CZ237097A3 - Inzulinové deriváty se zvýšenou schopností vázat zinek - Google Patents

Inzulinové deriváty se zvýšenou schopností vázat zinek Download PDF

Info

Publication number
CZ237097A3
CZ237097A3 CZ972370A CZ237097A CZ237097A3 CZ 237097 A3 CZ237097 A3 CZ 237097A3 CZ 972370 A CZ972370 A CZ 972370A CZ 237097 A CZ237097 A CZ 237097A CZ 237097 A3 CZ237097 A3 CZ 237097A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
insulin
amino acid
ala
residue
gly
Prior art date
Application number
CZ972370A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ292274B6 (cs
Inventor
Johann Dr. Ertl
Paul Dr. Habermann
Karl Dr. Geisen
Gerhard Dr. Seipke
Original Assignee
Hoechst Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Aktiengesellschaft filed Critical Hoechst Aktiengesellschaft
Publication of CZ237097A3 publication Critical patent/CZ237097A3/cs
Publication of CZ292274B6 publication Critical patent/CZ292274B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Vynález se týká nových derivátů inzulínu, kter^- yý^cQ-Q \
zuji zvýšenou schopnost vázat zinek.
Dosavadní stav techniky (i Mi i 5 «
Farmakokinetika subkutánně aplikovaného inzulínu zá^o visí na asociačním chování inzulínu. Inzulín tvoří v 'nestra’ ním vodném roztoku hexamer. Když má inzulín dospět z tkáně do krevního řečiště a odtud na místo účinku, musí inzulín nejdříve projít stěnami kapilár. Předpokládá se, že takový průchod stěnami kapilár je možný pouze pro monomerní a dimerní inzulín, avšak v omezeného míře k němu dochází nebo k němu nedochází vůbec v případě hexamerního inzulínu nebo v případě jeho vysokomolekulárních asociátů (Brange a kol., Diabetes Care: 13 (1990), strany 923-954; Kang a kol., Diabetes Care:
(1991), strany 942-948). Disociace hexameru inzulínu jě proto nezbytným předpokladem pro rychlý přechod, inzulínu ze subkutánní tkáně do krevního řečiště.
Asociační a agregační chování inzulínu je ovlivněno zinečnatými ionty (2n++), jejichž přítomnost vede ke stabilizaci hexameru inzulínu a při hodnotách pH okolo neutrální oblasti k tvorbě vysokomolekulárních agregátů a až k vysrážení . Zinečnaté ionty přidané k nepufrovanému roztoku lidského inzulínu (pH 4) však ovlivňují profil účinku inzulínu jen velmi málo. I když je takový roztok po injekci v subkutánní tkáni rychle neutralizován a dochází k tvorbě komplexu zinek-inzulín, nepostačuje přirozená schopnost lidského inzulínu vázat zinek ke stabilizaci hexameru a vyšších agregátů inzulínu.
Proto není uvolňování lidského inzulínu přidánímzinečnatých iontů nikterak významně zpomaleno nebo oddáleno a nedochází v tomto případě k dosažení silného depotního účinku. Známé ** /
inzulínové hexamery vykazují obsah zinku odpovídající asi 2 molům Zn++ na mol inzulínového hexameru (Blundell a kol., Adv.Protein Chem.:26(1972), strany 323-328). Dva zinečnaté ionty jsou pevně vázány k inzulínovému hexameru a nemohou být odděleny obvykloudialýzou. Byly sice popsány tak zvané 4-zinek inzulínové krystaly, avšak tyto krystaly v průměru obsahují méně než tři moly Zn na mol inzulínového hexameru {G.D.
Smith a kol., Proč.Nati.Acad.Sci. USA: 81, strany 7093-7097).
Cílem vynálezu je nalézt inzulínové deriváty, které by vykazovaly zvýšenou schopnost vázat zinek, které by tvořily stabilní komplex obsahující inzulínový hexamer a Zn++ a které by rovněž vykazovaly prolongovaný profil účinku při subkutánní injekci a to ve srovnání s lidským inzulínem.
Podstata vynálezu
Nyní byly nalezeny inzulíny obecného vzorce I
(A 20) Cys— r3-oh (O (B 1) •Cys(B7)
Cys— (B19) y-2 (B 30) nebo/a fyziologicky přijatelné solí inzulínů obecného vzorce
I, které splňují výše uvedená kritéria, přičemž v uvedeném obecném vzorci I
R1 znamená fenylalaninový zbytek nebo atom vodíku, znamená geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek,
Y znamená geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek, znamená a) aminokyselinový zbytek His nebo
b) peptid se 2 až 35 geneticky kódovatelnými aminokyselinovými zbytky obsahující 1 až 5 histidinových zbytků, a zbytky A2 až A20 odpovídají aminokyselinové sekvenci A-řetězce lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo inzulínového derivátu a zbytky B2 až B29 odpovídají aminokyselinové sek věnci B-řetězce lidského inzulínu, zvířevího inzulínu nebo inzulínového derivátu.
Obzvláště výhodný je inzulín obecného vzorce I, ve kte rém
R znamená fenylalaninový zbytek,
R znamená aminokyselinový zbytek z množiny zahrnující
Asn, Gly, Ser, Thr, Ala, Asp, Glu a Gin,
Y znamená aminokyselinový zbytek z množiny zahrnující Ala, Thr, Ser a His,
Z znamená a) aminokyselinový zbytek His nebo
b) peptid se 4 až 7 aminokyselinovými zbytky obsahující 1 nebo 2 histidinové zbytky.
Dále je výhodný inzulín obecného vzorce I, ve kterém r! znamená fenylalaninový zbytek,
R^ znamená aminokyselinový zbytek z množiny zahrnující
Asn, Gly, Ser, Thr, Ala, Asp, Glu a Gin,
Y znamená aminokyselinový zbytek z množiny zahrnující Ala, Thr, Ser a His,
Z znamená a) aminokyselinový zbytek His nebo
b) peptid se 2 až 7 aminokyselinovými zbytky . obsahující 1 nebo 2 histidinové zbytky.
Obzvláště výhodný je inzulín obecného vzorce I, ve kte rém rem
R1 znamená peptid s 1 až 5 aminokyselinovými zbytky obsahující 1 nebo 2 histidinové zbytky.
Zejména výhodný je inzulín obecného vzorce I, ve kteznamená fenylalaninový zbytek, znamená aminokyselinový zbytek z množiny zahrnující
Asn a Gly, znamená aminokyselinový zbytek z množiny zahrnující
Thr a His a znamená peptid s 1 až 5 aminokyselinovými zbytky obsahu jící 1 nebo 2 histidinové zbytky.
Dále je výhodný inzulín obecného vzorce I, ve kterém znamená fenylalaninový zbytek, R^ znamená glycinový zbytek,
Y znamená threoninový zbytek a Z znamená peptid s 1 až 5 aminokyselinovými zbytky obsahující 1 nebo 2 histidinové zbytky.
Mimořádně výhodný je inzulín obecného vzorce I, ve kterém Z znamená peptid se sekvencí His His,His His Arg, Ala His His, Ala His His Arg, Ala Ala His His Arg nebo Ala Ala His·; His
Aminokyselinová sekvence peptidů a proteinů je popsána od N-konce aminokyselinového řetězce. Údaje uvedené v obecném vzorci I v závorkách, například AI, A6, A7, ATI, A20, B1, B7, B19 nebo B30, odpovídají poloze aminokyselinových zbytků v Anebo B-řetězci inzulínu.
Výraz geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek znamená zbytky aminokyselin Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp,
Pro a selenocystein.
Pod pojmem zbytky A2 až A20 a zbytky B2 aŽ B29 zvířecího inzulínu se například rozumí aminokyselinové sekvence inzulínu z hovězího dobytka, prasat nebo slepic.
Výraz zbytky A2 až A20 a B2 až B29 inzulínových deri5 vátů znamená odpovídající aminokyselinové sekvence lidského inzulínu, které byly vytvořeny výměnou aminokyselin jinými geneticky kódovatelnými aminokyselinami.
A-Řetězec lidského inzulínu má následující sekvenci (SEQ ID n°1):
Gly, Ile, Val, Glu, Gin, Cys, Cys, Thr, Ser, Ile, Cys, Ser,
Leu, Tyr, Gin, Leu, Glu, Asn, Tyr, Cys, Asn.
B-řetězec lidského inzulínu má následující sekvenci
(SEQ ID n°2) :
Phe, Val, Asn, Gin, His, Leu, Cys, Gly, Ser, His, Leu, Val,
Glu, Ala, Leu, Tyr, Leu, Val, Cys, Gly, Glu, Arg, Gly, Phe,
Phe, Tyr, thr, Pro, Lys, Thr.
Inzulínový derivát obecného vzorce I může být získán pomocí množiny geneticko-inženýrských konstruktů v mikroorganismech (EP 0 489 780, EP 0 347 781, EP 0 368 187, EP 0 453 969). Tyto konstrukty se exprimují v mikroorganismech, jakými jsou Escherichia coli nebo Streptomyceten v průběhu fermentace. Vytvořené proteiny se uloží uvnitř mikroorganismů (EP 0 489 780) nebo se vyloučí do fermentačního roztoku.
Příkladnými inzuliny obecného vzorce I jsou:
Gly(A21}-lidský Gly(A21)-lidský Gly(A21)-lidský Gly(A21)-lidský Gly(A21)-lidský Gly(A21)-lidský
Arg(B35)-OH.
inzulin-His(B31)-His(B32)-OH, inzulin-His(B31)-His(B32)-Arg(B33)-OH, inzulin-Ala(B31)-His(B32)-His(B33)-OH, inzulin-Ala(B31)-His(B32)-His(B33)-Arg(B34)-OH, inzulin-Ala(B31 )-Ala(B32)-His.(B33)-His(B34)-OH, inzulin-Ala(B31)-Ala(B32)-His(B33)-His(B34)Příprava inzulínových derivátů obecného vzorce I se hlavně provádí genotechnologicky prostřednictvím lokálně řízené (site-diredted) mutageneze za použití standardních metod. Za tím účelem se konstruuje genová struktura kódující požado6 vany inzulínový derivát, která se přivede k expresi v hostitelské buňce, výhodně v bakterii, jakou je Escherichia coli, nebo ve kvasince, a v případě, že uvedená struktura kóduje fuzní protein, uvolní se z fuzního proteinu inzulínový derivát obecného vzorce I; analogické metody jsou například popsané v EP-A-0 211 299, EP-A-0 227 938, EP-A-0 229 998, EP-A-0 286 956 a v DE-patentové přihlášce P 38 21 159.
Odštěpení podílu tvořeného fuzním proteinem se provede po otevření buňky bučí chemicky pomocí halogenkyanu (o tom viz EP-A-0 180 920) nebo enzymaticky za použití lysostaphinu nebo trypsinu (o tom viz DE-A-37 39 347.
Inzulínový prekurzor se potom podrobí oxidační sulfitolýze, popsané například v: R.C. Marscha.il a A.S. Inglís, Practical Protein Chemistry - A Handbook (nakl. A.Darbre) 1986, strany 49 až 53, načež se renaturuje v přítomnosti thiolu za tvorby přesných disulfidových můstků, například metodou popsanou G.H.Dixon-em a A.C.Wardlow-em v Nátuře (1960), strany 721 až 724.
Inzulínové prekurzory mohou však být také složeny přímo (EP-A-0 600 372, EP-A-0 668 292).
C-Peptid a presekvence (R ve vzorci II) v případě, že je přítomna, se potom odstraní tryptickým štěpením, například za použití metody Kemmler-a a kol. popsané v J.B.C. ¢1971), strany 6786-6791, a získaný inzulínový derivát obecného vzorce I se přečistí za použití známých technik, mezi které patří například chromatografie (například EP-A-0 305 760)a krystalizace.
Vynález se dále týká komplexů obsahujících inzulínový hexamer a asi 5 až 9 molů zinku na mol inzulínového hexameru, výhodně 5 až 7 molů Zn na mol inzulínového hexameru, přičemž inzulínový hexamer je tvořen šesti inzulínovými molekulami obecného vzorce I.
Vazba zinku k inzulínovému hexameru je tak pevná, že až 9 molů Zn++ na mol inzulínového hexameru nelze odstranit po 40 hodinách obvyklé dialýzy, prováděné například vodným 1 OmM Tris/HCl-pufrem, pH 7,4.
Inzulíny obecného vzorce I vykazují po subkutánní aplikaci v případe, že se nachází ve formě přípravku v podstatě prostého zinku ( pH 4), pouze nepatrné prolongování účinku
2+ ve srovnání s lidským inzulínem. Po přidání asi 20/Ug Zn /ml přípravku lze po subkutánní aplikaci pozorovat pozdější nástup účinku inzulínu. K protrahování účinku dochází výhodně při přítomnosti 40/Ug Zn /ml. Vyšší koncentrace zinku tento účinek ještě zesilují.
Vynález se dále týká preproinzulinu obecného vzorce II
R2-R1-B2-B29-Y-Z1-Gly-A2-A20-R3 (II) ve kterém R3 a Y mají významy uvedené pro obecný vzorec I podle jednoho nebo několika nároků 1 až 6 a znamená fenylalaninový zbytek nebo kovaientní vazbu,
R znamená a) geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek nebo
b) peptid se 2 až 45 aminokyselinovými zbytky a zbytky A2-A20 a B2-B29 odpovídají aminokyselinovým sekvencím A- a B-řetězce lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo inzulínového derivátu, a
Z^ znamená peptid se 2 až 40 geneticky kódovatelnými aminokyselinovými zbytky s 1 až 5 histidinovými (His) zbytky.
Proinzulin obecného vzorce II je vhodný jako meziprodukt při přípravě inzulínů obecného vzorce I.
Obzvláště výhodnými jsou proinzuliny obecného vzorce II, ve kterém R znamená peptid se 2 až 15 aminokyselinovými zbytky, ve kterém je na karboxylovém konci aminokyselinový zbytek z množiny zahrnující Met, Lys a Arg.
Inzulínové deriváty obecného vzorce I nebo/a komplexy +4· obsahující inzulínový hexamer a 5 až 9 molů Zn na mol hexameru inzulínu nebo/a jejich fyziologicky přijatelné soli (například soli alkalických kovů a amonné soli) se hlavně používají jako účinné látky farmaceutických přípravků pro léčení dibates, zejména dibetes mellitus.
Uvedeným farmaceutickým přípravkem je výhodně roztok nebo suspenze pro podání injekcí. Tento přípravek je charakterizován obsahem alespoňjednoho inzulínového derivátu obecného vzorce I nebo/a komplexu podle vynálezu nebo/a alespoň jedné z jejich fyziologicky přijatelných solí v rozpuštěné, amorf ní nebo/a krystalické formě, výhodně v rozpuštěné formě.
Uvedený přípravek má výhodně hodnotu pH asi 2,5 až 8,5, zejména asi 4,0 až 8,5 a obsahuje vhodné izotonizační činidlo, vhodné konzervační činidlo a případně vhodný pufr, jakož i výhodně také určitou koncentraci zinečnatých iontů a to vše přirozeně ve sterilním vodném roztoku. Veškerý podíl složek přípravku kromě účinné látky tvoří nosičovy roztok přípravku.
Přípravky obsahující roztoky inzulínu obecného vzorce I mají hodnotu pH 2,5 až 4,5, zejména 3,5 až 4,5, výhodně 4,0.
Přípravky obsahující suspenze inzulínu obecného vzorce I mají hodnotu pH 6,5 až 8,5, zejména 7,0 až 8,0, výhodně 7,4.
Vhodnými izotonizačními činidly jsou například glycerin, glukóza, mannit, chlorid sodný a vápenaté nebo hořečnaté sloučeniny, jako například chlorid vápenatý nebo chlorid hořečnatý.
Volbou izotonizačního činidla nebo/a konzervačních látek lze ovlivnit rozpustnost inzulínového derivátu nebo jeho fyziologicky přijatelných solí při mírně kyselých hodnotách pH
Vhodnými konzervačními činidly jsou například fenol, m-kresol, benzylalkohol nebo/a ester kyseliny p-hydroxybenzoové.
Jako pufrovací látky, zejména pro nastavení hodnoty pH mezi asi 4,0 a 8,5, mohou být použity octan sodný, citran sodný nebo fosforečnan sodný. Jinak jsou k nastavení hodnoty pH vhodné také fyziologicky neškodné zředěné kyseliny (typicky HC1) nebo louhy (typicky NaOH).
V případě, že přípravek obsahuje podíl zinku, potom tento podíl činí 1^ug až 2 mg Zn++/ml, zejména 5^ug až 200/Ug Zn++/ml.
Za účelem modifikace profilu účinku přípravku podle vynálezu mohou být přimíšeny také nemodifikovaný insulin, například hovězí, prasečí nebo lidský insulin, zejména lidský inzulín, nebo modifikované inzulíny, například monomerní inzulíny, rychle působící inzulíny nebo Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32) lidský inzulín.
Výhodnými koncentracemi účinné látky jsou koncentrace odpovídající asi 1 až 1500, výhodněji 5 až 1000 a zejména asi 40 až 400, mezinárodním jednotkám/ml. '
V následující části popisu bude vynález blíže popsán pomocí příkladů jeho konkrétního provedení, přičemž tyto příklady mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen definicí patento vých nároků.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Příprava Gly(A21)-lidský inzulin-His(B31)-His(B32)-OH
Příprava expresivního systému se děje v podstatě postupem popsaným patentu US 5,358,857. V tomto dokumentu jsou popsány rovněž vektory pINT 90d a pINT 91d (viz příklad 17) a PCR PrimeryTIR a Insull. Tyto čtyři složky slouží mezi jiným jako výchozí materiál pro dále popsané vektorové konstrukce.
Nejdříve se do sekvence kódující mini-proinzulin zavede kodon pro Gly{A21). K tomu účelu se použije pINT 91d jako templát a PCR-reakce s primery TIR a Insu31.
Insu31 (SEQ ID n°10):
5'TTT TTT GTC GAC CTA TTA GCC GCA GTA GTT CTC CAG CTG 3'
PCR-Cyklus se provede následujícím způsobem: 1. minuta při 94 °C, 2. minuta při 55 °C, 3.minuta při 72 °C. Tento cyklus se opakuje 25 krát, načež se reakční směs inkubuje 7 minut při teplotě T2. °C a. potom přes noc při teplotě 4 °C.
Získaný PCR-fragment se za účelem čištění vysráží v ethanolu, vysuší a potom digeruje v restrikčním pufru podle instrukcí výrobce za použití restrikčních enzymů NcO1 a Sal1. Reakční směs se potom rozdělí elektroforeticky a fragment NcOl-ore-proinzulin-Sal1 se izoluje. Restrikčními enzymy Nc01 a Sáli se také štěpí DNA plasmidu pINT90d a tímto způsobem se od zbytkového plasmidu pINT oddělí opičí proinzulinový fragment. Oba fragmenty se elektroforeticky oddělí a DNA plasmidu se izoluje. Tato DNA zreaguje s fragmentem NcOl-Sal1-PCR v průběhu reakce za použití ligázy. Takto se získá plasmid pINT150d, který se po transformaci do E.Coli multiplikuje a potom opětovně izoluje.
DNA plasmidu pINT150d slouží jako výchozí materiál pro plasmid pINT302, který umožňuje přípravu požadované inzulínové varianty.
Ke konstrukci tohoto plasmidu se použije postup popsaný v patentu US 5,358,857 (viz příklad 6). Provedou se dvě vzájemně nezávislé PCR-reakce při použití DNA plasmidu pINT150d jako templátu. Jedna reakce se provede primerovým párem TXR a pINTB5 (SEQ ID n°11):
5' GAT GCC GCG GTG GTG GGT CTT GGG TGT GTAG 3' a druhá se provede s primerovým párem InsulI a pINT B6 (SEQ ID n°12):
5' A CCC AAG ACC CAC CAC CGC GGC ATC GTG GAG 3'.
PCR-Fragmenty, které vzniknou,jsou parciálně komplementární, takže ve třetí PCR-reakci vedou k fragmentu, který kóduje Gly (A21) miniproinzulin prodloužený o polohu B31 a B32. Tento fragment se štěpí systémem Nc01 a Sall a potom převede reakcí s DNA popsaného zbytkového plasmidu pINT90d za použití ligázy na plasmid pINT303. Tímto plasmidem transformovaný E.coli K12 W3 110 se potom fermentuje a zpracuje postupy popsanými v příkladu 4 patentu US 5,227,293. Preproinzulinový derivát {před štěpením trypsinem) získaný jako meziprodukt má následující aminokyselinovou sekvenci:
preproinzulin 1 (SEQ ID n°,3):
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg
Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
His His Arg
Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Gly.
Preproinzulin 1 odpovídá obecnému vzorci II, ve kterém 2
R znamena peptid s 11 aminokyselinovými zbytky, r1 znamená Phe{B1),
Y Thr(B30),
Z1 His His Arg(B31-B33),
R3 Gly(A21) a
A2-A20 je aminokyselinová sekvence A-řetězce lidského inzulínu (aminokyselinové zbytky 2 až 20) a B2-B29 jsou aminokyselinová sekvence B-řetězce lidského inzulínu (aminokyselinové zbytky 2 až 29).
Preproinzulin 1 se štěpí trypsinem za použití postupu popsaného v příkladu 4 patentu US 5,227,293. Získaný produkt se t potom převede reakcí s karboxypeptidázou B provedenou postupem popsaným v příkladu 11 na inzulín 1. Inzulín 1 odpovídá obecnému vzorci I, ve kterém znamená Phe(B1),
Y znamená Thr(B30),
Z znamená His His Arg (B31-B3332),
R znamena Gly(A21).a
A2-A20 jsou aminokyselinová sekvence A-řetězce lidského inzulínu (aminokyselinové zbytky 2 až 20) a B2-B29 jsou aminokyse linová sekvence B-řetězce lidského inzulínu (aminokyselinové zbytky 2 až 29).
Inzulín 1 má následující aminokyselinovou sekvenci: Inzulín 1 (SEQ ID n°.4):
B-Řetězec;
Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr His His
A-řetězec:
Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Gly (disulfidové můstky, které jsou zobrazeny ve vzorci I).
Příklad 2
Příprava Gly(A21)-lidský inzulin-Ala(B31)-His(B32)-His(B33)Arg(B34)-OH
Expresivní vektor se konstruuje způsobem popsaným v příkladu 1. Plasmid pINT150d slouží jako templát pro dvě vzájemně nezávislé PCR-reakce s příměrovými páry TIR a pINT B7 (SEQ ID n°.13):
5' GAT GCC GCG GTG GTG CGC GGT CTT GGG TGT GTAG 3' a Insul1 a pINT B8 (SEQ ID n°.14):
5' ACCC AAG ACC GCG CAC CAC CGC GGC ATC GTG GAG 3'.
PCR-Fragmenty, ke kterým vedou obě reakce,jsou částečně komplementární a takto poskytují při třetí PCR-reakci kompletní sekvenci, která kóduje požadovanou inzulínovou variantu. Frag ment reakce se zpracuje systémem Nc01 a Sall a potom liguje do Nc01/Sal1 otevřeného-zbytkového plasmidu pINTT90d DNA. Získá se plasmid pINT303, který po transformaci v E.coli K12 W3110 slouží jako báze pro expresi požadovaného pre-miniproin2ulinu. Fermentace a zpracování se provedou stejně jako v příkladu 1, přičemž se však nerealizuje reakce s karboxypepti dázou B. Získaný preproinzulinový derivát má následující aminokyselinovou sekvenci:
preproinzulin 2
(SEQ ID 0 n . 5):
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg
Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
Ala His His Arg
Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Gly.
Preproinsulin 2 odpovídá obecnému vzorci II, ve kterém r1 znamená Phe(Bl),
R znamená peptid s 11 aminokyselinovými zbytky,
Y Thr(B30),
Z1 Ala His His Arg(B31-B34),
R3 Gly(A21) a
A2-A20 jsou aminokyselinová sekvence A-řetězce lidského inzulínu (aminokyselinové zbytky 2 až 20) a B2-B29 jsou aminokyse linová sekvence B-řetězce lidského inzulínu (aminokyselinové zbytky 2 až 29).
Uvedený preproinzulin 2 se potom převede působením trypsinu na inzulín 2- Inzulín 2 odpovídá obecnému vzorci II, ve kte< rém íJ znamená Phe(B1),
Y znamená Thr(B30),
Z^ znamená Ala His His Arg(B31-B34), znamená Gly(A21) a
A2-A20 jsou aminokyselinová sekvence A-řetězce lidského inzulínu (aminokyselinové zbytky 2 až 20) a B2-B29 jsou aminokyselinová sekvence B-řetězce lidského inzulínu (aminokyselinové zbytky 2 až 29).
Inzulín 2 má následující aminokyselinovou sekvenci: inzulín 2 (SEQ ID n°,6):
B-řetězec:
Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
Ala His His Arg,
A-řetězec:
Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
(disulfidové můstky, které jsou zobrazeny ve : vzorci I).
Příklad 3
Příprava Gly(A21)-lidský inzulin-Ala(B31)-Ala{B32)-His{B33)HÍs(B34}-OH
Expres-ivní vektor se konstruuje způsobem· popsaným v příkladu 1. Plasmid pINT150d slouží jako templát pro dvě vzájemně nezávislé PCŘ-reakce s příměrovými páry TIR a pINT 316a (SEQ ID n°.15):
5' GAT GCC GCG ATG ATG CGC CGC GGT CTT GGG TGT GTA G 3' a Insul1 a pINT316b (SEQ ID n°.16):
5' A CCC AAG ACC GCG GCG CAT CAT CGC GGC ATC GTG GAG 3'.
PCR-Fragmenty, ke kterým obě reakce vedou, jsou částečně komplementární a poskytují při třetí PCR-reakci kompletní sekvenci, která kóduje požadovanou inzulínovou variantu. Frag ment reakce se zpracuje enzymy NcOl a Sáli a potom se líguje do NcOI/Sall otevřenéhozbytkového plasmidu pINT90d DNA.
Získá se plasmid pINT316, který po transformaci v E.coli K12 W3110 slouží jako báze pro expresi požadovaného pre-miniproinzulinu. Fermentace a zpracování se provádí jako v příkladu 1, přičemž se neprovádí reakce s karboxypeptidázou B. Získaný preproinzulin 3 má následující aminokyselinovou sekvenci: preproinzulin 3 [SEQ ID n°.7);
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg
Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
Ala Ala His His Arg
Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Gly.
Preproinzulin 3 odpovídá vzorci II, ve kterém
R^ znamená Phe(Bl),
R peptid s 11 aminokyselinovými zbytky
Y Thr(B30),
Ala Ala His His Arg (B31-B35),
R3 Gly (A21) a
A2-A20 jsou aminokyselinová sekvence A-řetězce lidského inzulínu (aminokyselinové zbytky 2 až 20) a B2-B29 jsou aminokyselinová sekvence B-řetězce lidského inzulínu (aminokyselinové zbytky 2 až 29).
Preproinzulin 3 se potom převede trypsinem a karboxypeptidázou B jako v příkladu 11 na inzulín 3.
Inzulín 3 odpovídá obecnému vzorci I, ve kterém R znamená Phe(BI), / Y znamená Thr(B30),
Z znamená Ala Ala His His(B31-B34),
R znamená Gly(A21) a
A2-A20 jsou aminokyselinová sekvence A-řetězce lidského inzulínu (aminokyselinové zbytky 2 až 20) a B2-B29 jsou aminokyselinová sekvence B-řetězce lidského inzulínu (aminokyselinové zbytky 2 až 29).
Inzulín 3 má následující aminokyselinovou sekvenci: inzulín 3 (SEQ ID n°.8):
B-řetězec:
Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
Tyr Leu Val cys ciy Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
Ala Ala His His
A-řetězec:
Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
(disulfidové můstky, které jsou zobrazeny ve vzorci I).
Příklad 4
Inzulín 2 připravený podle příkladu 2 se převede karbopeptidázou B postupem podle příkladu 11 na inzulín 4.
Inzulín 4 odpovídá vzorci I, ve kterém
R1 znamená Phe (Bl),
Y znamená Thr(B30),
Z znamená Ala His His(B31-B33),
R3 Gly(A21) a
A2-A20 jsou aminokyselinová sekvence A-řetězce lidského inzulínu (aminokyselinové zbytky 2 až 20) a B2-B29 jsou aminokyselinová sekvence B-řetězce lidského inzulínu (aminokyselinové zbytky 2 až 29).
Inzulín 4 má následující aminokyselinovou sekvenci: inzulín 4 > (SEQ ID n°.9):
B-řetězec:
Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His His
A-řetězec:
Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Gly (disulfidové můstky, které byly zobrazeny ve vzorci I).
Příklad 5
Va2ba se zinkem inzulínových derivátů
Přípravek inzulínu (0,243 mM lidského inzulínu, 0,13 M NaCl, 0,1 % fenolu, 80/Ug/ml (1,22 mM) Zn++, 10 mM Tr'is/HCl, pH 7,4) se dialyzuje při teplotě 15 °C proti 10 mM Tris/HCl-pufru pH 7,4, celkem po dobu 40 hodin (výměny pufru po 16 a 24 hodinách). Získaný dialyzát se potom okyselí a stanoví se v něm koncentrace inzulínu vysoko výkonnou kapalinovou chromatografií a koncentrace zinku absorpční spektroskopií. Obsahy zinku se korigují s obsahem zinku kontrolního subjektu, který neobsahuje žádný inzulín. Získané výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 1.
Tabulka 1
Moly zinku na mol inzulínového hexameru
Srovnávací inszuliny:
Lidský inzulín (HI)
1,98
Tabulka 1 (pokračování)
Gly(A21)Des(B30)-HI 1,8
Gly(A21)Arg(B31)-Arg(B32)-HI 2,1
Inzulíny podle vynálezu
obecného vzorce I.
Gly(A21)His(B31}His(B32)-HI 6,53
Gly(A21)His(B3T)His(B32)Arg(B33)-HI 5,29
Gly(A21)Ala(B3l)His(B32)His(B33)-HI 6,73
Gly(A21)Ala(B31)His(B32)His(B33)-
Arg(B34)-HI 5,01
Příklad 6
Závislost profilu účinku, lidského inzulínu u psa na přítomnosti zinku Aplikace: subkutánní Dávka: 0,3 IE/kg, pH přípravku 4,0
Počet psů (n) na pokus je 6, V následující tabulce 2 jsou uvedeny hodnoty krevní glukózy v procentech, vztažených na výchozí hodnotu krevní glukózy.
Tabulka 2
Čas (h) bez zinku 80 pg Zn/ml 160 pg Zn/ml
0 100 10θ 100
0,5 88,66 94,06 101,48
1 59,73 72,31 76,87
1,5 50,61 58,6 67,44
2 54,32 54,05 61,49
3 61,94 58,84 62,8
4 85,59 70,03 71,32
Tabulka 2 {pokračování
5 100,46 78,97 81,65
6 105,33 94,63 96,19
7 106 102,46 100,27
8 108,39 106,12 104,34
10 102,72 105,11 105,1
12 105-,03 107,14 103,02
Příklad 7
Profil- účinku Gly(A21)Ala(B31)His(B32),His(B33),Arg(B34)-lidské ho inzulínu u psa (inzulín 2)
Inzulín připravený podle příkladu 2 byl použit v následující formulaci:
glycerin 20 mg/ml, m-kresol 2,7 mg/ml, inzulín 2 40 IE/ml Symbol IE znamená mezinárodní jednotku, která odpovídá asi 6 nmolům inzulínu, například lidského inzulínu nebo inzulínu vzorce I. Hodnota pH formulace se nastaví pomocí hydroxidu sodného nebo kyseliny chlorovodíkové.
Aplikace: subkutánní, dávka: 0,3 IE/kg.
Počet pokusných psů na pokus je 6. Hodnota pH formulace činí 4,0. V následující tabulce 3 jsou uvedeny hodnoty krevní glukózy v procentech,'vztaženo na výchozí hodnotu krevní glukózy.
Tabulka 3
Čas(h) bez zinku 20 pg Zn/ml 40 pg Zn/ml 80 pg Zn/ml
0 100 100 100 1D0
1 74,38 95,24 95,6 102,06
2 48,27 90,11 78,74 97,44
3 57,67 89,96 84,81 90,44
4 74,2 81,35 74,66 88,69
Tabulka 3 (pokračování)
5 91,68 74,43 75,71 79,7
6 100,79 71,61 67,37 65,26
7 98,5 67>73 66,05 62,17
8 100,54 68,92 64,97 47,71
Příklad 8
Profil účinku Gly(A21)Ala(B31)His(B32),His(B33)-lidského inzu linu u psa (inzulín 4)
Inzulín 4 připravený podle příkladu 4 byl formulován a použit stejně jako v příkladu 7.
Aplikace: subkutánní, dávka: 0,3 TE/kg, počet psů (n) na. pokus: 6,. hodnota pH formulace: 4,0.
V následující tabulce 4 jsou uvedeny hodnoty krevní glukózy v procentech, vztaženo na výchozí hodnotu krevní glukózy.
Tabulka 4
Čas(h) bez zinku 20 pg Zn/ml 40 pg Zn/ml 80 pg Zn/ml
0 100 100 100 100
1 61,51 70 96,52 101,77
2 49,82 52,55 89,28 90,01
3 55,66 60,13 80,23 70,79
4 . 78,09 78,46 73,03 68,48
5 94,27 97,7 70,3 74,94
6 103,69 105,27 61,86 74,1
7 105,51 106,48 62,28 76,42
8 108,05 104,51 81,68 88
Příklad 9
Profil účinku Gly(A21)His(B31),His(B32)-lidského inzulínu u psa (inzulín 1)
Inzulín 1 připravený podle příkladu 1 byl formulován a použit stejně jako v příkladu 7.
Aplikace: subkutánně, dávka: 0,3 IE/kg, počet psů (n) na pokus: *6, hodnota pH formulace: 4,0.
V následující tabulce 5 jsou uvedeny hodnoty krevní glukózy v procentech, vztaženo na výchozí hodnotu krevní glukózy.
Tabulka 5
Čas(h) bez zinku 20 pg Zn/mi 40 pg Zn/ml 80 pg Zn/ml
0 100 100 100 100
1 60,71 73,16 100,25 102,86
2 52,29 55,43 94,86 100,19
3 61,74 61,6 89,37 89,12
4 79,93 81,53 81,55 79,19
5 96,17 96,84 73,06 70,67
6 103,2 102,43 74,58 75,75
7 110,86 104,75 77,68 79,36
8; 113,42 108,14 84,87 78,74
Příklad 10
Profil účinku Gly(A21)Ala(B31)Ala(B32)His(B33)His(B34-lidské ho inzulínu u psa (inzulín 3)
Inzulín 3 připravený podle příkladu 1 se formuluje a použije stejně jako v příkladu 7.
Aplikace: subkutánně, dávka: 0,3 IE/kg, počet psů (n) na pokus: 6, hodnota pH přípravku: 4,0.
V následující tabulce 6 jsou uvedeny hodnoty krevní glukózy v procentech, vztaženo na výchozí hodnotu krevní glukózy.
Tabulka 6
Čas(h) bez zinku 20 pg Zn/ml 40 pg Zn/ml 80 pg Zn/ml
0 100 100 100 100
1 75 99 101 99
2 57 77 96 91
3 . 58 64 84 80
4 82 65 73 79
5 94 70 68 77
6 100 74 72 76
7 96 81 80 69
8 100 90 88 75
9 100 96 94 83
10 95 98 92 87
12 98 99 95 94
14 95 100 94 93
Příklad 11
Příprava inzulínu 1 z preproinzulinu 1
200 mg inzulínu s Arg na karboxylovém konci B-řetězce, připraveného podle příkladu 1 se rozpustí v 95 ml 10mM roztoku
Informace o sekvenci SEQ ID n°:2 Charakteristika sekvence: délka: 30 aminokyselin druh: aminokyselina počet řetězců: jediný topologie: lineární typ molekuly: protein původ: organismus:Escherichia coli Popis sekvence: SEQ ID n°; 2
Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu 10 Val Glu Ala Leu Tyr 15
1 5
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
Informace o sekvenci SEQ ID n°: 3 Charakteristika sekvence: délka: 65 aminokyselin druh: aminokyselina počet řetězců: jediný . topologie: lineární typ molekuly: protein původ: organismus:Escherichia coli Popis sekvence: SEQ ID n°: 3
V
í. ·
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe 10 Val Asn Gin 15 His
1 5
Leu cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu
20 25 30
Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr His His Arg Gly Ile Val Glu
35 40 4 5-
Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys
50 55 60
Gly
Informace o sekvenci SEQ ID n°: 4 Charakteristika sekvence: délka: 53 aminokyselin druh: aminokyselina počet řetězců: jediný topologie: lineární kyseliny chlorovodíkové. Po přidání 5 ml 1M Tris/HCl-pufru (tris(hydroxymethyl)aminomethan), pH 8, se nastaví hodnota pH na 8 pomocí kyseliny chlorovodíkové nebo hydroxidu sodného.
I
Přidá se 0,1*mg karboxypeptidázy. Po 90 minutách je dokončeno odštěpení argininu. Reakční směs se přidáním kyseliny chlorovodíkové upraví na hodnotu pH 3,5, načež se zavede na . sloupec s reverzní fází (PLRP-S RP 300 10 ,u, 2,5 x 30 cm,Polymer Laboratories Amherst,- MA, USA). .- Mobilní fáze A je tvořena t * vodou obsahující 0,1 % kyseliny trifluoroctové. Fáze B sestavá s acetonitrilu obsahujícího 0,09 % kyseliny trifluoroctové.
W „ , t 'W
Sloupec se provozuje pri průtoků 5 ml/min. Polnanesení se sloupec promyje 150 ml fáze A. K frakcionačnf-eluci dochází v , --¼ ác z za použití lineárního gradientu od 22,5 do 40 % B v průběhu 400 minut. Jednotlivé získané frakce se jednotlivě analyzují analytickou vysoko výkonnou kapalinovou chromatografií s reverzní fází a frakce obsahující Des-Arg-inzulin v dostatečné čistotě se sloučí.. Hodnota- pH se nastaví hydroxidem sodným na 3,5 a acetonitril se odežene v rotační odparce. Des-Arg-inzulin se potom vysráží nastavením hodnoty.pH 6,5. Sraženina se odstředí, dvakrát.se„promy-je. vždy 50 ml vody a nakonec se lyo-· filizuje. Výtěžek činí 60 až 80 % inzulínu 1.
--- í___ /
i sr
.....s« o
Seznam sekvencí’
Informace o ssekvenci SEQ ID n : 1 , gW'
Charakteristika sekvence;
délka; 21 aminokyselin.. ,
druh: aminokyselina počet řetězců: jediný topologie: lineární typ molekuly: protein původ: organismus:Escherichia coli Popis sekvence: SEQ ID n°:1:
Gly ile Val Glu4Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr 15 10 l _
Glu Asn Tyr Cys Asn 20 i
typ molekuly: protein původ: organismus:Escherichia coli Popis sekvence: SEQ ID n°: 4
Phe Val Asn Gin 1 His Leu Cys Gly 5 Ser His 10 Leu Val Glu Ala Leu 15 Tyr
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr His His
20 25 30
Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu
35 40 45
Glu A3n Tyr Cys Gly 50
Informace o sekvenci SEQ ID n°: 5 Charakteristika sekvence: délka: 66 aminokyselin druh: aminokyselina počet řetězců: jediný topologie: lineární typ molekuly: protein původ: organismus.-Escherichia coli Popis sekvence: SEQ ID n°: 5
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg 'Phe Val Asn Gin His
1 5 10 15
Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu
20 25 30
Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His His Arg Gly Ile Val
35 40 45
Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr
50 55 60
Cys Gly
Informace o sekvenci SEQ ID n°: 6 Charakteristika sekvence: délka: 55 aminokyselin druh: aminokyselina počet řetězců: jediný topologie: lineární typ molekuly: protein původ: organismus:Escherichia coli Popis sekvence: SEQ ID n°; 6
Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His
20 25 30
His Arg Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr
35 40 45
Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
50 55
Informace o sekvenci SEQ ID n°: 7
Charakteristika sekvence:
délka: 67 aminokyselin druh: aminokyselina počet řetězců: jediný topologie: lineární typ molekuly: protein původ: organismus:Escherichia coli
Popis sekvence: SEQ ID n°: 7
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe val Asn Gin His
1 5 10 15
Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu
20 25 30
Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala Ala His His Arg Gly Ile
35 40 45
Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn
50 55 60
Tyr Cys Gly
Informace o sekvenci SEQ ID n°: 8
Charakteristika sekvence:
délka: 55 aminokyselin druh: aminokyselina počet řetězců: jediný topologie: lineární typ molekuly: protein původ: organismus .-Escherichia coli
Popis sekvence: SEQ ID n°: 8
Phe 1 Val Asn Gin His 5 Leu Cys Gly Ser His 10 Leu Val Glu Ala Leu 15 Tyr
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala Ala
20 25 30
His His Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr 35 40 4S
Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Gly 50 55
Informace o sekvenci SEQ ID n°: 9
Charakteristika sekvence:
délka: 54 aminokyselin druh: aminokyselina počet řetězců: jediný topologie: lineární typ molekuly: protein původ: organismus:Escherichia coli ·
Popis sekvence: SEQ ID n°: 9
Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His
20 25 30
His Gly Ile Val· Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin
35 40 45
Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
Informace o sekvenci SEQ ID n°; 10
Charakteristika sekvence:
délka: 39 párů bází druh: nukleová kyselina počet řetězců: jediný topologie: lineární typ molekuly: DNA (genomová)
Popis sekvence: SEQ ID n°: 10
TTTTTTGTCG ACCTATTAGC CGCAGTAGTT CTCCAGCTG
Informace o sekvenci SEQ ID n°: 11
Charakteristika sekvence:
délka: 31 párů bází druh: nukleová kyselina počet řetězců: jediný topologie: lineární typ molekuly: DNA (genomová)
Popis sekvence:SEQ ID n°: 11
GATGCCGCGG TGGTGGGTCT TGGGTGTGTA G
Informace o sekvenci SEQ ID n°: 12
Charakteristika sekvence:
délka: 31 párů bází druh: nukleová kyselina počet řetězců: jediný topologie: lineární typ molekuly: DNA (genomová)
Popis Sekvence: SEQ ID n°: 12
ACCCAAGACC CACCACCGCG GCATCGTGGA G
Informace o sekvenci SEQ ID n°: 13
Charakteristika sekvence:
délka: 34 párů bází.
druh: nukleová kyselina počet řetězců: jediný topologie: lineární typ molekuly: DNA (genomová,'
Popis sekvence: SEQ ID n°; 13
GATGCCGCGG TGGTGCGCGG TCTTGGGTGT GTAG
Informace o sekvenci SEQ ID n°: 14
Charakteristika sekvence:
délka: 34 párů bází druh: nukleová kyselina počet řetězců: jediný topologie: lineární typ molekuly: DNA (genomová)
Popis sekvence: SEQ ID n°: 14
ACCCAAGACC GCGCACCACC GCGGCATCGT GGAG
Informace o sekvenci SEQ ID n°: 15
Charakteristika sekvence:
délka: 37 párů bází druh: nukleová kyselina počet řetězců: jediný topologie: lineární typ molekuly: DNA (genomová)
Popis sekvence: SEQ ID n°: 15
GATGCCGCGA TGATGCGCCG CGGTCTTGGG TGTGTAG
Informace o sekvenci SEQ ID n°: 16
Charakteristika sekvence:
délka: 37 párů bází druh: nukleová kyselina počet řetězců: jediný topologie: lineární typ molekuly: DNA (genomová)
Popis sekvence: SEQ ID n°: 16
ACCCAAGACC GCGGCGCATC ATCGCGGCAT CGTGGAG

Claims (16)

1. Inzulín obecného vzorce I
Cys — (A 11) (A 20) Cys—
R3-OH (I)
R1(B1)
Cys (B 7)
Cys— (B 19)
Y-Z (B 30) nebo fysiologicky přijatelná sůl inzulínu obecného vzorce I, přičemž v uvedeném obecném vzorci I
R1 znamená fenylalaninový zbytek nebo atom vodíku,
R3 znamená geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek,
Y znamená geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek,
Z znamená a) histidinový zbytek nebo
b) peptid se 2 až 35 geneticky kódovatelnými aminokyselinovými zbytky obsahující 1 až 5 histidinových zbytků, a zbytky A2 až A20 odpovídají aminokyselinové sekvenci A-řetěžce lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo inzulínového derivátu a zbytky B2 až B29 odpovídají aminokyselinové sekvenci B-řetězce lidského inzulínu, zvířevího inzulínu nebo inzulínového derivátu.
2.
Inzulín podle nároku 1 obecného vzorce I, ve kterém
R1 znamená fenylalaninový zbytek,
R^ znamená aminokyselinový zbytek z množiny zahrnující Asn, Gly, Ser, Thr, Ala, Asp, Glu a Gin,
Y znamená aminokyselinový zbytek z množiny zahrnující Ala, Thr, Ser a His,
Z znamená a) histidinový zbytek nebo
b) peptid se 4 až 7 aminokyselinovými zbytky obsahující 1 nebo 2 histidinové zbytky.
3. Inzulín podle nároku 1 obecného vzorce I, ve kterém R1 . znamená fenylalaninový zbytek>
R^ znamená aminokyselinový zbytek z množiny zahrnující
Asn, Gly, Ser, Thr, Ala, Asp, Glu a Gin,
Y znamená aminokyselinový zbytek z množiny zahrnující Ala, Thr, Ser a His,
Z znamená a) histidinový zbytek nebo
b) peptid se 2 až 7 aminokyselinovými zbytky obsahující 1 nebo 2 histidinové zbytky.
4. Inzulín podle nároku 3 obecného vzorce I, ve kterém
Z znamená peptid s 1 až 5 aminokyselinovými zbytky obsahující 1 nebo 2 histidinové zbytky.
5. Inzulín podle jednoho nebo několika nároků 1 až 4 obecného vzorce I, ve kterém r1 znamená fenylalaninový zbytek,
R znamená aminokyselinový zbytek z množiny zahrnující
Asn a Gly,
Y . znamená aminokyselinový zbytek z množiny zahrnující
Thr a His a
Z znamená peptid s 1 až 5 aminokyselinovými zbytky obsahu jící 1 nebo 2 histidinové zbytky.
6. Inzulín podle nároku 1 obecného vzorce I, ve kterém
R^ znamená fenylalaninový zbytek, R^ znamená glycinový zbytek,
Y znamená threoninový zbytek a Z znamená peptid s 1 až 5 amino· kyselinovými zbytky.
7. Inzulín podle nároku 6 obecného vzorce I, ve kterém Z znamená peptid se sekvencí His His, His His Arg, Ala His His, Ala His His Arg, Ala Ala His His Arg nebo Ala Ala His His.
8. Komplexy obsahující inzulínový hexamer a 5 až 9 molů zinku na mol inzulínového hexameru, zejména 5 až 7 molů zinku na mol inzulínového hexameru, přičemž inzulínový hexamer je tvořen šesti inzulínovými molekulami obecného vzorce I podle jednoho nebo několika nároků 1 až 7.
9. Farmaceutický přípravek, vyznačený tím, že obsahuje účinné množství alespoň jednoho insulinu obecného vzorce I nebo/a alespoň jedné fyziologicky přijatelné soli inzulínu obecného vzorce I podle jednoho nebo několika nároků
1 až 8 v rozpuštěné, amorfní nebo/a krystalické formě.
10. Farmaceutický přípravek podle nároku 9, vyznačený tím, že obsahuje. dodatečné množství l^ug až 2 mg, výhodně 5^ug až 200/Ug, zinku/ml.
11. Farmaceutický přípravek podle nároku 9 nebo 10, vyznačený tím, že má hodnotu pH 2,5 až 8,5.
12. Farmaceutický přípravek podle jednoho nebo několika nároků 9 až 11, vyznačený tím , že má pH 2,5 až 4,5
13. Farmaceutický přípravek podle jednoho nebo několika nároků 9 až 12,vyznačený tím, že obsahuje dodatečné množství nemodifikovaného inzulínu, výhodně nemodifikovaného lidského inzulínu, nebo modifikovaného inzulínu, výhodně Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)-lidského inzulínu.
14. Proinzulin obecného vzorce II
R2-R1-B2-B29-Y-Zl-Gly-A2-A20-R3 (II) ve kterém
R3 a Y mají významy uvedené pro obecný vzorec I v jedncmnebo několika nárocích 1 až 7,
R znamená fenylalaninový zbytek nebo kovalentní vazbu,
R znamená a) geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek nebo
b) peptid se 2 až 45 aminokyselinovými zbytky a zbytky A2-A20 a B2-B29 odpovídají aminoky selinovým sekvencím A- a B-řetězce lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo inzulínového derivátu, a
1 , „
Z ' znamena peptid se 2 až 40 geneticky kodovatelnými aminokyselinovými zbytky s 1 až 5 histidinovými zbytky.
15. Proinzulin podle nároku 14 obecného vzorce II, ve kte2 rém R znamená peptid se 2 až 25 aminokyselinovými zbytky.
16. Proinzulin podle nároku 14 nebo 15 obecného, vzorce II, ve kterem. R znamena peptid se 2· až .15 aminokyselinovými zbyt ky, přičemž na karboxylovém konci je aminokyselinový zbytek z množiny zahrnující Met, Lys a Arg.
CZ19972370A 1996-07-26 1997-07-24 Inzulinové deriváty se zvýšenou schopností vázat zinek CZ292274B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19630242 1996-07-26

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ237097A3 true CZ237097A3 (cs) 1998-02-18
CZ292274B6 CZ292274B6 (cs) 2003-08-13

Family

ID=7800962

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19972370A CZ292274B6 (cs) 1996-07-26 1997-07-24 Inzulinové deriváty se zvýšenou schopností vázat zinek

Country Status (25)

Country Link
US (1) US6221837B1 (cs)
EP (1) EP0821006B1 (cs)
JP (1) JP4046388B2 (cs)
KR (1) KR100547922B1 (cs)
CN (2) CN1158305C (cs)
AR (1) AR008269A1 (cs)
AT (1) ATE264871T1 (cs)
AU (1) AU725201B2 (cs)
BR (1) BR9704117B1 (cs)
CA (1) CA2207078C (cs)
CZ (1) CZ292274B6 (cs)
DE (1) DE59711533D1 (cs)
DK (1) DK0821006T3 (cs)
ES (1) ES2218622T3 (cs)
HK (1) HK1048125A1 (cs)
HU (1) HU224591B1 (cs)
IL (2) IL121382A0 (cs)
NO (1) NO317666B1 (cs)
NZ (1) NZ328421A (cs)
PL (1) PL188617B1 (cs)
PT (1) PT821006E (cs)
RU (1) RU2176646C2 (cs)
TR (1) TR199700685A2 (cs)
TW (1) TW474944B (cs)
ZA (1) ZA976645B (cs)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19825447A1 (de) * 1998-06-06 1999-12-09 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung
DE19838097A1 (de) 1998-08-24 2000-03-02 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Verfahren zur chromatographischen Reinigung von Insulinen
DE19947456A1 (de) * 1999-10-02 2001-04-05 Aventis Pharma Gmbh C-Peptid zur verbesserten Herstellung von Insulin und Insulinanaloga
CA2452044A1 (en) * 2001-08-28 2003-03-13 Eli Lilly And Company Pre-mixes of glp-1 and basal insulin
JP2005508360A (ja) * 2001-10-19 2005-03-31 イーライ・リリー・アンド・カンパニー Ｇｌｐ−１およびインスリンの二相混合物
KR100769183B1 (ko) * 2001-12-28 2007-10-23 엘지.필립스 엘시디 주식회사 면발광 램프
CA2518776A1 (en) * 2003-04-29 2004-11-11 Eli Lilly And Company Insulin analogs having protracted time action
EP2264065B1 (en) * 2003-08-05 2017-03-08 Novo Nordisk A/S Novel insulin derivatives
CN101027318B (zh) 2004-07-19 2016-05-25 比奥孔有限公司 胰岛素-低聚物共轭物，制剂及其用途
US7833513B2 (en) 2004-12-03 2010-11-16 Rhode Island Hospital Treatment of Alzheimer's Disease
ATE519780T1 (de) 2005-12-28 2011-08-15 Novo Nordisk As Ein acyliertes insulin und zink enthaltende zusammensetzungen und verfahren zur herstellung dieser zusammensetzungen
WO2008015099A2 (en) * 2006-07-31 2008-02-07 Novo Nordisk A/S Pegylated, extended insulins
AU2007298919C1 (en) * 2006-09-22 2014-02-06 Novo Nordisk A/S Protease resistant insulin analogues
US9387176B2 (en) * 2007-04-30 2016-07-12 Novo Nordisk A/S Method for drying a protein composition, a dried protein composition and a pharmaceutical composition comprising the dried protein
EP2164458A1 (en) * 2007-06-01 2010-03-24 Novo Nordisk A/S Stable non-aqueous pharmaceutical compositions
WO2008152106A1 (en) * 2007-06-13 2008-12-18 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical formulation comprising an insulin derivative
MX2010003979A (es) * 2007-10-16 2010-06-02 Biocon Ltd Composicion farmaceutica oralmente administrable y proceso para su preparacion.
WO2009112583A2 (en) * 2008-03-14 2009-09-17 Novo Nordisk A/S Protease-stabilized insulin analogues
CA2718738C (en) 2008-03-18 2019-05-07 Novo Nordisk A/S Protease stabilized, acylated insulin analogues
ES2607003T3 (es) * 2008-10-30 2017-03-28 Novo Nordisk A/S Tratamiento de diabetes mellitus utilizando inyecciones de insulina con una frecuencia de inyección inferior a la diaria
RU2413531C2 (ru) * 2009-03-31 2011-03-10 Общество С Ограниченной Ответственностью "Концерн О3" Способ получения препарата с-пептида проинсулина для перорального применения
BR112013010345A2 (pt) 2010-10-27 2017-07-25 Novo Nordisk As tratamento de diabetes melitus usando as injeções de insulina administradas com intervalos de variação da injeção
US9481721B2 (en) 2012-04-11 2016-11-01 Novo Nordisk A/S Insulin formulations
JP2016519127A (ja) 2013-04-30 2016-06-30 ノヴォ ノルディスク アー／エス 新規投与レジメン
WO2015052088A1 (en) 2013-10-07 2015-04-16 Novo Nordisk A/S Novel derivative of an insulin analogue
FR3013049B1 (fr) 2013-11-14 2015-11-13 You-Ping Chan Analogue de l'insuline glargine
ES2930149T3 (es) 2016-12-16 2022-12-07 Novo Nordisk As Composiciones farmacéuticas que contienen insulina
US10335464B1 (en) 2018-06-26 2019-07-02 Novo Nordisk A/S Device for titrating basal insulin
US12343383B2 (en) 2019-07-12 2025-07-01 Novo Nordisk A/S High concentration insulin formulation

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4430260A (en) * 1979-02-27 1984-02-07 Lee Weng Y Penicillin-polyvinyl alcohol conjugate and process of preparation
FI78616C (fi) * 1982-02-05 1989-09-11 Novo Industri As Foerfarande foer framstaellning av en foer infusionsaendamaol avsedd stabiliserad insulinloesning, som har en foerhoejd zinkhalt.
DE3326472A1 (de) 1983-07-22 1985-02-14 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Neue insulin-derivate, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung sowie pharmazeutische mittel zur behandlung des diabetes mellitus
DE3327709A1 (de) * 1983-07-29 1985-02-07 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Insulin-derivat-kristallsuspensionen, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung
DE3440988A1 (de) 1984-11-09 1986-07-10 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Verfahren zur spaltung von peptiden und proteinen an der methionyl-bindung
US4569794A (en) 1984-12-05 1986-02-11 Eli Lilly And Company Process for purifying proteins and compounds useful in such process
US5008241A (en) * 1985-03-12 1991-04-16 Novo Nordisk A/S Novel insulin peptides
DE3526995A1 (de) 1985-07-27 1987-02-05 Hoechst Ag Fusionsproteine, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
DE3636903A1 (de) 1985-12-21 1987-07-02 Hoechst Ag Fusionsproteine mit eukaryotischem ballastanteil
DE3541856A1 (de) 1985-11-27 1987-06-04 Hoechst Ag Eukaryotische fusionsproteine, ihre herstellung und verwendung sowie mittel zur durchfuehrung des verfahrens
CA1340522C (en) 1987-03-10 1999-05-04 Heinz Dobeli Fusion proteins containing neighbouring histidines for improved purification
DE3805150A1 (de) 1987-04-11 1988-10-20 Hoechst Ag Gentechnologisches verfahren zur herstellung von polypeptiden
DE4012818A1 (de) 1990-04-21 1991-10-24 Hoechst Ag Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten
DE3726655A1 (de) 1987-08-11 1989-02-23 Hoechst Ag Verfahren zur isolierung basischer proteine aus proteingemischen, welche solche basischen proteine enthalten
DE3739347A1 (de) 1987-11-20 1989-06-01 Hoechst Ag Verfahren zur selektiven spaltung von fusionsproteinen
ATE101620T1 (de) 1988-06-23 1994-03-15 Hoechst Ag Mini-proinsulin, seine herstellung und verwendung.
DE3827533A1 (de) * 1988-08-13 1990-02-15 Hoechst Ag Pharmazeutische zubereitung zur behandlung des diabetes mellitus
DE3837825A1 (de) * 1988-11-08 1990-05-10 Hoechst Ag Neue insulinderivate, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung
NZ232375A (en) * 1989-02-09 1992-04-28 Lilly Co Eli Insulin analogues modified at b29
DE3921447A1 (de) * 1989-06-30 1991-01-17 Hoechst Ag Verfahren zur herstellung von n-alkyl-halogenanilinen
US5358857A (en) 1989-08-29 1994-10-25 The General Hospital Corp. Method of preparing fusion proteins
IL95495A (en) 1989-08-29 1996-10-16 Hoechst Ag Fusion proteins their preparation and use
US5227293A (en) 1989-08-29 1993-07-13 The General Hospital Corporation Fusion proteins, their preparation and use
ZA928916B (en) * 1991-11-26 1994-05-18 Lilly Co Eli Tri-arginine insulins
DE59305396D1 (de) 1992-12-02 1997-03-20 Hoechst Ag Verfahren zur Gewinnung von Proinsulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken
AU682061B2 (en) * 1993-09-17 1997-09-18 Novo Nordisk A/S Acylated insulin
DE4405179A1 (de) * 1994-02-18 1995-08-24 Hoechst Ag Verfahren zur Gewinnung von Insulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken
JP3053873B2 (ja) * 1994-08-12 2000-06-19 イムノメディクス，インコーポレイテッド Ｂ細胞リンパ腫細胞および白血病細胞に特異的な免疫結合体およびヒト化抗体

Also Published As

Publication number Publication date
DE59711533D1 (de) 2004-05-27
MX9705667A (es) 1998-07-31
IL121381A (en) 2004-09-27
PL321343A1 (en) 1998-02-02
ATE264871T1 (de) 2004-05-15
JP4046388B2 (ja) 2008-02-13
NO973438D0 (no) 1997-07-25
DK0821006T3 (da) 2004-08-16
KR980009281A (ko) 1998-04-30
PL188617B1 (pl) 2005-03-31
TR199700685A3 (tr) 1998-02-21
BR9704117B1 (pt) 2009-08-11
KR100547922B1 (ko) 2006-06-22
HK1048125A1 (zh) 2003-03-21
ES2218622T3 (es) 2004-11-16
CA2207078C (en) 2008-01-29
HU9701299D0 (en) 1997-09-29
AU725201B2 (en) 2000-10-05
EP0821006B1 (de) 2004-04-21
NO317666B1 (no) 2004-11-29
TR199700685A2 (xx) 1998-02-21
NO973438L (no) 1998-01-27
CA2207078A1 (en) 1998-01-26
IL121381A0 (en) 1998-01-04
CN1158305C (zh) 2004-07-21
HU224591B1 (hu) 2005-11-28
BR9704117A (pt) 1998-12-29
HUP9701299A3 (en) 2001-04-28
AU3017197A (en) 1998-02-05
RU2176646C2 (ru) 2001-12-10
ZA976645B (en) 1998-01-26
US6221837B1 (en) 2001-04-24
JPH1072496A (ja) 1998-03-17
PT821006E (pt) 2004-09-30
CZ292274B6 (cs) 2003-08-13
NZ328421A (en) 1998-12-23
CN1172811A (zh) 1998-02-11
IL121382A0 (en) 1998-01-04
EP0821006A2 (de) 1998-01-28
CN1362417A (zh) 2002-08-07
EP0821006A3 (de) 2001-11-28
HUP9701299A1 (hu) 1998-11-30
TW474944B (en) 2002-02-01
AR008269A1 (es) 1999-12-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ237097A3 (cs) Inzulinové deriváty se zvýšenou schopností vázat zinek
US6251856B1 (en) Insulin derivatives
EP0871665B1 (en) Insulin derivatives
Markussen et al. Soluble, prolonged-acting insulin derivatives. I. Degree of protraction and crystallizability of insulins substituted in the termini of the B-chain
CZ78996A3 (en) Acetylated insulin
EP0894095A1 (en) Insulin derivatives and their use
US6686177B1 (en) Insulin analogs with enhanced zinc binding
MXPA97005667A (en) Insulin derivatives with zinc increment
MXPA97007056A (en) Insulated derivatives
HK1036808B (en) Novel insulin analogs with enhanced zinc binding

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20140724