DD247684A1 - Verfahren zur isolierung von insulinderivaten - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Isolierung einer aus biogenetischen Vorstufen des Insulins bestehenden Komponente durch Einsatz makroporoeser carboxylierter Kationenaustauscher auf Acrylatbasis mit Divinylbenzol oder seiner Derivaten, wobei die B-Komponente waehrend der Elution des Insulins am Ionenaustauscher verbleibt und anschliessend durch Veraenderung der Loesungsmittelkonzentration, der Polaritaet des Loesungsmittels und/oder der Ionenstaerke desorbiert wird.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Insulinderivaten als Nebenprodukt der Insulinreinigung.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Bei der Feinreinigung von Insulin nach der herkömmlichen Methode der Gelchromatografie wird eine als B-Komponente bezeichnete Fraktion gewonnen, die im wesentlichen biogenetische Vorstufen des Insulins enthält wie z. B. solche Substanzen wie Proinsulin und seine Derivate sowie enzymatische und chemische Abbauprodukte dieser Substanzen. In dieser B-Komponente ist von medizinischer Wichtigkeit besonders das menschliche Proinsulin zur Diagnose von Erkrankungen der endokrinen Organe auf der Basis von Immunoassays. Weiterhin lassen sich Proinsulin und seine enzymatischen Abbauprodukte, die mit dem Insulin gemeinsam aus Pankreas extrahiert werden, die die verschiedenen Intermediatformen mit Vorteil als Ausgangsprodukte für Semi- und Partialsynthesen von modifizierten Insulinen nutzen, die zu solchen hochwertigen Substanzen wie zum Human-Insulin führen können.

Weiterhin sind solche Substanzen wie tierisches Proinsulin von großer Bedeutung für den Aufbau von Analysenmethoden zur Reinh'eitsunfersuchung von hochgereinigten Insulinen.

Für solche Produkte reicht die Analytik mit klassischen physikalisch-chemischen Methoden nicht mehr aus, so daß auf die hochempfindlichen Antikörpertechniken übergegangen wird, um in Insulinpräparaten solche Verunreinigungen wie Proinsulin im ppm-Bereich nachzuweisen. Für solche Verfahren ist die Bereitstellung von Proinsulin Voraussetzung. Der Stand der Technik wird dadurch charakterisiert, daß mit hohem Aufwand an Dextran-oder Polyacrylamidgel verdünnte Lösungen der B-Komponente gewonnen werden. So isolierten SCHMIDT und ARENS (H. S. Z. Physiol. Chem. 349 [1968] S. 1157-1168) aus 10g Insulin unter Einsatz von 6000ml Gel eine etwa 0,1%ige Lösung der B-Komponente in 1 M Essigsäure. Bedingt durch die niedrige Konzentration ist es notwendig, diese Lösungen durch Einengen in Rotationsverdampfern und anschließende Lyophilisierung aufzuarbeiten. Diese Aufarbeitung hat neben dem hohen technischen Aufwand noch den Nachteil, daß durch den hohen Säureüberschuß und den Eindampfungsprozeß mit einer teilweisen Zerstörung der empfindlichen Substanzen gerechnet werden muß. Moderne Verfahren zur Reinigung von Insulin beruhen fast ausschließlich auf dem Einsatz von Ionenaustauschern. Diese Verfahren sind auf jeden Fall Voraussetzung für die Gewinnung solcher Insuline aus Pankreas, die nur aus einer in der Polyacrylamiddiskelektrophorese nachweisbaren Komponente bestehen. Obwohl solche Verfahren zur Reinigung von Insulin mit Ionenaustauschern in der Patentliteratur beschrieben werden, die Insulin mit hohen Reinheitskriterien ausweisen, wurde die Gewinnung von B-Komponente als Nebenprodukt dieser Verfahren nicht beschrieben.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Gewinnung einer aus biogenetischen Vorstufen des Insulins bestehende Komponente als Nebenprodukt eines Insulinreinigungsverfahrens aufzuzeigen.

DasZiel besteht darin, ein neues Verfahren aufzuzeigen, daß eine hohe Effektivität aufweist und die wertvollen Substanzen dabei weitgehend vor Zerstörung schützt.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren, daß die Isolierung einer aus biogenetischen Vorstufen des Insulins bestehende Komponente als Nebenprodukt der Reinigung von Insulin mit Kationenaustauschern bei weitgehender Schonung der empfindlichen Substanzen aufzuzeigen.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß amorphes oder kristallines Rohinsulin an einen schwach sauren Ionenaustauscher mit hydrophober Matrix im sauren pH-Bereich adsorbiert wird und nach Elution des Insulins durch Veränderung der Art und/oder Konzentration des Elutionsmittels, gegebenenfalls bei Veränderung der lonenstärke sowie durch Zusatz von aromatischen Substanzen die B-Komponente eluiert wird.

Geeignete Ionenaustauscher sind z. B. solche makroporösen Copolymere, die aus Acrylsäurederivaten und Vernetzern, wie z. B.

Divinylbenzolen und Funktionalisierung gewonnen werden (z. B. kommerzielle Wofatite® des CKB).

Geeignete Elutionsmittel sind homogene Gemische aus organischen Lösungsmitteln und Wasser. Dabei eignen sich als Lösungsmittel besonders flüssige aliphatische Alkohole, niedrigsiedende aliphatische Ketone und Halbacetale und wenigstens teilweise mit Wasser mischbare Ester sowie Mischungen daraus.

Geeignete aromatische Substanzen sind Benzol und seine Derivate.

Zur Einstellung der Acidität und lonenstärke sind organische Säuren wie z. B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Weinsäure, Zitronensäure, anorganische Säuren wie z. B. Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure sowie Salze dieser Säuren wie z. B. Natriumchlorid, Natriumzitrat, Ammoniumsulfat, Kaliumphosphat geeignet.

Zur Gewinnung der B-Komponente ist die Anwendung der Ionenaustauscher sowohl im Säulenverfahren wie auch im „batch"-Verfahren möglich.

Das Verfahren wird im allgemeinen so durchgeführt, daß mit Substanzen der B-Komponente verunreinigtes Insulin beliebiger Spezies durch Adsorption an den Kationenaustauscher gebunden wird. Anschließend wird das Insulin eluiert und es hinterbleibt ein mit Substanzen der B-Komponente beladener Austauscher.

Durch Veränderung der Elutionsmittelzusammensetzung in Richtung niedrigerer Polarität und/oder höherer Konzentration und/oder Erhöhung der lonenstärke wird die gebundene Substanz vom Austauscher eluiert und nach bekannten Verfahren weiter verarbeitet.

Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, im Temperaturbereich von 260-320 K zu arbeiten, wobei Temperaturen zwischen 290 und 310Kaus Gründen der Reaktionskinetik zu bevorzugen sind.

Als Lösungsmittel sind aus ökonomischen Gründen mit Vorteil solche einzusetzen, die normalerweise in der Insulinherstellung üblich sind, weshalb Ethanol und Aceton bevorzugt werden, da sie in den normalen Rückgewinnungsprozeß eingeschleust werden können.

Wird solch eine Verkopplung mit einem Lösungsmittelrückgewinnungsprozeß nicht angestrebt, sind mit Vorteil Propanole im Gemisch mit Estern und Aromaten einsetzbar.

Wegen des hohen Einflusses der Porengröße auf den Adsorptions- und Desorptionsprozeß von den zu isolierenden Eiweißkomponenten sind Kationenaustauscher mit geringem Quervernetzungsgrad und makroporöser Struktur zu bevorzugen.

Aus gleichem Grunde sind kleine Korngrößen empfehlenswert.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist im pH-Bereich von 1 bis 12 realisierbar. Aus Gründen der Stabilität ist besonders im Bereich höherer Arbeitstemperaturen ein Intervall von pH 2,5 bis 10 zu empfehlen. In Abhängigkeit von der Reinheit der am Austauscher adsorbierten Substanz sollte bei mit Thiolen und/oder proteolytischen Enzymen verunreinigten Ausgangssubstanzen ein ph über 7,0 vermieden werden.

B-Komponente (Beispiele) Beispiel 1:

500 mg Human-Insulin werden in 10ml 1 N Essigsäure gelöst und auf eine Säule, die 5 ml Wofatit CP enthält, aufgetragen. Nach Waschen der Säule und Elution des Insulins erfolgt die Desorption der am Ionenaustauscher verbliebenen B-Komponente mit 20 ml 60%igem Ethanol, 1 N Essigsäure, 0,1 M Natriumchlorid mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 5 ml/h. Das die B-Komponente enthaltende Eluat wird schonend LM-befreit, an Sephadex G-25 entsalzt und lyophilisiert.

Ausbeute: 35 mg

Insulingehalt: 10%

Proinsulingehalt: 15%

Beispiel 2:

90g Schweineinsulin werden in 1,010,01 N Salzsäure gelöst und auf einer mit 0,11 Amberlite IRC-50 (US) gefüllten Säule aufgegeben. Nach Elution des Insulins erfolgt die Desorption der B-Komponente mit 40% Aceton, 0,02 N Salzsäure mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 0,5 l/h und bei Raumtemperatur. Die Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 1.

Ausbeute: 560 mg

Insulingehalt: <10%

Beispiel 3:

1g Schweineinsulin wird in 10OmI 45%igem Ethanol 1 N an Essigsäure gelöst und auf 10ml in 45% Ethanol, 1 η Essigsäure äquilibriertem Wofatit CA20 aufgegeben. Nach 3stündigem Rühren bei 40°C befindet sich das System im Gleichgewicht. Der Ionenaustauscher wird von der Lösung durch Filtration abgetrennt. Das Filtrat enthält die proinsulinfreie C-Komponente des Insulins, während die höhermolekularen Bestandteile des Insulins am Ionenaustauscher gebunden sind.

DieEiution der B-Komponente vom lonenaustauschererfolgt durch Zugabe von 50ml 0,1 N Essigsäure, 60% Ethanol, 1 N an Natriumchlorid.

Die Aufarbeitung der B-Komponente wird nach bekannten Methoden der Aussalzung, Entsalzung an SephadexG-25 und Lyophilisierung durchgeführt.

Ausbeute: 50 mg

Insulingehalt: . 15%

Proinsulingehalt: 10%

Claims (8)

Erfindungsanspruch:

1. Verfahren zur Isolierung einer aus biogenetischen Vorstufen des Insulins bestehende Komponente durch Einsatz von Ionenaustauschern, gekennzeichnet dadurch, daß die am Ionenaustauscher adsorbierte B-Komponente getrennt vom Insulin eluiertwird. *

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Insulin vom Ionenaustauscher eluiert wird, während die B-Komponente am Ionenaustauscher verbleibt.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Insulin vom Ionenaustauscher eluiert wird, während die B-Komponente am Ionenaustauscher verbleibt.

3. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Elution der B-Komponente vom Ionenaustauscher durch Veränderung der Lösungsmittel-Konzentration, der Polarität des Lösungsmittels oder der lonenstärke durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß als Lösungsmittel flüssige aliphatische Alkohole, niedrigsiedende aliphatische Ketone oder Halbacetale und wenigstens teilweise mit Wasser mischbare Ester sowie Mischungen daraus eingesetzt werden.

5. Verfahren nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß die Veränderung der lonenstärke durch Zusatz von organischen und anorganischen Salzen zum Elutionsmittel erfolgt.

6. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Isolierung der B-Komponente im pH-Bereich 1 bis 12 durchgeführt wird.

7. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Isolierung der B-Komponente vorzugsweise im pH-Bereich 2,5 bis 9,5 erfolgt.

8. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Ionenaustauscher makroporöse Copolymere, die aus Acrylsäurederivaten und Vernetzern, wie Divinylbenzol und seinen Derivaten bestehen, eingesetzt werden.