedsakelig ved hjelp av insulin fra dyr som isoleres fra kjertler hos slaktedyr, eller ved humant insulin, som er tilgjengelig halvsyntetisk fra svininsulin eller ved hjelp av genteknologiske fremgangsmåter.

Ved anvendelsen av genteknologiske fremgangsmåter har det hittil vært slått inn på to hovedsakelig forskjellige veier: den adskilte syntese av A- og B-kjeder og deres senere kjemiske rekombinering, samt syntesen av preproinsulin, den naturlige forløperen for insulin. I proinsulin-molekylet er A- og B-kjeden knyttet sammen ved et forbindelsesstykke, C-peptidet. Den viktigste funksjonen til dette er den romlige fiksering av begge kjedene i forhold til hverandre etter øyeblikkelig innstilling, slik at det kan finne sted en korrekt folding. Etter at foldingen har skjedd dannes de tre disulfidbroene og stabiliserer derved den naturlige tredimen-sjonale strukturen til insulin. Avspaltingen av C-peptidet skjer ved hjelp av enzymer med trypsin- og karboksypeptidase-B-aktivitet. Spaltingsstedet foregis av en sekvens-lys-arg (foran N-enden til A-kjeden), henholdsvis Arg-Arg (ved C-enden til B-kjeden). Bare det frie insulinet er i besittelse av full biologisk aktivitet, mens en del av det biologiske gjenkjennelsesområdet på overflaten av molekylet sannsynlig-vis er maskert når C-peptidet er tilstede.

Insulinets spesielle kjemiske egenskaper medfører at behandlingen vanligvis skjer parenteralt; hormonet ned-bygges fullstending, for eksempel ved mage/tarm-passering, ennå før det kan få virke. Nedbyggingsreaksjoner, hovedsakelig med forskjellige, forholdsvis uspesifikke proteolyttiske enzymer, finner imidlertid også sted på injeksjonsstedet, og i blodsirkulasjonen. Den korte halveringstiden in vivo på bare ca. 7 minutter som skyldes dette, er de fysiologisk i betydningen av en homeostase i grunnen sinnrik; behandlingen vanskelig-

gjøres imidlertid derved betydelig etter som diabetikeren vanligvis må sette sprøyter fire ganger daglig, som regel kort tid før måltidene.

Det har ifølge dette allerede tidligere vært utført

forsøk som gir insulinet en forlenget virkning. Til alt hell har det derfor hittil foreligget slike fremgarfgs-måter hvorved insulinet overføres i en tungt løselig tilstandsform ved tilsetning av et depothjelpestoff.

Til disse hører fremfor alt toverdige sinkioner, i hvis nærvær insulinet kan foreligge i krystallinsk eller amorph form i nøytralt medium. Tilsetningen av basiske proteiner, f.eks. protaminsulfat eller humanglobin,

har, ettersom insulinet er et surt molekyl med isoelektrisk punkt Pj = 5,4, den samme virkningen: basisk protein og insulin foreligger i det nøytrale området som krystallinsk eller amorpht tungtløselig kompleks av salttype.

Den langsomme frisettingen av insulin fra denne retardtilberedningen\ skjer, som man antok, ved for-

tynning, det vil si diffusjon av enkelte, bestanddeler som bygger opp krystallet eller det amorphe bunnfallet, eller ved proteolyttisk nedbygging av depotbærende i tilfellet med insulinkomplekser med basiske proteiner.

På nytt diskuteres humant proinsulin, enten alene eller

i kombinasjon med de vanlige depottilsetningene, som forsinkelsesprinsipp (se DE-patent søknad 42 42 036) .

Man forestiller seg at den proteolyttiske avspaltingen av C-peptidet in vivo skjer forsinket og dermed det med fullt aktive hormonet frisettes fra det i og for seg biologisk bare lite aktive proinsulinet (ca. 1/8 av aktiviteten til insulin beregnet på proteinmengde).

For anvendelse på mennesker er bare slikt proinsulin akseptabelt som i sin sekvens er identisk med et av de menneskelige proinsuliner (av disse finnes det åpen-bart flere) eller er svært likt med de. Svin- eller storfe-proinsulin er som bekjent immunogene. Den nøyaktige virkningsmåten til proinsulinet forblir imidlertid fortsatt åpen. Det er på ingen måte sikkert at insulin frisettes spesifikt. Tvert imot skjer ned-byggingen in vivo på forskjellige -måter under produksjon av for det meste inaktive bruddstykker. Den terapeutiske nytten av proinsulinet kunne altså heller, om i det hele tatt, være å søke på reseptorplånet.

Nå er diabetesterapien kjennetegnet ved individuelle påvirkningsfaktorer, som forskjeller i anvendelsen av måltider, forskjeller i karakteristikken til underhuds-vev, dessuten imidlertid også de bestemte spisevanene, kroppslig aktivitet og mye mer. Man er altså

nødt til å ha en rekke insulinpreparater med forskjellige virkningskarakteristikk til rådighet for å få en god blodsukkerinnstilling, som er tilpasset de individuelle behov. I sammenheng med ikke-optimal innstilling diskuteres det, ved siden av de umiddelbare subjektive' og objektive virkninger som hyper- eller hypoglykemier, særlig dannelsen av diabetisk senskader. Til disse hører frem for alt Makro- og Mikroangiopathia, Neuropathia, Nephropathia og Retinopathia.

Som preparater som er optimalt tilpasset pasientens behov, har ved siden av rene forsinkelsesinsuliner, fremfor alt såkalte mellomproduktinsuliner vist seg anvendbare. De utgjøres av blandinger av en forsinket og en øyeblikkelig kortvirkende bestanddel. Slike blandinger utgjøres blant annet av kompliserte fler-fasesystemer, som forblir stabile over lang tid bare i forholdsvis snevert begrenset blandingsforhold. Således er eksempelvis en suspensjon av 2-sink-insulin-

krystaller fra svin ikke fritt blandbar med oppløst svineinsulin. Øyeblikkelig eller i tidens løp utfelles det iblandede, oppløste insulin på grunn av det høye sinkinnholdet som er nødvendig for stabiliseringen av krystallene. S;llke blandinger er stabile innenfor snevre grenser når det som oppløst insulin anvendes storfeinsulin (med dette tapes imidlertid artsrenheten,

en medisinsk forønsket egenskap) eller en blanding av oppløst svineinsulin og fenylalanin (B1)-svineinsulin (DE-patent søknad 24 18 218 og DE-patentsøknad 24 59 515). I betraktning av blandbarheten med oppløst insulin er protamininsulin-tilberedninger fordelaktige når krystaller av protamin og insulin i isophane forhold tilsettes som forsinkelsesbestanddel. Med disse preparatene er NPH-typisk virkningsprofil fremstillbar; nærværet

av protaminsulfat som kroppsfremmed, allikevel forholdsvis uskadelig protein som tilsetning synes å være erstattbar.

Formålet ved oppfinnelsen er tilveiebringelsen av et stabilt farmasøytisk middel, som oppviser en virkningskarakteristikk som er tilpasset de individuelle behovene til diabetikeren.

Denne oppgaven er nå< løst ifølge oppfinnelsen ved

en kombinasjon av aktive forbindelser som består av et insulinderivat, hvis B-kjede bærer en organisk gruppe med basisk karakter i C-enden, og et naturlig forekommende insulin, henholdsvis dets Des-Phe -analog.

Insulinderivater, som i C-enden av B-kjeden bærer resten Arg-OH eller Arg-Arg-OH er tidligere beskrevet. Som bekjent oppstår derivatet ved den enzymatiske forandring av proinsulin til insulin in vivo som naturlig mellomprodukt og lar seg også påvise i små andeler i ekstrakter fra bukspytt-kjertel. Den nevnte resten avspaltes vanligvis ved hjelp av trypsin og/eller karboksypeptidase B eller enzymer med lignende spesifisitet under frisetting av det naturlig forekommende insulin.

Ytterligere insulinderivater som er basisk modifisert i C-enden, fremgangsmåter for deres fremstilling og deres anvendelse er gjenstand for NO-patentsøknad nr. 842977.

Oppfinnelsen vedrører følgelig fremgangsmåte til fremstilling av et legemiddel av en fysiologisk bærer og en kombinasjon av aktive forbindelser, kjennetegnet ved at

a) et insulinderivat med formel I

hvori

R<1> betyr H eller H-Phe,

R<30> står for Ala, Thr eller Ser og

R<31> står for cholinrest, Arg, Lys, di- eller tri-peptidrest av Arg- og/eller Lys-enheter, hvor den endestående COOH-gruppen av Arg og Lys også er forestret med cholin eller enverdige alkoholer, eller være amidert med énverdige nitrogenbaser,

med et isoelektrisk punkt mellom 5,8 og 8,5 og

b) et insulin med formel I, hvori

R<1> betyr H eller H-Phe,

R<30> betyr Ala, Thr eller Ser og

R31 betyr OH,

eller fysiologisk tålbare salter herav, samt

c) eventuelt proinsulin eller en proinsulin-analogon og

d) eventuelt C-peptid, og

e) en fysiologisk godtagbar bærer bringes i en egnet terapeutisk administrerbar form ved at mengden av komponent b) utgjør 0-60 vekt-%, c) og d) utgjør 0-40 vekt-%, mengdene a) b) c) og d) er løste eller inneholder amorfe og/eller krystallinske andeler, pH-verdien til ovennevnte blanding innstilles mellom 2,5 og 8,5, virksomme stoffer med bæreren blir bearbeidet til en oppløsning eller suspensjon, idet bæreren inneholder a- ±) et vanlig isotonmiddel, a2) et vanlig konserveringsmiddel, a3) en bufferforbindelse og/eller a4); mellom 0 og 100 pg sink/100 I.U. og/eller andre vanlige hjelpemidler med forsinket virkning. Oppfinnelsen vedrører videre at insulindelen og/eller proinsulindelen og/'eller des-Phe<B1->insulindelen og/eller C-peptiddelen og insirlinderivatet med formel I foreligger i en blanding som inneholder a) oppløste og b) amorfe og/eller krystalline deler, idet sekvensen av insulinderivatene a) og b) tilsvarer formel I samt proinsulin- og C-peptidsekvensen fortrinnsvis denne hos mennesker.

Aminosyreresten X og resten av det tilsvarende derivatet kan uavhengig av hverandre foreligge i D- eller L-konfigurasjonen. Foretrukket er imidlertid L-konfigurasjonen for alle restene.

Genetisk kodende er de følgende L-aminosyrer:

Gly. Ala. Ser. Thr. Val. Len, Ile. Asp. Asn. Glu. Gin. Cvs. Met. Arg, Lys, His, Tyr. Phe. Trp. Pro (nøytrale aminosyrer er understreket).

Med en nøytral forekommende aminosyre forstår man særlig Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asn, Gin, Cys, Met, Tyr, Phe, Pro eller Hyp. Med en basisk, naturlig forekommende aminosyre forstår man særlig Arg, Lys, Hyl, Orn, Cit eller His.

Blant grupper som eventuelt blokkerer en fri karboksylgruppe i C-enden av B-kjeden i insulinderivatet, forstår man fremfor alt ester- og aminogruppen, fortrinnsvis (021-05)-alkoksy, (C3-C6)-cykloalkoksy, NH2 , ( C^- Cq) -alkylamino eller Di-fC!-C6)-alkylamino,

eller basiske grupper, som

amino-(C2 - Cg)-alkoksy, (C2 - C4)-alkylamino - (C2 - Cg)-aikoksy, Di-(Cj - C4)-alkylamino - (C2 - C > a.lkoksy,

Tri-(C1 - C4)-ammonio-(C2 - Cg)-alkoksy, amino-(C2 - Cg)-alkylamino, (Cj <-><C>4)-alkylamino)-(C2 - Cg)-alkylamino, (Di-(Cj - <C>4)-alkylamino)-(C2 - Cg)-alkylamino eller (tri(C1 - C4)alkylammonio)-(C2 - Cg)-alkylamino, særlig

--N0H--(C(CHH22)p)p-N-NRR23, 9-, 0h-v(CoHr 2p ).p-= NR2 3®- , 6-,NH-(CH2) p-NR2 eller

og R er lik eller forskjellig og står for hydrogen eller (C1 - C4)-alkyl.

Fra rekken av insulinderivater med formel I skal eksempelvis nevnes de; nedenfor angitte forbindelser uten at oppfinnelsen begrenses til disse:

B3 Ti

Humaninsulin - Arg -0H

B3 11

Svineinsulin - Arg -0H

B31

Storfeinsulin- Arg -OH

Humaninsulin - Arg -Arg -0H

Storfeinsulin- Arg*5"* ^ -ArgB32-OH

— ... « B31 _ B32 _„

Storfeinsulin — Arg -Arg -0H

Des-Phe<B1> - svineinsulin—-Arg<B31->OH

B1 B31

Des-Phe - humaninsulin-Arg -0H

B1 B31 B3 2

Des-Phe -svineinsulin-Arg -Arg -0H

_ B1 , ... R B31 A B32 _„

Des-Phe -humaninsulin-Arg -Arg -0H

B31

Svineinsulin-Arg -OCH

Humaninsulin-Arg -OCH

B31

Storfeinsulin- Arg - OCU^

Svineinsulin - Arg<B31->Arg <3>iI<->OCH~

B31 B32

Humaninsulin - Arg -Arg -OCH3

Des-ThrB30 - humaninsulin-Val -ArgB32-OCH3 m^ B30 , , . , B30 ^ B31 Des-Thr - humaninsulin-Val -Arg -0H ml- B30 , . „ ,B30 B31 . B32 „„ Des-Thr - humaniinsulin-Val -Ala -Arg -0H

B31

Humaninsulin-Lys -0H

B31

Humaninsulin - D-Arg -0H

B31 B3 2

Humaninsulin - D-Argr -Arg -0H

-. • - B3H _ . B32 _„

Humaninsulin - Arg -D-Arg -0H

■ T T B3i1 » BJ2 _„

Humaninsulin - Lys -Arg -0H

• i • _ B3J1 T B32 ntT

Humaninsulin - Arg -Lys -OH

B31 '

Humaninsulin - Argirainol

B3'1 B3 y

Humaninsulin - Val -Arg -OH

Humaninsulin - Val<B>3i1-Arg<B32->Arg<B33->OH Humaninsulin - Arg B 3» ' 1 -Argininol

Humaninsulin - Lys<5>31-Arg<B3>^-Arg<B33->OH

Humaninsulin Humaninsulin

B31

Humaninsulin - Arg -NH~

B31 B32

Humaninsulin - Arg -Arg -NH~

B31

Humaninsulin - Orn -OH

Humaninsulin - Leu<B31->Cit<B32->OH

Humaninsulin - (B30)-OCH2CH2-NH2

Humaninsulin - (B30)-NH-CH9CH,-NH9

B3 1

Humaninsulin - Arg -0-CH_-CH9-NH„

B31

Humaninsulin - Arg -NH-CH2-CH2~N(CH3)2

Humaninsulin - (B30)-0-CH2-CH2-N(CH3)3

Humaninsulin - (B30) -NH-CH^-CH9-®N (CH).,

B31

Humaninsulin - Leu -0-CH,-CH,-CH,- N (C HJ,

D-n RTO

Humaninsulin - Trp -Trp -Trp -NH(CH2)(nC^Hg)3

Fremstillingen av insulinderivatet med formel I skjer ved at man

a) kondenserer et des-octapeptid (B 23-30)-insulin med formel II, 1 1 hvor R betyr Phe eller en binding og S betyr en protonensolvolyttisk eller ved 3-eliminering av-spaltbar aminobeskyttelsesgruppe slik som tert-butyloksykarbonyl-(Boe), tert-amuloksykarbonyl-(Aoc), eller metylsulfonyl-etyloksykarbonyl-(Msc)-resten, med et peptid; med formel III

hvor R og R har betydningene som er definert ovenfor, S 2 står for hydrogen, Bzl eller Bu t og S<3 >står for en urethanbeskyttelsesgruppe, som Boe, Moe eller Z, idet eventuelt tilstedeværende frie

COOH-, OH-, SH-, w-NH2-, guanidino- og/eller imidazol-grupper i resten R og R3\ om nødvendig, foreligge beskyttet på i og for seg kjent måte, og eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper avspaltes på i og for seg kjent måte,

b) omsetter et Des-B30-insulin med formel I, hvor

R<1> står for H eller H-Phe og R*30 - R31 i C-enden

tilsammen står for OH, i nærvær av trypsin eller en trypsinliknende endo-peptidase med en forbindelse med formel IV

hvor R3^ og R<31> har de ovenfor definerte betydninger og hvor tilstedeværende frie COOH-, OH-, SH, ui-NH2-, guanidino og/eller imidazo-grupper om nødvendig foreligger beskyttet på i og for seg kjent måte,

og hvoretter eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper avspaltes på i og for seg kjent måte, eller

c) for fremstilling av et insulinderivat med amino-syrerester i L-konfigurasjon i resten R 31, spalter

et proinsulin, en proinsulinanalog eller en prepro-insulinanalog eller et mellomprodukt av disse forbindelsene kjemisk og/eller enzymatisk.

De ved fremgangsmåtevarianten b) som utgangsforbindelser anvendte Des-B30-insuliner er kjent f.eks. fra EP-patent-søknad 46 979 eller Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 359

(1978) 799. Det ved variant b) anvendte utgangsmateriale med formel IV fremstilles på i og for seg kjent måte etter fremgangsmåter som er kjent innen peptidkjemien. Brukbar beskyttelsesgruppe for IV er detaljert beskrevet av M. Bodanzky el al., Peptide Synthesis, 2nd Ed.

1976, Wiley & Sons.

Ved hjelp av geneteknologiske fremgangsmåter er bl.a. humant eller primat-proinsulin tilgjengelig som utgangsmateriale for fremgangsmåtevariant c): Derivatet Arg(B31) og Di-Arg(B31-32) er derved tilgjengelig ved enkel nedbrytning med trypsin eller trypsinliknende enzymer. Plasmider som fører til nye insulinderivater ettersom de i stedet for argininet som naturlig befinner

i B31 eller Bj2, koder for andre nøytrale eller basiske aminosyrer, lar seg dessuten forholdsvis* lettvint konstruere.

Fremstillingen av proinsulin under anvendelse av metodikken med rekombinant-DNA krever dannelsen av en DNA-sekvens som koder for aminosyresekvensen til et proinsulin, enten den lar seg oppnå ved isolering, Konstruksjon eller en kombinasjon av begge deler.

Den erholdte proinsulin-DNA innsettes så i lesefase

i en egnet klonings- eller ékspresjonsplasrnid. Plasmidet tjener til transformering av en egnet mikroorganisme og den herved erholdte transformerte mikroorganismen under-kastes så fermenteringsbetmgelser som fører til dannelsen av ytterligere kopier av de proinsulinholdige vektorer og til ekspresjon av proinsulin, et proinsulinderivat eller en proinsulinforløper henholdsvis et preproinsuiinderivat.

Dersom ekspresjonsproduktet dreier seg om en proinsulin-forløper, så inneholder et slikt produkt vanligvis proinsulinaminosekvensen, som ved sin endestaende amino-gruppe er bundet til et fragment av et protein som vanligvis uttrykkes av gensekvensen, og som proinsulinet eller proinsulinderivatet er innsatt ved siden av. Proinsulin-aminosyresekvensen er bundet til proteinrragmentet over et spesifikt spaltbart sted, idet det eksempelvis dreier seg om methionin.

Den erholdte proinsulinaminosyresekvensen avspaltes fra det sammensmeltede genproduktet, eksempelvis slik som beskrevet i DE-patent søknad 32 52 036, og proinsulinet isoleres etter rensing.

Den enzymatiske spaltingen av det på denne maten erholdte proinsulinet eller proinsuiinderivatet skjer analogt med de fremgangsmåtene som er beskrevet i Excerptia Medica International Congress Series No. 2.31, side 292 ff, eller i DE-patent søknad 32 09 184 (HOE 8^/F 047).

Ved hjelp av de beskrevne halvsyntetiske fremgangsmåtene er dermed, i tillegg til de kjente arginin(B30)- og diarginin(B31-32)-derivater samt deres gjennom genteknologiske fremgangsmåter tilgjengelige derivater som

31

bærer naturlige L-aminosyrer i R , en rekke nye insulinderivater tilgjengelige som er kjennetegnet ved en eller flere basiske grupper og/eller fraværet av den frie karboksylgruppen, slik at nettoladningen til molekylet i det minste øker til en positiv ladning mer enn hos naturlig forekommende insulin eller hos

B1

Des-Phe -Insulin.

Til disse hører f.eks. derivater som i posisjon B-31

i stedet for naturlige aminosyrer L-lysin, L-histidin eller L-arginin, har disses D-enantiomerer eller vanlige D- eller L-aminosyre-analoger, som i sidekjeden hår en basisk gruppe (f.eks. ornithin, hydroksylysin). I stedet for en aminosyre kan eksempelvis cholinestergruppen inntre på stedet for posisjon B31, hvorved det netto vinnes to

positive ladninger. Aminosyren eller aminosyreanalogen i posisjon B31, kan ha en slik karboksylende eller være forestret med enverdige alkoholer (f.eks. metanol, etanol), henholdsvis være amidert med enverdige nitrogen-base(f.eks. ammoniakk, mono- eller di- metylamin) ;

de kan dessuten være forestret med f.eks. cholin.

I posisjon B31 kan eksempelvis en nøytral eller også

en ytterligere naturlig basisk aminosyre eller en av de ovenfor beskrevne aminosyrederivatene følge; på analog måte kan dens karboksylgruppe være frie eller forestret, henholdsvis amidert. Det kan eksempelvis også her følge cholinestergruppen henholdsvis nok en ytterligere nøytral eller basisk aminosyre henholdsvis en aminosyre-analog.

Alle disse insulinderivatene har det til felles, at

den eller de ytterligere positive ladning(er)

som befinner seg på overflaten av molekylet gir molekylet et isoelektrisk punkt som er forskjøvet inn i nøytral-området. Alt etter derivat måles ved den isoelektriske fokuseringen isoelektriske punkter fra 5,8 til 8,5 , særlig 6,2 til 8,2. Derved er derivatene mindre opp-løselige i nøytralcmrådet enn naturlig forekommende insulin eller proinsulin som har sitt isoelektriske punkt og dermed området for maksimalt uoppløselighet ved pH = 5,4, mens det vanligvis foreligger oppløst i nøytralområdet.

Som en følge av dette tilveiebringer disse insulin-

i

derivatene ifølge formelen fullstendig nye forsinkelses-prinsipper som kan bringes til å virke uten depotshjelpe-stoffer som sink eller protaminsulfat. Depotvirkningen skriver seg fra et iboende, proteinkjemisk betinget, fysikalsk prinsipp, nemlig tungtløseligheten ved det isoelektriske punktet. Ved oppløsningen under fysiologiske betingelser skulle, som man ville anta, oppnås ved avspalting av den basiske tilleggsgruppen, som alt etter

derivat kommer i stand ved trypsin- eller trypsinliknende, og/eller karboksypeptidase- eller karboksypeptidase B-liknende, og/eller esterase-aktivitet. De avspaltede gruppene enten er rene fysiologiske metabolitter, som aminosyre, ornithin eller cholin, eller også fysiologisk ufarlige, og lett metaboliserbare stoffer.

B31 " Svineinsulin-Arg -OH og dets tilsvarende diarginin-derivat oppviser i undersøkelsen av Chance, Excerpta Medica International Congress Series No. 231, side 29 2,

293 ff bare 62% henholdsvis 66% av aktiviteten til naturlig forekommende svineinsulin.

Det ble overraskende funnet at (også til forskjell fra proinsulin) den biologiske aktiviteten til derivatene er omtrent like stor som hos det naturlig forekommende insulin. De er også til forskjell fra de i litteraturen beskrevne mellomproduktene, som bare inneholder deler av det heterologe C-peptidet, ikke sterkere immunogene enn det tilsvarende insulin selv. Muligens har den ovenfor nevnte, lave verdien til Chance sin årsak i at dette peptidet ikke har foreligget i ren form, eller at målingen var beheftet med en systematisk feil.

Ved siden av anvendelsen av de beskrevne derivatene alene eller i blanding som rene forsinkelsesinsuliner eller i kombinasjon med de kjente depotbærerne, er det nå mulig på mangfoldige måter å fremstille stabile blandinger av insulin som står til rådighet hurtig, f.eks. oppløste andeler. Det er derved tilgjengelig en "palett" av svært fint avstemte virkningsprofiler.

Det kommer særlig på tale med nøytrale blandinger av

en eller flere derivater som virker som retardasjons-bestanddeler, med oppløst, naturlig forekommende insulin,

fortrinnsvis fra den samme arten. Dessuten kan imidlertid også proinsulin og/eller C-peptid, enten alene eller i kombinasjon med insulin, tilsettes som oppløste bestanddeler. Karakteristisk for disse tilberedningene er at de er stabile i ethvert blandingsforhold. Dette er forutsetningen for fremstillingen av de i dagens terapi svært anvendelige, intermediært virkende insulin-preparatene.

Midlet kan også inneholde flere forskjellige insulinderivater med formel I og/eller flere forskjellige insuliner med formel I. Dessuten kan også andre terapeutisk interessante kombinasjoner komme til anvendelse, slik som blandingen av derivat og insulin og/eller proinsulin og/eller Des-Phe B1-insulin og/eller C-peptid i oppløst form eller, i form av NPH-krystaller eller andre vanlig kjente forsinkelsesformer. På denne måten lar bl.a. preparater med svært langvarig virkning pg med differensiert basalprofil seg fremstille. Nettopp ved humaninsulin er dette ønskverdig ettersom virkningsvarigheten til dette ifølge de tidligere erfaringene ikke oppviser en ekte ultraretardasjonsprofil hverken i form av sinkkrystaller eller i form av NPH-krystaller,

slik som de analoge storfeinsulinpreparatene.

Insulin og/eller proinsulin og/eller Des-Phe B1-insulin og/eller C-peptid og insulinderivatene med formel I

kan også anvendes i form av et alkalisalt eller ammoniumsaltet.

Blandingsforholdene mellom naturlig forekommende insulin og/eller proinsulin og/eller Des-Phe B1-insulin og/eller C-peptid og insulinderivat kan variere i området 0 til 99% insulin og 0 til 99% proinsulin og 0 til 99% av fenylalanin-(B1)-insulin og 0-99% C-peptid og 1 til 100% insulinderivat (beregnet av den totale mengde av disse peptider).

En anvendelsesform er også en sur oppløsning, f.eks. av insulinderivatet og insulin eller proinsulin, som har en pH verdi som ligger under det isoelektriske punktet til insulinet.

Foretrukne midler har en pH-verdi mellom 2^.5 og 8,5

og foreligger derved som oppløsning eller suspensjon.

Vanligvis er de beskevne anvendelsesformene blitt opp-

løst henholdsvis suspendert i et vandig medium som i tillegg inneholder et egnet isotoniseringsmiddel, f.eks. glycerol eller koksalt, og et egnet middel mot mikro-

bielle angrep, f.eks. fenol, m-kresol eller p-hydroksy-benzosyre-ester, i egnet dosering. Disse fysiologisk uskadelige bærerne kan i pH-området fra 5,0 til 8,5 i tillegg inneholde et bufferstoff, f.eks. natriumacetat, natriumcitrat, natriumfosfat eller tris-(hydroksymetyl-)amino-metan. Til oppløsning og til innstilling av pH-verdien anvendes det fortynnede syrer, vanligvis saltsyre, eller fortynnete luter, vanligvis natronlut.

B1 Insulindelen og/eller proinsulindelen og/eller Des-Phe insulindelen og/eller C-peptiddelen og andelen med insulinderivatet med formel I kan uavhengig av hverandre foreligge i oppløst, amorph- og/eller krystallinsk form. En vilkårlig del av insulinandelen og/eller proinsulinandelen og/eller Des-Phe-insulinandelen og/eller C-peptidandelen og andelen av insulinderivat med formel I

kan foreligge i krystallinsk form, en ytterligere vilkårlig del av insuVinandelen og/eller proinsulinandelen og/eller .

Des-Phe-insulinandelen og/eller C-peptidandelen og andelen av insulinderivat med formel I kan foreligge i amorph.

form samt resten av insulinandelen og/eller proinsulinet og/eller Des-Phe-insulinandelen og/eller C-peptidandelen og andelen av insulinderivatet med formel I kan foreligge i oppløst form.

Preparatet kan inneholde hjelpemiddel med forsinkende virkning (depot-hjelpemiddel) i egnet mengde slik som protaminsulfat, globin eller sink (0 til 100 ug/100 I.U.).

Dette forsinkelsesprinsippet kan anvendes i kombinasjon

med den totale andelen av aktiv forbindelse eller med deler derav. Det kan også være inkludert flere forskjellige hjelpestoffer méd forsinkende virkning,

Det er ofte fordelaktig å tilsette en passende mengde

av en egnet stabilisator til preparatet som

forhindrer utfellingen av protein ved termisk-mekanisk belastning ved kontakt med forskjellige materialer. Slike stabilisatorer er eksempelvis kjent fra EP-patent søknad 18 609, DE-patent søknad 32 40 177 eller fra WO-patent søknad 83/00288. Eksemplene nedenunder skal tjene -til ytterligere forklaringer av oppfinnelsen, uten at oppfinnelsen begrenser seg til disse.

Eksempel 1:

B31 B3 2

Insulin-Arg -Arg -OH fra svin, som er fremstilt ved trypsinspalting av svine-proinsulin, i nøytral formulering med 40 IE7ml og dettes blandbarhet med 20%, henholdsvis

40% oppløst svineinsulin (40 IE/ml):

I et totalt volum på 10 ml oppløses det med vann:

pH innstilles på 7,3 ved tilsetning av 1 N HC1 henholdsvis 1 N NaOH. Det tilblandes en 40 IE/ml oppløsning av svineinsulin i et liknende eller det samme medium, slik at dennes volummessige andel utgjør 20%, henholdsvis 40%. Ved hjelp av HPLC undersøkes straks og etter 3 måneders lagring ved 4°C det totale innholdet samt innholdet i supernatanten.

Svineinsulin—Arg B3 1 -Arg B3 2-OH skiller seg fra svineinsulin på HPLC. I supernatanten er ikke noe derivat påvisbart, dvs. at den uoppløselige andelen ikke oppløses. Omvendt er ikke noe insulin påvisbart etter vasking av bunnfallet , dvs. insulin felles heller ikke ut.

Eksempel 2;

B31

Svineinsulin-Arg -OH som er fremstilt fra svine-proinsulin ved trypsinspalting, i blanding med 25%

(aktivitet) av oppløst svineproinsulin i nøytral formulering med 40 IE/ml og dettes depot-virkning:

I et totalt volum på 10 ml blander man med vann:

pH innstilles på 7,0 ved tilsetning av 1 N HCl henholdsvis 1 N NaOH.

En slik suspensjon viser på hund depotvirkning som er

lik med virkningen til et depot-sammenlikningspreparat (Optisulin<*R>) Depot CS).

Eksempel 3:

B31 B3 2 Svineinsulin-Arg -Arg -OH, fremstilt fra svineproinsulin ved trypsinspalting, i form av NPH-krystaller i blanding med 25% Des-fenylalanin-(B1)-svineinsulin, som er fremstilt fra svineinsulin ved Edmann nedbrytning, i nøytral formulering med 40 IE/ml og dennes forsinkende virkning.

Man blander i et totalvolum på 10 ml med vann:

Ved tilsetning av 1 N HC1 henholdsvis 1 N NaOH ble

pH innstilt på 7,3.

En slik suspensjon viser på hund et depotliknende virknings-forløp.

Eksempel 4:

Humaninsulin-(B30)-cholinester, fremstilt fra svineinsulin halvsyntetisk • i' blanding med 40% humaninsulin og 20%

(masse) human-C-peptid, i nøytral tilberedning med 40 IE/ml og dennes virkningskarakteristikk av middels lang varighet:

Man blander i et totalvolum på 10 med vann:

pH-verdien ved tilsetning av 1 N HC1 henholdsvis 1 N NaOH innstilt på pH = 7,3.

En slik suspensjon viser på hund en virkningsprofil som er sammenliknbar med et kombinasjonspreparat (f.eks.

(R)

Komb-H-Insulin * R* Hoechst).

Eksempel 5;

B31 B3 2

Humaninsulin-Arg -Lys -OCH^, fremstilt halvsyntetisk fra svineinsulin, i blanding med 50% sinkhumaninsulin-krystaller i en tilberedning med 4 0 IE/ml og dennes forsinkede virkning.

Man blander i et totalvolum på 10 ml med vann:

Ved tilsetning av 1 N HC1 henholdsvis 1 N NaOH ble

pH innstilt på 7,0.

Et slikt preparat har på kaniner (0,4 IE/kg) en utpreget retarderende virkning.

Eksempel 6:

B31

Humaninsulin-Arg -OH i blanding med 30% humaninsulin-B31 B3 2

Arg -Arg -OH, begge fremstilt ved hjelp av trypsinspalting av primat-preproinsulin uttrykket i E.coli, i blanding med 40% krystallinsk NPH-humaninsulin i en tilberedning med 40 IE/ml, og dennes utpregede retarda-sjonsvirkning.

Man blander i et totalt volum på 10 ml med vann:

Ved tilsetning av 1 N NaOH henholdsvis 1 N HC1 ble

pH innstilt på 7,3.

En slik suspensjon viser på kaniner en sterk forsinkende og lenge vedvarende virkning.

Claims

1. Fremgangsmåte til fremstilling av et legemiddel av en fysiologisk bærer og en kombinasjon av aktive forbindelser, karakterisert ved at a) et insulinderivat med formel I hvori R<1> betyr H eller H-Phe, R<30> står for Ala, Thr eller Ser og R<31> står for cholinrest, Arg, Lys, di- eller tri- peptidrest av Arg- og/eller Lys-enheter, hvor den endestående COOH-gruppen av Arg og Lys også er forestret med cholin eller enverdige alkoholer, eller være amidert med enverdige nitrogenbaser, med et isoelektrisk punkt mellom 5,8 og 8,5 og b) et insulin med formel I, hvori R<1> betyr H eller H-Phe, R<30> betyr Ala, Thr eller Ser og R<31> betyr OH, eller fysiologisk tålbare salter herav, samt c) eventuelt proinsulin eller en proinsulin-analogon og d) eventuelt C-peptld, og e) en fysiologisk godtagbar bærer bringes 1 en egnet terapeutisk administrerbar form ved at mengden av komponent b) utgjør 0-60 vekt-?6, c) og d) utgjør 0-40 vekt-#, mengdene a) b) c) og d) er løste eller inneholder amorfe og/eller krystallinske andeler, pH-verdien til ovennevnte blanding innstilles mellom 2,5 og 8,5, virksomme stoffer med bæreren blir bearbeidet til en oppløsning eller suspensjon, idet bæreren inneholder ) et vanlig isotonmiddel, a£) et vanlig konserveringsmiddel, & 2) en bufferforbindelse og/eller a4 ) mellom 0 og 100 pg sink/100 I.U. og/eller andre vanlige hjelpemidler med forsinket virkning.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at insulindelen og/eller proinsulindelen og/eller des-Phe<B1->insulindelen og/eller C-peptiddelen og insulinderivatet med formel I foreligger i en blanding som inneholder a) oppløste og b) amorfe og/eller krystalline deler, idet sekvensen av insulinderivatene a) og b) tilsvarer formel I samt proinsulin- og C-peptidsekvensen fortrinnsvis denne hos mennesker. '