JP4046388B2 - 亜鉛結合が増大したインシュリン誘導体 - Google Patents
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Description
【０００１】
皮下投与されるインシュリンの薬物動態学はその会合作用に依存する。インシュリンは中性の水溶液中でヘキサマー（６量体）を形成する。インシュリンが組織から血流に入り、作用部位に達する場合、それは最初に毛細管の壁を通過しなければならない。モノマーおよびダイマーのインシュリンはこれができるが、ヘキサマーのインシュリンや比較的高分子量の会合体は全くできないか、できてもほんの僅かであると考えられる（Brangeらの「糖尿病のケア」、１３、第９２３〜９５４頁（１９９０年）；Kangらの「糖尿病のケア」、１４、第９４２〜９４８頁（１９９１年))。したがって、ヘキサマーの解離は皮下組織から血流への迅速な通過の前提条件である。
【０００２】
インシュリンの会合および凝集作用はＺｎ2+に影響され、それはヘキサマーを安定化し、中性付近のpHで比較的高分子量の凝集物を生成し、沈殿が起こる。しかしながら、ヒトインシュリンの非緩衝溶液（pH４）への添加剤としてのＺｎ2+は作用プロフィールにほんの僅かしか影響を与えない。そのような溶液は注射時皮下組織において迅速に中和され、インシュリン−亜鉛複合体が生成するが、ヒトインシュリンと亜鉛の自然な結合はヘキサマーおよびより大きな凝集物を安定化するのに不十分である。そのためＺｎ2+の添加によりヒトインシュリンの放出が著しく遅れることはなく、強力な貯留効果が達成される。知られているインシュリンヘキサマーはインシュリンヘキサマー１モルにつき約２モルのＺｎ2+を含有する（BlundellらのAdv. Protein Chem. ２６, 第３２３〜３２８頁（１９７２年))。インシュリンヘキサマー１個につき２個のＺｎ2+イオンがしっかりとインシュリンヘキサマーに結合し、そしてこれらは通常の透析により除去することができない。いわゆる４−亜鉛インシュリン結晶は一般によく知られているが、これらの結晶は平均してインシュリンヘキサマー１モルにつき３モル未満のＺｎ2+しか含有しない（G. D. SmithらのProc. Natl. Acad. Sci. USA：８１、第７０９３〜７０９７頁）。
【０００３】
本発明の目的はヒトインシュリンと比べて増大した亜鉛結合力を有し、インシュリンヘキサマーおよびＺｎ2+を含有する安定な複合体を形成し、そして皮下注射において遅延型作用プロフィールを有するインシュリン誘導体を見い出すことである。
【０００４】
今般、上記の特徴を満たす式Ｉ
【化２】
〔式中、Ｒ1はフェニルアラニン残基または水素原子であり、
Ｒ3は遺伝学的にコード化可能なアミノ酸残基であり、
Ｙは遺伝学的にコード化可能なアミノ酸残基であり、
Ｚはａ） アミノ酸残基Ｈｉｓであるか、または
ｂ） １〜５個のヒスチジン残基を含有する２〜３５個の遺伝学的にコード化可能なアミノ酸残基を有するペプチドであり、
残基Ａ２〜Ａ２０はヒトインシュリン、動物インシュリンまたはインシュリン誘導体のＡ鎖のアミノ酸配列に相当し、そして
残基Ｂ２〜Ｂ２９はヒトインシュリン、動物インシュリンまたはインシュリン誘導体のＢ鎖のアミノ酸配列に相当する〕のインシュリンおよび／またはその生理学的に許容しうる塩を見い出した。
【０００５】
Ｒ1はフェニルアラニン残基であり、
Ｒ3はＡｓｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ａｓｐ、ＧｌｕおよびＧｌｎからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
ＹはＡｌａ、Ｔｈｒ、ＳｅｒおよびＨｉｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
Ｚはａ） アミノ酸残基Ｈｉｓであるか、または
ｂ） １または２個のヒスチジン残基を含有する、４〜７個のアミノ酸残基を有するペプチドである
式Ｉのインシュリンが特に好ましい。
【０００６】
さらに、Ｒ1はフェニルアラニン残基であり、
Ｒ3はＡｓｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ａｓｐ、ＧｌｕおよびＧｌｎからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
ＹはＡｌａ、Ｔｈｒ、ＳｅｒおよびＨｉｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
Ｚはａ） アミノ酸残基Ｈｉｓであるか、または
ｂ） １または２個のヒスチジン残基を含有する、２〜７個のアミノ酸残基を有するペプチドである、
式Ｉのインシュリンが好ましい。
Ｚは１または２個のヒスチジン残基を含有する、１〜５個のアミノ酸残基を有するペプチドである式Ｉのインシュリンが特に好ましい。
【０００７】
Ｒ1はフェニルアラニン残基であり、
Ｒ3はＡｓｎおよびＧｌｙからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
ＹはＴｈｒおよびＨｉｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、そして
Ｚは１または２個のヒスチジン残基を含有する、１〜５個のアミノ酸残基を有するペプチドである式Ｉのインシュリンが特に好ましい。
さらにＲ1はフェニルアラニン残基であり、Ｒ3はグリシン残基であり、Ｙはトレオニン残基であり、そしてＺは１または２個のヒスチジン残基を含有する１〜５個のアミノ酸残基を有するペプチドである式Ｉのインシュリンが好ましい。
【０００８】
ＺはHis His, His His Arg, Ala His His, Ala His His Arg, Ala Ala His His ArgまたはAla Ala His His 配列を有するペプチドである式Ｉのインシュリンが特に好ましい。
ペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列はアミノ酸鎖のＮ−末端以降から表示される。式Ｉの括弧内の記号、例えばＡ１、Ａ６、Ａ７、Ａ１１、Ａ２０、Ｂ１、Ｂ７、Ｂ１９またはＢ３０はインシュリンのＡまたはＢ鎖のアミノ酸残基の位置に相当する。
【０００９】
「遺伝学的にコード化可能な（genetically encodable）アミノ酸残基」なる表現はGly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Proおよびセレノシステインの残基を示す。
動物インシュリンの「残基Ａ２〜Ａ２０」および「残基Ｂ２〜Ｂ２９」なる表現は例えばウシ、ブタまたはニワトリのインシュリンのアミノ酸配列を意味すると理解される。
インシュリン誘導体の「残基Ａ２〜Ａ２０」および「残基Ｂ２〜Ｂ２９」なる表現は他の遺伝学的にコード化可能なアミノ酸によるアミノ酸の置換によって生成するヒトインシュリンの相当するアミノ酸配列を示す。
【００１０】
ヒトインシュリンのＡ鎖は次の配列（配列番号１）：
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu
Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
を有する。
ヒトインシュリンのＢ鎖は次の配列（配列番号２）：
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu
Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr
Thr Pro Lys Thr
を有する。
【００１１】
式Ｉのインシュリン誘導体は様々な遺伝子工学構造物（ＥＰ ０ ４８９ ７８０、ＥＰ ０ ３４７ ７８１、ＥＰ ０ ３６８ １８７、ＥＰ ０ ４５３ ９６９）を用いて微生物において生成することができる。遺伝子工学構造物は大腸菌またはストレプトミセテス科の放線菌のような微生物において発酵中に発現される。
生成したタンパク質は微生物の体内に貯蔵され（ＥＰ ０ ４８９ ７８０）、または発酵溶液中に分泌される。
【００１２】
典型的な式Ｉのインシュリンは、
Gly(A21)−ヒトインシュリン−His(B31)-His(B32)-OH
Gly(A21)−ヒトインシュリン−His(B31)-His(B32)-Arg(B33)-OH
Gly(A21)−ヒトインシュリン−Ala(B31)-His(B32)-His(B33)-OH
Gly(A21)−ヒトインシュリン−Ala(B31)-His(B32)-His(B33)-Arg(B34)-OH
Gly(A21)−ヒトインシュリン−Ala(B31)-Ala(B32)-His(B33)-His(B34)-OH
Gly(A21)−ヒトインシュリン−Ala(B31)-Ala(B32)-His(B33)-His(B34)-Arg(B35)-OH
である。
【００１３】
式Ｉのインシュリン誘導体は主として、標準法に従って位置特異的変異誘起を用いた遺伝子工学技術により製造される。このために、所望の式Ｉのインシュリン誘導体に対する遺伝子構造コードは宿主細胞、好ましくは大腸菌または酵母、特にサッカロミセスセレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)のような細菌において構成および発現され、そして融合タンパク質に対して遺伝子構造のコード化が行われる場合、式Ｉのインシュリン誘導体は融合タンパク質から放出される；同様の方法は例えばＥＰ−Ａ−０ ２１１ ２９９、ＥＰ−Ａ−０ ２２７ ９３８、ＥＰ−Ａ−０ ２２９ ９９８、ＥＰ−Ａ−０ ２８６ ９５６およびＤＥ特許出願Ｐ ３８ ２１ １５９に記載されている。
細胞の破壊後、融合タンパク質部分はハロゲン化シアンを用いて化学的に（ＥＰ−Ａ−０ １８０ ９２０を参照）あるいはリソスタフィンまたはトリプシンを用いて酵素的に（ＤＥ−Ａ−３７ ３９ ３４７を参照）切断されることができる。
【００１４】
次に、インシュリン前駆体は例えばR. C. MarshallおよびA. S. Inglisの「タンパク質の応用化学−便覧」（A. Darbre編）、第４９〜５３頁（１９８６年）に記載の方法に従って酸化的亜硫酸分解に付され、そして例えばG. H. DixonおよびA. C. WardlowのNature, 第７２１〜７２４頁（１９６０年）に記載の方法に従ってチオールの存在下で適当なジスルフィドブリッジの生成を伴って再生される。しかしながら、インシュリン前駆体はまた、直接折りたたむ（fold）ことができる（ＥＰ−Ａ−０ ６００ ３７２；ＥＰ−Ａ−０ ６６８ ２９２）。
Ｃペプチドおよび、もし存在する場合前置配列（式IIのＲ2）は例えばKemmlerらのJ. B. C., 第６７８６〜６７９１頁（１９７１年）に記載の方法に従ってトリプシン分解により除去され、そして式Ｉのインシュリン誘導体はクロマトグラフィー（例えばＥＰ−Ａ−０ ３０５ ７６０）および結晶化のような知られている方法により精製される。
【００１５】
本発明はさらに、インシュリンヘキサマーおよびインシュリンヘキサマー１モルにつき約５〜９モルのＺｎ2+、好ましくはインシュリンヘキサマー１モルにつき５〜７モルのＺｎ2+を含有し、インシュリンヘキサマーは６個の式Ｉのインシュリン分子からなる複合体に関する。
亜鉛とインシュリンヘキサマーの結合はしっかりしているため、インシュリンヘキサマー１モルにつき５〜９モルのＺｎ2+は例えばpH７.４の水性１０mMトリス／ＨＣｌ緩衝液を用いた４０時間の通常の透析により除去することができない。
皮下投与後、式Ｉのインシュリンは本質的に亜鉛を含まない製剤（pH４）の場合、ヒトインシュリンと比べて極めてわずかな作用の遅れを示す。製剤１mlにつき約２０μgのＺｎ2+を加えると、皮下投与後に遅い作用開始が観察される。作用の遅延は好ましくは４０μg／mlのＺｎ2+で観察される。より高い亜鉛濃度はこの効果を高める。
【００１６】
本発明はさらに、式II
Ｒ2−Ｒ1−Ｂ２−Ｂ２９−Ｙ−Ｚ1−Ｇｌｙ−Ａ２−Ａ２０−Ｒ3 (II)
〔式中、Ｒ3およびＹは請求項１〜６の何れかの項記載の式Ｉで定義された通りであり、
Ｒ1はフェニルアラニン残基または共有結合であり、
Ｒ2はａ） 遺伝学的にコード化可能なアミノ酸残基であるか、または
ｂ） ２〜４５個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、そして残基Ａ２〜Ａ２０およびＢ２〜Ｂ２９はヒトインシュリン、動物インシュリンまたはインシュリン誘導体のＡおよびＢ鎖のアミノ酸配列に相当し、そして
Ｚ1は１〜５個のヒスチジン残基を含有する２〜４０個の遺伝学的にコード化可能なアミノ酸残基を有するペプチドである〕のプレプロインシュリンに関する。
式IIのプロインシュリンは式Ｉのインシュリンの製造において中間体として適当である。
好ましい式IIのプロインシュリンはＲ2が２〜２５個のアミノ酸残基を有するペプチドであるものである。
特に好ましい式IIのプロインシュリンはＲ2が２〜１５個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、そしてＭｅｔ、ＬｙｓおよびＡｒｇからなる群より選択されるアミノ酸残基がンルボキシル末端にあるものである。
【００１７】
本発明の式Ｉのインシュリン誘導体および／またはインシュリンヘキサマーとヘキサマー１モルにつき５〜９モルのＺｎ2+を含有する複合体および／またはそれらの生理学的に許容しうる塩（例えばアルカリ金属またはアンモニウム塩）は主に糖尿病、特に真性糖尿病の治療のための薬剤において活性化合物として使用される。
薬剤は好ましくは注射用溶液または懸濁液である；それは少なくとも１種の本発明の式Ｉのインシュリン誘導体および／または複合体および／または少なくとも１種のその生理学的に許容しうる塩を溶解した形態、非晶質および／または結晶質形態、好ましくは溶解した形態で含有する。
【００１８】
薬剤は好ましくは約２.５〜８.５、特に約４.０〜８.５のpHを有し、無菌の水溶液中で適当な等張化剤、適当な保存剤、場合により適当な緩衝剤、好ましくはさらに特定濃度の亜鉛イオンを含有する。活性化合物を除く、薬剤の構成成分のすべては薬物担体溶液を形成する。
式Ｉのインシュリンの溶液を含有する薬剤は２.５〜４.５、特に３.５〜４.５、好ましくは４.０のpHを有する。
式Ｉのインシュリンの懸濁液を含有する薬剤は６.５〜８.５、特に７.０〜８.０、好ましくは７.４のpHを有する。
適当な等張化剤は例えばグリセロール、グルコース、マンニトール、ＮａＣｌ、カルシウム化合物またはマグネシウム化合物、例えばＣａＣｌ2またはＭｇＣｌ2である。
【００１９】
等張化剤および／または保存剤の選択の結果として、インシュリン誘導体またはその生理学的に許容しうる塩の溶解度は弱酸性のpHで影響される。
適当な保存剤は例えばフェノール、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコールおよび／またはｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルである。
特にpHを約４.０〜８.５に調整するのに使用されうる緩衝物質は例えば酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウムである。別法として、生理学的に許容しうる希酸（典型的にはＨＣｌ）またはアルカリ（典型的にはＮａＯＨ）もまた、pHを調整するのに適している。
薬剤がＺｎ2+を含有する場合、Ｚｎ2+含量は１μg〜２mg／ml、特に５μg〜２００μg／mlが好ましい。
【００２０】
本発明の薬剤の作用プロフィールを変えるために、非修飾インシュリン、好ましくはウシ、ブタまたはヒトインシュリン、特にヒトインシュリン、あるいは修飾インシュリン、例えばモノマーのインシュリン、迅速に作用するインシュリンまたはＧｌｙ（Ａ２１）−Ａｒｇ（Ｂ３１）−Ａｒｇ（Ｂ３２）−ヒトインシュリンもまた混合することができる。
好ましい活性化合物濃度は約１〜１５００、さらに好ましくは約５〜１０００、特に約４０〜４００国際単位／mlである。
【００２１】
【実施例】
実施例１
Gly(A21)−ヒトインシュリン−His(B31)-His(B32)-OHの製造
本質的にＵＳ ５,３５８,８５７に記載のようにして発現系の製造を行った。
ベクターｐＩＮＴ ９０ｄおよびｐＩＮＴ ９１ｄ（実施例１７参照）、ＰＣＲプライマーＴＩＲおよびInsu １１もまた、そこに記載されている。これらの４成分を下記のベクター構造物の出発物質として使用する。
最初に、Ｇｌｙ(Ａ２１)に対するコドンをミニプロインシュリンの配列コードに挿入する。これを行うために、ｐＩＮＴ ９１ｄを鋳型として使用し、そしてプライマーＴＩＲおよびInsu ３１を用いてＰＣＲ反応を行う。
Insu ３１（配列番号１０）：
5′TTT TTT GTC GAC CTA TTA GCC GCA GTA GTT CTC CAG CTG 3′
ＰＣＲサイクルは次のようにして行う。最初の１分間は９４℃、次の１分間は５５℃、最後の１分間は７２℃。このサイクルを２５回繰り返し、混合物を７２℃で７分間、次に４℃で一晩インキュベートする。
得られるＰＣＲフラグメントをエタノール中で沈殿させて精製し、乾燥し、そして製造業者の手引に従って制限酵素ＮｃＯ１およびＳａｌ１を使用して制限緩衝液中で消化する。次に、反応混合物をゲル電気泳動により分離し、ＮｃＯ１−プレ−プロインシュリン−Ｓａｌ１フラグメントを単離する。同様に、ＮｃＯ１およびＳａｌ１を使用してプラスミドｐＩＮＴ ９０ｄのＤＮＡを分解し、そしてサルのプロインシュリンフラグメントをこのようにｐＩＮＴ残余プラスミドから放出する。両方のフラグメントをゲル電気泳動により分離し、残余プラスミドＤＮＡを単離する。このＤＮＡをＮｃＯ１−Ｓａｌ１ ＰＣＲフラグメントとリガーゼ反応により反応させる。このようにして得られるプラスミドｐＩＮＴ １５０ｄを大腸菌により形質転換した後、精製し、再び単離する。
【００２２】
プラスミドｐＩＮＴ １５０ｄのＤＮＡをプラスミドｐＩＮＴ ３０２の出発物質として使用する。それは所望のインシュリン変体の製造を可能にする。
プラスミドを構成するために、ＵＳ ５,３５８,８５７に記載の方法（実施例６参照）を採用した。互いに独立している２つのＰＣＲ反応をこのために行い、プラスミドｐＩＮＴ １５０ｄのＤＮＡを鋳型として使用する。一方の反応はプライマー対ＴＩＲおよびｐＩＮＴ Ｂ５（配列番号１１）：
5′GAT GCC GCG GTG GTG GGT CTT GGG TGT GTAG 3′
を使用して行い、他方の反応はプライマー対Insu１１およびｐＩＮＴ Ｂ６（配列番号１２）：
5′A CCC AAG ACC CAC CAC CGC GGC ATC GTG GAG 3′
を使用して行う。
得られるＰＣＲフラグメントは部分的に相補性であるため、第３のＰＣＲ反応においてそれらはＢ３１およびＢ３２の位置により延長されたＧｌｙ（Ａ２１）ミニプロインシュリンについてコード化するフラグメントをもたらす。このフラグメントをＮｃＯ１およびＳａｌ１を使用して分解し、上記のｐＩＮＴ９０ｄ残余プラスミドのＤＮＡとリガーゼ反応により反応させてプラスミドｐＩＮＴ３０２を得る。
【００２３】
このプラスミドを用いて形質転換した大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０をＵＳ ５,２２７,２９３の実施例４に記載のようにして発酵させ、後処理する。（トリプシン分解前の）中間体として得られるプレプロインシュリン誘導体は次のアミノ酸配列を有する：
プレプロインシュリン（配列番号３）：
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe
Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu
Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe
Tyr Thr Pro Lys Thr His His Arg Gly Ile Val Glu
Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
Glu Asn Tyr Cys Gly
【００２４】
プレプロインシュリン１は式IIに相当し、この場合
Ｒ2は１１個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、
Ｒ1はＰｈｅ（Ｂ１）であり、
ＹはＴｈｒ（Ｂ３０）であり、
ＺはHis His Arg(B31〜B33)であり、
Ｒ3はＧｌｙ（Ａ２１）であり、
Ａ２〜Ａ２０はヒトインシュリンのＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０）であり、そして
Ｂ２〜Ｂ２９はヒトインシュリンのＢ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２９）である。
【００２５】
プレプロインシュリン１をＵＳ ５,２２７,２９３に記載のようにして実施例４に従ってトリプシンで分解する。得られる生成物をカルボキシペプチダーゼＢと実施例１１に従って反応させてインシュリン１を得る。インシュリン１は式Ｉに相当し、この場合
Ｒ1はＰｈｅ（Ｂ１）であり、
ＹはＴｈｒ（Ｂ３０）であり、
ＺはHis His(B31〜B32)であり、
Ｒ3はＧｌｙ（Ａ２１）であり、
Ａ２〜Ａ２０はヒトインシュリンのＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０）であり、そして
Ｂ２〜Ｂ２９はヒトインシュリンのＢ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２９）である。
【００２６】
インシュリン１は次のアミノ酸配列を有する：
ジスルフィドブリッジは式Ｉのように形成される。
【００２７】
実施例２
Gly(A21)-ヒトインシュリン-Ala(B31)-His(B32)-His(B33)-Arg(B34)-OHの製造
発現ベクターを実施例１に従って構成する。
プライマー対ＴＩＲおよびｐＩＮＴ Ｂ７（配列番号１３）：
5′GAT GCC GCG GTG GTG CGC GGT CTT GGG TGT GTAG 3′
またはInsu１１およびｐＩＮＴ Ｂ８（配列番号１４）：
5′ACCC AAG ACC GCG CAC CAC CGC GGC ATC GTG GAG 3′
を用いた、互いに独立している２つのＰＣＲ反応において、プラスミドｐＩＮＴ１５０ｄを鋳型として使用する。
両方の反応で得られるＰＣＲフラグメントは部分的に相補性であり、第３のＰＣＲ反応において、所望のインシュリン変体についてコード化する完全配列を与える。反応のフラグメントを酵素ＮｃＯ１およびＳａｌ１で処理し、ＮｃＯ１／Ｓａｌ１が開いたｐＩＮＴ ９０ｄ ＤＮＡの残余プラスミドに連結する。得られるプラスミドｐＩＮＴ ３０３を大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０により形質転換した後、所望のプレ−ミニプロインシュリンの発現の基礎原料として使用する。発酵および後処理は実施例１のようにして行うが、カルボキシペプチダーゼＢ反応は不要である。
【００２８】
得られるプレプロインシュリン誘導体は次のアミノ酸配列を有する：
プレプロインシュリン２（配列番号５）：
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe
Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu
Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe
Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His His Arg Gly Ile Val
Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
【００２９】
プレプロインシュリン２は式IIに相当し、この場合
Ｒ1はＰｈｅ（Ｂ１）であり、
Ｒ2は１１個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、
ＹはＴｈｒ（Ｂ３０）であり、
ＺはAla His His Arg(B31〜B34)であり、
Ｒ3はＧｌｙ（Ａ２１）であり、
Ａ２〜Ａ２０はヒトインシュリンのＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０）であり、そして
Ｂ２〜Ｂ２９はヒトインシュリンのＢ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２９）である。
【００３０】
次に、プレプロインシュリン２をトリプシンと反応させてインシュリン２を得る。インシュリン２は式IIに相当し、この場合
Ｒ1はＰｈｅ（Ｂ１）であり、
ＹはＴｈｒ（Ｂ３０）であり、
ＺはAla His His Arg(B31〜B34)であり、
Ｒ3はＧｌｙ（Ａ２１）であり、
Ａ２〜Ａ２０はヒトインシュリンのＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０）であり、そして
Ｂ２〜Ｂ２９はヒトインシュリンのＢ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２９）である。
【００３１】
インシュリン２は次のアミノ酸配列を有する：
ジスルフィドブリッジは式Ｉのように形成される。
【００３２】
実施例３
Gly(A21)-ヒトインシュリン-Ala(B31)-Ala(B32)-His(B33)-His(B34)-OHの製造
発現ベクターを実施例１に従って構成する。
プライマー対ＴＩＲおよびｐＩＮＴ ３１６ａ（配列番号１５）：
5′GAT GCC GCG ATG ATG CGC CGC GGT CTT GGG TGT GTA G 3′
またはInsu１１およびｐＩＮＴ ３１６ｂ（配列番号１６）：
5′A CCC AAG ACC GCG GCG CAT CAT CGC GGC ATC GTG GAG 3′
を用いた、互いに独立している２つのＰＣＲ反応において、プラスミドｐＩＮＴ１５０ｄを鋳型として使用する。
両方の反応で得られるＰＣＲフラグメントは部分的に相補性であり、第３のＰＣＲ反応において、所望のインシュリン変体についてコード化する完全配列を与える。反応のフラグメントを酵素ＮｃＯ１およびＳａｌ１で処理し、ＮｃＯ１／Ｓａｌ１が開いたｐＩＮＴ ９０ｄ ＤＮＡの残余プラスミドに連結する。得られるプラスミドｐＩＮＴ ３１６を大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０により形質転換した後、所望のプレ−ミニプロインシュリンの発現の基礎原料として使用する。発酵および後処理は実施例１のようにして行うが、カルボキシペプチダーゼＢ反応は不要である。
【００３３】
得られるプレプロインシュリン３は次のアミノ酸配列を有する：
プレプロインシュリン３（配列番号７）：
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe
Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu
Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe
Tyr Thr Pro Lys Thr Ala Ala His His Arg Gly Ile
Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
【００３４】
プレプロインシュリン３は式IIに相当し、この場合
Ｒ1はＰｈｅ（Ｂ１）であり、
Ｒ2は１１個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、
ＹはＴｈｒ（Ｂ３０）であり、
ＺはAla Ala His His Arg(B31〜B35)であり、
Ｒ3はＧｌｙ（Ａ２１）であり、
Ａ２〜Ａ２０はヒトインシュリンのＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０）であり、そして
Ｂ２〜Ｂ２９はヒトインシュリンのＢ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２９）である。
【００３５】
次に、プレプロインシュリン３をトリプシンおよび実施例１１に従ってカルボキシペプチダーゼＢと反応させてインシュリン３を得る。インシュリン３は式Ｉに相当し、この場合
Ｒ1はＰｈｅ（Ｂ１）であり、
ＹはＴｈｒ（Ｂ３０）であり、
ＺはAla Ala His His Arg(B31〜B34)であり、
Ｒ3はＧｌｙ（Ａ２１）であり、
Ａ２〜Ａ２０はヒトインシュリンのＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０）であり、そして
Ｂ２〜Ｂ２９はヒトインシュリンのＢ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２９）である。
【００３６】
インシュリン３は次のアミノ酸配列を有する：
ジスルフィドブリッジは式Ｉのように形成される。
【００３７】
実施例４
実施例２に従って製造したインシュリン２を実施例１１に従ってカルボキシペプチダーゼＢと反応させてインシュリン４を得る。
インシュリン４は式Ｉに相当し、この場合
Ｒ1はＰｈｅ（Ｂ１）であり、
ＹはＴｈｒ（Ｂ３０）であり、
ＺはAla His His(B31〜B33)であり、
Ｒ3はＧｌｙ（Ａ２１）であり、
Ａ２〜Ａ２０はヒトインシュリンのＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０）であり、そして
Ｂ２〜Ｂ２９はヒトインシュリンのＢ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２９）である。
【００３８】
インシュリン４は次のアミノ酸配列を有する：
ジスルフィドブリッジは式Ｉのように形成される。
【００３９】
実施例５
インシュリン誘導体の亜鉛結合
インシュリンの調製液（０.２４３mMのヒトインシュリン、０.１３ＭのＮａＣｌ、０.１％フェノール、８０μg／ml（１.２２mM）のＺｎ2+、１０mMのトリス／ＨＣｌ、pH７.４）を１５℃で１０mMのトリス／ＨＣｌ（pH７.４）に対して４０時間（１６時間および２４時間後に緩衝液交換）透析する。次に透析液を酸性にし、インシュリンの濃度をＨＰＬＣにより測定し、そして亜鉛の濃度を原子吸光分光分析法により測定する。亜鉛の数値はインシュリンを含まない対照バッチの亜鉛含量を使用して補正する。その結果を表１に示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】
実施例６
イヌにおけるヒトインシュリンの作用プロフィールの亜鉛依存性
投与経路：皮下
投与量：０.３IU／kg；調製液のpH４.０
実験１回あたりのイヌの数(ｎ)：６
表２は初期値の％として表される血中グルコースを示す。
【表２】
【００４２】
実施例７
イヌにおけるGly(A21)Ala(B31)His(B32), His(B33), Arg(B34)ヒトインシュリン(インシュリン２）の作用プロフィール
実施例２に従って製造したインシュリン２を次の配合物において使用する：２０mg／mlのグリセロール、２.７mg／mlのｍ−クレゾール、４０IU／mlのインシュリン２。
IUは国際単位を示し、約６ナノモルのインシュリン、例えばヒトインシュリンまたは式Ｉのインシュリンに相当する。pHはＮａＯＨまたはＨＣｌを使用して調整する。
投与経路：皮下
投与量：０.３IU／kg
試験したイヌの数：６
調製液のpH：４.０
表３は始発値の％として表される血中グルコースを示す。
【００４３】
【表３】
【００４４】
実施例８
イヌにおけるGly(A21)Ala(B31)His(B32), His(B33)ヒトインシュリン（インシュリン４）の作用プロフィール
実施例４に従って製造したインシュリン４を実施例７のようにして配合し、使用する。
投与経路：皮下
投与量：０.３IU／kg
ｎ＝６
調製液のpH：４.０
表４は始発値の％として表される血中グルコースを示す。
【００４５】
【表４】
【００４６】
実施例９
イヌにおけるGly(A21)His(B31)，His(B32)ヒトインシュリン（インシュリン１）の作用プロフィール
実施例１に従って製造したインシュリン１を実施例７のようにして配合し、使用する。
投与経路：皮下
投与量：０.３IU／kg
ｎ＝６
調製液のpH：４.０
表５は始発値の％として表される血中グルコースを示す。
【００４７】
【表５】
【００４８】
実施例１０
イヌにおけるGly(A21)Ala(B31)Ala(B32)His(B33)His(B34)ヒトインシュリン（インシュリン３）の作用プロフィール
実施例１に従って製造したインシュリン３を実施例７のようにして配合し、使用する。
投与経路：皮下
投与量：０.３IU／kg
ｎ＝６
調製液のpH：４.０
表６は始発値の％として表される血中グルコースを示す。
【００４９】
【表６】
【００５０】
実施例１１
プレプロインシュリン１からのインシュリンの製造
１個のＡｒｇがＢ鎖のカルボキシ末端にある、実施例１に従って製造した２００mgのインシュリンを９５mlの１０mM ＨＣｌに溶解する。５mlの１Ｍトリス／ＨＣｌ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン；pH８）を加えた後、ＨＣｌまたはＮａＯＨを使用してpHを８に調整する。
０.１mgのカルボキシペプチダーゼＢを加える。９０分後、アルギニンの切断を終了する。ＨＣｌを加えて混合物をpH３.５に調整し、ポンプで逆相カラム（ＰＬＲＰ−Ｓ ＲＰ３００ １０μ、２.５×３０cm、ポリマー ラボラトリーズ アマースト社製）に送り込む。移動相Ａは０.１％トリフルオロ酢酸を含有する水である。相Ｂは０.０９％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリルからなる。カラムを５ml／分の流量で操作する。使用後、カラムを１５０mlのＡで洗浄する。直線勾配の２２.５〜４０％のＢを４００分間使用することにより分別溶離を行う。分析用逆相ＨＰＬＣにより各フラクションを分析し、十分な純度のＤｅｓ−Ａｒｇ−インシュリンを含有するフラクションを合一する。ＮａＯＨを使用してpHを３.５に調整し、アセトニトリルを回転蒸発器で除去する。次に、pHを６.５に設定してＤｅｓ−Ａｒｇ−インシュリンを沈殿させる。沈殿物を遠心分離し、５０mlの水で２回洗浄し、最後に凍結乾燥する。インシュリン１が６０〜８０％の収率で得られる。
【００５１】
【配列表】
【００５２】
【００５３】
【００５４】
【００５５】
【００５６】
【００５７】
【００５８】
【００５９】
【００６０】
【００６１】
【００６２】
【００６３】
【００６４】
【００６５】
【００６６】
皮下投与されるインシュリンの薬物動態学はその会合作用に依存する。インシュリンは中性の水溶液中でヘキサマー（６量体）を形成する。インシュリンが組織から血流に入り、作用部位に達する場合、それは最初に毛細管の壁を通過しなければならない。モノマーおよびダイマーのインシュリンはこれができるが、ヘキサマーのインシュリンや比較的高分子量の会合体は全くできないか、できてもほんの僅かであると考えられる（Brangeらの「糖尿病のケア」、１３、第９２３〜９５４頁（１９９０年）；Kangらの「糖尿病のケア」、１４、第９４２〜９４８頁（１９９１年))。したがって、ヘキサマーの解離は皮下組織から血流への迅速な通過の前提条件である。
【０００２】
インシュリンの会合および凝集作用はＺｎ2+に影響され、それはヘキサマーを安定化し、中性付近のpHで比較的高分子量の凝集物を生成し、沈殿が起こる。しかしながら、ヒトインシュリンの非緩衝溶液（pH４）への添加剤としてのＺｎ2+は作用プロフィールにほんの僅かしか影響を与えない。そのような溶液は注射時皮下組織において迅速に中和され、インシュリン−亜鉛複合体が生成するが、ヒトインシュリンと亜鉛の自然な結合はヘキサマーおよびより大きな凝集物を安定化するのに不十分である。そのためＺｎ2+の添加によりヒトインシュリンの放出が著しく遅れることはなく、強力な貯留効果が達成される。知られているインシュリンヘキサマーはインシュリンヘキサマー１モルにつき約２モルのＺｎ2+を含有する（BlundellらのAdv. Protein Chem. ２６, 第３２３〜３２８頁（１９７２年))。インシュリンヘキサマー１個につき２個のＺｎ2+イオンがしっかりとインシュリンヘキサマーに結合し、そしてこれらは通常の透析により除去することができない。いわゆる４−亜鉛インシュリン結晶は一般によく知られているが、これらの結晶は平均してインシュリンヘキサマー１モルにつき３モル未満のＺｎ2+しか含有しない（G. D. SmithらのProc. Natl. Acad. Sci. USA：８１、第７０９３〜７０９７頁）。
【０００３】
本発明の目的はヒトインシュリンと比べて増大した亜鉛結合力を有し、インシュリンヘキサマーおよびＺｎ2+を含有する安定な複合体を形成し、そして皮下注射において遅延型作用プロフィールを有するインシュリン誘導体を見い出すことである。
【０００４】
今般、上記の特徴を満たす式Ｉ
【化２】
Ｒ3は遺伝学的にコード化可能なアミノ酸残基であり、
Ｙは遺伝学的にコード化可能なアミノ酸残基であり、
Ｚはａ） アミノ酸残基Ｈｉｓであるか、または
ｂ） １〜５個のヒスチジン残基を含有する２〜３５個の遺伝学的にコード化可能なアミノ酸残基を有するペプチドであり、
残基Ａ２〜Ａ２０はヒトインシュリン、動物インシュリンまたはインシュリン誘導体のＡ鎖のアミノ酸配列に相当し、そして
残基Ｂ２〜Ｂ２９はヒトインシュリン、動物インシュリンまたはインシュリン誘導体のＢ鎖のアミノ酸配列に相当する〕のインシュリンおよび／またはその生理学的に許容しうる塩を見い出した。
【０００５】
Ｒ1はフェニルアラニン残基であり、
Ｒ3はＡｓｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ａｓｐ、ＧｌｕおよびＧｌｎからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
ＹはＡｌａ、Ｔｈｒ、ＳｅｒおよびＨｉｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
Ｚはａ） アミノ酸残基Ｈｉｓであるか、または
ｂ） １または２個のヒスチジン残基を含有する、４〜７個のアミノ酸残基を有するペプチドである
式Ｉのインシュリンが特に好ましい。
【０００６】
さらに、Ｒ1はフェニルアラニン残基であり、
Ｒ3はＡｓｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ａｓｐ、ＧｌｕおよびＧｌｎからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
ＹはＡｌａ、Ｔｈｒ、ＳｅｒおよびＨｉｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
Ｚはａ） アミノ酸残基Ｈｉｓであるか、または
ｂ） １または２個のヒスチジン残基を含有する、２〜７個のアミノ酸残基を有するペプチドである、
式Ｉのインシュリンが好ましい。
Ｚは１または２個のヒスチジン残基を含有する、１〜５個のアミノ酸残基を有するペプチドである式Ｉのインシュリンが特に好ましい。
【０００７】
Ｒ1はフェニルアラニン残基であり、
Ｒ3はＡｓｎおよびＧｌｙからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
ＹはＴｈｒおよびＨｉｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、そして
Ｚは１または２個のヒスチジン残基を含有する、１〜５個のアミノ酸残基を有するペプチドである式Ｉのインシュリンが特に好ましい。
さらにＲ1はフェニルアラニン残基であり、Ｒ3はグリシン残基であり、Ｙはトレオニン残基であり、そしてＺは１または２個のヒスチジン残基を含有する１〜５個のアミノ酸残基を有するペプチドである式Ｉのインシュリンが好ましい。
【０００８】
ＺはHis His, His His Arg, Ala His His, Ala His His Arg, Ala Ala His His ArgまたはAla Ala His His 配列を有するペプチドである式Ｉのインシュリンが特に好ましい。
ペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列はアミノ酸鎖のＮ−末端以降から表示される。式Ｉの括弧内の記号、例えばＡ１、Ａ６、Ａ７、Ａ１１、Ａ２０、Ｂ１、Ｂ７、Ｂ１９またはＢ３０はインシュリンのＡまたはＢ鎖のアミノ酸残基の位置に相当する。
【０００９】
「遺伝学的にコード化可能な（genetically encodable）アミノ酸残基」なる表現はGly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Proおよびセレノシステインの残基を示す。
動物インシュリンの「残基Ａ２〜Ａ２０」および「残基Ｂ２〜Ｂ２９」なる表現は例えばウシ、ブタまたはニワトリのインシュリンのアミノ酸配列を意味すると理解される。
インシュリン誘導体の「残基Ａ２〜Ａ２０」および「残基Ｂ２〜Ｂ２９」なる表現は他の遺伝学的にコード化可能なアミノ酸によるアミノ酸の置換によって生成するヒトインシュリンの相当するアミノ酸配列を示す。
【００１０】
ヒトインシュリンのＡ鎖は次の配列（配列番号１）：
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu
Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
を有する。
ヒトインシュリンのＢ鎖は次の配列（配列番号２）：
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu
Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr
Thr Pro Lys Thr
を有する。
【００１１】
式Ｉのインシュリン誘導体は様々な遺伝子工学構造物（ＥＰ ０ ４８９ ７８０、ＥＰ ０ ３４７ ７８１、ＥＰ ０ ３６８ １８７、ＥＰ ０ ４５３ ９６９）を用いて微生物において生成することができる。遺伝子工学構造物は大腸菌またはストレプトミセテス科の放線菌のような微生物において発酵中に発現される。
生成したタンパク質は微生物の体内に貯蔵され（ＥＰ ０ ４８９ ７８０）、または発酵溶液中に分泌される。
【００１２】
典型的な式Ｉのインシュリンは、
Gly(A21)−ヒトインシュリン−His(B31)-His(B32)-OH
Gly(A21)−ヒトインシュリン−His(B31)-His(B32)-Arg(B33)-OH
Gly(A21)−ヒトインシュリン−Ala(B31)-His(B32)-His(B33)-OH
Gly(A21)−ヒトインシュリン−Ala(B31)-His(B32)-His(B33)-Arg(B34)-OH
Gly(A21)−ヒトインシュリン−Ala(B31)-Ala(B32)-His(B33)-His(B34)-OH
Gly(A21)−ヒトインシュリン−Ala(B31)-Ala(B32)-His(B33)-His(B34)-Arg(B35)-OH
である。
【００１３】
式Ｉのインシュリン誘導体は主として、標準法に従って位置特異的変異誘起を用いた遺伝子工学技術により製造される。このために、所望の式Ｉのインシュリン誘導体に対する遺伝子構造コードは宿主細胞、好ましくは大腸菌または酵母、特にサッカロミセスセレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)のような細菌において構成および発現され、そして融合タンパク質に対して遺伝子構造のコード化が行われる場合、式Ｉのインシュリン誘導体は融合タンパク質から放出される；同様の方法は例えばＥＰ−Ａ−０ ２１１ ２９９、ＥＰ−Ａ−０ ２２７ ９３８、ＥＰ−Ａ−０ ２２９ ９９８、ＥＰ−Ａ−０ ２８６ ９５６およびＤＥ特許出願Ｐ ３８ ２１ １５９に記載されている。
細胞の破壊後、融合タンパク質部分はハロゲン化シアンを用いて化学的に（ＥＰ−Ａ−０ １８０ ９２０を参照）あるいはリソスタフィンまたはトリプシンを用いて酵素的に（ＤＥ−Ａ−３７ ３９ ３４７を参照）切断されることができる。
【００１４】
次に、インシュリン前駆体は例えばR. C. MarshallおよびA. S. Inglisの「タンパク質の応用化学−便覧」（A. Darbre編）、第４９〜５３頁（１９８６年）に記載の方法に従って酸化的亜硫酸分解に付され、そして例えばG. H. DixonおよびA. C. WardlowのNature, 第７２１〜７２４頁（１９６０年）に記載の方法に従ってチオールの存在下で適当なジスルフィドブリッジの生成を伴って再生される。しかしながら、インシュリン前駆体はまた、直接折りたたむ（fold）ことができる（ＥＰ−Ａ−０ ６００ ３７２；ＥＰ−Ａ−０ ６６８ ２９２）。
Ｃペプチドおよび、もし存在する場合前置配列（式IIのＲ2）は例えばKemmlerらのJ. B. C., 第６７８６〜６７９１頁（１９７１年）に記載の方法に従ってトリプシン分解により除去され、そして式Ｉのインシュリン誘導体はクロマトグラフィー（例えばＥＰ−Ａ−０ ３０５ ７６０）および結晶化のような知られている方法により精製される。
【００１５】
本発明はさらに、インシュリンヘキサマーおよびインシュリンヘキサマー１モルにつき約５〜９モルのＺｎ2+、好ましくはインシュリンヘキサマー１モルにつき５〜７モルのＺｎ2+を含有し、インシュリンヘキサマーは６個の式Ｉのインシュリン分子からなる複合体に関する。
亜鉛とインシュリンヘキサマーの結合はしっかりしているため、インシュリンヘキサマー１モルにつき５〜９モルのＺｎ2+は例えばpH７.４の水性１０mMトリス／ＨＣｌ緩衝液を用いた４０時間の通常の透析により除去することができない。
皮下投与後、式Ｉのインシュリンは本質的に亜鉛を含まない製剤（pH４）の場合、ヒトインシュリンと比べて極めてわずかな作用の遅れを示す。製剤１mlにつき約２０μgのＺｎ2+を加えると、皮下投与後に遅い作用開始が観察される。作用の遅延は好ましくは４０μg／mlのＺｎ2+で観察される。より高い亜鉛濃度はこの効果を高める。
【００１６】
本発明はさらに、式II
Ｒ2−Ｒ1−Ｂ２−Ｂ２９−Ｙ−Ｚ1−Ｇｌｙ−Ａ２−Ａ２０−Ｒ3 (II)
〔式中、Ｒ3およびＹは請求項１〜６の何れかの項記載の式Ｉで定義された通りであり、
Ｒ1はフェニルアラニン残基または共有結合であり、
Ｒ2はａ） 遺伝学的にコード化可能なアミノ酸残基であるか、または
ｂ） ２〜４５個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、そして残基Ａ２〜Ａ２０およびＢ２〜Ｂ２９はヒトインシュリン、動物インシュリンまたはインシュリン誘導体のＡおよびＢ鎖のアミノ酸配列に相当し、そして
Ｚ1は１〜５個のヒスチジン残基を含有する２〜４０個の遺伝学的にコード化可能なアミノ酸残基を有するペプチドである〕のプレプロインシュリンに関する。
式IIのプロインシュリンは式Ｉのインシュリンの製造において中間体として適当である。
好ましい式IIのプロインシュリンはＲ2が２〜２５個のアミノ酸残基を有するペプチドであるものである。
特に好ましい式IIのプロインシュリンはＲ2が２〜１５個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、そしてＭｅｔ、ＬｙｓおよびＡｒｇからなる群より選択されるアミノ酸残基がンルボキシル末端にあるものである。
【００１７】
本発明の式Ｉのインシュリン誘導体および／またはインシュリンヘキサマーとヘキサマー１モルにつき５〜９モルのＺｎ2+を含有する複合体および／またはそれらの生理学的に許容しうる塩（例えばアルカリ金属またはアンモニウム塩）は主に糖尿病、特に真性糖尿病の治療のための薬剤において活性化合物として使用される。
薬剤は好ましくは注射用溶液または懸濁液である；それは少なくとも１種の本発明の式Ｉのインシュリン誘導体および／または複合体および／または少なくとも１種のその生理学的に許容しうる塩を溶解した形態、非晶質および／または結晶質形態、好ましくは溶解した形態で含有する。
【００１８】
薬剤は好ましくは約２.５〜８.５、特に約４.０〜８.５のpHを有し、無菌の水溶液中で適当な等張化剤、適当な保存剤、場合により適当な緩衝剤、好ましくはさらに特定濃度の亜鉛イオンを含有する。活性化合物を除く、薬剤の構成成分のすべては薬物担体溶液を形成する。
式Ｉのインシュリンの溶液を含有する薬剤は２.５〜４.５、特に３.５〜４.５、好ましくは４.０のpHを有する。
式Ｉのインシュリンの懸濁液を含有する薬剤は６.５〜８.５、特に７.０〜８.０、好ましくは７.４のpHを有する。
適当な等張化剤は例えばグリセロール、グルコース、マンニトール、ＮａＣｌ、カルシウム化合物またはマグネシウム化合物、例えばＣａＣｌ2またはＭｇＣｌ2である。
【００１９】
等張化剤および／または保存剤の選択の結果として、インシュリン誘導体またはその生理学的に許容しうる塩の溶解度は弱酸性のpHで影響される。
適当な保存剤は例えばフェノール、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコールおよび／またはｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルである。
特にpHを約４.０〜８.５に調整するのに使用されうる緩衝物質は例えば酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウムである。別法として、生理学的に許容しうる希酸（典型的にはＨＣｌ）またはアルカリ（典型的にはＮａＯＨ）もまた、pHを調整するのに適している。
薬剤がＺｎ2+を含有する場合、Ｚｎ2+含量は１μg〜２mg／ml、特に５μg〜２００μg／mlが好ましい。
【００２０】
本発明の薬剤の作用プロフィールを変えるために、非修飾インシュリン、好ましくはウシ、ブタまたはヒトインシュリン、特にヒトインシュリン、あるいは修飾インシュリン、例えばモノマーのインシュリン、迅速に作用するインシュリンまたはＧｌｙ（Ａ２１）−Ａｒｇ（Ｂ３１）−Ａｒｇ（Ｂ３２）−ヒトインシュリンもまた混合することができる。
好ましい活性化合物濃度は約１〜１５００、さらに好ましくは約５〜１０００、特に約４０〜４００国際単位／mlである。
【００２１】
【実施例】
実施例１
Gly(A21)−ヒトインシュリン−His(B31)-His(B32)-OHの製造
本質的にＵＳ ５,３５８,８５７に記載のようにして発現系の製造を行った。
ベクターｐＩＮＴ ９０ｄおよびｐＩＮＴ ９１ｄ（実施例１７参照）、ＰＣＲプライマーＴＩＲおよびInsu １１もまた、そこに記載されている。これらの４成分を下記のベクター構造物の出発物質として使用する。
最初に、Ｇｌｙ(Ａ２１)に対するコドンをミニプロインシュリンの配列コードに挿入する。これを行うために、ｐＩＮＴ ９１ｄを鋳型として使用し、そしてプライマーＴＩＲおよびInsu ３１を用いてＰＣＲ反応を行う。
Insu ３１（配列番号１０）：
5′TTT TTT GTC GAC CTA TTA GCC GCA GTA GTT CTC CAG CTG 3′
ＰＣＲサイクルは次のようにして行う。最初の１分間は９４℃、次の１分間は５５℃、最後の１分間は７２℃。このサイクルを２５回繰り返し、混合物を７２℃で７分間、次に４℃で一晩インキュベートする。
得られるＰＣＲフラグメントをエタノール中で沈殿させて精製し、乾燥し、そして製造業者の手引に従って制限酵素ＮｃＯ１およびＳａｌ１を使用して制限緩衝液中で消化する。次に、反応混合物をゲル電気泳動により分離し、ＮｃＯ１−プレ−プロインシュリン−Ｓａｌ１フラグメントを単離する。同様に、ＮｃＯ１およびＳａｌ１を使用してプラスミドｐＩＮＴ ９０ｄのＤＮＡを分解し、そしてサルのプロインシュリンフラグメントをこのようにｐＩＮＴ残余プラスミドから放出する。両方のフラグメントをゲル電気泳動により分離し、残余プラスミドＤＮＡを単離する。このＤＮＡをＮｃＯ１−Ｓａｌ１ ＰＣＲフラグメントとリガーゼ反応により反応させる。このようにして得られるプラスミドｐＩＮＴ １５０ｄを大腸菌により形質転換した後、精製し、再び単離する。
【００２２】
プラスミドｐＩＮＴ １５０ｄのＤＮＡをプラスミドｐＩＮＴ ３０２の出発物質として使用する。それは所望のインシュリン変体の製造を可能にする。
プラスミドを構成するために、ＵＳ ５,３５８,８５７に記載の方法（実施例６参照）を採用した。互いに独立している２つのＰＣＲ反応をこのために行い、プラスミドｐＩＮＴ １５０ｄのＤＮＡを鋳型として使用する。一方の反応はプライマー対ＴＩＲおよびｐＩＮＴ Ｂ５（配列番号１１）：
5′GAT GCC GCG GTG GTG GGT CTT GGG TGT GTAG 3′
を使用して行い、他方の反応はプライマー対Insu１１およびｐＩＮＴ Ｂ６（配列番号１２）：
5′A CCC AAG ACC CAC CAC CGC GGC ATC GTG GAG 3′
を使用して行う。
得られるＰＣＲフラグメントは部分的に相補性であるため、第３のＰＣＲ反応においてそれらはＢ３１およびＢ３２の位置により延長されたＧｌｙ（Ａ２１）ミニプロインシュリンについてコード化するフラグメントをもたらす。このフラグメントをＮｃＯ１およびＳａｌ１を使用して分解し、上記のｐＩＮＴ９０ｄ残余プラスミドのＤＮＡとリガーゼ反応により反応させてプラスミドｐＩＮＴ３０２を得る。
【００２３】
このプラスミドを用いて形質転換した大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０をＵＳ ５,２２７,２９３の実施例４に記載のようにして発酵させ、後処理する。（トリプシン分解前の）中間体として得られるプレプロインシュリン誘導体は次のアミノ酸配列を有する：
プレプロインシュリン（配列番号３）：
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe
Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu
Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe
Tyr Thr Pro Lys Thr His His Arg Gly Ile Val Glu
Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
Glu Asn Tyr Cys Gly
【００２４】
プレプロインシュリン１は式IIに相当し、この場合
Ｒ2は１１個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、
Ｒ1はＰｈｅ（Ｂ１）であり、
ＹはＴｈｒ（Ｂ３０）であり、
ＺはHis His Arg(B31〜B33)であり、
Ｒ3はＧｌｙ（Ａ２１）であり、
Ａ２〜Ａ２０はヒトインシュリンのＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０）であり、そして
Ｂ２〜Ｂ２９はヒトインシュリンのＢ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２９）である。
【００２５】
プレプロインシュリン１をＵＳ ５,２２７,２９３に記載のようにして実施例４に従ってトリプシンで分解する。得られる生成物をカルボキシペプチダーゼＢと実施例１１に従って反応させてインシュリン１を得る。インシュリン１は式Ｉに相当し、この場合
Ｒ1はＰｈｅ（Ｂ１）であり、
ＹはＴｈｒ（Ｂ３０）であり、
ＺはHis His(B31〜B32)であり、
Ｒ3はＧｌｙ（Ａ２１）であり、
Ａ２〜Ａ２０はヒトインシュリンのＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０）であり、そして
Ｂ２〜Ｂ２９はヒトインシュリンのＢ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２９）である。
【００２６】
インシュリン１は次のアミノ酸配列を有する：
【００２７】
実施例２
Gly(A21)-ヒトインシュリン-Ala(B31)-His(B32)-His(B33)-Arg(B34)-OHの製造
発現ベクターを実施例１に従って構成する。
プライマー対ＴＩＲおよびｐＩＮＴ Ｂ７（配列番号１３）：
5′GAT GCC GCG GTG GTG CGC GGT CTT GGG TGT GTAG 3′
またはInsu１１およびｐＩＮＴ Ｂ８（配列番号１４）：
5′ACCC AAG ACC GCG CAC CAC CGC GGC ATC GTG GAG 3′
を用いた、互いに独立している２つのＰＣＲ反応において、プラスミドｐＩＮＴ１５０ｄを鋳型として使用する。
両方の反応で得られるＰＣＲフラグメントは部分的に相補性であり、第３のＰＣＲ反応において、所望のインシュリン変体についてコード化する完全配列を与える。反応のフラグメントを酵素ＮｃＯ１およびＳａｌ１で処理し、ＮｃＯ１／Ｓａｌ１が開いたｐＩＮＴ ９０ｄ ＤＮＡの残余プラスミドに連結する。得られるプラスミドｐＩＮＴ ３０３を大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０により形質転換した後、所望のプレ−ミニプロインシュリンの発現の基礎原料として使用する。発酵および後処理は実施例１のようにして行うが、カルボキシペプチダーゼＢ反応は不要である。
【００２８】
得られるプレプロインシュリン誘導体は次のアミノ酸配列を有する：
プレプロインシュリン２（配列番号５）：
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe
Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu
Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe
Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His His Arg Gly Ile Val
Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
【００２９】
プレプロインシュリン２は式IIに相当し、この場合
Ｒ1はＰｈｅ（Ｂ１）であり、
Ｒ2は１１個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、
ＹはＴｈｒ（Ｂ３０）であり、
ＺはAla His His Arg(B31〜B34)であり、
Ｒ3はＧｌｙ（Ａ２１）であり、
Ａ２〜Ａ２０はヒトインシュリンのＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０）であり、そして
Ｂ２〜Ｂ２９はヒトインシュリンのＢ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２９）である。
【００３０】
次に、プレプロインシュリン２をトリプシンと反応させてインシュリン２を得る。インシュリン２は式IIに相当し、この場合
Ｒ1はＰｈｅ（Ｂ１）であり、
ＹはＴｈｒ（Ｂ３０）であり、
ＺはAla His His Arg(B31〜B34)であり、
Ｒ3はＧｌｙ（Ａ２１）であり、
Ａ２〜Ａ２０はヒトインシュリンのＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０）であり、そして
Ｂ２〜Ｂ２９はヒトインシュリンのＢ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２９）である。
【００３１】
インシュリン２は次のアミノ酸配列を有する：
【００３２】
実施例３
Gly(A21)-ヒトインシュリン-Ala(B31)-Ala(B32)-His(B33)-His(B34)-OHの製造
発現ベクターを実施例１に従って構成する。
プライマー対ＴＩＲおよびｐＩＮＴ ３１６ａ（配列番号１５）：
5′GAT GCC GCG ATG ATG CGC CGC GGT CTT GGG TGT GTA G 3′
またはInsu１１およびｐＩＮＴ ３１６ｂ（配列番号１６）：
5′A CCC AAG ACC GCG GCG CAT CAT CGC GGC ATC GTG GAG 3′
を用いた、互いに独立している２つのＰＣＲ反応において、プラスミドｐＩＮＴ１５０ｄを鋳型として使用する。
両方の反応で得られるＰＣＲフラグメントは部分的に相補性であり、第３のＰＣＲ反応において、所望のインシュリン変体についてコード化する完全配列を与える。反応のフラグメントを酵素ＮｃＯ１およびＳａｌ１で処理し、ＮｃＯ１／Ｓａｌ１が開いたｐＩＮＴ ９０ｄ ＤＮＡの残余プラスミドに連結する。得られるプラスミドｐＩＮＴ ３１６を大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０により形質転換した後、所望のプレ−ミニプロインシュリンの発現の基礎原料として使用する。発酵および後処理は実施例１のようにして行うが、カルボキシペプチダーゼＢ反応は不要である。
【００３３】
得られるプレプロインシュリン３は次のアミノ酸配列を有する：
プレプロインシュリン３（配列番号７）：
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe
Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu
Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe
Tyr Thr Pro Lys Thr Ala Ala His His Arg Gly Ile
Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
【００３４】
プレプロインシュリン３は式IIに相当し、この場合
Ｒ1はＰｈｅ（Ｂ１）であり、
Ｒ2は１１個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、
ＹはＴｈｒ（Ｂ３０）であり、
ＺはAla Ala His His Arg(B31〜B35)であり、
Ｒ3はＧｌｙ（Ａ２１）であり、
Ａ２〜Ａ２０はヒトインシュリンのＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０）であり、そして
Ｂ２〜Ｂ２９はヒトインシュリンのＢ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２９）である。
【００３５】
次に、プレプロインシュリン３をトリプシンおよび実施例１１に従ってカルボキシペプチダーゼＢと反応させてインシュリン３を得る。インシュリン３は式Ｉに相当し、この場合
Ｒ1はＰｈｅ（Ｂ１）であり、
ＹはＴｈｒ（Ｂ３０）であり、
ＺはAla Ala His His Arg(B31〜B34)であり、
Ｒ3はＧｌｙ（Ａ２１）であり、
Ａ２〜Ａ２０はヒトインシュリンのＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０）であり、そして
Ｂ２〜Ｂ２９はヒトインシュリンのＢ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２９）である。
【００３６】
インシュリン３は次のアミノ酸配列を有する：
【００３７】
実施例４
実施例２に従って製造したインシュリン２を実施例１１に従ってカルボキシペプチダーゼＢと反応させてインシュリン４を得る。
インシュリン４は式Ｉに相当し、この場合
Ｒ1はＰｈｅ（Ｂ１）であり、
ＹはＴｈｒ（Ｂ３０）であり、
ＺはAla His His(B31〜B33)であり、
Ｒ3はＧｌｙ（Ａ２１）であり、
Ａ２〜Ａ２０はヒトインシュリンのＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０）であり、そして
Ｂ２〜Ｂ２９はヒトインシュリンのＢ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２９）である。
【００３８】
インシュリン４は次のアミノ酸配列を有する：
【００３９】
実施例５
インシュリン誘導体の亜鉛結合
インシュリンの調製液（０.２４３mMのヒトインシュリン、０.１３ＭのＮａＣｌ、０.１％フェノール、８０μg／ml（１.２２mM）のＺｎ2+、１０mMのトリス／ＨＣｌ、pH７.４）を１５℃で１０mMのトリス／ＨＣｌ（pH７.４）に対して４０時間（１６時間および２４時間後に緩衝液交換）透析する。次に透析液を酸性にし、インシュリンの濃度をＨＰＬＣにより測定し、そして亜鉛の濃度を原子吸光分光分析法により測定する。亜鉛の数値はインシュリンを含まない対照バッチの亜鉛含量を使用して補正する。その結果を表１に示す。
【００４０】
【表１】
実施例６
イヌにおけるヒトインシュリンの作用プロフィールの亜鉛依存性
投与経路：皮下
投与量：０.３IU／kg；調製液のpH４.０
実験１回あたりのイヌの数(ｎ)：６
表２は初期値の％として表される血中グルコースを示す。
【表２】
実施例７
イヌにおけるGly(A21)Ala(B31)His(B32), His(B33), Arg(B34)ヒトインシュリン(インシュリン２）の作用プロフィール
実施例２に従って製造したインシュリン２を次の配合物において使用する：２０mg／mlのグリセロール、２.７mg／mlのｍ−クレゾール、４０IU／mlのインシュリン２。
IUは国際単位を示し、約６ナノモルのインシュリン、例えばヒトインシュリンまたは式Ｉのインシュリンに相当する。pHはＮａＯＨまたはＨＣｌを使用して調整する。
投与経路：皮下
投与量：０.３IU／kg
試験したイヌの数：６
調製液のpH：４.０
表３は始発値の％として表される血中グルコースを示す。
【００４３】
【表３】
実施例８
イヌにおけるGly(A21)Ala(B31)His(B32), His(B33)ヒトインシュリン（インシュリン４）の作用プロフィール
実施例４に従って製造したインシュリン４を実施例７のようにして配合し、使用する。
投与経路：皮下
投与量：０.３IU／kg
ｎ＝６
調製液のpH：４.０
表４は始発値の％として表される血中グルコースを示す。
【００４５】
【表４】
実施例９
イヌにおけるGly(A21)His(B31)，His(B32)ヒトインシュリン（インシュリン１）の作用プロフィール
実施例１に従って製造したインシュリン１を実施例７のようにして配合し、使用する。
投与経路：皮下
投与量：０.３IU／kg
ｎ＝６
調製液のpH：４.０
表５は始発値の％として表される血中グルコースを示す。
【００４７】
【表５】
実施例１０
イヌにおけるGly(A21)Ala(B31)Ala(B32)His(B33)His(B34)ヒトインシュリン（インシュリン３）の作用プロフィール
実施例１に従って製造したインシュリン３を実施例７のようにして配合し、使用する。
投与経路：皮下
投与量：０.３IU／kg
ｎ＝６
調製液のpH：４.０
表６は始発値の％として表される血中グルコースを示す。
【００４９】
【表６】
実施例１１
プレプロインシュリン１からのインシュリンの製造
１個のＡｒｇがＢ鎖のカルボキシ末端にある、実施例１に従って製造した２００mgのインシュリンを９５mlの１０mM ＨＣｌに溶解する。５mlの１Ｍトリス／ＨＣｌ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン；pH８）を加えた後、ＨＣｌまたはＮａＯＨを使用してpHを８に調整する。
０.１mgのカルボキシペプチダーゼＢを加える。９０分後、アルギニンの切断を終了する。ＨＣｌを加えて混合物をpH３.５に調整し、ポンプで逆相カラム（ＰＬＲＰ−Ｓ ＲＰ３００ １０μ、２.５×３０cm、ポリマー ラボラトリーズ アマースト社製）に送り込む。移動相Ａは０.１％トリフルオロ酢酸を含有する水である。相Ｂは０.０９％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリルからなる。カラムを５ml／分の流量で操作する。使用後、カラムを１５０mlのＡで洗浄する。直線勾配の２２.５〜４０％のＢを４００分間使用することにより分別溶離を行う。分析用逆相ＨＰＬＣにより各フラクションを分析し、十分な純度のＤｅｓ−Ａｒｇ−インシュリンを含有するフラクションを合一する。ＮａＯＨを使用してpHを３.５に調整し、アセトニトリルを回転蒸発器で除去する。次に、pHを６.５に設定してＤｅｓ−Ａｒｇ−インシュリンを沈殿させる。沈殿物を遠心分離し、５０mlの水で２回洗浄し、最後に凍結乾燥する。インシュリン１が６０〜８０％の収率で得られる。
【００５１】
【配列表】
Claims (12)
- 式Ｉ
Ｒ3は遺伝学的にコード化可能なアミノ酸残基であり、
Ｙは遺伝学的にコード化可能なアミノ酸残基であり、
ＺはHis His, His His Arg, Ala His His, Ala His His Arg, Ala Ala His His ArgまたはAla Ala His His 配列を有するペプチドであり、
残基Ａ２〜Ａ２０はヒトインシュリンまたは動物インシュリンのＡ鎖のアミノ酸配列に相当し、そして
Ｂ２〜Ｂ２９はヒトインシュリンまたは動物インシュリンのＢ鎖のアミノ酸配列に相当する〕のインシュリンまたはその生理学的に許容しうる塩。 - Ｒ1はフェニルアラニン残基であり、
Ｒ3はＡｓｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ａｓｐ、ＧｌｕおよびＧｌｎからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
ＹはＡｌａ、Ｔｈｒ、ＳｅｒおよびＨｉｓからなる群より選択されるアミノ酸残基である、請求項１記載の式Ｉのインシュリン。 - Ｒ1はフェニルアラニン残基であり、
Ｒ3はＡｓｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ａｓｐ、ＧｌｕおよびＧｌｎからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
ＹはＡｌａ、Ｔｈｒ、ＳｅｒおよびＨｉｓからなる群より選択されるアミノ酸残基である、請求項１記載の式Ｉのインシュリン。 - Ｒ1はフェニルアラニン残基であり、
Ｒ3はＡｓｎおよびＧｌｙからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
ＹはＴｈｒおよびＨｉｓからなる群より選択されるアミノ酸残基である、請求項１〜３の何れかの項記載の式Ｉのインシュリン。 - Ｒ1はフェニルアラニン残基であり、Ｒ3はグリシン残基であり、Ｙはトレオニン残基である、請求項１記載の式Ｉのインシュリン。
- インシュリンヘキサマーおよびインシュリンヘキサマー１モルにつき５〜９モルのＺｎ2+を含有し、インシュリンヘキサマーは請求項１〜５の何れかの項記載の式Ｉのインシュリン分子６個からなる複合体。
- 有効量の請求項１〜５の何れかの項記載の少なくとも１種の式Ｉのインシュリンおよび／または少なくとも１種の式Ｉのインシュリンの生理学的に許容しうる塩を溶解した形態、非晶質および／または結晶質形態で含有する薬剤。
- 追加的に１μg〜２mg／mlの亜鉛を含有する請求項７記載の薬剤。
- ２.５〜８.５のpHを有する請求項７または８記載の薬剤。
- ２.５〜４.５のpHを有する請求項７〜９の何れかの項記載の薬剤。
- 追加的にＧｌｙ（Ａ２１）−Ａｒｇ（Ｂ３１）−Ａｒｇ（Ｂ３２）−ヒトインシュリンを含有する請求項７〜１０の何れかの項記載の薬剤。
- 式II
Ｒ2−Ｒ1−Ｂ２−Ｂ２９−Ｙ−Ｚ1−Ｇｌｙ−Ａ２−Ａ２０−Ｒ3 (II)
〔式中、Ｒ3およびＹは請求項１〜５の何れかの項記載の式Ｉで定義された通りであり、
Ｒ1はフェニルアラニン残基または共有結合であり、
Ｒ2は１１個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、そこでＡｒｇであるアミノ酸残基はカルボキシル末端にあり、そして
残基Ａ２〜Ａ２０およびＢ２〜Ｂ２９はヒトインシュリンまたは動物インシュリンのＡおよびＢ鎖のアミノ酸配列に相当し、そして
Ｚ1は His His Arg, Ala His His ArgまたはAla Ala His His Arg配列を有するペプチドである〕のプロインシュリン。
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