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Verfahren zur Abtrennung von Aldosteron aus Nebennierenextrakten Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung von Aldosteron, einer biologisch
hochwirksamen, chemisch einheitlichen neuen- Verbindung, aus Nebennieren.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man
einen nach bekannten Methoden mit Lipoidlösungsmitteln aus Nebennieren hergestellten
Extrakt durch Verteilung zwischen einem wäßrigen und einem mit Wasser nicht mischbaren.
Lösungsmittel und bzw. oder durch Chromatographie auftrennt, gegebenenfalls in Kombination
mit einer Reinigung nach demVerfahren von Gi rar d (Girard, A., und Sandulescu,
G., Helv. chim. Acta, Bd. i9, 1936,
S. 1095 bis 1107; USA.-Patentschrift 2
045 132) unter Gewinnung des ketonischen Anteils, und aus den erhaltenen,
insbesondere im Mineralstoffwechsel hochwirksamen Fraktionen das Aldosteron durch
Kristallisation abtrennt.
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Die verfahrensgemäß z. B. aus Acetön-Wasser gewonnene Verbindung ist
kristallin. Die lufttrockenen Kristalle enthalten Kristallwasser, denn bei längerem
Trocknen im Hochvakuum bei etwa 50° wird i Mol Wasser abgegeben. Der Schmelzpunkt
liegt vor und nach dem Trocknen je nach Kristallgröße und Erhitzungsgeschwiftdigkeit
zwischen etwa io4 und ii2° Die geschmolzene Masse kristallisiert bei weiterem Erwärmen
wieder vollständig, worauf bei etwa 153 bis i58° definitives Schmelzen eintritt.
Die letzten Spuren.
schmelzen oft erst einige Grade höher. Es kann
auch eine höher schmelzende Form gewonnen werden, z. B. durch Kristallisation aus
anderen Lösungsmitteln, beispielsweise Aceton-Äther; sie schmilzt nach dem Opakwerden
bei etwa 165 bis r69°. Die spezifische Drehung des Hydrats beträgt [a)o = + z45°
± 2° (c = o,9896 in Aceton), diejenige der getrockneten Substanz [a]D = + z52° ±
2° (c = 1,o264 in Aceton). Auf Grund der Mikroanalyse kommt dem getrockneten Präparat
die Bruttoformel C21 H2805 zu, wobei, wie immer bei so hochmolekularen Verbindungen,
die Wasserstoffzahl mit einer gewissen Unsicherheit behaftet ist (± 2). Im Ultraviolettabsorptionsspektrum
ist sowohl beim Hydrat wie bei der getrockneten Verbindung die für a, ß-ungesättigte
Ketone typische starke Bande sichtbar. Sie liegt bei 2,40 0,25 mu und weist
eine Extinktion auf, deren log e = 4,2o beträgt. Eine zweite, deutliche Bande befindet
sich bei 3o8 ::L 2 mu; log s = 1,92. Diese Werte wurden mit Konzentrationen von9,7o.
1o-4, xo-5undio-BMolje Liter in Äthanol bestimmt.
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Im Infrarotabsorptionsspektrum (aufgenommen auf einem sogenannten
Perkin-Elmer-double-beam-Instrument, Modellex, in Chloroformlösung, Schichtdicke
o,2 mm, mit Chloroform gleicher Schichtdicke kompensiert) sind charakteristische
Banden unter anderem bei 2,79,u (Hydroxylgruppe), bei 5,85/£ (mittelstark), 5,98
,u (stark) und 6,16 ,u (mittelstark) im Doppelbindungsbereich und bei
7,85 ,c', 9,38 ,u, 9,62 ,u, 9,95 ,u, xo,x8,u und xo,4x',u im Fingerprintbereich
sichtbar.
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Zur Kennzeichnung des neuen Wirkstoffes kann ferner die Wanderungsgeschwindigkeit
im Papierchromatogramm in den Ausführungsformen nach Zaffaroni, Burton und- Keutmann
(Science, Bd. im, 1950, S. 6) oder nach Bush (Biochem. Journ. Bd. 5o, 1952, S. 37o)
dienen, die im ersten Fall nur wenig größer ist als diejenige von Cortison und im
zweiten Fall zwischen derjenigen von Cortison ünd Hydrocortison liegt oder mit letzterer
weitgehend übereinstimmt. Der Nachweis der Substanz auf den Papierchromatogrammen
gelingt durch ihr Reduktionsvermögen gegenüber Silberdiammin- oder Triphenyltetrazoliumhalogenidlösüng,
durch ihre Ultraviolettabsorption, durch die gelbe Fluoreszenz nach Einwirkung von
wäßrig-methanolischer Alkalilauge und durch das Ausbleiben von Farbreaktionen mit
Phosphorsäure und mit Antimontrichloridlösung. Die Kombination dieser Eigenschaften
ist-unbedingt kennzeichnend für die Verbindung.
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An diesem neuen Wirkstoff durchgeführte Abbauversuche ergeben für
diesen die folgenden, miteinander offenbar im Gleichgewicht stehenden Formeln, wobei
bei den meisten Umsetzungen die Halbacetalform reagiert
Der neue Wirkstoff bzw. sein Hydrat wird als Aldosteron bezeichnet.
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Das Verfahrensprodukt ist biologisch hochwirksam. Besonders ausgeprägt
ist seine Wirkung auf den Mineralstoffwechsel. Im Test an der nebennierenlosen Ratte
nach K a g aw a sowie in demjenigen nach Simpson und Tait und im Erhaltungstest
am nebennierenlosen Hunde besitzt es eine mindestens 25- bis zoomal höhere Wirkung
als das Desoxycorticosteron (bzw. dessen Acetat), das die im Mineralstoffwechsel
wirksamste bekannte Verbindung darstellt (vgl. hierzu C. M. Kagawa, E. C. Shipley
und R. K. Meyer, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Bd. 8o, 1952, S. 281; S. A. Simpson
und I. F. Tait, Endocrinology, Bd.5o, 1952, S. 150, C. A. Harrop,1. I. Pfiffner,
A. Weinstein und W. W. Swingle, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Bd. 29, 1932, S. 449).
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Für das vorliegende Verfahren als Ausgangsstoff geeignete Rohextrakte
lassen sich nach bekannten Methoden, insbesondere in Anlehnung an die Vorschriften
von Cartland und Kuizenga oder von Swingle und Pfiffner gewinnen. Dabei hat es sich
als vorteilhaft erwiesen, die Vorschrift von Cartland und Kuizenga nur bis zur Extraktion
mit Äthylenchlorid zu verfolgen. - Die verfahrensgemäße Auftrennung der Extrakte
erfolgt z. B. durch Verteilung zwischen einem wäßrigen Alkohol, wie 3oprozentigem
Methanol, oder Wasser und einem geeigneten, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel,
insbesondere einem Kohlenwasserstoff, wie Petroläther oder Benzol, oder einem halogenierten
Kohlenwasserstoff, wie Chloroform, bzw. deren Gemischen. Diese Reinigung kann in
den für diesen Zweck bestimmten Apparaten, z. B. denjenigen von Craig oder von Podbjelniak
durchgeführt werden (vgl. hierzu G. F. Cartland und M. H. Kuizenga, Journ. Biol.
Chem., Bd. 116, 1936, S. 57; Swingle, W. W., und Pfiffner, I. I, Amer. Journ. Physiol,
Bd. 96, 1931, S. 153, 164; Graig, L. C., Journ. Biol. Chem., Bd. x55, 1944, S. 519;
Graig, L. C., undPost, O., Anal. Chem., Bd. 21, 1949, S. 500; Graig, C. L., und
Graig, D., »Extraction and Distributionzc in Weissberger, »Technique of Organic
Chemistry, Interscience, N. Y., 1950, Vol. III, S. 171 bis 311; Ullmanns
Enzyklopädie der technischen Chemie, III. Auflage, i. Band, S. 425).
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An Stelle einer solchen Verteilung oder zusammen mit ihr eignet sich
auch die Chromatographie hervorragend zur Reinigung, und zwar die Adsorptions- und
die Verteilungschromatographie. Diese beiden Prinzipien
lassen
sich nicht völlig voneinander unterscheiden, indem bekanntlich auch bei der Verteäungschromatographie
adsorptive Eigenschaften der Trägersubstanz eine Rolle spielen. Als Träger verwendet
man beispielsweise Kieselsäure (bekannt unter der Handelsbezeichnung »Silicagelcc),
Magnesiunisilikat, Kieselgur, Cellulose bzw. deren Gemische und als Lösungsmittel
z. B. Petroläther, Benzol, Aceton, Chloroform oder deren Gemische. In Verbindung
mit einem oder beiden vorstehend genannten Anreicherungsverfahren läßt sich auch
eine schonende Reinigung nach Girard durchführen, also mit Reagenzien die, wie Trimethylammonium-
oder Pyridiniumessigsäurehydrazid, wasserlösliche Ketonderivate ergeben, unter anschließender
Abtrennung und gelinder Spaltung der letzteren und Gewinnung des ketonischen Anteils.
Zur schonenden Durchführung der Trennung nach Girard arbeitet man in Abwesenheit
von Säuren, wie Eisessig. Als Lösungsmittel für diese Reaktion eignen sich Alkohole,
z. B. Methanol.
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Aus den Fraktionen, die auf Grund der beschriebenen papietchromatographischen
Analyse oder biologischen Untersuchung die neue Verbindung enthalten, läßt sich
diese durch Kristallisation aus einem geeigneten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch,
z. B. Aceton-Äther, gewinnen, vorteilhaft in Gegenwart von wenig Wasser, oder aus
wäßrigem Aceton. Bei Gegenwart von Wasser wird das Hydrat des Wirkstoffes erhalten.
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Frühere Untersuchungen von Nebennierenrinderohextrakten nach ähnlichen
Arbeitsmethoden, wie sie in der vorliegenden Anmeldung beschrieben sind (vgl. z.
B. Helv. chim. Acta, Bd. i9, 1936, S. iio7; deutsche Patentschriften 656 785 und
892 228) führten lediglich zu den bereits bekannten Hormonen oder zu gereinigten
Extrakten mit hoher Wirkung im Mineralstoffwechsel. Die Abtrennung des Aldosterons,
des reinen und kristallisierten Nebennierenhormons, wird im Rahmen der vorliegenden
Erfindung erstmals beschrieben. Seine hohe Aktivität erschließt ein ausgedehntes
Gebiet praktischer Anwendungsmöglichkeiten.
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DienachstehendenBeispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.
Beispiel i 5o0 kg frische oder tiefgekühlte Rindernebennieren werden nach einem
der bekannten Verfahren, vorzugsweise nach Cartland und Kuizenga (Journ. Biol. Chem.,
Bd. 116, 1936, S. 57), extrahiert. Je nach der Qualität der Drüsen erhält
man so ioo bis 5oo g Rohextrakt, der sodann durch Verteilung zwischen wäßrigem Alkohol,
z. B. 3o°/oigem Methanol, und Petroläther gründlich entfettet wird. Die wäßrige
Schicht extrahiert man nach Entfernen des Alkohols (alle Verfahrensmaßnahmen erfolgen
bei einer Temperatur von weniger als 50°) 4mal. mit dem gleichen Volumen Äther-Chloroform
(2 :_i oder 3: i; die Lösungsmittel müssen vorher gründlich gereinigt werden). Die
vereinigten Äther-Chloroform-Lösungen werden als solche oder nach Waschen mit verdünnter
Salzsäure und Hydrogencarbonatlösung und Trocknen über Natriumsulfat im Vakuum eingedampft.
Man erhält auf diese Art 23 bis 30 g gereinigten Extrakt als Ausgangsstoff
für das vorliegende Verfahren.
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Der genannte Extrakt wird auf einer großen Säule einer Verteilungschromatographie
unterworfen, wobei als stationäre Phase die ioo- bis Zoofache Menge Kieselgur-Wasser
im Gewichtsverhältnis i : i und als mobile Phase Petroläther, Benzol und Chloroform
dienen. Die Laufgeschwindigkeit der Eluate soll etwa 9o bis ioo cm3 *je Stunde
betragen, das Volumen jeder Fraktion iooo bis i2oo cm3. Die durch Eindampfen im
Vakuum gewonnenen Rückstände der einzelnen Fraktionen, aus denen zum Teil einige
der bekannten Corticosteroide -bereits kristallisiert anfallen, werden papierchromatographisch
analysiert. Die neue Verbindung läßt sich dabei z. B. mit Hilfe der RF-Werte (relative
papierchromatographische Wanderungsgeschwindigkeiten; vgl. z. B. Journ. biol. Chem.,
Bd. 177, S. iii), der Ultraviolettabsorption und des Reduktionsvermögens gegen Silberdiamminlösung
in solchen Fraktionen lokalisieren, welche durch Elution mit Benzol-Petroläther
7:,3 bis 9 : i erhalten werden. Die betreffenden Fraktionen (3oo bis 400 mg) werden
hierauf vereinigt und an einer zweiten Säule aus gereinigtem Cellulosepulver durch
Verteilung zwischen 6o°/oigem wäßrigem Methanol und Petroläther-Toluol (i : 2 bis
i : 3) aufgetrennt. Das Gewichtsverhältnis von Substanz zu Cellulose beträgt dabei
etwa i : ioo und dasjenige von stationärer Phase zu Cellulose i : 2. Zum Durchlauf
einer einzelnen Fraktion (4o cm3) benötigt man etwa 5 Stunden. Die durch Eindampfen
erhaltenen Fraktionen werden wiederum papierchromatographisch analysiert. Aus den
ausgewählten und vereinigten Fraktionen läßt sich die neue Substanz nun mit Aceton-Äther,
vorteilhaft in Gegenwart von wenig Wasser, kristallisieren. Durch Umkristallisieren
gewinnt man farblose Kristalle des Aldosterons in Form des Hydrates vom doppelten
Schmelzpunkt 104 bis 112 und 153 bis i58°, die sich als einheitlich ` erweisen,
eine hohe biologische Wirksamkeit auf den Mineralstoffwechsel und die übrigen in
der Einleitung genannten Eigenschaften besitzen. Die Elementaranalyse des im Hochvakuum
bei 50° getrockneten Präparates lieferte die folgenden Werte: Kohlenstoff 69,68"/"
Wasserstoff 8,39 °%; berechnet für C" H28 O5 : Kohlenstoff 69,970/" Wasserstoff
7,830/,. Die übrigen Eigenschaften der getrockneten Verbindung weichen nicht wesentlich
von denjenigen des Hydrats ab. Beispiel 2 5oo kg Rindernebennieren werden, wie im
Beispiel i angegeben, extrahiert. Das entfettete Ausgangsmaterial (24 g) wird zuerst
durchAdsorptionschromatographie an der iofachen Menge Kieselsäure (bekannt unter
dem Handelsnamen »Silicagela) mit Methylenchlorid, Chloroform, Aceton und Methanol
gereinigt. Die papierchromatographisch kontrollierten Fraktionen, welche neben anderen
Verbindungen den gesuchten Wirkstoff enthalten (9,7 g), werden vereinigt und auf
einer Säule unter Verwendung der 2ofachen Menge Cellulosepulver zwischen Propylenglykol
einerseits und Cyclohexan, Toluol sowie Methylenchlorid anderseits verteilt. Diejenigen
Fraktionen,
welche viel Propylenglykol enthalten, werden davon nach
Versetzen mit Äther-Chloroform-Lösung (3: 1) durch Ausschütteln mit Wasser
befreit.
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Die entsprechend der papierchromatographischen Analyse geeigneten
Fraktionen '(2,g g) werden vereinigt und einer weiteren Verteilungschromatographie
an der 40fachen Menge Cellulose zwischen Propylenglykol und Benzol unterzogen. Die
wirkstoffhaltigen Fraktionen (etwa 60o mg) reinigt man schließlich noch durch Verteilung
gemäß Beispiel i. Nun läßt sich die neue Verbindung ohne weiteres, wie im Beispiel
i beschrieben, kristallisieren.
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An Stelle einer Verteilungschromatographie im Rohr läßt sich auch
eine solche an Papierbögen unter Verwendung der Systeme Propylenglykol-Toluol oder
wäßriges Methanol-Petroläther-Toluol bzw. Benzol oder Essigester durchführen. Beispiel
3 Ein aus 50o kg Nebennieren hergestellter, wie im Beispiel i angegeben, gereinigter
Extrakt (25 g) wird mit Girard-Reagenz (vgl. A. Girard und C. Sandulesco, Helv.
chim. Acta, Bd. i9,1936, S. 1095 bis iio7) in methanolischer Lösung stehengelassen.
Dann wird Wasser zugegeben, mit Chloroform-Äther (1:3) extrahiert, der wäßrige Anteil
mit verdünnter Salzsäure auf etwa pH = i gebracht und nach 1/4 Stunde der freigesetzte
ketonische Anteil mit Chloroform-Äther (1:3) ausgezogen. Die regenerierte Ketonfraktion
(q.,8 g) unterwirft man den im Beispiel i beschriebenen zwei Verteilungschromatographien.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform besteht darin, daß man die Abtrennung
der ketonischen Bestandteile nach Girard erst nach der ersten Verteilungschromatographie
mit den hierbei ausgewählten Fraktionen vornimmt und erst dann die so erhaltene
Ketonfraktion (8o mg) der zweiten Verteilungschromatographie auf einer Cellulosesäule
oder an Papierblättern unterwirft.
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Die in der papierchromatographischen Analyse als besonders wirkstoffhaltig
befundenen Fraktionen kristallisiert man in der im Beispiel i beschriebenen Weise
oder aus Aceton-Wasser um. Beispiel q. ioo kg Schweinenebennieren werden, wie im
Beispiel i angegeben, extrahiert. Der noch stark fetthaltige Extrakt (151g) wird
dann zwischen natriumchloridhaltigem, 3o°/oigem Methanol und Petroläther verteilt.
Die wäßrig-alkoholische Lösung, in der sich die Nebennierenrindenhormone befinden,
wird sodann im Vakuum auf 250 cm3 eingeengt und 5mal mit- je 11 Äther-Chloroform
(3: 1) extrahiert. NachTrocknen über Natriumsulfat wird das Lösungsmittelgemisch
im Vakuum abdestilliert. Man erhält so 38 g eines Extraktes, der an einer Säule
mit der ioofachen Menge Kieselgur-Wasser (i: i) chromatographiert wird. Als mobile
Phase dient wassergesättigter Petroläther, dem im Verlaufe der Chromatographie nach
und nach steigende Mengen von Benzol zugesetzt werden. Die papierchromatographische
Analyse der einzelnen 5oo-cm3-Fraktionen zeigt das Aldosteron in den Eluaten mit
7o °/a Benzol an. Diese Fraktionen werden vereinigt (38o mg) und an einer Säule
mit der Zoofachen Menge gereinigten Cellulosepulvers unter Verwendung des Systems
Wasser-Methanol-Benzol-Petroläther 5 : 5 : 3 : 7 und i : i : _-: i chromatographiert,
wobei das Gewichtsverhältnis von Cellulose zu unterer (stationärer) Phase 9,: 1
beträgt. Aus den nach papierchromatographischer Analyse ausgewählten Fraktionen
läßt sich der Wirkstoff aus Aceton-Äther-Wasser kristallisieren. Aus den Mutterlaugen
erhält man nach papierchromatographischer Reinigung noch weitere Mengen Kristalle.
Durch Umkristallisieren aus Aceton-Äther gewinnt man das Aldosteron in Form von
farblosen Kristallen vom F. = 165 bis 16g° (nach Opakwerden ab 13o°). Beispiel 5
500 kg Rindernebennieren werden, wie im Beispiel z angegeben, extrahiert.
Das entfettete Ausgangsmaterial (27 g) wird in 50 cm3 Aceton gelöst, mit
25 g Kieselgur-Wasser (i: i) vermischt und das Aceton im Vakuum vollständig entfernt.
Dann wird in Petrol äther suspendiert, auf die Säule (Füllung: 1,4 kg Kieselgur,
mit 1,4 kg Wasser befeuchtet und in Petroläther suspendiert) gegeben und nach Absitzen
und FestpressenmitpassendenFilterpapierscheibengedeckt. Zum Schluß wird noch eine
Schicht (25 g) frisches Kieselgur-Wassei analog aufgetragen und wieder mit einigen
Filterpapierscheiben gedeckt. Anschließend wird bei 2o° chromatographiert, Laufgeschwindigkeit
etwa loo cm3 je Stunde. Als mobile Phase werden verwendet: Petroläther, Petroläther-Benzol-Gemisch,
Benzol-Chloroform-Gemische und Chloroform (alle Lösungsmittel wassergesättigt).
In den Eluaten, die mit Benzol-Petroläther vom Mischungsverhältnis 65: 35 bis 75:
25 erhalten werden, kann das neue Hormon papierchromatographisch nachgewiesen werden
(Propylenglykol-Toluol-System sowie C-System vön Bush; vgl. Science, Bd.111,
1950, S.6, und Biochem. Journ., Bd. 50, 1952, S. 37o).
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Diese Fraktionen (32q. mg) werden zur weiteren Reinigung einer zweiten
Verteilungschromatographie unterworfen. Als Träger dient 6o g gewaschenes Cellulosepulver,
das mit 3o cm3 der unteren Phase des folgenden Lösungsmittelsystems vermischt wird:
666 cm3 TOlu01, 333 cm3 Petroläther, 400 cm3 Wasser und 60o cm3 Methanol. Als bewegliche
Phase wird die obere Schicht anfangs dieses Systems verwendet, später diejenige
aus 750 cm3 Toluol, 250 cm3 Petroläther, 400 cm3 Wasser und 60o cm3
Methanol. Das zu trennende Material (32¢ mg) wird in 2 cm3 schwerer Phase gelöst
(eine kleine Menge Material bleibt ungelöst) und mit q. g Cellulosepulver vermischt
auf die Säule aufgetragen. Der kleine ungelöste Rest wird nun noch mit i cm3 schwerer
Phase und 2 cm3 Cellulosepulver aufgenommen und ebenfalls auf die Säule gegeben.
Nach Auflegen einer Filterpapierscheibe werden noch 2 g Cellulosepulver mit i cm3
schwerer Phase vermischt aufgegeben, gut gepreßt und mit der leichten Phase chromatographiert.
Laufgeschwindigkeit 8 bis g cm3 je Stunde, Temperatur 2o°. Alle Fraktionen werden
im Vakuum bei 35° Badtemperatur eingedampft. Für die Fraktionen 34 bis q.¢ wird
das Gemisch mit höherem Toluolzusaiz verwendet
und von Fraktion
45 an die leichte Phase eines Gemisches aus io Teilen reinem Benzol, q. Teilen Wasser
und 6 Teilen Methanol. Die Fraktionen, die hauptsächlich das neue Hormon enthalten
(etwa 51 mg), geben aus wenig feuchtem Aceton mit Äther nach mehrstündigem Stehen
bei o° spontan Kristall drusen; F. = ioq. bis 1o7°, dann bei vorsichtigem weiterem
Erhitzen langsam erstarrend mit zweitem Schmelzpunkt bei 154 bis i57°. Nach dem
Papierchromatogramm ist die Verbindung einheitlich. Die Hauptmenge ist farblos.
Die vereinigten Mutterlaugen geben, wie -vorstehend beschrieben, nochmals eine reichliche
Menge Kristalle, die aber leicht gelblich gefärbt ist. Die Reinigung gelingt am
besten wie folgt: Die Rohkristalle werden in wenig Aceton, das io °/o Wasser enthält,
gelöst, mit etwa der 5fachen Menge Äther versetzt und durch eine kleine Schicht
gepreßter Watte (etwa 3 mm dick und 5 mm lang) filtriert, die vorher gut mit Aceton-Äther
gewaschen worden ist. Dann wird gut mit demselben Lösungsmittel nachgewaschen, das
klare farblose Filtrat auf ein kleines Volumen eingeengt und vorsichtig niit Äther
verdünnt. Nach Impfen setzt die Kristallisation sofort ein. Sie wird durch mehrstündiges
Stehen bei o° und allmählichen Zusatz von Äther vervollständigt. Dann wird mit wenig
Aceton-Äther (etwa i : io), reinem Äther und Pentan gewaschen. Ausbeute an Rohkristallen:
22,5 mg. Diese werden nochmals auf die gleiche Weise filtriert und umkristallisiert
und liefern 2r,8 mg des analysenreinen Wirkstoffes.