CZ292274B6

CZ292274B6 - Inzulinové deriváty se zvýšenou schopností vázat zinek

Info

Publication number: CZ292274B6
Application number: CZ19972370A
Authority: CZ
Inventors: Johann Dr. Ertl; Paul Dr. Habermann; Karl Dr. Geisen; Gerhard Dr. Seipke
Original assignee: Hoechst Aktiengesellschaft
Priority date: 1996-07-26
Filing date: 1997-07-24
Publication date: 2003-08-13
Also published as: BR9704117B1; TR199700685A2; HU224591B1; IL121381A; EP0821006A3; RU2176646C2; CZ237097A3; IL121381A0; CA2207078C; BR9704117A; EP0821006A2; EP0821006B1; KR100547922B1; TW474944B; HUP9701299A3; AU725201B2; NO973438L; IL121382A0; ES2218622T3; ZA976645B

Abstract

Inzulinov deriv ty se zv²Üenou schopnost v zat zinek obecn ho vzorce I, ve kter m Z znamen histidinov² zbytek nebo peptid se 2 a 35 geneticky k dovateln²mi aminokyselinov²mi zbytky obsahuj c 1 a 5 histidinov²ch zbytk , jsou vhodn pro p° pravu farmaceutick²ch p° pravk pro l en diabetes. Inzuliny obecn ho vzorce I tvo° se zinkem komplexy, kter obsahuj inzulinov² hexamer a asi 5 a 9 mol zinku na mol inzulinov ho hexameru.\

Description

Inzulínové deriváty se zvýšenou schopností vázat zinek

Oblast techniky

Vynález se týká nových derivátů inzulínu, která vykazují zvýšenou schopnost vázat zinek.

Dosavadní stav techniky

Farmakokinetika subkutánně aplikovaného inzulínu závisí na asociačním chování inzulínu. Inzulín tvoří v neutrálním vodném roztoku hexamer. Když má inzulín dospět z tkáně do krevního řečiště a odtud na místo účinku, musí inzulín nejdříve projít stěnami kapilár. Předpokládá se, že takový průchod stěnami kapilár je možný pouze pro monomemí a dimemí inzulín, avšak v omezené míře k němu dochází nebo k němu nedochází vůbec v případě hexamemího inzulínu nebo v případě jeho vysokomolekulámích asociátů (Brange a kol., Diabetes Care: 13 (1990), strany 923 až 954; Kang a kol., Diabetes Care: 14 (1991), strany 942 až 948). Disociace hexameru inzulínu je proto nezbytným předpokladem pro rychlý přechod inzulínu ze subkutánní tkáně do krevního řečiště.

Asociační a agregační chování inzulínu je ovlivněno zinečnatými ionty (Zn⁴⁴), jejichž přítomnost vede ke stabilizaci hexameru inzulínu a při hodnotách pH okolo neutrální oblasti k tvorbě vysokomolekulámích agregátů a až kvysrážení. Zinečnaté ionty přidané k nepufrovanému roztoku lidského inzulínu (pH 4) však ovlivňují profil účinku inzulínu jen velmi málo. I když je takový roztok po injekci v subkutánní tkáni iychle neutralizován a dochází k tvorbě komplexu zinek-inzulin, nepostačuje přirozená schopnost lidského inzulínu vázat zinek ke stabilizaci hexameru a vyšších agregátů inzulínu. Proto není uvolňování lidského inzulínu přidáním zinečnatých iontů nikterak významně zpomaleno nebo oddáleno a nedochází v tomto případě k dosažení silného depotního účinku. Známé inzulínové hexamery vykazují obsah zinku odpovídající asi 2 molům Zn⁴⁴ na mol inzulínového hexameru (Blundell a kol., Adv. Protein Chem.: 26(1972), strany 323 až 328). Dva zinečnaté ionty jsou pevně vázány k inzulínovému hexameru a nemohou být odděleny obvyklou dialýzou. Byly sice popsány tak zvané 4—zinek-inzulinové krystaly, avšak tyto krystaly v průměru obsahují méně než tři molZn⁴⁴ na mol inzulínového hexameru (G.D. Smith a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA: 81, strany 7093 až 7097).

Cílem vynálezu je nalézt inzulínové deriváty, které by vykazovaly zvýšenou schopnost vázat zinek, které by vytvořily stabilní komplex obsahující inzulínový hexamer a Zn⁴⁴ a které by rovněž vykazovaly prolongovaný profil účinku při subkutánní injekci a to ve srovnání s lidským inzulínem.

Podstata vynálezu

Nyní byly nalezeny inzulíny obecného vzorce I s I (A 20}

Cye------Oys------- R³ - OH (A 11) | s

co,

R¹(B 1}

30}

-1 CZ 292274 B6 nebo/a fyziologicky přijatelné soli inzulínů obecného vzorce I, které splňují výše uvedená kritéria, přičemž v uvedeném obecném vzorci I

R¹ znamená fenylalaninový zbytek nebo atom vodíku,

R³ znamená geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek,

Y znamená geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek,

Z znamená a) aminokyselinový zbytek His nebo

b) peptid se 2 až 35 geneticky kódovatelnými aminokyselinovými zbytky obsahující 1 až 5 histidinových zbytků, a zbytky A2 až A20 odpovídající aminokyselinové sekvenci A-řetězce lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo inzulínového derivátu a zbytky B2 až B29 odpovídají aminokyselinové sekvenci B-řetězce lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo inzulínového derivátu.

Obzvláště výhodný je inzulín obecného vzorce I, ve kterém

R¹ znamená fenylalaninový zbytek,

R³ znamená aminokyselinový zbytek z množiny zahrnující Asn, Gly, Ser, Thr, Ala, Asp, Glu a Gin,

Y znamená aminokyselinový zbytek z množiny zahrnující Ala, Thr, Ser a His,

Z znamená a) aminokyselinový zbytek His nebo

b) peptid se 4 až 7 aminokyselinovými zbytky obsahující 1 nebo 2 histidinové zbytky.

Dále je výhodný inzulín obecného vzorce I, ve kterém

R¹ znamená fenylalaninový zbytek,

Y znamená aminokyselinový zbytek z množiny zahrnující Ala, Thr, Ser a His,

Z znamená a) aminokyselinový zbytek His nebo

b) peptid se 2 až 7 aminokyselinovými zbytky obsahující 1 nebo 2 histidinové zbytky.

Obzvláště výhodný je inzulín obecného vzorce I, ve kterém

Z znamená peptid s 1 až 5 aminokyselinovými zbytky obsahující 1 nebo 2 histidinové zbytky.

Zejména výhodný je inzulín obecného vzorce I, ve kterém

R¹ znamená fenylalaninový zbytek,

R³ znamená aminokyselinový zbytek z množiny zahrnující Asn a Gly,

Y znamená aminokyselinový zbytek z množiny zahrnující Thr a His a

-2CZ 292274 B6

Dále je výhodný inzulín obecného vzorce I, ve kterém R¹ znamená fenylalaninový zbytek, R³znamená glycinový zbytek, Y znamená threoninový zbytek a Z znamená peptid s 1 až 5 aminokyselinovými zbytky obsahující 1 nebo 2 histidinové zbytky.

Mimořádně výhodný je inzulín obecného vzorce I, ve kterém Z znamená peptid se sekvencí His His, His His Arg, Ala His His, Ala His His Arg, Ala Ala His His Arg nebo Ala Ala His His.

Aminokyselinová sekvence peptidů a proteinů je popsána od N-konce aminokyselinového řetězce. Údaje uvedené v obecném vzorci I v závorkách, například Al, A6, A7, All, A20, Bl, B7, B19 nebo B30, odpovídající poloze aminokyselinových zbytků v A nebo B-řetězci inzulínu.

Výraz „geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek“ znamená zbytky aminokyselin Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro a selenocystein.

Pod pojmem „zbytky A2 až A20“ a „zbytky B2 až B29“ zvířecího inzulínu se například rozumí aminokyselinové sekvence inzulínu z zvířecího dobytka, prasat nebo slepic.

Výraz zbytky A2 až A20 a B2 až B29 inzulínových derivátů znamená odpovídající aminokyselinové sekvence lidského inzulínu, které byly vytvořeny výměnou aminokyselin jinými geneticky kódovatelnými aminokyselinami.

A-Řetězec lidského inzulínu má následující sekvenci (SEQ IDNO:1):

Gly,	ile,	Val, Glu,	Gin, Cys, Cys, Thr,	Ser,	Ile,	Cys,	Ser,
Leu,	Tyr,	Gin, Leu,	Glu, Asn, Tyr, Cys,	Asn.
B-řetězec lidského inzulínu má následující sekvenci (SEQ ID NO:2):
Phe,	Val,	Asn, Gin,	His, Leu, Cys, Gly,	Ser,	His,	Leu,	Val,
Glu,	Ala,	Leu, Tyr,	Leu, Val, Cys, Gly,	Glu,	Arg,	Gly,	Phe,
Phe,	Tyr,	thr, Pro,	Lys, Thr.

Inzulínový derivát obecného vzorce I může být získán pomocí množiny geneticky-inženýrských konstruktů v mikroorganismech (EP 0 489 780, EP 0 347 781, EP 0 368 187, EP 0 453 969). Tyto konstrukty se exprimují v mikroorganismech, jakými jsou Escherichia coli nebo Streptomyceten v průběhu fermentace. Vytvořené proteiny se uloží uvnitř mikroorganismů (EP 0 489 780) nebo se vyloučí do fermentačního roztoku.

Příkladnými inzulíny obecného vzorce I jsou:

Gly(A21)-lidský inzulin-His(B3 l)-His(B32)-OH,

Gly(A21)-lidský inzulin-His(B3 l)-His(B32)-Arg(B33)-OH,

Gly(A21)-lidský inzulin-Ala(B3 l)-His(B32)-His(B33)-OH,

Gly(A21)-lidský inzulin-Ala(B3 l)-His(B32)-His(B33)-Arg(B34)-OH,

Gly(A21)-lidský inzulin-Ala(B3 l)-His(B32)-His(B33>-Arg(B34)-OH, Gly(A21)-lidský inzulin-Ala(B3 l)-His(B32)-His(B33)-Arg(B34)-Arg(B35)-OH.

Příprava inzulínových derivátů obecného vzorce I se hlavně provádí genotechnologicky prostřednictvím lokálně řízené (site-directed) mutageneze za použití standardních metod. Za tím účelem se konstruuje genová struktura kódující požadovaný inzulínový derivát, která se přivede k expresi v hostitelské buňce, výhodně v bakterii, jakou je Escherichia coli, nebo ve kvasnice, a v případě, že uvedená struktura kóduje fuzní protein, uvolní se zfuzního proteinu inzulínový derivát

-3CZ 292274 B6 obecného vzorce I; analogické metody jsou například popsané vEP-A-0 211 299, EP-A-0 227 938, EP-A-0 229 998, EP-A-0 286 956 a v DE-patentové přihlášce P 38 21 159.

Odštěpení podílu tvořeného fuzním proteinem se provede po otevření buňky buď chemicky pomocí halogenkyanu (o tom viz EP-A-0 180 920), nebo enzymaticky za použití lysostaphinu nebo trypsinu (o tom viz DE-A-37 39 347).

Inzulínový prekurzor se potom podrobí oxidační sulfotolýze, popsané například v: R.C. Marschall a A.S. Inglis, „Practical Protein Chemistry - A Handbook“ (nakl. A. Derbre) 1986, strany 49 až 53, načež se renaturuje v přítomnosti thiolu za tvorby přesných disulfídových můstků, například metodou popsanou G.H. Dixon-em a A.C. Wardlow-em v Nátuře (1960), strany 721 až 724.

Inzulínové prekurzory mohou však být také složeny přímo (EP-A-0 600 372, EP-A-0 668 292).

C-Peptid a presekvence (R² ve vzorci Π) v případě, že je přítomen, se potom odstraní tryptickým štěpením, například za použití metody Kemmler-a a kol. popsané v J.B.C. (1971), strany 6786 až 6791, a získaný inzulínový derivát obecného vzorce I se přečistí za použití známých technik, mezi které patří například chromatografie (například EP-A-0 305 760) a krystalizace.

Vynález se dále týká komplexů obsahujících inzulínový hexamer a asi 5 až 9 molů zinku na mol inzulínového hexameru, výhodně 5 až 7 molů Zn⁺⁺ na mol inzulínového hexameru, přičemž inzulínový hexamer je tvořen šesti inzulínovými molekulami obecného vzorce I.

Vazba zinku k inzulínovému hexameru je tak pevná, že 5 až 9 mol Zn^ na mol inzulínového hexameru nelze odstranit po 40 hodinách obvyklé dialýzy, prováděné například vodným lOmM Tris/HCl-pufirem, pH 7,4.

Inzulíny obecného vzorce I vykazují po subkutánní aplikaci v případě, že se nachází ve formě přípravku v podstatě prostého zinku (pH 4), pouze nepatrné prolongování účinku ve srovnání s lidským inzulínem. Po přidání asi 20 μg Zn²⁺/ml přípravku lze po subkutánní aplikaci pozorovat pozdější nástup účinku inzulínu. K protrahování účinku dochází výhodně při přítomnosti 40 pg Zn²⁺/ml. Vyšší koncentrace zinku tento účinek ještě zesiluj í.

Vynález se dále týká preproinzulinu obecného vzorce Π

R^z-R¹-B2-B29-Y-Z¹-Gly-A2-A20-R³ (H), ve kterém R³ a Y mají významy uvedené pro obecný vzorec I podle jednoho nebo několika nároků 1 až 6 a

R¹ znamená fenylalaninový zbytek nebo kovalentní vazbu,

R² znamená a) geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek nebo

b) peptid se 2 až 45 aminokyselinovými zbytky a zbytky A2-A20 a B2-B29 odpovídají aminokyselinovým sekvencím A- a B-řetězec lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo inzulínového derivátu, a

Z¹ znamená peptid se 2 až 40 geneticky kódovatelnými aminokyselinovými zbytky s 1 až 5 histidinovými (His) zbytky.

Proinzulin obecného vzorce Π je vhodný jako meziprodukt při přípravě inzulínů obecného vzorce I.

-4CZ 292274 B6

Obzvláště výhodnými jsou proinzuliny obecného vzorce Π, ve kterém R² znamená peptid se 2 až 15 aminokyselinovými zbytky, ve kterém je na karboxylovém konci aminokyselinový zbytek z množiny zahrnující Met, Lys a Arg.

Inzulínové deriváty obecného vzorce I nebo/a komplexy obsahující inzulínový hexamer a 5 až 9 molů Zn⁺⁺ na mol hexameru inzulínu nebo/a jejich fyziologicky přijatelné soli (například soli alkalických kovů a amonné soli) se hlavně používají jako účinné látky farmaceutických přípravků pro léčení diabetes, zejména diabetes mellitus.

Uvedeným farmaceutickým přípravkem je výhodně roztok nebo suspenze pro podání injekcí. Tento přípravek je charakterizován obsahem alespoň jednoho inzulínového derivátu obecného vzorce I nebo/a komplexu podle vynálezu nebo/a alespoň jednoho z jejich fyziologicky přijatelných solí v rozpouštěné, amorfní nebo/a krystalické formě, výhodně v rozpuštěné formě.

Uvedený přípravek má výhodně hodnotu pH asi 2,5 až 8,5, zejména asi 4,0 až 8,5 a obsahuje vhodné izotonizační činidlo, vhodné konzervační činidlo a případně vhodný pufr, jakož i výhodně také určitou koncentraci zinečnatých iontů, a to vše přirozeně ve sterilním vodném roztoku. Veškerý podíl složek přípravku kromě účinné látky tvoří nosičový roztok přípravku.

Přípravky obsahují roztoky inzulínu obecného vzorce I mají hodnotu pH 2,5 až 4,5, zejména 3,5 až 4,5, výhodně 4,0.

Přípravky obsahují suspenze inzulínu obecného vzorce I mají hodnotu pH 6,5 až 8,5, zejména 7,0 až 8,0, výhodně 7,4.

Vhodnými izotonizačními činidly jsou například glycerin, glukóza, mannit, chlorid sodný a vápenatý nebo hořečnaté sloučeniny, jako například chlorid vápenatý nebo chlorid hořečnatý.

Volbou izotonizačního činidla nebo/a konzervačních látek lze ovlivnit rozpustnost inzulínového derivátu nebo jeho fyziologicky přijatelných solí při mírně kyselých hodnotách pH.

Vhodnými konzervačními činidly jsou například fenol, m-kresol, benzylalkohol nebo/a ester kyseliny p-hydroxybenzoové.

Jako pufrovací látky, zejména pro nastavení hodnoty pH mezi asi 4,0 a 8,5, mohou být použity octan sodný, citran sodný nebo fosforečnan sodný. Jinak jsou k nastavení hodnoty pH vhodné také fyziologicky neškodné zředěné kyseliny (typicky HC1) nebo louhy (typicky NaOH).

V případě, že přípravek obsahuje podíl zinku, potom tento podíl činí 1 pg až 2 mg Zn⁺7ml, zejména 5 pg až 200 pg Zn^/ml.

Za účelem modifikace profilu účinku přípravku podle vynálezu mohou být přimíšeny také nemodifikovaný inzulín, například hovězí, prasečí nebo lidský inzulín, zejména lidský inzulín, nebo modifikované inzulíny, například monomemí inzulíny, rychle působící inzulíny nebo Gly(A21)Arg(B31 )-Arg(B32)-lidský inzulín.

Výhodnými koncentracemi účinné látky jsou koncentrace odpovídající asi 1 až 1500, výhodněji 5 až 1000 a zejména asi 40 až 400, mezinárodním jednotkám/ml.

V následující části popisu bude vynález blíže popsán pomocí příkladů jeho konkrétního provedení, přičemž tyto příklady mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen definicí patentových nároků.

-5CZ 292274 B6

Příklady provedení vynálezu

Přikladl

Příprava Gly(A21)-lidský inzulin-His(B3 l)-His(B32)-OH

Příprava expresivního systému se děje v podstatě postupem popsaným patentu US 5 358 857. V tomto dokumentu jsou popsány rovněž vektory pINT 90d a pINT 9ld (viz příklad 17) a PCR příměry TIR a Insull. Tyto čtyři složky slouží mezi jiným jako výchozí materiál pro dále popsané vektorové konstrukce.

Nejdříve se do sekvence kódující mini-proinzulin zavede kodon pro Gly(A21). K tomu účelu se použije pINT 9ld jako templát a PCR-reakce s primery TIR a Insu31.

Insu31 (SEQ ID NO: 10):

5'TTT TTT GTC GAC CTA TTA GCC GCA GTA GTT CTC CAG CTG 3'

PCR-Cyklus se provede následujícím způsobem: 1. minuta při 94 °C, 2. minuta při 55 °C, 3. minuta při 72 °C. Tento cyklus se opakuje 25 krát, načež se reakční směs inkubuje 7 minut při teplotě 72 °C a potom přes noc při teplotě 4 °C.

Získaný PCR-fragment se za účelem čištění vysráží v ethanolu, vysuší a potom digeruje v restrikčním pufru podle instrukcí výrobce za použití restrikčních enzymů NcOl a Sall. Reakční směs se potom rozdělí elektroforeticky a fragment NcOl-ore-proinzulin-Sall se izoluje. Restrikčními enzymy NcOl a Sall se také štěpí DNA plasmidu pINT90d a tímto způsobem se od zbytkového plasmidu pINT oddělí opičí proinzulinový fragment. Oba fragmenty se elektroforeticky oddělí a DNA plasmidu se izoluje. Tato DNA zreaguje s fragmentem NcOl-Sall-PCR v průběhu reakce za použití ligázy. Takto se získá plasmid pINT150d, který se po transformaci do E.Coli multiplikuje a potom opětovně izoluje.

DNA plasmidu pINT150d slouží jako výchozí materiál pro plasmid pINT302, který umožňuje přípravu požadované inzulínové varianty.

Ke konstrukci tohoto plasmidu se použije postup popsaný v patentu US 5 358 857 (viz příklad 6). Provedou se dvě vzájemně nezávislé PCR-reakce při použití DNA plasmidu pINT150d jako templátu. Jedna reakce se provede příměrovým párem TIR a pINTB5 (SEQ ID NO: 11):

5' GAT GCC GCG GTG GTG GGT CTT GGG TGT GTAG 3' a druhá se provede s příměrovým párem Insul 1 a pINT B6 (SEQ ID NO: 12):

5’ A CCC AAG ACC CAC CAC CGC GGC ATC GTG GAG 3'.

PCR-Fragmenty, které vzniknou, jsou parciálně komplementární, takže ve třetí PCR-reakci vedou k fragmentu, který kóduje Gly (A21) miniproinzulin prodloužený o polohu B31 a B32. Tento fragment se štěpí systémem NcOl a Sall a potom převede reakcí s DNA popsaného zbytkového plasmidu pINT90d za použití ligázy na plasmid pINT303. Tímto plasmidem transformovaný E.coli K12W3110 se potom fermentuje a zpracuje postupy popsanými v příkladu 4 patentu US 5 227 293. Preinzulinový derivát (před štěpením trypsinem) získaný jako meziprodukt má následující aminokyselinovou sekvenci:

preproinzulin 1 (SEQ ID NO:3):

-6CZ 292274 B6

Met	Ala	Thr	Thr Sér	Thr Gly	Asn	Ser Ala	Arg
Phe	Val	Asn	Gin His	Leu Cys	Gly	Ser His	Leu	Val Gj	Lu Ala
Tyr	Leu	val	Cys Gly	Glu Arg	Gly	Phe Phe	Tyr	Thr Pí	70 Lys
His	His	Arg-
Gly	Ile	Val	Glu Gin	Cys Cys	Thr	Ser Ile	Cys	Ser
Leu	Tyr	Gin	Leu Glu	Asn Tyr	Cys	Gly.

Preproinzulin 1 odpovídá obecnému vzorci Π, ve kterém

R² znamená peptid sil aminokyselinovými zbytky,

R¹ znamená Phe(B 1),

Y Thr(B30),

Z¹ His His Arg(B31-B33),

R³ Gly(A21)a

A2-A20 je aminokyselinová sekvence A-řetězec lidského inzulínu (aminokyselinové zbytky 2 až 20) a B2-B29 jsou aminokyselinová sekvence B-řetězce lidského inzulínu (aminokyselinové zbytky 2 až 29).

Preproinzulin 1 se štěpí trypsinem za použití postupu popsaného v příkladu 4 patentu US 5 227 293. Získaný produkt se potom převede reakcí s karboxypeptidázou B provedenou postupem popsaným v příkladu 11 na inzulín 1. Inzulín 1 odpovídá obecnému vzorci I, ve kterém

R¹ znamená Phe(B 1),

Y znamená Thr(B30),

Z znamená His His Arg (B31-B3332),

R³ znamená Gly(A21) a

A2-A20 jsou aminokyselinová sekvence A-řetězce lidského inzulínu (aminokyselinové zbytky 2 až 20) a B2-B29 jsou aminokyselinová sekvence B-řetězce lidského inzulínu (aminokyselinové zbytky 2 až 29).

Inzulín 1 má následující aminokyselinovou sekvenci:

Inzulín 1 (SEQIDNO:4):

B-Řetězec:

Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu

Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr His His

A-Řetězec:

Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser

Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Gly

Příklad 2

Příprava Gly(A21)-lidský inzulin-Ala(B31)-His(B32)-His(B33>-Arg(B34)-OH

Expresivní vektor se konstruuje způsobem popsaným v příkladu 1. Plasmid pINT150d slouží jako templát pro dvě vzájemně nezávislé PCR-reakce s primerovými páry T1R a pINT B7 (SEQIDNO:13):

5' GAT GCC GCG GTG GTG CGC GGT CTT GGG TGT GTAG 3' alnsull apINTB8 (SEQ ID NO: 14):

5' ACCC AAG ACC GCG CAC CAC CGC GGC ATC GTG GAG 3'.

PCR-Fragmenty, ke kterým vedou obě reakce, jsou částečně komplementární a takto poskytují při třetí PCR-reakci kompletní sekvenci, která kóduje požadovanou inzulínovou variantu. Fragment reakce se zpracuje systémem NcOl a Sall a potom liguje do NcOl/Sall otevřeného zbytkového plasmidu pINTT90d DNA. Získá se plasmid pINT303, který po transformaci v E.coli K12 W3110 slouží jako báze pro expresi požadovaného pre-miniproinzulinu. Fermentace a zpracování se provedou stejně jako v příkladu 1, přičemž se však nerealizuje reakce s karboxypeptidázou B. Získaný preproinzulinový derivát má následující aminokyselinovou sekvenci:

preproinzulin 2 (SEQIDNO:5):

Met

Ala

Thr

Ser

Thr

Gly

Asn

Ser

Ala

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Tyr

Thr

Pro Lys

Thr

Ala

His

Arg

Gly

Ile

Val

Glu

Gin

Cys

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Cly.

Preproinzulin 2 odpovídá obecnému vzorci Π, ve kterém

R¹ znamená Phe(B 1),

R² znamená peptid sil aminokyselinovými zbytky,

Y Thr(B30),

Z¹ Ala His His Arg(B31-B34),

R³ Gly(A21)a

Uvedený preproinzulin 2 se potom převede působením trypsinu na inzulín 2. Inzulín 2 odpovídá obecnému vzorci Π, ve kterém

R¹ znamená Phe(B 1),

-8CZ 292274 B6

Y znamená Thr(B30),

Z¹ znamená Ala His His Arg(B31-B3 4),

R³ znamená Gly(A21) a

Inzulín 2 má následující aminokyselinovou sekvenci:

inzulín 2 (SEQEDNO:6):

B-řetězec:

Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His His Arg,

A-řetězec:

Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser

Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Gly (disulfidové můstky, které jsou zobrazeny ve vzorci I).

Příklad 3

Příprava Gly(A21)-lidský inzulin-Ala(B231)-Ala(B32)-His(B33)-His(B34}-OH

Expresivní vektor se konstruuje způsobem popsaným v příkladu 1. Plasmid pJNT150d slouží jako templát pro dvě vzájemně nezávislé PCR-reakce s příměrovými páry T1R a pINT 316a (SEQ ID NO: 15):

5' GAT GCC GCG ATG ATG CGC CGC GGT CTT GGG TGT GTA G 3' a Insul 1 a pINT316d (SEQ ID NO: 16):

5' A CCC AAG ACC GCG GCG CAT CAT CGC GGC ATC GTG GAG 3'.

PCR-Fragmenty, ke kterým obě reakce vedou, jsou částečně komplementární a poskytují při třetí PCR-reakci kompletní sekvenci, která kóduje požadovanou inzulínovou variantu. Fragment reakce se zpracuje enzymy NcOl a Sall a potom se liguje do NcOl/Sall otevřeného zbytkového plasmidu plNT90d DNA. Získá se plasmid pINT316, který po transformaci v E.coli K12 W3110 slouží jako báze pro expresi požadovaného pre-miniproinzulinu. Fermentace a zpracování se provádí jako v příkladu 1, přičemž se neprovádí reakce s karboxypeptidázou B. Získaný preproinzulin 3 má následující aminokyselinovou sekvenci:

preproinzulin 3 (SEQIDNO:7):

-9CZ 292274 B6

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg

Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu

Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

Ala Ala His His Arg

Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser

Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Gly.

Preproinzulin 3 odpovídá vzorci Π, ve kterém

R¹ znamená Phe(B 1),

R² peptid sil aminokyselinovými zbytky

Y Thr(B30),

Z¹ Ala Ala His His Arg (B31-B35),

R³ Gly(A21)a

Preproinzulin 3 se potom převede trypsinem a karboxypeptidázou B jako v příkladu 11 na inzulín 3.

Inzulín 3 odpovídá obecnému vzorci I, ve kterém

R¹ znamená Phe(B 1),

Y znamená Thr(B30),

Z znamená Ala Ala His His(B31-B34),

R³ znamená Gly(A21) a

Inzulín 3 má následující aminokyselinovou sekvenci:

inzulín 3 (SEQIDNO:8):

B-řetězec:

Phe	Val	Asn	Gin	His Leu Cys Gly	Ser	His	Leu	Val	Glu	Ala	Leu
Tyr	Leu	Val	Cys	Gly Glu Arg Gly	Phe	Phe	Tyr	Thr	Pro	Lys	Thr
Ala	Ala	His	His

-10CZ 292274 B6

A-řetězec:

Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser

Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Gly (disulfidové můstky, které j sou zobrazeny ve vzorci I).

Příklad 4

Inzulín 2 připravený podle příkladu 2 se převede karbopeptidázou B postupem podle příkladu 11 na inzulín 4.

Inzulín 4 odpovídá vzorci I, ve kterém

R¹ znamená Phe(B 1),

Y znamená Thr(B30),

Z znamená Ala His His(B31-B33),

R³ Gly(A21)a

Inzulín 4 má následující aminokyselinovou sekvenci:

inzulín 4 (SEQ ID NO:9):

B-řetězec:

Phe	Val	Asn	Gin	His Leu Cys Gly Ser	His	Leu	Val Glu	Ala	Leu
Tyr	Leu	Val	Cys	Gly Glu Arg Gly Phe	Phe	Tyr	Thr Pro	Lys	Thr
Ala	His	His
A-řetězec:
Gly	Ile	Val	Glu	Gin Cys Cys Thr Ser	Tle	Cys Ser
Leu	Tyr	Gin	Leu	Glu Asn Tyr Cys Gly

(disulfidové můstky, které byly zobrazeny ve vzorci I).

Příklad 5

Vazba se zinkem inzulínových derivátů

Přípravek inzulínu (0,243 mM lidského inzulínu, 0,13 M NaCl, 0,1 % fenolu, 80 pg/ml (1,22 mM) Zn^, 10 mM Tris/HCl, pH 7,4) se dialyzuje při teplotě 15 °C proti 10 mM Tris/HClpufru pH 7,4, celkem po dobu 40 hodin (výměny pufru po 16 a 24 hodinách). Získaný dialyzát se potom okyselí a stanoví se vněm koncentrace inzulínu vysoko výkonnou kapalinovou chromatografii a koncentrace zinku absorpční spektroskopií. Obsahy zinku se korigují s obsahem zinku kontrolního subjektu, který neobsahuje žádný inzulín. Získané výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 1.

-11 CZ 292274 B6

Tabulka 1

	Moly zinku na mol inzulínového hexameru
Srovnávací inzulíny:
Lidský inzulín (HI)	1,98
Gly(A21)Des(B30)-HI	1,8
Gly(A21)Arg(B3 l)-Arg(B32)-HI	2,1
Inzulíny podle vynálezu obecného vzorce I
Gly(A2 l)His(B3 l)His(B32)-HI	6,53
Gly(A2 l)His(B3 l)His(B32)Arg(B33)-HI	5,29
Gly(A21)Ala(B3 l)His(B32)His(B33)-HI	6,73
Gly(A21)Ala(B31)His(B32)His(B33)Arg(B34)-HI	5,01

Příkladó

Závislost profilu účinku lidského inzulínu u psa na přítomnosti zinku

Aplikace: subkutánní

Dávka: 0,3 IE/kg, pH přípravku 4,0

Počet psů (n) na pokus je 6. V následující tabulce 2 jsou uvedeny hodnoty krevní glukózy v procentech, vztažených na výchozí hodnotu krevní glukózy.

Tabulka 2

Čas (h)	bez zinku	80 pg Zn/ml	160 pg Zn/ml
0	100	100	100
0,5	88,66	94,06	101,48
1	59,73	72,31	76,87
1,5	50,61	58,6	67,44
2	54,32	54,05	61,49
3	61,94	58,84	62,8
4	85,59	70,03	71,32
5	100,46	78,97	81,65
6	105,33	94,63	96,19
7	106	102,46	100,27
8	108,39	106,12	104,34
10	102,72	105,11	105,1
12	105,03	107,14	103,02

Příklad 7

Profil účinku Gly(A21)Ala(B31)His(B32),His(B33),Arg(B34)-lidského inzulínu u psa (inzulín 2)

Inzulín připravený podle příkladu 2 byl použit v následující formulaci:

glycerin 20 mg/ml, m-kresol 2,7 mg/ml, inzulín 2 40 IE/ml. Symbol IE znamená mezinárodní jednotku, která odpovídá asi 6 nmolům inzulínu, například lidského inzulínu nebo inzulínu vzorce I. Hodnota pH formulace se nastaví pomocí hydroxidu sodného nebo kyseliny chlorovodíkové.

-12CZ 292274 B6

Aplikace: subkutánní, dávka: 0,3 IE/kg.

Počet pokusných psů na pokus je 6. Hodnota pH formulace činí 4,0. V následující tabulce 3 jsou uvedeny hodnoty krevní glukózy v procentech, vztaženo na výchozí hodnotu krevní glukózy.

Tabulka 3

Čas (h)	bez zinku	20 pg Zn/ml	40 pg Zn/ml	80 pg Zn/ml
0	100	100	100	100
1	74,38	95,24	95,6	102,06
2	48,27	90,11	78,74	97,44
3	57,67	89,96	84,81	90,44
4	74,2	81,35	74,66	88,69
5	91,68	74,43	75,71	79,7
6	100,79	71,61	67,37	65,26
7	98,5	67,73	66,05	62,17
8	100,54	68,92	64,97	47,71

Příklad 8

Profil účinku Gly(A21)Ala(B31)His(B32),His(B33)-lidského inzulínu u psa (inzulín 4)

Inzulín 4 připravený podle příkladu 4 byl formulován a použit stejně jako v příkladu 7.

Aplikace: subkutánní, dávka: 0,3 IE/kg, počet psů (n) na pokus: 6, hodnota pH formulace: 4,0.

V následující tabulce 4 jsou uvedeny hodnoty krevní glukózy v procentech, vztaženo na výchozí hodnotu krevní glukózy.

Tabulka 4

Čas (h)	bez zinku	20 pg Zn/ml	40 pg Zn/ml	80 pg Zn/ml
0	100	100	100	100
1	61,51	70	96,52	101,77
2	49,82	52,55	89,28	90,01
3	55,66	60,13	80,23	70,79
4	78,09	78,46	73,03	68,48
5	94,27	97,7	70,3	74,94
6	103,69	105,27	61,86	74,1
7	105,51	106,48	62,28	76,42
8	108,05	104,51	81,68	88

Příklad 9

Profil účinku Gly(A21)His(B3 l),His(B32)-lidského inzulínu u psa (inzulín 1)

Inzulín 1 připravený podle příkladu 1 byl formulován a použit stejně jako v příkladu 7.

-13CZ 292274 B6

Aplikace: subkutánně, dávka: 0,3 IE/kg, počet psů (n) na pokus: 6, hodnota pH formulace: 4,0.

V následující tabulce 5 jsou uvedeny hodnoty krevní glukózy v procentech, vztaženo na výchozí hodnotu krevní glukózy.

Tabulka 5

Čas (h)	bez zinku	20 pg Zn/ml	40 pg Zn/ml	80 pg Zn/ml
0	100	100	100	100
1	60,71	73,16	100,25	102,86
2	52,29	55,43	94,86	100,19
3	61,74	61,6	89,37	89,12
4	79,93	81,53	81,55	79,19
5	96,17	96,84	73,06	70,67
6	103,2	102,43	74,58	75,75
7	110,86	104,75	77,68	79,36
8	113,42	108,14	84,87	78,74

Příklad 10

Profil účinku Gly(A21)Ala(B31)Ala(B32)His(B33)His(B34)-lidského inzulínu u psa (inzulín 3)

Inzulín 3 připravený podle příkladu 1 se formuluje a použije stejně jako v příkladu 7.

Aplikace: subkutánně, délka: 0,3 IE/kg, počet psů (n) na pokus: 6, hodnota pH přípravku: 4,0.

V následující tabulce 6 jsou uvedeny hodnoty krevní glukózy v procentech, vztaženo na výchozí hodnotu krevní glukózy.

Tabulka 6

Čas (h)	bez zinku	20 pg Zn/ml	40 pg Zn/ml	80 pg Zn/ml
0	100	100	100	100
1	75	99	101	99
2	57	77	96	91
3	58	64	84	80
4	82	65	73	79
5	94	70	68	77
6	100	74	72	76
7	96	81	80	69
8	100	90	88	75
9	100	96	94	83
10	95	98	92	87
12	98	99	95	94
14	95	100	94	93

-14CZ 292274 B6

Příklad 11

Příprava inzulínu 1 z preproinzulinu 1

200 mg inzulínu sArg na karboxylovém konci B-řetězce, připraveného podle příkladu 1 se rozpustí v 95 ml lOmM roztoku kyseliny chlorovodíkové. Po přidání 5 ml 1M Tris/HCl-pufiru (tris(hydroxymethyl)aminomethan), pH 8, se nastaví hodnota pH na 8 pomocí kyseliny chlorovodíkové nebo hydroxidu sodného.

Přidá se 0,1 mg karboxypeptidázy. Po 90 minutách je dokončeno odštěpení argininu. Reakční směs se přidáním kyseliny chlorovodíkové upraví na hodnotu pH 3,5, načež se zavede na sloupec s reverzní fází (PLRP-S RP 300 10 μ, 2,5 x 30 cm, Polymer Laboratories Amherst, MA, USA). Mobilní fáze A je tvořena vodou obsahující 0,1 % kyseliny trifluoroctové. Fáze B sestává s acetonitrilu obsahujícího 0,09 % kyseliny trifluoroctové. Sloupec se projevuje při průtoku 5 ml/min. Po nanesení se sloupec promyje 150 ml fáze A. K frakcionační eluci dochází za použití lineárního gradientu od 22,5 do 40 % B v průběhu 400 minut. Jednotlivé získání frakce se jednotlivě analyzují analytickou vysoko výkonnou kapalinovou chromatografií s reverzní fází a frakce obsahující Des-Arg-inzulin v dostatečné čistotě se sloučí. Hodnota pH se nastaví hydroxidem sodným na 3,5 a acetonitril se odežene v rotační odparce. Des-Arg-inzulin se potom vysráží nastavením hodnoty pH 6,5. Sraženina se odstředí, dvakrát se promyje vždy 50 ml vody a nakonec se lyofilizuje. Výtěžek činí 60 až 80 % inzulínu 1.

Seznam sekvencí

Informace o sekvenci SEQ ID NO: 1

Charakteristika sekvence: délka: 21 aminokyselin druh: aminokyselina počet řetězců: jediný topologie; lineární typ molekuly: protein původ: organismus: Escherichia coli

Popis sekvence: SEQ ID NO: 1

Cly ile Val Clu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu

5 10 15

Clu Asn Tyr Cys Asn

Informace o sekvenci SEQ ID NO: 2

Charakteristika sekvence: délka: 30 aminokyselin druh: aminokyselina počet řetězců: jediný topologie: lineární typ molekuly: protein původ: organismus: Escherichia coli

-15CZ 292274 B6

Popis sekvence: SEQ ID NO: 2

Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

25 30

Informace o sekvenci SEQ ID NO: 3

Charakteristika sekvence:

délka: 65 aminokyselin druh: aminokyselina počet řetězců: jediný topologie: lineární typ molekuly: protein původ: organismus: Escherichia coli

Popis sekvence: SEQ ID NO: 3

Met 1

Ala

Thr

Ser 5

Thr

Gly

Asn

Sér

Ala 10

Arg

Phe

Val

Asn

Gin 15

His

Leu

Cys

Gly

Ser 20

His

Leu

Val

Glu

Ala 25

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys 30

oiy·

Glu

Arg

Gly

Phe 35

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys 40

Thr

Hle

His

Arg

Gly 45

Ile

Val

Glu

Gin

Cys

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Týr

cys

55 60

Gly

Informace o sekvenci SEQ ID NO: 4

Charakteristika sekvence: délka: 53 aminokyselin druh: aminokyselina počet řetězců: jediný topologie: lineární typ molekuly: protein původ: organismus: Escherichia coli

Popis sekvence: SEQ ID NO: 4

Phé

val

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

val

Glu

Ala

Leu

Tyr

1

5

10

15

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Thr

His

20

25

30

Gly

Ile

Val

Glu

Gin

Cys

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

35

40

45

Glu

Asn

Tyr

cys

Gly

Informace o sekvenci SEQ ID NO: 5

Charakteristika sekvence: délka: 66 aminokyselin

-16CZ 292274 B6 druh: aminokyselina počet řetězců: jediný topologie: lineární typ molekuly: protein původ: organismus: Escherichia coli

Popis sekvence: SEQ ID NO: 5

Met

Ala

Thr Thr

Ser

Thr

Gly

Asn Sér

Ala

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

1

5

10

15

Leu

Cys

Gly Ser 20

His

Leu

Val

Glu Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

25

30

Arg

Gly

Phe Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys Thr 40

Ala

His

Arg

Gly

ile

35

45

Glu

Gin

Cys Cys

Thr

Ser

Ile

cys ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

50

55

60

His

Glu val

Tyr

Cys Gly

Informace o sekvenci SEQ ID NO: 6

Charakteristika sekvence: délka: 55 aminokyselin druh: aminokyselina počet řetězců: jediný topologie: lineární typ molekuly: protein původ: organismus: Escherichia coli

Popis sekvence: SEQ ID NO: 6

Phe 1

Val

Asn

Gin

His 5

Leu

Cys

Gly

ser

His 10

Leu

val

Glu

Ala

Leu 15

Tyr

Leu

Val

cys

Gly 20

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe 25

Tyr

Thr

Pro

Lys

Thr 30

Ala

His

Arg

Gly 35

Ile

Val

Glu

Gin

Cys 40

Cys

Thr

Ser

Ile

Cys 45

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu 50

Glu

Asn

Tyr

Cys

Gly 55

Informace o sekvenci SEQ ID NO: 7

Charakteristika sekvence: délka: 67 aminokyselin druh: aminokyselina počet řetězců: jediný typ molekuly: protein původ: organismus: Escherichia coli

-17CZ 292274 B6

Popis sekvence: SEQ ID NO: 7

Met

Ala

Ser Ala Arg Phe val Asn Gin His 10

Leu

Cys

Ala Leu

Arg

Phe Phe Tyr Thr Pro Lys

40

Thr Ala

Ala His

His Arg Gly Ile

Vál Glu

Gin Cys Cys Thr Ser

Ile

Čys šer

Leu

Tyr

Gin

Leu Glu Asn

Tyr Cys

Informace o sekvenci SEQ ID NO: 8

Popis sekvence: SEQ ID NO: 8

Phe 1

Val

Asn

Gin

His 5

Leu

Cys

Gly

Ser

His 10

Leu

Val

Glu

Ala

Leu 15

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly 20

G1U

Arg

Gly

Phe

Phe 25

Tyr

Thr

Pro

LyS

Thr 30

Ala

His

Gly 35

Ile

Val

Glu

Gin

Cys 40

Cys

Thr

Ser

Ile

Cys 45

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu 50

Glu

Asn

Tyr

Cys

Gly 55

Informace o sekvenci SEQ ID NO: 9

Charakteristika sekvence: délka: 54 aminokyselin druh: aminokyselina počet řetězců: jediný topologie: lineární typ molekuly: protein původ: organismus: Escherichia coli

Popis sekvence: SEQ ID NO: 9

Phe 1

Val

Asn

Gin

His 5

Leu

Cys

Gly

Ser

His 10

Leu

Val

Glu

Ala

Leu 15

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly 20

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe 25

Tyr

Thr

Pro

Lys

Thr 30

Ala

His

Gly

Ile 35

Val

Glu

Gin

Cys

Cys 40

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser 45

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu 50

Asn

Tyt

Cys

Gly

-18CZ 292274 B6

Informace o sekvenci SEQ ID NO: 10

Charakteristika sekvence: délka: 39 párů bází druh: nukleová kyselina počet řetězců: jediný topologie: lineární typ molekuly: DNA (genomová).

Popis sekvence: SEQ ID NO: 10

TTTTTTGTCG ACCTATTAGC CGCAGTAGTT CTCCAGCTG

Informace o sekvenci SEQ ID NO: 11

Charakteristika sekvence: délka: 31 párů bází druh: nukleová kyselina počet řetězců: jediný topologie: lineární typ molekuly: DNA (genomová).

Popis sekvence: SEQ ID NO: 11

GATGCCGCGG TGGTGGGTCT TGGGTGTGTA G

Informace o sekvenci SEQ ID NO: 12

Charakteristika sekvence: délka: 31 párů bází druh: nukleová kyselina počet řetězců: jediný topologie: lineární typ molekuly: DNA (genomová)

Popis sekvence: SEQ ID NO: 12

ACCCAAGACC CACCACCGCG GCATCGTGGA G

Informace o sekvenci SEQ ID NO: 13

Charakteristika sekvence: délka: 34 párů bází druh: nukleová kyselina počet řetězců: jediný topologie: lineární typ molekuly: DNA (genomová).

Popis sekvence: SEQ ID NO: 13

GATGCCGCGG TGGTGCGCGG TČTTGGGTGT GTAG

Informace o sekvenci SEQ ID NO: 14

Charakteristika sekvence: délka: 34 párů bází druh: nukleová kyselina počet řetězců: jediný topologie: lineární

-19CZ 292274 B6 typ molekuly: DNA (genomová).

Popis sekvence: SEQ ID NO: 14

ACCCAAGACC GCGCACCACC GCGGCATCGT GGAG

Informace o sekvenci SEQ ID NO: 15

Charakteristika sekvence: délka: 37 párů bází druh: nukleová kyselina počet řetězců: jediný topologie: lineární typ molekuly: DNA (genomová).

Popis sekvence: SEQ ID NO: 15

GATGCCGCGA TGATGCGCCG CGGTCTTGGG TGTGTAG

Informace o sekvenci SEQ ID NO: 16

Popis sekvence: SEQ ID NO: 16

ACCCAAGACC GCGGCGCATC ATCGCGGCAT CGTGGAG

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1.

R³ - OH (D,

R¹ -------Cys-...,,. .........

(B1) (B7)

Cys— (B 19)

Y-Z (B 30)

-20GZ 292274 B6 nebo fysiologicky přijatelná sůl inzulínu obecného vzorce I, přičemž v uvedeném obecném vzorci I

R¹ znamená fenylalaninový zbytek nebo atom vodíku,

R³ znamená geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek,

Y znamená geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek,

Z znamená a) histidinový zbytek nebo

b) peptid se 2 až 35 geneticky kódovatelnými aminokyselinovými zbytky obsahující 1 až 5 histidinových zbytků, a zbytky A2 až A20 odpovídají aminokyselinové sekvenci A-řetězce lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo inzulínového derivátu a zbytky B2 až B26 odpovídají aminokyselinové sekvenci B-řetězce lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo inzulínového derivátu.
2. Inzulín podle nároku 1 obecného vzorce I, ve kterém

R¹ znamená fenylalaninový zbytek,

R³ znamená aminokyselinový zbytek z množiny zahrnující Asn, Gly, Thr, Ala, Asp, Glu a Gin,

Y znamená aminokyselinový zbytek z množiny zahrnující Ala, Thr, Ser a His,

Z znamená a) hisitidinový zbytek nebo

b) peptid se 4 až 7 aminokyselinovými zbytky obsahující 1 nebo 2 histidinové zbytky.
3. Inzulín podle nároku 1 obecného vzorce I, ve kterém

R¹ znamená fenylalaninový zbytek,

R³ znamená aminokyselinový zbytek z množiny zahrnující Asn, Gly, Ser, Thr, Ala, Asp, Glu a Gin,

Y znamená aminokyselinový zbytek z množiny zahrnující Ala, Thr, Ser a His,

Z znamená a) histidinový zbytek nebo

b) peptid se 2 až 7 aminokyselinovými zbytky obsahující 1 nebo 2 histidinové zbytky.
4. Inzulín podle nároku 3 obecného vzorce I, ve kterém Z znamená peptid s 2 až 5 aminokyselinovými zbytky obsahující 1 nebo 2 histidinové zbytky.
5. Inzulín podle jednoho nebo několika nároků 1 až 4 obecného vzorce I, ve kterém

R¹ znamená fenylalaninový zbytek,

R³ znamená aminokyselinový zbytek z množiny zahrnující Asn a Gly,

Y znamená aminokyselinový zbytek z množiny zahrnující Thr a His a

Z znamená peptid s 2 až 5 aminokyselinovými zbytky obsahující 1 nebo 2 histidinové zbytky.
6. Inzulín podle nároku 1 obecného vzorce I, ve kterém R¹ znamená fenylalaninový zbytek, R³znamená glycinový zbytek, Y znamená threoninový zbytek a Z znamená peptid s 2 až 5 aminokyselinovými zbytky obsahující 1 nebo 2 histidinové zbytky.
7. Inzulín podle nároku 6 obecného vzorce I, ve kterém Z znamená peptid se sekvencí His His, His His Arg, Ala His His, Ala His His Arg, Ala Ala His His Arg nebo Ala Ala His His.
8. Komplexy obsahující inzulínový hexamer a 5 až 9 mol zinku na mol inzulínového hexameru, zejména 5 až 7 mol zinku na mol inzulínového hexameru, přičemž inzulínový hexamer je

-21CZ 292274 B6 tvořen šesti inzulínovými molekulami obecného vzorce I podle jednoho nebo několika nároků 1 až 7.
9. Farmaceutický přípravek, vyznačený tím, že obsahuje účinné množství alespoň jednoho inzulínu obecného vzorce I nebo/a alespoň jedné fyziologicky přijatelné soli inzulínu obecného vzorce I podle jednoho nebo několika nároků 1 až 8 v rozpuštěné, amorfní nebo/a krystalické formě.
10. Farmaceutický přípravek podle nároku 9, vyznačený tím, že obsahuje dodatečné množství 1 pg až 2 mg, výhodně 5 pg až 200 pg, zinku/ml.
11. Farmaceutický přípravek podle nároků 9 nebo 10, vyznačený tím, že má hodnotu pH2,5 až 8,5.
12. Farmaceutický přípravek podle jednoho nebo několika nároků 9 až 11, vyznačený tím, že má pH 2,5 až 4,5.
13. Farmaceutický přípravek podle jednoho nebo několika nároků 9 až 12, vyznačený tím, že obsahuje dodatečné množství nemodifikovaného inzulínu, výhodně nemodifikovaného lidského inzulínu, nebo modifikovaného inzulínu, výhodně Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)lidského inzulínu.
14. Proinzulin obecného vzorce Π

R²-R¹-B2-B29-Y-Z¹-Gly-A2-A20-R³ (Π), ve kterém

R³ a Y mají významy uvedené pro obecný vzorec I v jednom nebo několika nárocích 1 až 7,

R¹ znamená fenylalaninový zbytek nebo kovalentní vazbu,

R² znamená a) geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek nebo

b) peptid se 2 až 45 aminokyselinovými zbytky a zbytky A2-A20 a B2-B29 odpovídají aminokyselinovým sekvencím A- a B-řetězce lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo inzulínového derivátu, a

Z¹ znamená peptid se 2 až 40 geneticky kódovatelnými aminokyselinovými zbytky s 1 až 5 histidinovými zbytky.
15. Proinzulin podle nároku 14 obecného vzorce Π, ve kterém R² znamená peptid se 2 až 25 aminokyselinovými zbytky.
16. Proinzulin podle 14 nebo 15 obecného vzorce Π, ve kterém R² znamená peptid se 2 až 15 aminokyselinovými zbytky, přičemž na karboxylovém konci je aminokyselinový zbytek z množiny zahrnující Met, Lys a Arg.