DE68919647T2

DE68919647T2 - Verfahren zur Verringerung des Aggregatinhaltes in Wachstumshormonen gleichenden Stoffen.

Info

Publication number: DE68919647T2
Application number: DE68919647T
Authority: DE
Inventors: Kevin Michael Mccoy; John Mclean Simpson
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1988-10-26
Filing date: 1989-09-27
Publication date: 1995-05-11
Anticipated expiration: 2009-09-28
Also published as: NZ231067A; ES2064412T3; AU621676B2; DK530889A; EP0365858A2; FI895063A0; IE893437A1; NO177857B; EP0365858B1; KR900006011A; DK172576B1; IL91837A0; AU4377489A; JPH02218690A; NO177857C; NO894249D0; KR0131872B1; ZA898097B; JP2728524B2; PT92088B

Description

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung betrifft eine Verbesserung eines durchflußchromatographischen Verfahrens unter Anwendung eines Mediums vom starken Anionenaustauschertyp zur Trennung von kovalenten und nichtkovalenten Aggregationen aus monomerem wachstumshormonähnlichem Material, umfassend:
Insgleichgewichtbringen des Mediums in einer Startpufferspezies mit einem pKa-Wert nahe 11,5 und einer ausreichenden Konzentration eines Einfachsalzes, um das monomere wachstumshormonähnliche Material nicht an dem Medium absorbieren zu lassen; Zugabe der geeigneten Menge an Pufferspezies und Einfachsalz zu der wachstumshormonähnliches Material enthaltenden Lösung, die zu reinigen ist, derart, daß die Konzentration von jedem die gleiche ist wie vom Startpuffer; Aufgeben der wachstumshormonähnliches Material enthaltenden Lösung auf eine mit dem Medium gefüllte Säule und Sammeln von Durchfluß herrührenden Ausflusses aus der Zuführungslösung und aus einer Verdrängungswaschlösung unter Verwendung des Startpuffers (der Ausfluß enthält das monomere wachstumshormonähnliche Material); und Waschen des Säulenmediums mit stark salzhaltigen und/oder alkalischen Lösungen zum Abstreifen von stark absorbierenden Spezies von dem Medium und anschließend Regenerieren des Mediums für den nächsten Zyklus; dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren die Ausführung bei einem pH-Wert der Lösung oberhalb 10,5 umfaßt. Die Erfindung schließt ein Absorptions/Desorptions-elutionschromatographisches Verfahren ein unter Anwendung eines Mediums vom starken Anionenaustauschertyp zur Trennung von kovalenten und nichtkovalenten Aggregationen aus monomerem wachstumshormonähnlichem Material, umfassend Insgleichgewichtbringen des Mediums in einer Startpufferspezies mit einem pKa nahe 11,5 und einer geeigneten Konzentration eines Einfachsalzes; unter Zugabe der geeigneten Menge von der Pufferspezies und dem Einfachsalz zu der zu reinigenden wachstumshormonähnliches Material enthaltenden Lösung, derart, daß die Konzentration von jedem dieselbe ist wie die des Startpuffers; Auftragen der wachstumshormonähnliches Material enthaltenden Lösung auf eine mit Medium gefüllte Säule, gefolgt von Verdrängungswaschen mit dem Startpuffer; Eluieren des monomeren wachstumshormonähnlichen Materials unter Verwendung einer isokratischen oder Gradientenmethode und Waschen und Regenerieren des Mediums mit geeigneten Puffern zur Entfernung stark absorbierter Spezies und Zubereiten des Mediums für den nächsten Zyklus.

Zeichnungen

Fig. 1 ist die SDS-PAGE vom Ausgangsmaterial (Bahn 1) und chromatographiertem Material (Bahn 2) unter Verwendung der Methode von Beispiel 1.
Fig. 2 sind Gelpermeationschromatogramme unter Verwendung einer Superose 6-Säule (Pharmacia). Das obere Chromatogramm ist die Zufuhrlösung, während das untere der lyophilisierte Ausfluß aus dem Anionenaustauscher, wie in Beispiel 2 beschrieben, ist.
Fig. 3 ist das Chromatogramm, erhalten unter Verwendung des Elutionsverfahrens, das in Beispiel 3 beschrieben wird. Die verwendete Säule hatte ein 1 cm³-Bettvolumen an Mono-Q Anionenaustauscher (Pharmacia).

Beschreibung der Erfindung im einzelnen

Rekombinante DNA-Technik macht es möglich, große Mengen an Proteinen für potentielle kommerzielle Verwendungen zu erzeugen, die vorher aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit solcher Proteine von natürlichen Quellen nicht denkbar waren. Durch Mikroorganismen erzeugte Proteine, die genetisch manipuliert wurden, sind jedoch häufig nicht so korrekt gefaltet und sind somit biologisch inaktiv.
Kürzlich gab es verschiedene Offenbarungen betreffend der Gewinnung, Isolierung und Solubilisierung von Einschlußkörperproteinen aus Bakterien. Das Ziel dieser Offenbarung war, Verfahren zu beschreiben, die die Umwandlung von denaturiertem unlöslichem Protein zu der geeignet gefalteten, monomeren, biologisch aktiven Form maximal gestalten. Nicht genau gefaltete nichtkovalente Aggregationen oder kovalente Oligomere werden während des Laufes der Solubilisierung und Renaturierung unvermeidlich gebildet. Diese Produkte sind biologisch nicht aktiv und müssen aus dem gewünschten bioaktiven monomeren Protein abgetrennt werden.
Folglich besteht die Aufgabe der Erfindung darin, ein effizientes Verfahren oder effiziente Verfahren zur Abtrennung dieser biologisch inaktiven Aggregation und/oder oligomeren Verunreinigungen aus dem monomeren biologisch aktiven Protein bereitzustellen.
Die Erfindung offenbart ein effizientes und wirtschaftliches Verfahren oder effiziente und wirtschaftliche Verfahren zur Abtrennung von Verunreinigungen hohen Molekulargewichts aus monomeren wachstumshormonähnlichen Materialien. Die Verunreinigungen hohen Molekulargewichts können das Ergebnis intermolekularer kovalenter Bindung oder nichtkovalenter Assoziation sein. Das chromatographische Verfahren bzw. die chromatographischen Verfahren, die hier beschrieben werden, trennen solche kovalenten oder nichtkovalenten Aggregationen, die biologisch inaktiv sind, wirksam von dem monomeren bioaktiven Protein.
Das erfindungsgemäße Verfahren wendet ein chromatographisches Verfahren auf der Grundlage der Trennung durch ionische Mechanismen an; d. h. Ionenaustauschchromatographie, die weit effizienter und wirtschaftlicher ist als übliche Mittel zur Trennung von Aggregationen von Monomer, wie Gelpermeationschromatographie. Die Vorteile der Ionenaustauschchromatographie schließen höhere Proteinbeladung pro Einheitsvolumen des Mediums, höhere lineare Geschwindigkeit durch das Medium ohne Verlust von Auflösung oder übermäßigen Rückdruck und die Fähigkeit, Verunreinigungen vom Bakterienwirt, wie Endotoxine zu entfernen, ein. Die ersten drei vorstehend genannten Vorteile führen bei Einsparung von Kosten und Betriebsaufwendungen zu einer Fertigungsanlage auf kommerzieller Ebene durch Verminderung der Größe der Ausstattung und der Menge an chromatographischem Medium, das erforderlich ist für eine festgelegte Produktionsgeschwindigkeit. Der letzte angeführte Vorteil erlaubt die Beseitigung des Betriebs einer Trennanlage durch Kombinieren der Funktionen von zwei Vorgängen zu einem.
Das durch das offenbarte chromatographische Verfahren oder die offenbarten chromatographischen Verfahren hergestellte Material enthält sehr geringe Mengen an Aggregationsverunreinigungen. Ähnliche Verunreinigungen können durch extensive Verarbeitung durch bekannte Verfahren erhalten werden. Es ist die Aufgabe der Erfindung, eine effizientere und kostengünstigere Alternative zur Herstellung von Materialien bereitzustellen, die vorwiegend aus bioaktivem monomerem Protein zusammengesetzt sind. Die Vorteile der Erfindung für eine Fertigungsanlage auf kommerzieller Ebene werden für den Fachmann aus der nachstehenden Beschreibung und den Beispielen leicht ersichtlich.

Beschreibung

In dieser Beschreibung bedeutet der verwendete Ausdruck "wachstumshormonähnliches Material" (1) tierisches Wachstumshormon selbst, Derivate, Analoga und Fragmente davon beliebiger Spezies, beispielsweise vom Menschen, Rind oder Schwein; (2) Vorstufen für Wachstumshormon, wie reduziertes (-SH) Wachstumshormon und S-geschütztes Wachstumshormon, beispielsweise Wachstumshormon S-Sulfonat; (3) Varianten von Wachstumshormon oder dessen Vorstufen, beispielsweise Strukturen, die in der Aminosäuresequenz des Wachstumshormons verlängert oder verkürzt wurden, beispielsweise die 20K-Variante von menschlichem Wachstumshormon, Methionylwachstumshormon, und dergleichen und (4) Analoga von Wachstumshormon oder deren Vorstufen, beispielsweise Strukturen, in denen die Aminosäuresequenz des Wachstumshormons durch Ersatz von einem oder mehreren Aminosäureresten modifiziert wurde.
Die Erfindung betrifft die Beschreibung von chromatographischen Verfahren zur Verwendung zur Trennung von Aggregationen aus wachstumshormonähnlichen Materialien von dem gewünschten bioaktiven monomeren Material. Frühere Offenbarungen beschrieben hinreichend die Gewinnung, Isolierung und Solubilisierung von Einschlußkörpern aus dem Wirtsbakterium.
Aufgrund der unvermeidbaren Ineffizienz des Solubilisierungsverfahrens werden einige nicht genau gefaltete, nichtkovalente Aggregationen oder kovalente Oligomere mit dem gewünschten Monomer erzeugt. Ultrafiltration kann angewendet werden, um Colloide zu entfernen und Verunreinigungen sehr hohen Molekulargewichts. Eine wesentliche Menge an Aggregationen läuft jedoch durch den Ultrafilter mit dem Monomer hindurch. Dieses Ultrafiltrat kann vorteilhafterweise durch das nachstehende chromatographische Verfahren gereinigt werden.
Der Fachmann wird erkennen, daß der Ausdruck "starker Anionenaustauscher" Harze betrifft mit kationischen Gruppen, die ihre positive Ladung bei relativ hohem pH-Wert, beispielsweise oberhalb pH 9,0, behalten. Die an den Träger gebundenen kationischen Gruppen können ausgewählt sein aus quaternären Ammoniumgruppen, wie -CH&sub2;CH&sub2;N+(CH&sub2;CH&sub3;)&sub2;CH&sub2;CH(OH)CH&sub3;. Man kann als Beispiele von geeigneten handelsüblichen Anionenaustauscherharzen zur Verwendung in der Praxis der Erfindung QAE-Sephadex A-25, QE-52-Cellulose, Cellex QAE, Q-Sepharose und Mono-Q anführen.
Das angewendete Ionenaustauschermedium ist ein starker Anionenaustauschertyp, beispielsweise, jedoch nicht darauf beschränkt, Q-Sepharose (Pharmacia). Das Medium wird in eine übliche Chromatographiesäule gefüllt, die Teil eines üblichen chromatographischen Systems ist, bestehend aus Pumpen, Pufferreservoirs, UV-Detektor und Fraktionssammler. Das Medium wird in einem wässerigen Startpuffer, bestehend aus Piperidin oder einem anderen geeigneten Pufferungsmittel, mit einem ähnlichen pKa ins Gleichgewicht gebracht, bei einer Konzentration von 20 mM und Natriumchlorid oder einem ähnlichen Einfachsalz bei einer Konzentration von 50-250 mM. Der bevorzugte pH der Lösung beträgt 11,3-11,7 und mehr oder weniger Piperidin kann verwendet werden, um den gewünschten pH- Wert des Ausgangspuffers zu erreichen. Drei Bettvolumina an Puffer sind gewöhnlich hinreichend, um die Gleichgewichtseinstellung zu erreichen.
Die lösliches monomeres wachstumshormonähnliches Material und Verunreinigungen enthaltende Lösung, die hier als Zufuhrlösung bezeichnet wird, wird zu derselben Piperidin- und Natriumchloridkonzentration gebracht wie der Ausgangspuffer. Der pH-Wert wird so eingestellt, daß dasselbe Ergebnis, falls erforderlich, durch Zugabe von mehr Piperidin erreicht wird. Die Zufuhrlösung wird dann auf die Säule bei einer scheinbaren Geschwindigkeit aufgebracht bis 300 cm/h bis 50- 150 g Protein pro Liter Medium aufgetragen worden sind. Der Ausfluß wird durch Absorption bei 260 nm verfolgt und Fraktionen werden gesammelt, wenn ein Anstieg der Grundlinie stattfindet. Die Zufuhrlösung wird von 3-6 Bettvolumina des Ausgangspuffers gefolgt bis die Grundlinie erreicht ist. Alle gesammelten Fraktionen, vom anfänglichen Durchbruch bis die Grundlinie erreicht ist, werden zusammengegeben. Die Säule kann für weitere Verwendung durch Waschen mit geeigneten Puffern regeneriert werden, um stark gebundene Verunreinigungen zu entfernen und in dem Ausgangspuffer wieder ins Gleichgewicht gebracht zu werden.
Es wurde demonstriert, daß die monomere Form des wachstumshormonähnlichen Materials nicht an den aktiven Ionenaustauscherstellen des Mediums bindet, sondern statt dessen durch die Säule fließt und in dem Ausfluß wiedergefunden wird. Die Aggregationsverunreinigungen binden jedoch an der Säule und werden zurückgehalten bis ein geeignetes stärkeres Verdrängungsmittel zur ihrer Elution verwendet wird.
Zusätzlich zu dem vorstehend beschriebenen Durchflußverfahren wurde demonstriert, daß ein Absorptions/Desorptions-elutionschromatographisches Verfahren ebenfalls zur Trennung von Aggregationsverunreinigungen aus monomerem, wachstumshormonähnlichem Material wirksam ist. Das elutionschromatographische Verfahren ist jedoch weniger effizient bei ähnlichen Proteinbeladungen pro Einheitsvolumen im Medium. Trotzdem ist es bei geringen Proteinbeladungen noch ein durchführbares Verfahren zum Trennen von Monomer von Aggregaten.
Das für das elutionschromatographische Verfahren verwendete Ionenaustauschmedium und die damit verbundene Vorrichtung ist dieselbe wie für das Durchflußverfahren. Die verwendeten Puffer sind wässeriger Puffer (A), zusammengesetzt aus 20 mM Piperidin oder einem anderen geeigneten Pufferungsmittel mit ähnlichem pKa, das einen pH-Wert von 11,3- 11,7 ergibt und wässeriger Puffer (B), zusammengesetzt aus 20 mM Piperidin und 1000 mM Natriumchlorid oder ein ähnliches Einfachsalz. Die Säule wird zunächst unter Verwendung von 17 % Vol./Vol. Puffer (B) in Puffer (A) ins Gleichgewicht gebracht. Drei Bettvolumina sind gewöhnlich ausreichend, um die Gleichgewichtseinstellung zu gewährleisten. Anschließend wird die Zufuhrlösung, die aus löslichem monomerem wachstumshormonähnlichem Material und Verunreinigungen besteht, zu derselben Zusammensetzung wie Puffer (A) gebracht und auf die Säule aufgebracht, bis 5-15 g Protein pro Liter Medium aufgetragen sind. Dem folgt Verdrängung durch Waschen, bestehend aus fünf Bettvolumina 17% Vol./Vol. Puffer (B) in Puffer (A). Die Elution wird unter Verwendung von 20 Bettvolumina eines linearen Gradienten, beginnend mit 17% Vol./Vol. von Puffer (B) in Puffer (A) bis 47% Vol./Vol. Puffer (B) in Puffer (A) bewirkt. Das Eluat wird über die Extinktion bei 280 nm verfolgt und Fraktionen werden gesammelt. Schließlich werden 10 Bettvolumina Puffer (B) verwendet, um die Säule von stark absorbierten Spezies abzustreifen. Die Säule kann dann zur weiteren Verwendung durch zusätzliche Waschungen mit geeigneten Puffern unter Entfernung anderer stark gebundener Verunreinigungen und wieder Insgleichgewichtbringen mit Ausgangspuffer regeneriert werden.
Es wurde demonstriert, daß die monomere Form des wachstumshormonähnlichen Materials im Verlauf der Elution des Salzgradienten früher eluiert wird und daß die Aggregationsverunreinigungen in dem Gradienten mit einer Grundlinienauflösung zwischen zwei Peaks später eluiert werden.
Die vorstehend beschriebenen chromatographischen Verfahren wurden als wirksam zur Trennung von Monomer aus Aggregationsverunreinigungen unter Verwendung relativ roher Proteinlösungen gezeigt; d. h. hohen Anteilen an Verunreinigungen, bezogen auf das gewünschte Monomer. Die Verfahren wurden also, wie man annehmen könnte, erfolgreich verwendet zur weiteren Reinigung oder Aufarbeitung relativ sauberer Proteinlösungen, die bereits durch verschiedene Reinigungsschritte geführt wurden. Das Durchflußverfahren ist besonders geeignet zur wirtschaftlichen Aufarbeitung von bereits gereinigtem Protein, das Aggregatanteile enthalten könnte, die nur wenig höher sind als die Spezifizierung.
Die nachstehenden Beispiele sind zur weiteren Erläuterung der Praxis der Erfindung vorgesehen, jedoch nicht, um deren Schutzbereich einzuschränken.

Beispiel 1

Das Beispiel beschreibt die Durchflußmethode, die zur weiteren Reinigung von aufgearbeitetem Rindersomatotropin, abgeleitet von rekombinanten Bakterien, das bereits teilweise gereinigt wurde, jedoch hohe Mengen an Aggregationen enthält, verwendet wird.
Eine Säule mit 200 cm³ Q-Sepharose (Pharmacia) Anionenaustauschergel wurde unter Verwendung von 3 Bettvolumina des wässerigen Ausgangspuffers, bestehend aus 20 mM Piperidin und 150 mM Natriumchlorid mit einem pH-Wert von 11,5, ins Gleichgewicht gebracht. 20 g lyophilisiertes rekombinantes Rindersomatotropin von American Cyanamid Company wurde in 2000 cm³ Ausgangspuffer zu einer Konzentration von 10 g pro Liter wiederhergestellt und auf die Säule bei einer scheinbaren linearen Geschwindigkeit von 95 cm/h gegeben. Bald nach dem Auftrag begann der Durchbruch und wurde durch Verfolgen der Extinktion des Ausflusses bei 280 nm beobachtet. Der Ausfluß wurde gesammelt, wenn der Durchbruch stattfand. Die Zufuhrlösung wurde gefolgt von einer Verdrängungswaschlösung derselben Zusammensetzung wie der Ausgangspuffer, bis die Extinktion zur Grundlinie zurückgekehrt war. Der Ausfluß von der Beladungsphase nach dem Durchbruch wurde mit dem Ausfluß von der Verdrängungswaschung zu einem Gesamtvolumen von 2840 cm³ kombiniert. Der vereinigte Ausfluß wurde entsalzen und unter Verwendung einer 10K Dalton cutoff Hohlfaserpatrone konzentriert und dann lyophilisiert.
Das Ausgangsmaterial dieses Beispiels enthielt 11% Aggregationen durch nichtreduzierende SDS-PAGE, wobei alle von ihnen ein scheinbares Molekulargewicht von 44K oder 42K Dalton aufwiesen. Es wird angenommen, daß dieses Material kovalentes Dimer ist, gebildet durch intermolekulare Disulfidbrückenbindung zwischen den Rindersomatotropinmonomeren. Es wurde auch gezeigt, daß das kovalente Dimer nicht biologisch aktiv ist. Das nach Chromatographie erhaltene Material wies 0,2% Dimer durch SDS-PAGE auf. Die Aggregationskonzentration wurde durch Größenausschlußchromatographie gemessen und zeigte ebenfalls eine Senkung von über 10% einer Aggregation und weniger als 1% zwischen Ausgangs- und chromatographiertem Material auf. Nur auf Monomerbasis war die Ausbeute über den Chromatographieschritt 84%, d. h. 84% des zugeführten Monomers wurden in dem kombinierten Ausfluß wiedergewonnen. Zusätzlich wurde die Bioaktivität des Materials von 92 auf 101% des Standards erhöht, gemessen durch Radiorezeptorassay. Die Ergebnisse eines analytischen Vergleiches zwischen dem Ausgangsmaterial und dem chromatographierten Material sind in Tabelle I zusammengefaßt. Fig. 1 zeigt auch die SDS- PAGE Gelbahnen für das Ausgangsmaterial und das chromatographierte Material im Vergleich. Isoelektrische Fokussierung kann sowohl am Ausgangsmaterial als auch am chromatographierten Material ausgeführt werden. Die Ergebnisse (nicht dargestellt) weisen aus, daß keine Desamidierung während des Chromatographieschrittes stattfand. Tabelle 1 Ausgangsmaterial chromatographiertes Material Protein SDS-PAGE Dimer Superose Radiorezeptor Assay
* SDS-PAGE = Natriumdodecylsulfonatpolyacrylamid- Gelelektrophoresebestimmung
** Superose 12 (Pharmacia) = Gelpermeationschromatographiebestimmung
Anmerkung: Alle Bestimmungen wurden auf feuchtigkeitsfreier Grundlage berechnet.

Beispiel 2

Dieses Beispiel beschreibt die Durchflußmethode, die zur chromatographischen Reinigung relativ roher Proteinlösung verwendet wird, die eine wesentliche Menge an Aggregation im Größenbereich von etwa 40K bis über 100K Dalton aufweist.
Das zu reinigende Material war eine rohe Proteinlösung von rekombinantem Rindersomatotropin, das von Einschlußkörpern abgeleitet wurde und Ultrafiltration unterzogen wurde, zur Entfernung von Kolloiden und Verunreinigungen sehr hohen Molekulargewichts. Die Lösung wurde aus einer Pilotanlage von American Cyanamid Company erhalten.
Eine Säule mit 135 cm 3 Q-Sepharose (Pharmacia) Anionenaustauscher wurde mit demselben Puffer, wie in Beispiel 1 beschrieben, ins Gleichgewicht gebracht. Die rohe Proteinlösung, die vorher unter Verwendung einer 100K Dalton cut-off- Hohlfaserultrafiltrationsvorrichtung (Amicon) ultrafiltriert wurde, wurde mit derselben Puffersalzzusammensetzung wie der Ausgangspuffer durch Zugabe von Piperidin und Natriumchlorid ins Gleichgewicht gebracht. Die Proteinkonzentration der Lösung betrug 4,71 g/l. Die Säule wurde mit 3180 cm³ der Lösung beladen und der Ausfluß wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, gesammelt. Die Zufuhrlösung wurde gefolgt von einer Verdrängungswaschlösung, beschrieben wie in Beispiel 1. Das gesamte Ausflußvolumen, das gesammelt wurde, betrug 3489 cm³. Der Ausfluß wurde entsalzen, konzentriert und lyophilisiert zu einem Trockengewicht von 11,4 g.
Die rohe Proteinlösung, die 19,2% Aggregation enthielt, wurde durch Gelpermeationschromatographie (GPC) untersucht. Das lyophilisierte chromatographierte Material enthielt weniger als 1% Aggregation, durch GPC ermittelt, und 0,3% Oligomer durch SDS-PAGE. Fig. 2 zeigt die GPC-Chromatogramme für die Zufuhrlösung und den lyophilisierten Ausfluß von der Säule.

Beispiel 3

Das vorliegende Beispiel erläutert die Verfahren, die zur chromatographischen Reinigung einer Probe rekombinanten Rindersomatotropins unter Verwendung des Absorptions/Desorptionselutionsverfahrens verwendet wurden. Das Material wurde von der American Cyanamid Company erhalten und enthielt mehr als 10% Aggregationen, gemessen durch SDS-PAGE.
Eine 1-cm³-Mono-Q-Anionenaustauschersäule (Pharmacia) wurde für das vorliegende Beispiel verwendet. Die Puffer waren wässerige Puffer (A), zusammengesetzt aus 20 mM Piperidin, pH 11,5, und wässerige Puffer (B), zusammengesetzt aus 20 mM Piperidin, 1000 mM Natriumchlorid, pH 11,5. Die Säule wurde unter Verwendung von 17% Vol./Vol. Puffer (B) in Puffer (A) ins Gleichgewicht gebracht und dann 200 ul einer 20 mg/ml-Lösung von Rindersomatotropin in Puffer (A) injiziert. Der Injektion folgten 5 Bettvolumina 17% Vol./Vol. Puffer (B) in Puffer (A) und anschließend 20 Bettvolumina des linearen Gradienten von 17% bis 47% Vol./Vol. Puffer (B) in Puffer (A). Schließlich wurden 10 Bettvolumina 100% Puffer (B) zur Elution von stark adsorbierten Verunreinigungen verwendet.
Drei gut ausgebildete Peaks wurden während des Salzgradienten erhalten (siehe Fig. 3). Der erste Peak (282 s), der kurz nach dem Start des Gradienten erschien, war der größte. Der zweite erschien als ein überlappter Peak (345 s) auf der nachlaufenden Kante des ersten. Der dritte Peak (531 s) war gut getrennt von den ersten zwei. Zusätzlich wurde ein kleiner Peak (796 s) während des isokratischen Waschens mit 100% Puffer (B) eluiert.
Die einzelnen Peaks wurden isoliert und durch SDS- PAGE geprüft. Die ersten und zweiten Peaks wurden als reines Rindersomatotropinmonomer befunden. Der dritte Peak jedoch war zusammengesetzt aus Rindersomatotropindimer und höheres Molekulargewicht aufweisenden Oligomeren.

Beispiel 4

Dieses Beispiel zeigt im einzelnen angewendete Verfahren zur weiteren Reinigung eines von rekombinanten Bakterien abgeleiteten Schweinesomatotropins, das bereits teilweise gereinigt war, jedoch 22,4% Aggregationen, wie durch Gelpermeationschromatographie bestimmt, enthielt.
Eine Säule, enthaltend 4,5 l Q-Sepharose-Anionenaustauschergel (Pharmacia), wurde in der Durchflußanordnung gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen gleichen Verfahren eingesetzt. Puffervolumina wurden eingestellt, um den Unterschied der Bettvolumina zwischen den 2 Beispielen anzupassen. Eine Gesamtmenge von 450 g lyophilisiertem rekombinantem Schweinesomatotropin, erhalten von American Cyanamid Company, wurde in 45 l Ausgangspuffer wiederhergestellt und dann auf die Säule aufgetragen. Der Ausfluß wurde verfolgt und, wie in Beispiel 1 beschrieben, gesammelt. Der Verdrängungswaschlösungsausfluß wurde mit dem Ausfluß des Zufuhrzeitraums, wie vorher im einzelnen in Beispiel 1 ausgeführt, vereinigt.
Die Hauptmenge an kombiniertem Ausfluß zeigte, daß sie eine nicht nachweisbare Menge an Aggregationen enthielt, bestimmt durch GPC.

Claims

1. Durchflußchromatographisches Verfahren unter Anwendung eines Mediums vom starken Anionenaustauschertyp zur Trennung von kovalenten und nichtkovalenten Aggregationen aus monomerem wachstumshormonähnlichem Material, umfassend: Insgleichgewichtbringen des Mediums in einer Startpufferspezies mit einem pKa-Wert nahe 11,5 und einer ausreichenden Konzentration eines Einfachsalzes, um das monomere wachstumshormonähnliche Material nicht an dem Medium absorbieren zu lassen; Zugabe der geeigneten Menge an Pufferspezies und Einfachsalz zu der wachstumshormonähnliches Material enthaltenden Lösung, die zu reinigen ist, derart, daß die Konzentration von jedem die gleiche ist wie die des Startpuffers; Aufgeben der wachstumshormonähnliches Material enthaltenden Lösung auf eine mit dem Medium gefüllten Säule und Sammeln von Durchfluß herrührenden Ausflusses aus der Zuführungslösung und aus einer Verdrängungswaschlösung unter Verwendung des Startpuffers und Waschen des Säulenmediums mit stark salzhaltigen und/oder alkalischen Lösungen zum Abstreifen von stark absorbierenden Spezies von dem Medium und anschließend Regenerieren des Mediums für den nächsten Zyklus; dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren die Ausführung bei einem pH- Wert der Lösung oberhalb 10,5 umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der pH-Wert der Lösung 11,3 - 11,7 beträgt und das Einfachsalz Natriumchlorid ist bei einer Konzentration von 50 - 250 mM in dem Startpuffer.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Pufferspezies Piperidin oder ein Phosphatsalz ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das wachstumshormonähnliche Material rekombinantes oder Hypophysen-Rinder- oder Schweinesomatotropin ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Lösung des zu reinigenden wachstumshormonähnlichen Materials roh ist, (starke Anteile Verunreinigungen) oder relativ rein ist (geringe Verunreinigungsanteile).

6. Absorptions/Desorptions-elutionschromatographisches Verfahren unter Anwendung eines Mediums vom starken Anionenaustauschertyp zur Trennung von kovalenten und nichtkovalenten Aggregationen aus monomerem wachstumshormonähnlichem Material, umfassend Insgleichgewichtbringen des Mediums in einer Startpufferspezies mit einem pKa nahe 11,5 und einer geeigneten Konzentration eines Einfachsalzes; Zugabe der geeigneten Menge von der Pufferspezies und dem Einfachsalz zu der zu reinigenden wachstumshormonähnliches Material enthaltenden Lösung, derart, daß die Konzentration von jedem dieselbe ist wie die des Startpuffers; Auftragen der wachstumshormonähnliches Material enthaltenden Lösung auf eine mit Medium gefüllte Säule, gefolgt von Verdrängungswaschen mit dem Startpuffer; Eluieren des monomeren wachstumshormonähnlichen Materials unter Verwendung einer isokratischen oder Gradientenmethode und Waschen und Regenerieren des Mediums mit geeigneten Puffern zur Entfernung stark absorbierter Spezies und Zubereiten des Mediums für den nächsten Zyklus; dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren die Ausführung bei einem pH-Wert der Lösung oberhalb 10,5.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der pH-Wert der Lösung 11,3 - 11,7 beträgt und das Einfachsalz Natriumchlorid bei einer Konzentration von 50 - 1000 mM ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Pufferspezies Piperidin oder ein Phosphatsalz ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das wachstumshormonähnliche Material rekombinantes oder Hypophysen-Rinder- oder Schweinesomatotropin ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Lösung des zu reinigenden wachstumshormonähnlichen Materials roh ist (hohe Anteile an Verunreinigungen) oder relativ rein ist (geringe Anteile an Verunreinigungen).