JPH1072496A - 亜鉛結合が増大したインシュリン誘導体 - Google Patents
亜鉛結合が増大したインシュリン誘導体Info
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- JPH1072496A JPH1072496A JP9200002A JP20000297A JPH1072496A JP H1072496 A JPH1072496 A JP H1072496A JP 9200002 A JP9200002 A JP 9200002A JP 20000297 A JP20000297 A JP 20000297A JP H1072496 A JPH1072496 A JP H1072496A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 亜鉛結合が増大されたインシュリン誘導体の
提供。 【解決手段】 このインシュリン誘導体は、式Ｉ 【化１】 （式中、Ｚはヒスチジン残基であるか、または１〜５個
のヒスチジン残基を含有する、２〜３５個の遺伝学的に
コード化可能なアミノ酸残基を有するペプチドである）
を有し、糖尿病の治療のための薬剤の製造に適してい
る。式Ｉのインシュリンは亜鉛との複合体を形成し、こ
の複合体はインシュリンヘキサマーとヘキサマー１モル
につき約５〜９モルの亜鉛を含有する。
提供。 【解決手段】 このインシュリン誘導体は、式Ｉ 【化１】 （式中、Ｚはヒスチジン残基であるか、または１〜５個
のヒスチジン残基を含有する、２〜３５個の遺伝学的に
コード化可能なアミノ酸残基を有するペプチドである）
を有し、糖尿病の治療のための薬剤の製造に適してい
る。式Ｉのインシュリンは亜鉛との複合体を形成し、こ
の複合体はインシュリンヘキサマーとヘキサマー１モル
につき約５〜９モルの亜鉛を含有する。
Description
【０００１】皮下投与されるインシュリンの薬物動態学
はその会合作用に依存する。インシュリンは中性の水溶
液中でヘキサマー（６量体）を形成する。インシュリン
が組織から血流に入り、作用部位に達する場合、それは
最初に毛細管の壁を通過しなければならない。モノマー
およびダイマーのインシュリンはこれができるが、ヘキ
サマーのインシュリンや比較的高分子量の会合体は全く
できないか、できてもほんの僅かであると考えられる
（Brangeらの「糖尿病のケア」、１３、第９２３〜９５
４頁（１９９０年）；Kangらの「糖尿病のケア」、１
４、第９４２〜９４８頁（１９９１年))。したがって、
ヘキサマーの解離は皮下組織から血流への迅速な通過の
前提条件である。
はその会合作用に依存する。インシュリンは中性の水溶
液中でヘキサマー（６量体）を形成する。インシュリン
が組織から血流に入り、作用部位に達する場合、それは
最初に毛細管の壁を通過しなければならない。モノマー
およびダイマーのインシュリンはこれができるが、ヘキ
サマーのインシュリンや比較的高分子量の会合体は全く
できないか、できてもほんの僅かであると考えられる
（Brangeらの「糖尿病のケア」、１３、第９２３〜９５
４頁（１９９０年）；Kangらの「糖尿病のケア」、１
４、第９４２〜９４８頁（１９９１年))。したがって、
ヘキサマーの解離は皮下組織から血流への迅速な通過の
前提条件である。
【０００２】インシュリンの会合および凝集作用はＺｎ
2+に影響され、それはヘキサマーを安定化し、中性付近
のpHで比較的高分子量の凝集物を生成し、沈殿が起こ
る。しかしながら、ヒトインシュリンの非緩衝溶液（pH
４）への添加剤としてのＺｎ2+は作用プロフィールにほ
んの僅かしか影響を与えない。そのような溶液は注射時
皮下組織において迅速に中和され、インシュリン−亜鉛
複合体が生成するが、ヒトインシュリンと亜鉛の自然な
結合はヘキサマーおよびより大きな凝集物を安定化する
のに不十分である。そのためＺｎ2+の添加によりヒトイ
ンシュリンの放出が著しく遅れることはなく、強力な貯
留効果が達成される。知られているインシュリンヘキサ
マーはインシュリンヘキサマー１モルにつき約２モルの
Ｚｎ2+を含有する（BlundellらのAdv. Protein Chem.
２６, 第３２３〜３２８頁（１９７２年))。インシュリ
ンヘキサマー１個につき２個のＺｎ2+イオンがしっかり
とインシュリンヘキサマーに結合し、そしてこれらは通
常の透析により除去することができない。いわゆる４−
亜鉛インシュリン結晶は一般によく知られているが、こ
れらの結晶は平均してインシュリンヘキサマー１モルに
つき３モル未満のＺｎ 2+しか含有しない（G. D. Smith
らのProc. Natl. Acad. Sci. USA：８１、第７０９３〜
７０９７頁）。
2+に影響され、それはヘキサマーを安定化し、中性付近
のpHで比較的高分子量の凝集物を生成し、沈殿が起こ
る。しかしながら、ヒトインシュリンの非緩衝溶液（pH
４）への添加剤としてのＺｎ2+は作用プロフィールにほ
んの僅かしか影響を与えない。そのような溶液は注射時
皮下組織において迅速に中和され、インシュリン−亜鉛
複合体が生成するが、ヒトインシュリンと亜鉛の自然な
結合はヘキサマーおよびより大きな凝集物を安定化する
のに不十分である。そのためＺｎ2+の添加によりヒトイ
ンシュリンの放出が著しく遅れることはなく、強力な貯
留効果が達成される。知られているインシュリンヘキサ
マーはインシュリンヘキサマー１モルにつき約２モルの
Ｚｎ2+を含有する（BlundellらのAdv. Protein Chem.
２６, 第３２３〜３２８頁（１９７２年))。インシュリ
ンヘキサマー１個につき２個のＺｎ2+イオンがしっかり
とインシュリンヘキサマーに結合し、そしてこれらは通
常の透析により除去することができない。いわゆる４−
亜鉛インシュリン結晶は一般によく知られているが、こ
れらの結晶は平均してインシュリンヘキサマー１モルに
つき３モル未満のＺｎ 2+しか含有しない（G. D. Smith
らのProc. Natl. Acad. Sci. USA：８１、第７０９３〜
７０９７頁）。
【０００３】本発明の目的はヒトインシュリンと比べて
増大した亜鉛結合力を有し、インシュリンヘキサマーお
よびＺｎ2+を含有する安定な複合体を形成し、そして皮
下注射において遅延型作用プロフィールを有するインシ
ュリン誘導体を見い出すことである。
増大した亜鉛結合力を有し、インシュリンヘキサマーお
よびＺｎ2+を含有する安定な複合体を形成し、そして皮
下注射において遅延型作用プロフィールを有するインシ
ュリン誘導体を見い出すことである。
【０００４】今般、上記の特徴を満たす式Ｉ
【化２】 〔式中、Ｒ1はフェニルアラニン残基または水素原子で
あり、Ｒ3は遺伝学的にコード化可能なアミノ酸残基で
あり、Ｙは遺伝学的にコード化可能なアミノ酸残基であ
り、Ｚはａ） アミノ酸残基Ｈｉｓであるか、または ｂ） １〜５個のヒスチジン残基を含有する２〜３５個
の遺伝学的にコード化可能なアミノ酸残基を有するペプ
チドであり、残基Ａ２〜Ａ２０はヒトインシュリン、動
物インシュリンまたはインシュリン誘導体のＡ鎖のアミ
ノ酸配列に相当し、そして残基Ｂ２〜Ｂ２９はヒトイン
シュリン、動物インシュリンまたはインシュリン誘導体
のＢ鎖のアミノ酸配列に相当する〕のインシュリンおよ
び／またはその生理学的に許容しうる塩を見い出した。
あり、Ｒ3は遺伝学的にコード化可能なアミノ酸残基で
あり、Ｙは遺伝学的にコード化可能なアミノ酸残基であ
り、Ｚはａ） アミノ酸残基Ｈｉｓであるか、または ｂ） １〜５個のヒスチジン残基を含有する２〜３５個
の遺伝学的にコード化可能なアミノ酸残基を有するペプ
チドであり、残基Ａ２〜Ａ２０はヒトインシュリン、動
物インシュリンまたはインシュリン誘導体のＡ鎖のアミ
ノ酸配列に相当し、そして残基Ｂ２〜Ｂ２９はヒトイン
シュリン、動物インシュリンまたはインシュリン誘導体
のＢ鎖のアミノ酸配列に相当する〕のインシュリンおよ
び／またはその生理学的に許容しうる塩を見い出した。
【０００５】Ｒ1はフェニルアラニン残基であり、Ｒ3は
Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇ
ｌｕおよびＧｌｎからなる群より選択されるアミノ酸残
基であり、ＹはＡｌａ、Ｔｈｒ、ＳｅｒおよびＨｉｓか
らなる群より選択されるアミノ酸残基であり、Ｚはａ）
アミノ酸残基Ｈｉｓであるか、または ｂ） １または２個のヒスチジン残基を含有する、４〜
７個のアミノ酸残基を有するペプチドである式Ｉのイン
シュリンが特に好ましい。
Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇ
ｌｕおよびＧｌｎからなる群より選択されるアミノ酸残
基であり、ＹはＡｌａ、Ｔｈｒ、ＳｅｒおよびＨｉｓか
らなる群より選択されるアミノ酸残基であり、Ｚはａ）
アミノ酸残基Ｈｉｓであるか、または ｂ） １または２個のヒスチジン残基を含有する、４〜
７個のアミノ酸残基を有するペプチドである式Ｉのイン
シュリンが特に好ましい。
【０００６】さらに、Ｒ1はフェニルアラニン残基であ
り、Ｒ3はＡｓｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、
Ａｓｐ、ＧｌｕおよびＧｌｎからなる群より選択される
アミノ酸残基であり、ＹはＡｌａ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒおよ
びＨｉｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であ
り、Ｚはａ） アミノ酸残基Ｈｉｓであるか、または ｂ） １または２個のヒスチジン残基を含有する、２〜
７個のアミノ酸残基を有するペプチドである、式Ｉのイ
ンシュリンが好ましい。Ｚは１または２個のヒスチジン
残基を含有する、１〜５個のアミノ酸残基を有するペプ
チドである式Ｉのインシュリンが特に好ましい。
り、Ｒ3はＡｓｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、
Ａｓｐ、ＧｌｕおよびＧｌｎからなる群より選択される
アミノ酸残基であり、ＹはＡｌａ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒおよ
びＨｉｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であ
り、Ｚはａ） アミノ酸残基Ｈｉｓであるか、または ｂ） １または２個のヒスチジン残基を含有する、２〜
７個のアミノ酸残基を有するペプチドである、式Ｉのイ
ンシュリンが好ましい。Ｚは１または２個のヒスチジン
残基を含有する、１〜５個のアミノ酸残基を有するペプ
チドである式Ｉのインシュリンが特に好ましい。
【０００７】Ｒ1はフェニルアラニン残基であり、Ｒ3は
ＡｓｎおよびＧｌｙからなる群より選択されるアミノ酸
残基であり、ＹはＴｈｒおよびＨｉｓからなる群より選
択されるアミノ酸残基であり、そしてＺは１または２個
のヒスチジン残基を含有する、１〜５個のアミノ酸残基
を有するペプチドである式Ｉのインシュリンが特に好ま
しい。さらにＲ1はフェニルアラニン残基であり、Ｒ3は
グリシン残基であり、Ｙはトレオニン残基であり、そし
てＺは１または２個のヒスチジン残基を含有する１〜５
個のアミノ酸残基を有するペプチドである式Ｉのインシ
ュリンが好ましい。
ＡｓｎおよびＧｌｙからなる群より選択されるアミノ酸
残基であり、ＹはＴｈｒおよびＨｉｓからなる群より選
択されるアミノ酸残基であり、そしてＺは１または２個
のヒスチジン残基を含有する、１〜５個のアミノ酸残基
を有するペプチドである式Ｉのインシュリンが特に好ま
しい。さらにＲ1はフェニルアラニン残基であり、Ｒ3は
グリシン残基であり、Ｙはトレオニン残基であり、そし
てＺは１または２個のヒスチジン残基を含有する１〜５
個のアミノ酸残基を有するペプチドである式Ｉのインシ
ュリンが好ましい。
【０００８】ＺはHis His, His His Arg, Ala His His,
Ala His His Arg, Ala Ala His His ArgまたはAla Ala
His His 配列を有するペプチドである式Ｉのインシュ
リンが特に好ましい。ペプチドおよびタンパク質のアミ
ノ酸配列はアミノ酸鎖のＮ−末端以降から表示される。
式Ｉの括弧内の記号、例えばＡ１、Ａ６、Ａ７、Ａ１
１、Ａ２０、Ｂ１、Ｂ７、Ｂ１９またはＢ３０はインシ
ュリンのＡまたはＢ鎖のアミノ酸残基の位置に相当す
る。
Ala His His Arg, Ala Ala His His ArgまたはAla Ala
His His 配列を有するペプチドである式Ｉのインシュ
リンが特に好ましい。ペプチドおよびタンパク質のアミ
ノ酸配列はアミノ酸鎖のＮ−末端以降から表示される。
式Ｉの括弧内の記号、例えばＡ１、Ａ６、Ａ７、Ａ１
１、Ａ２０、Ｂ１、Ｂ７、Ｂ１９またはＢ３０はインシ
ュリンのＡまたはＢ鎖のアミノ酸残基の位置に相当す
る。
【０００９】「遺伝学的にコード化可能な（geneticall
y encodable）アミノ酸残基」なる表現はGly, Ala, Se
r, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Me
t, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Proおよびセレノシ
ステインの残基を示す。動物インシュリンの「残基Ａ２
〜Ａ２０」および「残基Ｂ２〜Ｂ２９」なる表現は例え
ばウシ、ブタまたはニワトリのインシュリンのアミノ酸
配列を意味すると理解される。インシュリン誘導体の
「残基Ａ２〜Ａ２０」および「残基Ｂ２〜Ｂ２９」なる
表現は他の遺伝学的にコード化可能なアミノ酸によるア
ミノ酸の置換によって生成するヒトインシュリンの相当
するアミノ酸配列を示す。
y encodable）アミノ酸残基」なる表現はGly, Ala, Se
r, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Me
t, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Proおよびセレノシ
ステインの残基を示す。動物インシュリンの「残基Ａ２
〜Ａ２０」および「残基Ｂ２〜Ｂ２９」なる表現は例え
ばウシ、ブタまたはニワトリのインシュリンのアミノ酸
配列を意味すると理解される。インシュリン誘導体の
「残基Ａ２〜Ａ２０」および「残基Ｂ２〜Ｂ２９」なる
表現は他の遺伝学的にコード化可能なアミノ酸によるア
ミノ酸の置換によって生成するヒトインシュリンの相当
するアミノ酸配列を示す。
【００１０】ヒトインシュリンのＡ鎖は次の配列（配列
番号１）： Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn を有する。ヒトインシュリンのＢ鎖は次の配列（配列番
号２）： Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr を有する。
番号１）： Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn を有する。ヒトインシュリンのＢ鎖は次の配列（配列番
号２）： Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr を有する。
【００１１】式Ｉのインシュリン誘導体は様々な遺伝子
工学構造物（ＥＰ ０ ４８９ ７８０、ＥＰ ０ ３４７
７８１、ＥＰ ０ ３６８ １８７、ＥＰ ０ ４５３ ９６
９）を用いて微生物において生成することができる。遺
伝子工学構造物は大腸菌またはストレプトミセテス科の
放線菌のような微生物において発酵中に発現される。生
成したタンパク質は微生物の体内に貯蔵され（ＥＰ ０
４８９ ７８０）、または発酵溶液中に分泌される。
工学構造物（ＥＰ ０ ４８９ ７８０、ＥＰ ０ ３４７
７８１、ＥＰ ０ ３６８ １８７、ＥＰ ０ ４５３ ９６
９）を用いて微生物において生成することができる。遺
伝子工学構造物は大腸菌またはストレプトミセテス科の
放線菌のような微生物において発酵中に発現される。生
成したタンパク質は微生物の体内に貯蔵され（ＥＰ ０
４８９ ７８０）、または発酵溶液中に分泌される。
【００１２】典型的な式Ｉのインシュリンは、 Gly(A21)−ヒトインシュリン−His(B31)-His(B32)-OH Gly(A21)−ヒトインシュリン−His(B31)-His(B32)-Arg
(B33)-OH Gly(A21)−ヒトインシュリン−Ala(B31)-His(B32)-His
(B33)-OH Gly(A21)−ヒトインシュリン−Ala(B31)-His(B32)-His
(B33)-Arg(B34)-OH Gly(A21)−ヒトインシュリン−Ala(B31)-Ala(B32)-His
(B33)-His(B34)-OH Gly(A21)−ヒトインシュリン−Ala(B31)-Ala(B32)-His
(B33)-His(B34)-Arg(B35)-OHである。
(B33)-OH Gly(A21)−ヒトインシュリン−Ala(B31)-His(B32)-His
(B33)-OH Gly(A21)−ヒトインシュリン−Ala(B31)-His(B32)-His
(B33)-Arg(B34)-OH Gly(A21)−ヒトインシュリン−Ala(B31)-Ala(B32)-His
(B33)-His(B34)-OH Gly(A21)−ヒトインシュリン−Ala(B31)-Ala(B32)-His
(B33)-His(B34)-Arg(B35)-OHである。
【００１３】式Ｉのインシュリン誘導体は主として、標
準法に従って位置特異的変異誘起を用いた遺伝子工学技
術により製造される。このために、所望の式Ｉのインシ
ュリン誘導体に対する遺伝子構造コードは宿主細胞、好
ましくは大腸菌または酵母、特にサッカロミセスセレビ
シアエ(Saccharomyces cerevisiae)のような細菌におい
て構成および発現され、そして融合タンパク質に対して
遺伝子構造のコード化が行われる場合、式Ｉのインシュ
リン誘導体は融合タンパク質から放出される；同様の方
法は例えばＥＰ−Ａ−０ ２１１ ２９９、ＥＰ−Ａ−０
２２７ ９３８、ＥＰ−Ａ−０ ２２９ ９９８、ＥＰ−
Ａ−０ ２８６ ９５６およびＤＥ特許出願Ｐ ３８ ２１
１５９に記載されている。細胞の破壊後、融合タンパ
ク質部分はハロゲン化シアンを用いて化学的に（ＥＰ−
Ａ−０ １８０ ９２０を参照）あるいはリソスタフィン
またはトリプシンを用いて酵素的に（ＤＥ−Ａ−３７
３９ ３４７を参照）切断されることができる。
準法に従って位置特異的変異誘起を用いた遺伝子工学技
術により製造される。このために、所望の式Ｉのインシ
ュリン誘導体に対する遺伝子構造コードは宿主細胞、好
ましくは大腸菌または酵母、特にサッカロミセスセレビ
シアエ(Saccharomyces cerevisiae)のような細菌におい
て構成および発現され、そして融合タンパク質に対して
遺伝子構造のコード化が行われる場合、式Ｉのインシュ
リン誘導体は融合タンパク質から放出される；同様の方
法は例えばＥＰ−Ａ−０ ２１１ ２９９、ＥＰ−Ａ−０
２２７ ９３８、ＥＰ−Ａ−０ ２２９ ９９８、ＥＰ−
Ａ−０ ２８６ ９５６およびＤＥ特許出願Ｐ ３８ ２１
１５９に記載されている。細胞の破壊後、融合タンパ
ク質部分はハロゲン化シアンを用いて化学的に（ＥＰ−
Ａ−０ １８０ ９２０を参照）あるいはリソスタフィン
またはトリプシンを用いて酵素的に（ＤＥ−Ａ−３７
３９ ３４７を参照）切断されることができる。
【００１４】次に、インシュリン前駆体は例えばR. C.
MarshallおよびA. S. Inglisの「タンパク質の応用化学
−便覧」（A. Darbre編）、第４９〜５３頁（１９８６
年）に記載の方法に従って酸化的亜硫酸分解に付され、
そして例えばG. H. DixonおよびA. C. WardlowのNatur
e, 第７２１〜７２４頁（１９６０年）に記載の方法に
従ってチオールの存在下で適当なジスルフィドブリッジ
の生成を伴って再生される。しかしながら、インシュリ
ン前駆体はまた、直接折りたたむ（fold）ことができる
（ＥＰ−Ａ−０ ６００ ３７２；ＥＰ−Ａ−０ ６６８
２９２）。Ｃペプチドおよび、もし存在する場合前置配
列（式IIのＲ2）は例えばKemmlerらのJ. B. C., 第６７
８６〜６７９１頁（１９７１年）に記載の方法に従って
トリプシン分解により除去され、そして式Ｉのインシュ
リン誘導体はクロマトグラフィー（例えばＥＰ−Ａ−０
３０５ ７６０）および結晶化のような知られている方
法により精製される。
MarshallおよびA. S. Inglisの「タンパク質の応用化学
−便覧」（A. Darbre編）、第４９〜５３頁（１９８６
年）に記載の方法に従って酸化的亜硫酸分解に付され、
そして例えばG. H. DixonおよびA. C. WardlowのNatur
e, 第７２１〜７２４頁（１９６０年）に記載の方法に
従ってチオールの存在下で適当なジスルフィドブリッジ
の生成を伴って再生される。しかしながら、インシュリ
ン前駆体はまた、直接折りたたむ（fold）ことができる
（ＥＰ−Ａ−０ ６００ ３７２；ＥＰ−Ａ−０ ６６８
２９２）。Ｃペプチドおよび、もし存在する場合前置配
列（式IIのＲ2）は例えばKemmlerらのJ. B. C., 第６７
８６〜６７９１頁（１９７１年）に記載の方法に従って
トリプシン分解により除去され、そして式Ｉのインシュ
リン誘導体はクロマトグラフィー（例えばＥＰ−Ａ−０
３０５ ７６０）および結晶化のような知られている方
法により精製される。
【００１５】本発明はさらに、インシュリンヘキサマー
およびインシュリンヘキサマー１モルにつき約５〜９モ
ルのＺｎ2+、好ましくはインシュリンヘキサマー１モル
につき５〜７モルのＺｎ2+を含有し、インシュリンヘキ
サマーは６個の式Ｉのインシュリン分子からなる複合体
に関する。亜鉛とインシュリンヘキサマーの結合はしっ
かりしているため、インシュリンヘキサマー１モルにつ
き５〜９モルのＺｎ2+は例えばpH７.４の水性１０mMト
リス／ＨＣｌ緩衝液を用いた４０時間の通常の透析によ
り除去することができない。皮下投与後、式Ｉのインシ
ュリンは本質的に亜鉛を含まない製剤（pH４）の場合、
ヒトインシュリンと比べて極めてわずかな作用の遅れを
示す。製剤１mlにつき約２０μgのＺｎ2+を加えると、
皮下投与後に遅い作用開始が観察される。作用の遅延は
好ましくは４０μg／mlのＺｎ2+で観察される。より高
い亜鉛濃度はこの効果を高める。
およびインシュリンヘキサマー１モルにつき約５〜９モ
ルのＺｎ2+、好ましくはインシュリンヘキサマー１モル
につき５〜７モルのＺｎ2+を含有し、インシュリンヘキ
サマーは６個の式Ｉのインシュリン分子からなる複合体
に関する。亜鉛とインシュリンヘキサマーの結合はしっ
かりしているため、インシュリンヘキサマー１モルにつ
き５〜９モルのＺｎ2+は例えばpH７.４の水性１０mMト
リス／ＨＣｌ緩衝液を用いた４０時間の通常の透析によ
り除去することができない。皮下投与後、式Ｉのインシ
ュリンは本質的に亜鉛を含まない製剤（pH４）の場合、
ヒトインシュリンと比べて極めてわずかな作用の遅れを
示す。製剤１mlにつき約２０μgのＺｎ2+を加えると、
皮下投与後に遅い作用開始が観察される。作用の遅延は
好ましくは４０μg／mlのＺｎ2+で観察される。より高
い亜鉛濃度はこの効果を高める。
【００１６】本発明はさらに、式II Ｒ2−Ｒ1−Ｂ２−Ｂ２９−Ｙ−Ｚ1−Ｇｌｙ−Ａ２−Ａ２０−Ｒ3 (II) 〔式中、Ｒ3およびＹは請求項１〜６の何れかの項記載
の式Ｉで定義された通りであり、Ｒ1はフェニルアラニ
ン残基または共有結合であり、Ｒ2はａ） 遺伝学的に
コード化可能なアミノ酸残基であるか、または ｂ） ２〜４５個のアミノ酸残基を有するペプチドであ
り、そして残基Ａ２〜Ａ２０およびＢ２〜Ｂ２９はヒト
インシュリン、動物インシュリンまたはインシュリン誘
導体のＡおよびＢ鎖のアミノ酸配列に相当し、そしてＺ
1は１〜５個のヒスチジン残基を含有する２〜４０個の
遺伝学的にコード化可能なアミノ酸残基を有するペプチ
ドである〕のプレプロインシュリンに関する。式IIのプ
ロインシュリンは式Ｉのインシュリンの製造において中
間体として適当である。好ましい式IIのプロインシュリ
ンはＲ2が２〜２５個のアミノ酸残基を有するペプチド
であるものである。特に好ましい式IIのプロインシュリ
ンはＲ2が２〜１５個のアミノ酸残基を有するペプチド
であり、そしてＭｅｔ、ＬｙｓおよびＡｒｇからなる群
より選択されるアミノ酸残基がンルボキシル末端にある
ものである。
の式Ｉで定義された通りであり、Ｒ1はフェニルアラニ
ン残基または共有結合であり、Ｒ2はａ） 遺伝学的に
コード化可能なアミノ酸残基であるか、または ｂ） ２〜４５個のアミノ酸残基を有するペプチドであ
り、そして残基Ａ２〜Ａ２０およびＢ２〜Ｂ２９はヒト
インシュリン、動物インシュリンまたはインシュリン誘
導体のＡおよびＢ鎖のアミノ酸配列に相当し、そしてＺ
1は１〜５個のヒスチジン残基を含有する２〜４０個の
遺伝学的にコード化可能なアミノ酸残基を有するペプチ
ドである〕のプレプロインシュリンに関する。式IIのプ
ロインシュリンは式Ｉのインシュリンの製造において中
間体として適当である。好ましい式IIのプロインシュリ
ンはＲ2が２〜２５個のアミノ酸残基を有するペプチド
であるものである。特に好ましい式IIのプロインシュリ
ンはＲ2が２〜１５個のアミノ酸残基を有するペプチド
であり、そしてＭｅｔ、ＬｙｓおよびＡｒｇからなる群
より選択されるアミノ酸残基がンルボキシル末端にある
ものである。
【００１７】本発明の式Ｉのインシュリン誘導体および
／またはインシュリンヘキサマーとヘキサマー１モルに
つき５〜９モルのＺｎ2+を含有する複合体および／また
はそれらの生理学的に許容しうる塩（例えばアルカリ金
属またはアンモニウム塩）は主に糖尿病、特に真性糖尿
病の治療のための薬剤において活性化合物として使用さ
れる。薬剤は好ましくは注射用溶液または懸濁液であ
る；それは少なくとも１種の本発明の式Ｉのインシュリ
ン誘導体および／または複合体および／または少なくと
も１種のその生理学的に許容しうる塩を溶解した形態、
非晶質および／または結晶質形態、好ましくは溶解した
形態で含有する。
／またはインシュリンヘキサマーとヘキサマー１モルに
つき５〜９モルのＺｎ2+を含有する複合体および／また
はそれらの生理学的に許容しうる塩（例えばアルカリ金
属またはアンモニウム塩）は主に糖尿病、特に真性糖尿
病の治療のための薬剤において活性化合物として使用さ
れる。薬剤は好ましくは注射用溶液または懸濁液であ
る；それは少なくとも１種の本発明の式Ｉのインシュリ
ン誘導体および／または複合体および／または少なくと
も１種のその生理学的に許容しうる塩を溶解した形態、
非晶質および／または結晶質形態、好ましくは溶解した
形態で含有する。
【００１８】薬剤は好ましくは約２.５〜８.５、特に約
４.０〜８.５のpHを有し、無菌の水溶液中で適当な等張
化剤、適当な保存剤、場合により適当な緩衝剤、好まし
くはさらに特定濃度の亜鉛イオンを含有する。活性化合
物を除く、薬剤の構成成分のすべては薬物担体溶液を形
成する。式Ｉのインシュリンの溶液を含有する薬剤は
２.５〜４.５、特に３.５〜４.５、好ましくは４.０のp
Hを有する。式Ｉのインシュリンの懸濁液を含有する薬
剤は６.５〜８.５、特に７.０〜８.０、好ましくは７.
４のpHを有する。適当な等張化剤は例えばグリセロー
ル、グルコース、マンニトール、ＮａＣｌ、カルシウム
化合物またはマグネシウム化合物、例えばＣａＣｌ2ま
たはＭｇＣｌ2である。
４.０〜８.５のpHを有し、無菌の水溶液中で適当な等張
化剤、適当な保存剤、場合により適当な緩衝剤、好まし
くはさらに特定濃度の亜鉛イオンを含有する。活性化合
物を除く、薬剤の構成成分のすべては薬物担体溶液を形
成する。式Ｉのインシュリンの溶液を含有する薬剤は
２.５〜４.５、特に３.５〜４.５、好ましくは４.０のp
Hを有する。式Ｉのインシュリンの懸濁液を含有する薬
剤は６.５〜８.５、特に７.０〜８.０、好ましくは７.
４のpHを有する。適当な等張化剤は例えばグリセロー
ル、グルコース、マンニトール、ＮａＣｌ、カルシウム
化合物またはマグネシウム化合物、例えばＣａＣｌ2ま
たはＭｇＣｌ2である。
【００１９】等張化剤および／または保存剤の選択の結
果として、インシュリン誘導体またはその生理学的に許
容しうる塩の溶解度は弱酸性のpHで影響される。適当な
保存剤は例えばフェノール、ｍ−クレゾール、ベンジル
アルコールおよび／またはｐ−ヒドロキシ安息香酸エス
テルである。特にpHを約４.０〜８.５に調整するのに使
用されうる緩衝物質は例えば酢酸ナトリウム、クエン酸
ナトリウムまたはリン酸ナトリウムである。別法とし
て、生理学的に許容しうる希酸（典型的にはＨＣｌ）ま
たはアルカリ（典型的にはＮａＯＨ）もまた、pHを調整
するのに適している。薬剤がＺｎ2+を含有する場合、Ｚ
ｎ2+含量は１μg〜２mg／ml、特に５μg〜２００μg／m
lが好ましい。
果として、インシュリン誘導体またはその生理学的に許
容しうる塩の溶解度は弱酸性のpHで影響される。適当な
保存剤は例えばフェノール、ｍ−クレゾール、ベンジル
アルコールおよび／またはｐ−ヒドロキシ安息香酸エス
テルである。特にpHを約４.０〜８.５に調整するのに使
用されうる緩衝物質は例えば酢酸ナトリウム、クエン酸
ナトリウムまたはリン酸ナトリウムである。別法とし
て、生理学的に許容しうる希酸（典型的にはＨＣｌ）ま
たはアルカリ（典型的にはＮａＯＨ）もまた、pHを調整
するのに適している。薬剤がＺｎ2+を含有する場合、Ｚ
ｎ2+含量は１μg〜２mg／ml、特に５μg〜２００μg／m
lが好ましい。
【００２０】本発明の薬剤の作用プロフィールを変える
ために、非修飾インシュリン、好ましくはウシ、ブタま
たはヒトインシュリン、特にヒトインシュリン、あるい
は修飾インシュリン、例えばモノマーのインシュリン、
迅速に作用するインシュリンまたはＧｌｙ（Ａ２１）−
Ａｒｇ（Ｂ３１）−Ａｒｇ（Ｂ３２）−ヒトインシュリ
ンもまた混合することができる。好ましい活性化合物濃
度は約１〜１５００、さらに好ましくは約５〜１００
０、特に約４０〜４００国際単位／mlである。
ために、非修飾インシュリン、好ましくはウシ、ブタま
たはヒトインシュリン、特にヒトインシュリン、あるい
は修飾インシュリン、例えばモノマーのインシュリン、
迅速に作用するインシュリンまたはＧｌｙ（Ａ２１）−
Ａｒｇ（Ｂ３１）−Ａｒｇ（Ｂ３２）−ヒトインシュリ
ンもまた混合することができる。好ましい活性化合物濃
度は約１〜１５００、さらに好ましくは約５〜１００
０、特に約４０〜４００国際単位／mlである。
【００２１】
実施例１ Gly(A21)−ヒトインシュリン−His(B31)-His(B32)-OHの
製造 本質的にＵＳ ５,３５８,８５７に記載のようにして発
現系の製造を行った。ベクターｐＩＮＴ ９０ｄおよび
ｐＩＮＴ ９１ｄ（実施例１７参照）、ＰＣＲプライマ
ーＴＩＲおよびInsu １１もまた、そこに記載されてい
る。これらの４成分を下記のベクター構造物の出発物質
として使用する。最初に、Ｇｌｙ(Ａ２１)に対するコド
ンをミニプロインシュリンの配列コードに挿入する。こ
れを行うために、ｐＩＮＴ ９１ｄを鋳型として使用
し、そしてプライマーＴＩＲおよびInsu ３１を用いて
ＰＣＲ反応を行う。 Insu ３１（配列番号１０）： 5′TTT TTT GTC GAC CTA TTA GCC GCA GTA GTT CTC CAG
CTG 3′ ＰＣＲサイクルは次のようにして行う。最初の１分間は
９４℃、次の１分間は５５℃、最後の１分間は７２℃。
このサイクルを２５回繰り返し、混合物を７２℃で７分
間、次に４℃で一晩インキュベートする。得られるＰＣ
Ｒフラグメントをエタノール中で沈殿させて精製し、乾
燥し、そして製造業者の手引に従って制限酵素ＮｃＯ１
およびＳａｌ１を使用して制限緩衝液中で消化する。次
に、反応混合物をゲル電気泳動により分離し、ＮｃＯ１
−プレ−プロインシュリン−Ｓａｌ１フラグメントを単
離する。同様に、ＮｃＯ１およびＳａｌ１を使用してプ
ラスミドｐＩＮＴ ９０ｄのＤＮＡを分解し、そしてサ
ルのプロインシュリンフラグメントをこのようにｐＩＮ
Ｔ残余プラスミドから放出する。両方のフラグメントを
ゲル電気泳動により分離し、残余プラスミドＤＮＡを単
離する。このＤＮＡをＮｃＯ１−Ｓａｌ１ ＰＣＲフラ
グメントとリガーゼ反応により反応させる。このように
して得られるプラスミドｐＩＮＴ １５０ｄを大腸菌に
より形質転換した後、精製し、再び単離する。
製造 本質的にＵＳ ５,３５８,８５７に記載のようにして発
現系の製造を行った。ベクターｐＩＮＴ ９０ｄおよび
ｐＩＮＴ ９１ｄ（実施例１７参照）、ＰＣＲプライマ
ーＴＩＲおよびInsu １１もまた、そこに記載されてい
る。これらの４成分を下記のベクター構造物の出発物質
として使用する。最初に、Ｇｌｙ(Ａ２１)に対するコド
ンをミニプロインシュリンの配列コードに挿入する。こ
れを行うために、ｐＩＮＴ ９１ｄを鋳型として使用
し、そしてプライマーＴＩＲおよびInsu ３１を用いて
ＰＣＲ反応を行う。 Insu ３１（配列番号１０）： 5′TTT TTT GTC GAC CTA TTA GCC GCA GTA GTT CTC CAG
CTG 3′ ＰＣＲサイクルは次のようにして行う。最初の１分間は
９４℃、次の１分間は５５℃、最後の１分間は７２℃。
このサイクルを２５回繰り返し、混合物を７２℃で７分
間、次に４℃で一晩インキュベートする。得られるＰＣ
Ｒフラグメントをエタノール中で沈殿させて精製し、乾
燥し、そして製造業者の手引に従って制限酵素ＮｃＯ１
およびＳａｌ１を使用して制限緩衝液中で消化する。次
に、反応混合物をゲル電気泳動により分離し、ＮｃＯ１
−プレ−プロインシュリン−Ｓａｌ１フラグメントを単
離する。同様に、ＮｃＯ１およびＳａｌ１を使用してプ
ラスミドｐＩＮＴ ９０ｄのＤＮＡを分解し、そしてサ
ルのプロインシュリンフラグメントをこのようにｐＩＮ
Ｔ残余プラスミドから放出する。両方のフラグメントを
ゲル電気泳動により分離し、残余プラスミドＤＮＡを単
離する。このＤＮＡをＮｃＯ１−Ｓａｌ１ ＰＣＲフラ
グメントとリガーゼ反応により反応させる。このように
して得られるプラスミドｐＩＮＴ １５０ｄを大腸菌に
より形質転換した後、精製し、再び単離する。
【００２２】プラスミドｐＩＮＴ １５０ｄのＤＮＡを
プラスミドｐＩＮＴ ３０２の出発物質として使用す
る。それは所望のインシュリン変体の製造を可能にす
る。プラスミドを構成するために、ＵＳ ５,３５８,８
５７に記載の方法（実施例６参照）を採用した。互いに
独立している２つのＰＣＲ反応をこのために行い、プラ
スミドｐＩＮＴ １５０ｄのＤＮＡを鋳型として使用す
る。一方の反応はプライマー対ＴＩＲおよびｐＩＮＴ
Ｂ５（配列番号１１）： 5′GAT GCC GCG GTG GTG GGT CTT GGG TGT GTAG 3′ を使用して行い、他方の反応はプライマー対Insu１１お
よびｐＩＮＴ Ｂ６（配列番号１２）： 5′A CCC AAG ACC CAC CAC CGC GGC ATC GTG GAG 3′ を使用して行う。得られるＰＣＲフラグメントは部分的
に相補性であるため、第３のＰＣＲ反応においてそれら
はＢ３１およびＢ３２の位置により延長されたＧｌｙ
（Ａ２１）ミニプロインシュリンについてコード化する
フラグメントをもたらす。このフラグメントをＮｃＯ１
およびＳａｌ１を使用して分解し、上記のｐＩＮＴ９０
ｄ残余プラスミドのＤＮＡとリガーゼ反応により反応さ
せてプラスミドｐＩＮＴ３０２を得る。
プラスミドｐＩＮＴ ３０２の出発物質として使用す
る。それは所望のインシュリン変体の製造を可能にす
る。プラスミドを構成するために、ＵＳ ５,３５８,８
５７に記載の方法（実施例６参照）を採用した。互いに
独立している２つのＰＣＲ反応をこのために行い、プラ
スミドｐＩＮＴ １５０ｄのＤＮＡを鋳型として使用す
る。一方の反応はプライマー対ＴＩＲおよびｐＩＮＴ
Ｂ５（配列番号１１）： 5′GAT GCC GCG GTG GTG GGT CTT GGG TGT GTAG 3′ を使用して行い、他方の反応はプライマー対Insu１１お
よびｐＩＮＴ Ｂ６（配列番号１２）： 5′A CCC AAG ACC CAC CAC CGC GGC ATC GTG GAG 3′ を使用して行う。得られるＰＣＲフラグメントは部分的
に相補性であるため、第３のＰＣＲ反応においてそれら
はＢ３１およびＢ３２の位置により延長されたＧｌｙ
（Ａ２１）ミニプロインシュリンについてコード化する
フラグメントをもたらす。このフラグメントをＮｃＯ１
およびＳａｌ１を使用して分解し、上記のｐＩＮＴ９０
ｄ残余プラスミドのＤＮＡとリガーゼ反応により反応さ
せてプラスミドｐＩＮＴ３０２を得る。
【００２３】このプラスミドを用いて形質転換した大腸
菌Ｋ１２ Ｗ３１１０をＵＳ ５,２２７,２９３の実施例
４に記載のようにして発酵させ、後処理する。（トリプ
シン分解前の）中間体として得られるプレプロインシュ
リン誘導体は次のアミノ酸配列を有する： プレプロインシュリン（配列番号３）： Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr His His Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
菌Ｋ１２ Ｗ３１１０をＵＳ ５,２２７,２９３の実施例
４に記載のようにして発酵させ、後処理する。（トリプ
シン分解前の）中間体として得られるプレプロインシュ
リン誘導体は次のアミノ酸配列を有する： プレプロインシュリン（配列番号３）： Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr His His Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
【００２４】プレプロインシュリン１は式IIに相当し、
この場合Ｒ2は１１個のアミノ酸残基を有するペプチド
であり、Ｒ1はＰｈｅ（Ｂ１）であり、ＹはＴｈｒ（Ｂ
３０）であり、ＺはHis His Arg(B31〜B33)であり、Ｒ3
はＧｌｙ（Ａ２１）であり、Ａ２〜Ａ２０はヒトインシ
ュリンのＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０）
であり、そしてＢ２〜Ｂ２９はヒトインシュリンのＢ鎖
のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２９）である。
この場合Ｒ2は１１個のアミノ酸残基を有するペプチド
であり、Ｒ1はＰｈｅ（Ｂ１）であり、ＹはＴｈｒ（Ｂ
３０）であり、ＺはHis His Arg(B31〜B33)であり、Ｒ3
はＧｌｙ（Ａ２１）であり、Ａ２〜Ａ２０はヒトインシ
ュリンのＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０）
であり、そしてＢ２〜Ｂ２９はヒトインシュリンのＢ鎖
のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２９）である。
【００２５】プレプロインシュリン１をＵＳ ５,２２
７,２９３に記載のようにして実施例４に従ってトリプ
シンで分解する。得られる生成物をカルボキシペプチダ
ーゼＢと実施例１１に従って反応させてインシュリン１
を得る。インシュリン１は式Ｉに相当し、この場合Ｒ1
はＰｈｅ（Ｂ１）であり、ＹはＴｈｒ（Ｂ３０）であ
り、ＺはHis His(B31〜B32)であり、Ｒ3はＧｌｙ（Ａ２
１）であり、Ａ２〜Ａ２０はヒトインシュリンのＡ鎖の
アミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０）であり、そして
Ｂ２〜Ｂ２９はヒトインシュリンのＢ鎖のアミノ酸配列
（アミノ酸残基２〜２９）である。
７,２９３に記載のようにして実施例４に従ってトリプ
シンで分解する。得られる生成物をカルボキシペプチダ
ーゼＢと実施例１１に従って反応させてインシュリン１
を得る。インシュリン１は式Ｉに相当し、この場合Ｒ1
はＰｈｅ（Ｂ１）であり、ＹはＴｈｒ（Ｂ３０）であ
り、ＺはHis His(B31〜B32)であり、Ｒ3はＧｌｙ（Ａ２
１）であり、Ａ２〜Ａ２０はヒトインシュリンのＡ鎖の
アミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０）であり、そして
Ｂ２〜Ｂ２９はヒトインシュリンのＢ鎖のアミノ酸配列
（アミノ酸残基２〜２９）である。
【００２６】インシュリン１は次のアミノ酸配列を有す
る： インシュリン１（配列番号４）： Ｂ鎖：Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr His His Ａ鎖：Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly ジスルフィドブリッジは式Ｉのように形成される。
る： インシュリン１（配列番号４）： Ｂ鎖：Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr His His Ａ鎖：Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly ジスルフィドブリッジは式Ｉのように形成される。
【００２７】実施例２ Gly(A21)-ヒトインシュリン-Ala(B31)-His(B32)-His(B3
3)-Arg(B34)-OHの製造発現ベクターを実施例１に従って
構成する。 プライマー対ＴＩＲおよびｐＩＮＴ Ｂ７（配列番号１
３）： 5′GAT GCC GCG GTG GTG CGC GGT CTT GGG TGT GTAG
3′ またはInsu１１およびｐＩＮＴ Ｂ８（配列番号１
４）： 5′ACCC AAG ACC GCG CAC CAC CGC GGC ATC GTG GAG
3′ を用いた、互いに独立している２つのＰＣＲ反応におい
て、プラスミドｐＩＮＴ１５０ｄを鋳型として使用す
る。両方の反応で得られるＰＣＲフラグメントは部分的
に相補性であり、第３のＰＣＲ反応において、所望のイ
ンシュリン変体についてコード化する完全配列を与え
る。反応のフラグメントを酵素ＮｃＯ１およびＳａｌ１
で処理し、ＮｃＯ１／Ｓａｌ１が開いたｐＩＮＴ ９０
ｄ ＤＮＡの残余プラスミドに連結する。得られるプラ
スミドｐＩＮＴ ３０３を大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０によ
り形質転換した後、所望のプレ−ミニプロインシュリン
の発現の基礎原料として使用する。発酵および後処理は
実施例１のようにして行うが、カルボキシペプチダーゼ
Ｂ反応は不要である。
3)-Arg(B34)-OHの製造発現ベクターを実施例１に従って
構成する。 プライマー対ＴＩＲおよびｐＩＮＴ Ｂ７（配列番号１
３）： 5′GAT GCC GCG GTG GTG CGC GGT CTT GGG TGT GTAG
3′ またはInsu１１およびｐＩＮＴ Ｂ８（配列番号１
４）： 5′ACCC AAG ACC GCG CAC CAC CGC GGC ATC GTG GAG
3′ を用いた、互いに独立している２つのＰＣＲ反応におい
て、プラスミドｐＩＮＴ１５０ｄを鋳型として使用す
る。両方の反応で得られるＰＣＲフラグメントは部分的
に相補性であり、第３のＰＣＲ反応において、所望のイ
ンシュリン変体についてコード化する完全配列を与え
る。反応のフラグメントを酵素ＮｃＯ１およびＳａｌ１
で処理し、ＮｃＯ１／Ｓａｌ１が開いたｐＩＮＴ ９０
ｄ ＤＮＡの残余プラスミドに連結する。得られるプラ
スミドｐＩＮＴ ３０３を大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０によ
り形質転換した後、所望のプレ−ミニプロインシュリン
の発現の基礎原料として使用する。発酵および後処理は
実施例１のようにして行うが、カルボキシペプチダーゼ
Ｂ反応は不要である。
【００２８】得られるプレプロインシュリン誘導体は次
のアミノ酸配列を有する： プレプロインシュリン２（配列番号５）： Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His His Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
のアミノ酸配列を有する： プレプロインシュリン２（配列番号５）： Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His His Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
【００２９】プレプロインシュリン２は式IIに相当し、
この場合Ｒ1はＰｈｅ（Ｂ１）であり、Ｒ2は１１個のア
ミノ酸残基を有するペプチドであり、ＹはＴｈｒ（Ｂ３
０）であり、ＺはAla His His Arg(B31〜B34)であり、
Ｒ3はＧｌｙ（Ａ２１）であり、Ａ２〜Ａ２０はヒトイ
ンシュリンのＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２
０）であり、そしてＢ２〜Ｂ２９はヒトインシュリンの
Ｂ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２９）である。
この場合Ｒ1はＰｈｅ（Ｂ１）であり、Ｒ2は１１個のア
ミノ酸残基を有するペプチドであり、ＹはＴｈｒ（Ｂ３
０）であり、ＺはAla His His Arg(B31〜B34)であり、
Ｒ3はＧｌｙ（Ａ２１）であり、Ａ２〜Ａ２０はヒトイ
ンシュリンのＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２
０）であり、そしてＢ２〜Ｂ２９はヒトインシュリンの
Ｂ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２９）である。
【００３０】次に、プレプロインシュリン２をトリプシ
ンと反応させてインシュリン２を得る。インシュリン２
は式IIに相当し、この場合Ｒ1はＰｈｅ（Ｂ１）であ
り、ＹはＴｈｒ（Ｂ３０）であり、ＺはAla His His Ar
g(B31〜B34)であり、Ｒ3はＧｌｙ（Ａ２１）であり、Ａ
２〜Ａ２０はヒトインシュリンのＡ鎖のアミノ酸配列
（アミノ酸残基２〜２０）であり、そしてＢ２〜Ｂ２９
はヒトインシュリンのＢ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残
基２〜２９）である。
ンと反応させてインシュリン２を得る。インシュリン２
は式IIに相当し、この場合Ｒ1はＰｈｅ（Ｂ１）であ
り、ＹはＴｈｒ（Ｂ３０）であり、ＺはAla His His Ar
g(B31〜B34)であり、Ｒ3はＧｌｙ（Ａ２１）であり、Ａ
２〜Ａ２０はヒトインシュリンのＡ鎖のアミノ酸配列
（アミノ酸残基２〜２０）であり、そしてＢ２〜Ｂ２９
はヒトインシュリンのＢ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残
基２〜２９）である。
【００３１】インシュリン２は次のアミノ酸配列を有す
る： インシュリン２（配列番号６）： Ｂ鎖：Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His His Arg Ａ鎖：Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly ジスルフィドブリッジは式Ｉのように形成される。
る： インシュリン２（配列番号６）： Ｂ鎖：Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His His Arg Ａ鎖：Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly ジスルフィドブリッジは式Ｉのように形成される。
【００３２】実施例３ Gly(A21)-ヒトインシュリン-Ala(B31)-Ala(B32)-His(B3
3)-His(B34)-OHの製造発現ベクターを実施例１に従って
構成する。 プライマー対ＴＩＲおよびｐＩＮＴ ３１６ａ（配列番
号１５）： 5′GAT GCC GCG ATG ATG CGC CGC GGT CTT GGG TGT GTA
G 3′ またはInsu１１およびｐＩＮＴ ３１６ｂ（配列番号１
６）： 5′A CCC AAG ACC GCG GCG CAT CAT CGC GGC ATC GTG G
AG 3′ を用いた、互いに独立している２つのＰＣＲ反応におい
て、プラスミドｐＩＮＴ１５０ｄを鋳型として使用す
る。両方の反応で得られるＰＣＲフラグメントは部分的
に相補性であり、第３のＰＣＲ反応において、所望のイ
ンシュリン変体についてコード化する完全配列を与え
る。反応のフラグメントを酵素ＮｃＯ１およびＳａｌ１
で処理し、ＮｃＯ１／Ｓａｌ１が開いたｐＩＮＴ ９０
ｄ ＤＮＡの残余プラスミドに連結する。得られるプラ
スミドｐＩＮＴ ３１６を大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０によ
り形質転換した後、所望のプレ−ミニプロインシュリン
の発現の基礎原料として使用する。発酵および後処理は
実施例１のようにして行うが、カルボキシペプチダーゼ
Ｂ反応は不要である。
3)-His(B34)-OHの製造発現ベクターを実施例１に従って
構成する。 プライマー対ＴＩＲおよびｐＩＮＴ ３１６ａ（配列番
号１５）： 5′GAT GCC GCG ATG ATG CGC CGC GGT CTT GGG TGT GTA
G 3′ またはInsu１１およびｐＩＮＴ ３１６ｂ（配列番号１
６）： 5′A CCC AAG ACC GCG GCG CAT CAT CGC GGC ATC GTG G
AG 3′ を用いた、互いに独立している２つのＰＣＲ反応におい
て、プラスミドｐＩＮＴ１５０ｄを鋳型として使用す
る。両方の反応で得られるＰＣＲフラグメントは部分的
に相補性であり、第３のＰＣＲ反応において、所望のイ
ンシュリン変体についてコード化する完全配列を与え
る。反応のフラグメントを酵素ＮｃＯ１およびＳａｌ１
で処理し、ＮｃＯ１／Ｓａｌ１が開いたｐＩＮＴ ９０
ｄ ＤＮＡの残余プラスミドに連結する。得られるプラ
スミドｐＩＮＴ ３１６を大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０によ
り形質転換した後、所望のプレ−ミニプロインシュリン
の発現の基礎原料として使用する。発酵および後処理は
実施例１のようにして行うが、カルボキシペプチダーゼ
Ｂ反応は不要である。
【００３３】得られるプレプロインシュリン３は次のア
ミノ酸配列を有する： プレプロインシュリン３（配列番号７）： Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala Ala His His Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
ミノ酸配列を有する： プレプロインシュリン３（配列番号７）： Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala Ala His His Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
【００３４】プレプロインシュリン３は式IIに相当し、
この場合Ｒ1はＰｈｅ（Ｂ１）であり、Ｒ2は１１個のア
ミノ酸残基を有するペプチドであり、ＹはＴｈｒ（Ｂ３
０）であり、ＺはAla Ala His His Arg(B31〜B35)であ
り、Ｒ3はＧｌｙ（Ａ２１）であり、Ａ２〜Ａ２０はヒ
トインシュリンのＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２
〜２０）であり、そしてＢ２〜Ｂ２９はヒトインシュリ
ンのＢ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２９）であ
る。
この場合Ｒ1はＰｈｅ（Ｂ１）であり、Ｒ2は１１個のア
ミノ酸残基を有するペプチドであり、ＹはＴｈｒ（Ｂ３
０）であり、ＺはAla Ala His His Arg(B31〜B35)であ
り、Ｒ3はＧｌｙ（Ａ２１）であり、Ａ２〜Ａ２０はヒ
トインシュリンのＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２
〜２０）であり、そしてＢ２〜Ｂ２９はヒトインシュリ
ンのＢ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２９）であ
る。
【００３５】次に、プレプロインシュリン３をトリプシ
ンおよび実施例１１に従ってカルボキシペプチダーゼＢ
と反応させてインシュリン３を得る。インシュリン３は
式Ｉに相当し、この場合Ｒ1はＰｈｅ（Ｂ１）であり、
ＹはＴｈｒ（Ｂ３０）であり、ＺはAla Ala His His Ar
g(B31〜B34)であり、Ｒ3はＧｌｙ（Ａ２１）であり、Ａ
２〜Ａ２０はヒトインシュリンのＡ鎖のアミノ酸配列
（アミノ酸残基２〜２０）であり、そしてＢ２〜Ｂ２９
はヒトインシュリンのＢ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残
基２〜２９）である。
ンおよび実施例１１に従ってカルボキシペプチダーゼＢ
と反応させてインシュリン３を得る。インシュリン３は
式Ｉに相当し、この場合Ｒ1はＰｈｅ（Ｂ１）であり、
ＹはＴｈｒ（Ｂ３０）であり、ＺはAla Ala His His Ar
g(B31〜B34)であり、Ｒ3はＧｌｙ（Ａ２１）であり、Ａ
２〜Ａ２０はヒトインシュリンのＡ鎖のアミノ酸配列
（アミノ酸残基２〜２０）であり、そしてＢ２〜Ｂ２９
はヒトインシュリンのＢ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残
基２〜２９）である。
【００３６】インシュリン３は次のアミノ酸配列を有す
る： インシュリン３（配列番号８）： Ｂ鎖：Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala Ala His His Ａ鎖：Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly ジスルフィドブリッジは式Ｉのように形成される。
る： インシュリン３（配列番号８）： Ｂ鎖：Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala Ala His His Ａ鎖：Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly ジスルフィドブリッジは式Ｉのように形成される。
【００３７】実施例４ 実施例２に従って製造したインシュリン２を実施例１１
に従ってカルボキシペプチダーゼＢと反応させてインシ
ュリン４を得る。インシュリン４は式Ｉに相当し、この
場合Ｒ1はＰｈｅ（Ｂ１）であり、ＹはＴｈｒ（Ｂ３
０）であり、ＺはAla His His(B31〜B33)であり、Ｒ3は
Ｇｌｙ（Ａ２１）であり、Ａ２〜Ａ２０はヒトインシュ
リンのＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０）で
あり、そしてＢ２〜Ｂ２９はヒトインシュリンのＢ鎖の
アミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２９）である。
に従ってカルボキシペプチダーゼＢと反応させてインシ
ュリン４を得る。インシュリン４は式Ｉに相当し、この
場合Ｒ1はＰｈｅ（Ｂ１）であり、ＹはＴｈｒ（Ｂ３
０）であり、ＺはAla His His(B31〜B33)であり、Ｒ3は
Ｇｌｙ（Ａ２１）であり、Ａ２〜Ａ２０はヒトインシュ
リンのＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０）で
あり、そしてＢ２〜Ｂ２９はヒトインシュリンのＢ鎖の
アミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２９）である。
【００３８】インシュリン４は次のアミノ酸配列を有す
る： インシュリン４（配列番号９）： Ｂ鎖：Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His His Ａ鎖：Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly ジスルフィドブリッジは式Ｉのように形成される。
る： インシュリン４（配列番号９）： Ｂ鎖：Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His His Ａ鎖：Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly ジスルフィドブリッジは式Ｉのように形成される。
【００３９】実施例５ インシュリン誘導体の亜鉛結合 インシュリンの調製液（０.２４３mMのヒトインシュリ
ン、０.１３ＭのＮａＣｌ、０.１％フェノール、８０μ
g／ml（１.２２mM）のＺｎ2+、１０mMのトリス／ＨＣ
ｌ、pH７.４）を１５℃で１０mMのトリス／ＨＣｌ（pH
７.４）に対して４０時間（１６時間および２４時間後
に緩衝液交換）透析する。次に透析液を酸性にし、イン
シュリンの濃度をＨＰＬＣにより測定し、そして亜鉛の
濃度を原子吸光分光分析法により測定する。亜鉛の数値
はインシュリンを含まない対照バッチの亜鉛含量を使用
して補正する。その結果を表１に示す。
ン、０.１３ＭのＮａＣｌ、０.１％フェノール、８０μ
g／ml（１.２２mM）のＺｎ2+、１０mMのトリス／ＨＣ
ｌ、pH７.４）を１５℃で１０mMのトリス／ＨＣｌ（pH
７.４）に対して４０時間（１６時間および２４時間後
に緩衝液交換）透析する。次に透析液を酸性にし、イン
シュリンの濃度をＨＰＬＣにより測定し、そして亜鉛の
濃度を原子吸光分光分析法により測定する。亜鉛の数値
はインシュリンを含まない対照バッチの亜鉛含量を使用
して補正する。その結果を表１に示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】実施例６ イヌにおけるヒトインシュリンの作用プロフィールの亜
鉛依存性 投与経路：皮下 投与量：０.３IU／kg；調製液のpH４.０ 実験１回あたりのイヌの数(ｎ)：６ 表２は初期値の％として表される血中グルコースを示
す。
鉛依存性 投与経路：皮下 投与量：０.３IU／kg；調製液のpH４.０ 実験１回あたりのイヌの数(ｎ)：６ 表２は初期値の％として表される血中グルコースを示
す。
【表２】
【００４２】実施例７ イヌにおけるGly(A21)Ala(B31)His(B32), His(B33), Ar
g(B34)ヒトインシュリン(インシュリン２）の作用プロ
フィール 実施例２に従って製造したインシュリン２を次の配合物
において使用する：２０mg／mlのグリセロール、２.７m
g／mlのｍ−クレゾール、４０IU／mlのインシュリン
２。IUは国際単位を示し、約６ナノモルのインシュリ
ン、例えばヒトインシュリンまたは式Ｉのインシュリン
に相当する。pHはＮａＯＨまたはＨＣｌを使用して調整
する。 投与経路：皮下 投与量：０.３IU／kg 試験したイヌの数：６ 調製液のpH：４.０ 表３は始発値の％として表される血中グルコースを示
す。
g(B34)ヒトインシュリン(インシュリン２）の作用プロ
フィール 実施例２に従って製造したインシュリン２を次の配合物
において使用する：２０mg／mlのグリセロール、２.７m
g／mlのｍ−クレゾール、４０IU／mlのインシュリン
２。IUは国際単位を示し、約６ナノモルのインシュリ
ン、例えばヒトインシュリンまたは式Ｉのインシュリン
に相当する。pHはＮａＯＨまたはＨＣｌを使用して調整
する。 投与経路：皮下 投与量：０.３IU／kg 試験したイヌの数：６ 調製液のpH：４.０ 表３は始発値の％として表される血中グルコースを示
す。
【００４３】
【表３】
【００４４】実施例８ イヌにおけるGly(A21)Ala(B31)His(B32), His(B33)ヒト
インシュリン（インシュリン４）の作用プロフィール 実施例４に従って製造したインシュリン４を実施例７の
ようにして配合し、使用する。 投与経路：皮下 投与量：０.３IU／kg ｎ＝６ 調製液のpH：４.０ 表４は始発値の％として表される血中グルコースを示
す。
インシュリン（インシュリン４）の作用プロフィール 実施例４に従って製造したインシュリン４を実施例７の
ようにして配合し、使用する。 投与経路：皮下 投与量：０.３IU／kg ｎ＝６ 調製液のpH：４.０ 表４は始発値の％として表される血中グルコースを示
す。
【００４５】
【表４】
【００４６】実施例９ イヌにおけるGly(A21)His(B31)，His(B32)ヒトインシュ
リン（インシュリン１）の作用プロフィール 実施例１に従って製造したインシュリン１を実施例７の
ようにして配合し、使用する。 投与経路：皮下 投与量：０.３IU／kg ｎ＝６ 調製液のpH：４.０ 表５は始発値の％として表される血中グルコースを示
す。
リン（インシュリン１）の作用プロフィール 実施例１に従って製造したインシュリン１を実施例７の
ようにして配合し、使用する。 投与経路：皮下 投与量：０.３IU／kg ｎ＝６ 調製液のpH：４.０ 表５は始発値の％として表される血中グルコースを示
す。
【００４７】
【表５】
【００４８】実施例１０ イヌにおけるGly(A21)Ala(B31)Ala(B32)His(B33)His(B3
4)ヒトインシュリン（インシュリン３）の作用プロフィ
ール 実施例１に従って製造したインシュリン３を実施例７の
ようにして配合し、使用する。 投与経路：皮下 投与量：０.３IU／kg ｎ＝６ 調製液のpH：４.０ 表６は始発値の％として表される血中グルコースを示
す。
4)ヒトインシュリン（インシュリン３）の作用プロフィ
ール 実施例１に従って製造したインシュリン３を実施例７の
ようにして配合し、使用する。 投与経路：皮下 投与量：０.３IU／kg ｎ＝６ 調製液のpH：４.０ 表６は始発値の％として表される血中グルコースを示
す。
【００４９】
【表６】
【００５０】実施例１１ プレプロインシュリン１からのインシュリンの製造 １個のＡｒｇがＢ鎖のカルボキシ末端にある、実施例１
に従って製造した２００mgのインシュリンを９５mlの１
０mM ＨＣｌに溶解する。５mlの１Ｍトリス／ＨＣｌ
（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン；pH８）を
加えた後、ＨＣｌまたはＮａＯＨを使用してpHを８に調
整する。０.１mgのカルボキシペプチダーゼＢを加え
る。９０分後、アルギニンの切断を終了する。ＨＣｌを
加えて混合物をpH３.５に調整し、ポンプで逆相カラム
（ＰＬＲＰ−Ｓ ＲＰ３００ １０μ、２.５×３０cm、
ポリマー ラボラトリーズアマースト社製）に送り込
む。移動相Ａは０.１％トリフルオロ酢酸を含有する水
である。相Ｂは０.０９％トリフルオロ酢酸を含有する
アセトニトリルからなる。カラムを５ml／分の流量で操
作する。使用後、カラムを１５０mlのＡで洗浄する。直
線勾配の２２.５〜４０％のＢを４００分間使用するこ
とにより分別溶離を行う。分析用逆相ＨＰＬＣにより各
フラクションを分析し、十分な純度のＤｅｓ−Ａｒｇ−
インシュリンを含有するフラクションを合一する。Ｎａ
ＯＨを使用してpHを３.５に調整し、アセトニトリルを
回転蒸発器で除去する。次に、pHを６.５に設定してＤ
ｅｓ−Ａｒｇ−インシュリンを沈殿させる。沈殿物を遠
心分離し、５０mlの水で２回洗浄し、最後に凍結乾燥す
る。インシュリン１が６０〜８０％の収率で得られる。
に従って製造した２００mgのインシュリンを９５mlの１
０mM ＨＣｌに溶解する。５mlの１Ｍトリス／ＨＣｌ
（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン；pH８）を
加えた後、ＨＣｌまたはＮａＯＨを使用してpHを８に調
整する。０.１mgのカルボキシペプチダーゼＢを加え
る。９０分後、アルギニンの切断を終了する。ＨＣｌを
加えて混合物をpH３.５に調整し、ポンプで逆相カラム
（ＰＬＲＰ−Ｓ ＲＰ３００ １０μ、２.５×３０cm、
ポリマー ラボラトリーズアマースト社製）に送り込
む。移動相Ａは０.１％トリフルオロ酢酸を含有する水
である。相Ｂは０.０９％トリフルオロ酢酸を含有する
アセトニトリルからなる。カラムを５ml／分の流量で操
作する。使用後、カラムを１５０mlのＡで洗浄する。直
線勾配の２２.５〜４０％のＢを４００分間使用するこ
とにより分別溶離を行う。分析用逆相ＨＰＬＣにより各
フラクションを分析し、十分な純度のＤｅｓ−Ａｒｇ−
インシュリンを含有するフラクションを合一する。Ｎａ
ＯＨを使用してpHを３.５に調整し、アセトニトリルを
回転蒸発器で除去する。次に、pHを６.５に設定してＤ
ｅｓ−Ａｒｇ−インシュリンを沈殿させる。沈殿物を遠
心分離し、５０mlの水で２回洗浄し、最後に凍結乾燥す
る。インシュリン１が６０〜８０％の収率で得られる。
【００５１】
配列番号：１ 配列の特徴： 配列の長さ：２１アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：エシェリヒア・コリ（Escherichia coli） 配列の特徴： 名称／記号：タンパク質 存在位置：1..21 配列：配列番号：１： Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 1 5 10 15 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 20
【００５２】配列番号：２ 配列の特徴： 配列の長さ：３０アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：エシェリヒア・コリ（Escherichia coli） 配列の特徴： 名称／記号：タンパク質 存在位置：1..30 配列：配列番号：２： Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30
【００５３】配列番号：３ 配列の特徴： 配列の長さ：６５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：エシェリヒア・コリ（Escherichia coli） 配列の特徴： 名称／記号：タンパク質 存在位置：1..65 配列：配列番号：３： Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His 1 5 10 15 Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu 20 25 30 Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr His His Arg Gly Ile Val Glu 35 40 45 Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys 50 55 60 Gly 65
【００５４】配列番号：４ 配列の特徴： 配列の長さ：５３アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：エシェリヒア・コリ（Escherichia coli） 配列の特徴： 名称／記号：タンパク質 存在位置：1..53 配列：配列番号：４： Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr His His 20 25 30 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 35 40 45 Glu Asn Tyr Cys Gly 50
【００５５】配列番号：５ 配列の特徴： 配列の長さ：６６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：エシェリヒア・コリ（Escherichia coli） 配列の特徴： 名称／記号：タンパク質 存在位置：1..66 配列：配列番号：５： Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His 1 5 10 15 Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu 20 25 30 Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His His Arg Gly Ile Val 35 40 45 Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr 50 55 60 Cys Gly 65
【００５６】配列番号：６ 配列の特徴： 配列の長さ：５５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：エシェリヒア・コリ（Escherichia coli） 配列の特徴： 名称／記号：タンパク質 存在位置：1..55 配列：配列番号：６： Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His 20 25 30 His Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr 35 40 45 Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly 50 55
【００５７】配列番号：７ 配列の特徴： 配列の長さ：６７アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：エシェリヒア・コリ（Escherichia coli） 配列の特徴： 名称／記号：タンパク質 存在位置：1..67 配列：配列番号：７： Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His 1 5 10 15 Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu 20 25 30 Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala Ala His His Arg Gly Ile 35 40 45 Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn 50 55 60 Tyr Cys Gly 65
【００５８】配列番号：８ 配列の特徴： 配列の長さ：５５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：エシェリヒア・コリ（Escherichia coli） 配列の特徴： 名称／記号：タンパク質 存在位置：1..55 配列：配列番号：８： Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala Ala 20 25 30 His His Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr 35 40 45 Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly 50 55
【００５９】配列番号：９ 配列の特徴： 配列の長さ：５４アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：エシェリヒア・コリ（Escherichia coli） 配列の特徴： 名称／記号：タンパク質 存在位置：1..54 配列：配列番号：９： Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His 20 25 30 His Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 35 40 45 Leu Glu Asn Tyr Cys Gly 50
【００６０】配列番号：１０ 配列の特徴： 配列の長さ：３９塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムDNA 配列の特徴： 名称／記号：エキソン 存在位置：1..39 配列：配列番号：１０： TTTTTTGTCG ACCTATTAGC CGCAGTAGTT CTCCAGCTG 39
【００６１】配列番号：１１ 配列の特徴： 配列の長さ：３１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムDNA 配列の特徴： 名称／記号：エキソン 存在位置：1..31 配列：配列番号：１１： GATGCCGCGG TGGTGGGTCT TGGGTGTGTA G 31
【００６２】配列番号：１２ 配列の特徴： 配列の長さ：３１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムDNA 配列の特徴： 名称／記号：エキソン 存在位置：1..31 配列：配列番号：１２： ACCCAAGACC CACCACCGCG GCATCGTGGA G 31
【００６３】配列番号：１３ 配列の特徴： 配列の長さ：３４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムDNA 配列の特徴： 名称／記号：エキソン 存在位置：1..34 配列：配列番号：１３： GATGCCGCGG TGGTGCGCGG TCTTGGGTGT GTAG 34
【００６４】配列番号：１４ 配列の特徴： 配列の長さ：３４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ 配列の特徴： 名称／記号：エキソン 存在位置：1..34 配列：配列番号：１４： ACCCAAGACC GCGCACCACC GCGGCATCGT GGAG 34
【００６５】配列番号：１５ 配列の特徴： 配列の長さ：３７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ 配列の特徴： 名称／記号：エキソン 存在位置：1..37 配列：配列番号：１５： GATGCCGCGA TGATGCGCCG CGGTCTTGGG TGTGTAG 37
【００６６】配列番号：１６ 配列の特徴： 配列の長さ：３７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ 配列の特徴： 名称／記号：エキソン 存在位置：1..37 配列：配列番号：１６： ACCCAAGACC GCGGCGCATC ATCGCGGCAT CGTGGAG 37
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 カール・ガイゼン ドイツ連邦共和国60318フランクフルト. ヤーンシユトラーセ43 (72)発明者 ゲールハルト・ザイプケ ドイツ連邦共和国65719ホーフハイム．ヴ イーゼンシユトラーセ44
Claims (16)
- 【請求項１】 式Ｉ 【化１】 〔式中、Ｒ1はフェニルアラニン残基または水素原子で
あり、 Ｒ3は遺伝学的にコード化可能なアミノ酸残基であり、 Ｙは遺伝学的にコード化可能なアミノ酸残基であり、 Ｚはａ） アミノ酸残基Ｈｉｓであるか、または ｂ） １〜５個のヒスチジン残基を含有する２〜３５個
の遺伝学的にコード化可能なアミノ酸残基を有するペプ
チドであり、 残基Ａ２〜Ａ２０はヒトインシュリン、動物インシュリ
ンまたはインシュリン誘導体のＡ鎖のアミノ酸配列に相
当し、そしてＢ２〜Ｂ２９はヒトインシュリン、動物イ
ンシュリンまたはインシュリン誘導体のＢ鎖のアミノ酸
配列に相当する〕のインシュリンまたはその生理学的に
許容しうる塩。 - 【請求項２】 Ｒ1はフェニルアラニン残基であり、 Ｒ3はＡｓｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ａｓ
ｐ、ＧｌｕおよびＧｌｎからなる群より選択されるアミ
ノ酸残基であり、 ＹはＡｌａ、Ｔｈｒ、ＳｅｒおよびＨｉｓからなる群よ
り選択されるアミノ酸残基であり、 Ｚはａ） アミノ酸残基Ｈｉｓであるか、または ｂ） １または２個のヒスチジン残基を含有する、４〜
７個のアミノ酸残基を有するペプチドである、請求項１
記載の式Ｉのインシュリン。 - 【請求項３】 Ｒ1はフェニルアラニン残基であり、 Ｒ3はＡｓｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ａｓ
ｐ、ＧｌｕおよびＧｌｎからなる群より選択されるアミ
ノ酸残基であり、 ＹはＡｌａ、Ｔｈｒ、ＳｅｒおよびＨｉｓからなる群よ
り選択されるアミノ酸残基であり、 Ｚはａ） アミノ酸残基Ｈｉｓであるか、または ｂ） １または２個のヒスチジン残基を含有する、２〜
７個のアミノ酸残基を有するペプチドである、請求項１
記載の式Ｉのインシュリン。 - 【請求項４】 Ｚは１または２個のヒスチジン残基を含
有する、１〜５個のアミノ酸残基を有するペプチドであ
る請求項３記載の式Ｉのインシュリン。 - 【請求項５】 Ｒ1はフェニルアラニン残基であり、 Ｒ3はＡｓｎおよびＧｌｙからなる群より選択されるア
ミノ酸残基であり、 ＹはＴｈｒおよびＨｉｓからなる群より選択されるアミ
ノ酸残基であり、そしてＺは１または２個のヒスチジン
残基を含有する、１〜５個のアミノ酸残基を有するペプ
チドである、請求項１〜４の何れかの項記載の式Ｉのイ
ンシュリン。 - 【請求項６】 Ｒ1はフェニルアラニン残基であり、Ｒ3
はグリシン残基であり、Ｙはトレオニン残基であり、そ
してＺは１〜５個のアミノ酸残基を有するペプチドであ
る請求項１記載の式Ｉのインシュリン。 - 【請求項７】 ＺはHis His, His His Arg, Ala His Hi
s, Ala His His Arg, Ala Ala His His ArgまたはAla A
la His His 配列を有するペプチドである請求項６記載
の式Ｉのインシュリン。 - 【請求項８】 インシュリンヘキサマーおよびインシュ
リンヘキサマー１モルにつき５〜９モルのＺｎ2+、特に
インシュリンヘキサマー１モルにつき５〜７モルのＺｎ
2+を含有し、インシュリンヘキサマーは請求項１〜７の
何れかの項記載の式Ｉのインシュリン分子６個からなる
複合体。 - 【請求項９】 有効量の請求項１〜７の何れかの項記載
の少なくとも１種の式Ｉのインシュリンおよび／または
少なくとも１種の式Ｉのインシュリンの生理学的に許容
しうる塩を溶解した形態、非晶質および／または結晶質
形態で含有する薬剤。 - 【請求項１０】 追加的に１μg〜２mg、好ましくは５
μg〜２００μg／mlの亜鉛を含有する請求項９記載の薬
剤。 - 【請求項１１】 ２.５〜８.５のpHを有する請求項９ま
たは１０記載の薬剤。 - 【請求項１２】 ２.５〜４.５のpHを有する請求項９〜
１１の何れかの項記載の薬剤。 - 【請求項１３】 追加的に非修飾インシュリン、好まし
くは非修飾ヒトインシュリン、または修飾インシュリ
ン、好ましくはＧｌｙ（Ａ２１）−Ａｒｇ（Ｂ３１）−
Ａｒｇ（Ｂ３２）−ヒトインシュリンを含有する請求項
９〜１２の何れかの項記載の薬剤。 - 【請求項１４】 式II Ｒ2−Ｒ1−Ｂ２−Ｂ２９−Ｙ−Ｚ1−Ｇｌｙ−Ａ２−Ａ２０−Ｒ3 (II) 〔式中、Ｒ3およびＹは請求項１〜７の何れかの項記載
の式Ｉで定義された通りであり、 Ｒ1はフェニルアラニン残基または共有結合であり、 Ｒ2はａ） 遺伝学的にコード化可能なアミノ酸残基で
あるか、または ｂ） ２〜４５個のアミノ酸残基を有するペプチドであ
り、そして残基Ａ２〜Ａ２０およびＢ２〜Ｂ２９はヒト
インシュリン、動物インシュリンまたはインシュリン誘
導体のＡおよびＢ鎖のアミノ酸配列に相当し、そしてＺ
1は１〜５個のヒスチジン残基を含有する２〜４０個の
遺伝学的にコード化可能なアミノ酸残基を有するペプチ
ドである〕のプロインシュリン。 - 【請求項１５】 Ｒ2は２〜２５個のアミノ酸残基を有
するペプチドである請求項１４記載の式IIのプロインシ
ュリン。 - 【請求項１６】 Ｒ2は２〜１５個のアミノ酸残基を有
するペプチドであり、そしてＭｅｔ、ＬｙｓおよびＡｒ
ｇからなる群より選択されるアミノ酸残基はカルボキシ
ル末端にある請求項１４または１５記載の式IIのプロイ
ンシュリン。
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