JPH02218690A - 生長ホルモン様物質の集合体を減少する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、強アニオン交換樹脂媒体を、１１゜５付近の
ｐＫａ及び単量体生長ホルモン様物質を該媒体に吸着せ
しめない十分な量の単純な塩を含む出発緩衝剤種牛で平
衡化させ；それぞれの濃度が出発緩衝剤と同一であるよ
うに適当な量の緩衝剤種及び単純な塩を精製すべき生長
ホルモン様物質の溶液に添加し：生長ホルモン様物質の
溶液を媒体を充填したカラムに負荷し、そして原料溶液
から及び出発緩衝剤を用いる置換洗浄液からの通流流出
物を集め（流出物は単量体生長ホルモン様物質を含有す
る）；そして カラムの媒体を高塩及び／又は苛性溶液で洗浄して強く
吸着された種を媒体から除去し、次いで次のサイクルの
ために該媒体を再生する、ことを含んでなる共有及び非
共有結合の集合体を単量体生長ホルモン様物質から分離
するために該アニオン交換樹脂型媒体を用いる通流クロ
マトグラフィー法に関する。

更に本発明は、強アニオン交換樹脂を媒体を、１１．５
付近のｐＫａ及び適当な濃度の単純な塩を含む出発緩衝
剤種中で平衡化させ；それぞれの濃度が出発緩衝剤と同
一であるように適当な量の緩衝剤種及び単純な塩を精製
すべき生長ホルモン様物質の溶液に添加シ、−生長ホル
モン様物質の溶液を該媒体を充填したカラムに負荷し、
続いて出発緩衝剤で置換洗浄し：単量体生長ホルモン様
物質を一定又はグラジェント法で流出させ：そして該媒
体を強く吸着された種を除去するために適当な緩衝剤で
洗浄し且つ再生し、次のサイクルに対して媒体を準備す
る、ことを含んでなる共有及び非共有集合体を単量体生
長ホルモン様物質から分離するために該強アニオン交換
樹脂型媒体、を用いる吸着／脱着流出クロマトグラフィ
ー法に関する。

要するに本発明によれば、生長ホルモン様物質の集合体
量をかなり減する該物質のクロマトグラフィー精製法が
開示される。本方法は集合体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）不
純物を減するために使用されている現存法に対する非常
に効率よい且つ安価な代替法である。

第１図は実施例１の方法を用いる出発物質（レーンｌ）
及びクロマトグラフィーで処理した物質（レーン２）の
５ＤＳ−ページ（ＰＡＧＥ）である。

第２図はスーパーローズ（Ｓ　ｕｐｅｒｏｓｅ）　６　
（ファーマシア）のカラムを用いるゲル・パーミェーシ
ョン・クロマトグラフィーである。上のクロマトグラム
は原料溶液であり、一方下は実施例２に記述したような
アニオン交換樹脂からの凍結乾燥した流出物である。

第３図は実施例３に記述した流出法を用いて得たクロマ
トグラフである。用いたカラムはモノ（Ｍｏｎｏ）　−
Ｑアニオン交換樹脂（ファーマシア）ｌｃｃの容量のカ
ラム床であった。

組換えＤＮＡ技術は、天然起源からのそのような蛋白質
の入手性が限定されていて従来可能でなかっｊ；潜在的
な商業的適用のために多量の該蛋白を製造することを可
能にした。しかしながら遺伝子操作した微生物の産生ず
る蛋白質はしばしば正しく表現されず、斯くして生物学
的に不活性である。

最近封入体蛋白質の、バクテリヤからの回収、単離及び
可溶化に関していくつかの開示がある。

これらの開示の目的は、変性された不溶性の蛋白質を、
適切に転写された単量体の生物学的に活性な形態に転化
するのを最大にする方法を記述している。回避できない
ことに、可溶化及び再自然化の過程では不適当に転写さ
れた非共有結合の集合体又は共有結合しＩ；オリゴマー
が生成する。これらの生成物は生物学的に活性でなく、
所望の生物活性単量体蛋白質から分離しなければならな
い。

従って本発明の目的はこれらの生物学的に不活性な集合
体及び／又はオリゴマー不純物を単量体の生物活性蛋白
質から分離するための効率的な方法を提供することであ
る。

本発明は高分子量の不純物を単量体の生長ホルモン様蛋
白質から分離するための効率良い且つ経済的な方法を開
示する。高分子量の不純物は分子間の共有結合又は非共
有結合による会合の結果であってよい。本クロマトグラ
フィー法は、生物学的に不活性であるそのような共有結
合又は非共有結合による集合体を単量体の生物活性蛋白
質から効率良く分離する。

本発明の方法は、集合体を単量体から分離するゲル・パ
ーミェーション・クロマトグラフィーのような通常の手
段よりもかなり効果的且つ経済的であるイオン機構、即
ちイオン交換クロマトグラフィーに基づくクロマトグラ
フィー法を利用する。

イオン交換クロマトグラフィーの利点は、媒体の単位容
量当りの蛋白質の高負荷量、分割の損失又は過度な背圧
なしに媒体を通過する高線速度、及びバクテリア宿主の
不純物例えば内毒素を除去する能力を含む。最初の３つ
の上述した利点は装置の大きさを減じ且つ一定の生産速
度に必要とされるクロマトグラフィー媒体の量を少くす
ることによって商業的規模の生産装置に対して投下資本
及び運転費の節約をもたらす。最後に言及した利点は、
２つの操作機能を１つに組合せることによって分離の単
位操作を排除せしめる。

開示するクロマトグラフィー法によって製造される物質
は集合体不純物を非常に少量でしか含有しない。同様の
純度は公知の技術、によると厳しい過程を経て達成する
ことが可能である。本発明の目的は、宿主に生物活性な
単量体蛋白質からなる物質を得るための非常に効率良い
且つ安定な代替法を提供することである。商業的規模の
生産装置に対する本発明の利点は以下の記述及び実施例
から同業者は容易に理解するところである。

本明細書の目的に対して、ここに用いる如き「生長ホル
モン様物質」とは、（１）種を問わない例えば人間、牛
又は豚の動物生長ホルモンそれ自体、その誘導体、同族
体及び７ラグメント；（２）生長ホルモンへの前駆物質
例えば還元された（　　ＳＨ）生長ホルモン及びＳ−保
護生長ホルモン例えば生長ホルモンＳ−スルホネート；
　（３）生長ホルモンの変種又はその前駆物質例えば生
長ホルモンのアミノ酸シーケンスを長く／又は短くして
改変した構造体、例えば人間の生長ホルモンの２０に変
種、メチオニル人間生長ホルモンなど：及び（４）生長
ホルモンの同族体又はその前駆物質、例えば生長ホルモ
ンのアミノ酸シーケンスが１つ又はそれ以上のアミノ酸
残基の置換によって改変される構造体、を示す。

本発明は生長ホルモン様物質の集合体を所望の生物活性
単量体物質から分離するために使用しうるクロマトグラ
フィー法の記述に関する。従来の開示は宿主バクテリア
からの封入体の回収、分離、及び可溶化を適当に記述し
ている。この可溶化法の避けがたい効率の悪さのために
、いくらかの不適切に転写された非共有結合の集合体又
は共有結合によるオリゴマーが所望の単量体と共に生成
する。フロイド及び非常に高分子量の不純物を除去する
ために限外濾過が使用できるが、普通実質的な量の集合
体は単量体と共に限外−過膜を通過する。この限外濾過
液は有利には次のクロマトグラフィー法によって生成し
うる。

同業者は、「強アニオン交換樹脂」が、その正荷電を比
較的高いｐＨ，例えばｐ　Ｈ９，０以上に維持するカチ
オン性基を有する樹脂に関するものであることを認識し
よう。支持体に結合するカチオン性基は四級アンモニウ
ム基例えば −Ｃ）（、ＣＨｆｆｉＮ”（ＣＨＩＣＨ，）２ＣＨＩＣ
Ｈ（ＯＨ）ＣＨ３から選択することができる。本発明の
実施に対して用いるための適当な市販のアニオン交換樹
脂の例としては、ＱＡＥ−セファデックス（Ｓ　ｅｐｈ
ａｄｅｘ）Ａ−２５、ＱＥ−５２セルロース、セレック
ス（Ｃｅｌ［ｅｘ）ＱＡＥ％　Ｑ−セファローズ（Ｓ　
ｅｐｈａｒｏｓｅ）及びモノ（Ｍｏｎｏ）　−Ｑを挙げ
ることができる。

使用されるイオン交換体は、強アニオン交換樹脂型、例
えばＱ−セファローズ（ファーマシア）であるが、これ
に限定されるものではない。この媒体は、ポンプ、緩衝
剤受器、ＵＶ検出器、及び画分捕集器からなる典型的な
りロマトグラフィー系の一部である通常のクロマトグラ
フィーのカラムに充填される。次いでこの媒体を、２０
ｍＭの程度のピペリジン又は同様のｐＫａの適当な緩衝
剤及び５０〜２５０ｍＭの塩化ナトリウム又は同様の塩
からなる適当な出発緩衝剤中で平衡化させる。この溶液
の好適なｐＨは１１．３〜１１．７であり、多かれ少な
かれピペリジンを用いて出発緩衝剤の所望のｐＨを達成
する。普通法容量の３倍の緩衝剤は平衡を保証するのに
適当である。

生長ホルモン様物質及び不純物を含有する、ここでは原
料溶液として１及される溶液は出発緩衝剤と同一のピペ
リジン及び塩化すトリウムの濃度にせしめられる。この
ｐＨは必要ならばより多くのピペリジンを添加すること
によって所望の結果が得られるように調節される。次い
で原料溶液を、媒体ｌＱ当り蛋白質５０〜１５０ｇが負
荷されるまで、３００　ｃ　ｍ／時の線速度でカラムに
負荷させる。流出液を２８０ｎｍの吸光度で監視し、ベ
ースラインから立ち上ってきた時に両分を集める。

そしてベースラインが再び回復されるまで床容量の３〜
１３倍の出発緩衝剤によって原料溶液を処置する。最初
の流出からベースラインの回復までに集められたすべて
の両分を一緒に貯蔵する。このカラムは、これを適当な
緩衝剤で洗浄して強く結合した不純物を洗浄し且つ出発
緩衝剤中で再平衡化することによプで再び使用するため
に再生することができる。

生長ホルモン様物質の単量体形は媒体上の活性なイオン
交換点に結合せず、その代りにカラムを通流し、流出液
中に回収されるということが示された。しかしながら、
集合体不純物はカラムに結合し、そしてより強い置換体
を用いて流出させるまでカラムに保持される。

上述した通流法のほかに、単量体の生長ホルモン様物質
から集合体不純物を分離するのに吸着／脱着流出クロマ
トグラフィー法も有効であることが示された。しかしな
がら流出クロマトグラフィー法は媒体の単位容量当りの
同様の蛋白質負荷において有効性が低い。それにも拘ら
ず、より低い蛋白質負荷の場合には、それは単量体を集
合体から分離するのにを効な方法である。

流出クロマトグラフィー法で用いるイオン交換樹脂及び
関連する装置は、通流法に対するものと同じである。用
いる緩衝剤は、ｐＨ１１，３〜１１．７を与えるために
２０ｍＭピペリジン又は同様のｋＰａを有する他の適当
な緩衝剤からなろ水性緩衝剤（Ａ）及び２０ｍＭピペリ
ジン及び１０００ｍＭ塩化ナトリウム又は同様の単純な
塩からなる水性緩衝剤（Ｂ）である。平衡を保証するに
は床容量の３倍が普通十分である。第２に可溶性の単量
体の生長ホルモン様物質及び不純物からなる原料溶液を
緩衝剤（Ａ）と同一の組成にもっていき、次いで媒体１
１２当り５〜１５ｇの蛋白質が負荷されるまでカラムに
供給する。これに続いて緩衝剤（Ａ）中緩衝剤（Ｂ）１
７％ｖ／ｖの床容量の５倍量で置換洗浄する。次いで緩
衝剤＜Ａ）中緩衝剤（Ｅ）１７％ｖ　／　ｖから始めて
緩衝剤（Ａ）中緩衝剤（Ｂ）４７％ｖ　／　ｖまでの線
状グラジェントの床容量の２０倍量を用いて流出を行な
う。流出物を２８０ｎｍでの吸光度により監視し、画分
を集める。最後に、緩衝剤（Ｂ）を来客１の１０倍量で
用いて、いずれか強く吸着された種をカラムから脱着さ
せる。次いで他の強く結合した不純物を際去するために
緩衝剤で更に洗浄し且つ出発の緩衝剤で再び平衡化する
ことにより、更に使用するため、カラムを再生してもよ
い。

今回成長ホルモン様物質の単量体形は流出塩グラジェン
トの過程において早く流出し、また集合体不純物はグラ
ジェントの遅い過程で流出し、２つのビ〜りの間にはベ
ースラインでの分離のあることが示された。

上述したクロマトグラフィー法は、比較的粗製の蛋白質
溶液、即ち所望の単量体に対して比較的高量の不純物を
含む溶液を用いて単量体を集合体不純物から分離するの
に効果的であることが示された。また本方法は想像され
るように、すでに数段階の精製工程を経た比較的きれい
な蛋白質溶液を更に精製し又は再処理するために成功裏
に使用できる。本通流法は、所望の品質よりも僅かにだ
け高量の集合体を含むすでに精製された蛋白質の経済的
な処理に特に適当である。

次の実施例は本発明の実施を例示することが意図され、
その範囲を制限するものではない。

実施例　１ 本実施例は、すでＩこ部分的に精製したが、集合体を高
量で含有する組換えバクテリヤに出来する牛のりマドト
ロピンを更に精製する処理のために用いた通流法につい
て記述する。

Ｑ−セファローズ（ファーマシア）アニオン交換樹脂ゲ
ル２００ｃｃを含有するカラムを、２０ｍＭピペリジン
及び１５０ｍＭ塩化ナトリウムからなるｐＨ１１，５の
出発水性緩衝剤の来客量の３倍量を用いて平衡化した。

アメリカン・サイアナミド社（Ａ　ｍｅｒ４ｃａｎ　　
Ｃｙａｎａｍｉｄｅ　　Ｃｏ、）からの凍結乾燥した組
換えの牛のソマトトロピン２０ｇを出発緩衝剤２０００
ｃｃ中で再構成してｌ。

ｇ　／　Ｑの濃度とし、９５ｃｍ／時の表面線速度でカ
ラムに負荷した。負荷を開始して直ぐに流出物の２８０
ｎｍでの吸光度を監視することにより通流が監視された
。通流が起こるやいなや、流出物を集めた。原料溶液に
次いで、吸光度がベースラインに戻るまで出発緩衝剤と
同一の組成の置換洗浄物を流した。通流後の負荷相から
の流出物を置換洗浄からの流出物と一緒にし、全容量２
８０ｃｃを得た。−緒にした流出物を脱塩し、ＩＯＫダ
ルトン排除の中空繊維カートリッジを用いて濃縮し、次
いで凍結乾燥した。

本実施例における出発物質は、５Ｏ５−ページ（ＰＡＧ
Ｅ）を減じていないことにより１１％の集合体を含有し
た。これらのすべては見かけ上４４Ｋ又は４２にダルト
ンの分子量を有した。この物質は牛のソマトトロピン単
量体間での分子間ジスルフィド架橋により精製した共有
結合二量体である２思われる。共有結合による二量体は
生物学的に活性でないことも示された。クロマトグラフ
ィー処理後に得られる物質は５ＤＳ−ページにより０．
２％の二量体を有した。サイズ排除クロマトグラフィー
によって測定される如き集合体の量も、１０％以上の集
合体から１％以下への、出発物質及びクロマトグラフィ
ー処理物質間の減少を示した。単量体だけの基準に基づ
くと、クロマトグラフィー工程を経た収率は８４％であ
った。

即ち原料中の単量体の８４％が一緒にした流出液で回収
された。更にこの物質の生物活性は放射性受容体分析で
測定されるように基準の９２％から１０１％まで増大し
た。出発物質とクロマトグラフィー処理後の物質量の分
析の比較結果を第１表に要約する。第１図は出発物質及
びクロマトグラフィー処理した物質の５ＤＳ−ページの
ゲル・レーン（ｇｅｌ　　１ａｎｅ）を比較のために示
す。出発物質及びクロマトグラフィー処理した物質の双
方に、導電的に焦点を当てた。結果（示していない）は
、クロマトグラフィー段階による脱アミド化が起こらな
かったことを示した。

第１表 蛋白質、ｍｇ／ｇ ＳＤＳ−ページ、重量％ ５ＤＳ−ページ、二量体零％ スーパーローズ１２■、重量％林 スーパーローズ１２■、二量体林％ 放射性受容体分析、重量％ １１．０ ＩＯ０４ ０，２ ＜１，０ ＊　５ＤＳ−ページ−ナトリウムドデシルスルボネート
ポリアクリルアミドゲル の電気泳動分析 ＊末スーパーローズ１２（７ｙ−マシア）−ゲルパーミ
ェーションクロマトグラ フィー分析 脚注：すべての分析は無水基準で計算した。

実施例　２ 本実施例は寸法で約４０ｋから１ｏｏｋダルトン以上ま
での範囲の集合体を実質的な量で含む比較的粗製の蛋白
質溶液をクロマトグラフィー的に精製するために用いた
通流法を記述する。

精製すべき物質は、封入体に由来し且つコロイド及び非
常に高分子量の不純物を除去するために限外濾過に供し
た牛の組換えのソマトトロピンの粗蛋白質溶液であった
。この溶液はアメリカン・サイアナミド社のパイロット
・プラント工場から得た。

Ｑ−セファローズ（ファーマシア）アニオン交換樹脂１
３５ｃｃを含有するカラムを、実施例１に記述したもの
と同一の緩衝剤を用いて平衡化させた。１００Ｋダルト
ン排除の中空繊維限外濾過膜［アミフン（Ａｍｉｃｏｎ
）　］を用いて予じめ限外濾過した粗蛋白質溶液を、ピ
ペリジン及び塩化ナトリウムを添加することによって出
発の平衡化と同一の緩衝剤塩ｉ成物にした。この溶液の
蛋白質濃度は４．７１ｇ／Ｑであった。このカラムに溶
液３１８０ｃｃを負荷し、流出物を実施例■に記述した
ように集めた。得られた全流出物の容量は３４８９ｃｃ
であった。この流出物を脱塩し、濃縮し、そして凍結乾
燥して１１．１ｇの乾燥重量を得た。

粗蛋白質溶液はゲルバーミエーシ目ンクロマトグラフイ
ーで測定される如＜１９．２％の集合体を含有した。ク
ロマトグラフィーにかけて凍結乾燥した物質はｇｐｃに
よると２％以下の集合体及び５ＤＳ−ページによると０
．３％のオリゴマーを含有した。第２図は原料溶液及び
カラムからの凍結乾燥した流出物に対するＧＰＣクロマ
トグラムを示す。

実施例　３ 本実施例は、組換えの牛Ωソマトトロピンの試料を吸着
／脱着流出法を用いてクロマトグラフィー的に精製する
ために用いた方法を例示する。物質はアメリカン・サイ
アナミド社から入手し、５ＤＳ−ページで測定して１０
％以上の集合体を含有した。

モノ−Ｑ（７アーマシア）アニオン交換ｍ脂ｉＣＣのカ
ラムを実施例に対して使用した。緩衝剤はｐＨ１１，５
の２０ｍＭピペリジンからなる水性緩衝剤（Ａ）及びｐ
Ｈ１１，５の２０ｍＭピペリジン及び塩化ナトリウムか
らなる水性緩衝剤（Ｂ）であった。カラムを緩衝剤（Ａ
）中１７％ｖ　／　ｖ緩衝剤（Ｂ）を用いて平衡化し、
次いで緩衝剤（Ａ）中手のソマトトロピンの２０ｍＭ／
ｍａ溶液２００ｐ１２を注入した。この注入に続いて、
緩衝剤（Ａ）中１７％ｖ　／　ｖ緩衝剤（Ｂ）を床容量
の５倍、次いで緩衝剤（Ａ）中緩衝剤（Ｂ）　１７％か
ら４７％Ｖ　／　Ｖまでの直線的グラジェントを床容量
の２０倍注入した。最後に１００％の緩衝剤（Ｂ）を床
容量の１０倍用いて、いずれか強く吸着した不純物を流
出させた。

塩のグラジェント中に３つの明確なピークが得られた（
第３図）。グラジェントの開始直後に現れる第１のピー
ク（２８２秒）は最大であっＩ；。

第２のピークは第１のピークのすその端１．：融合した
、ピーク（３４５秒）として現われた。第３のピーク（
５３・１秒）は最初の２つと良く分離していた。更にア
イソクラチックな（１ｓｏｃｒａｔ　１ｃ）１００％緩
衝剤（Ｂ）での洗浄中に小さいピーク（７９６秒）が流
出した。

個々のピークを分画し、５ＤＳ−ＰＡＧＥで試験した。

第１及び第２のピークは純粋な牛のソマトトロピン単量
体であることがわかった。しかしながら第３のピークは
牛のソマトトロピンの二量体及びより高分子量のオリゴ
マーからなった。

実施例　４ 本実施例は、すでに部分的に精製したが、ゲル・パーミ
エーシ９ン・クロマトグラフィーで決定して２２．４％
の集合体を含有する組換えバタテリアに由来する豚のソ
マトトロピンを更に精製するために用いた方法を詳述す
仝。

Ｑ−セファローズ（７アーマシア）アニオン交換樹脂ゲ
ル４．５Ｑを含有するカラムを、実施例１に記述したも
のと同一の方法による通流法で用いた。緩衝剤の容量は
２つの実施例間の床容量での相違を考慮してｍ節した。

アメリカン・サイアナミド社から得た凍結乾燥した組換
えの豚のソマトトロピン４５０の全量を出発緩衝剤４５
Ｑ中で再構成し、次いでカラムに供給した。実施例１に
記述したようＩこ流出物を監視し、集めた。次いで置換
洗浄流出物を実施例１で詳述したように先行する期間の
流出物と一緒にした。

かさ高の一緒にした流出物はｇｌ）Ｃで決定して集合体
を検知できない量でしか含有しないことがわかった。

本発明の特徴及び態様は以下の通りである：１、強アニ
オン交換樹脂媒体を、Ｉｌ、５付近のｐＫａ及び単量体
生長ホルモン様物質を該媒体に吸着せしめない十分な量
の単純な塩を含む出発緩衝剤種牛で平衡化させ； それぞれの濃度が出発緩衝剤と同一であるように適当な
量の緩衝剤種及び単純な塩を精製すべき生長ホルモン様
物質の溶液に添加し； 生長ホルモン様物質の溶液を媒体を充填したカラムに負
荷し、そして原料溶液から及び出発緩衝剤を用いる置換
洗浄液からの通流流出物を集め；そして カラムの媒体を高塩及び／又は苛性溶液で洗浄して強く
吸着された種を媒体から除去し、次いで次のサイクルの
ために該媒体を再生する、ことを含んでなる共有及び非
共有結合の集合体を単量体生長ホルモン様物質から分離
するために該アニオン交換樹脂型媒体を用いる通流クロ
マトグラフィー法。

２、出発緩衝剤のｐｕがｌ００５以上であり、また単純
な塩が出発緩衝剤中５０〜２５０ｍＭの濃度の塩化ナト
リウムである上記ｌの方法。

３、緩衝剤種がピペリジン又はホスフェート塩である上
記２の方法。

４、生長ホルモン様物質が組換えのまたは下垂体の牛又
は豚のソマトトロピンである上記３の方法。

５、精製すべき生長ホルモン様物質の溶液が粗製（高量
の不純物）であり、又は比較的純粋（低不純物量）であ
る上記４の方法。

６、強アニオン交換樹脂を媒体を、１１．５付近のｐＫ
ａ及び適当な濃度の単純な塩を含む出発緩衝剤種中で平
衡化させ； それぞれの濃度が出発緩衝剤と同一であるように適当な
量の緩衝剤種及び単純な塩を精製すべき生長ホルモン様
物質の溶液に添加し； 生長ホルモン様物質の溶液を該媒体を充填したカラムに
負荷し、続いて出発緩衝剤で置換洗浄し； 単量体生長ホルモン様物質を一定又はグラジェント法で
流出させ；そして 該媒体を強く吸着された種を除去するために適当な緩衝
剤で洗浄し且つ再生し、次のサイクルに対して媒体を準
備する、 ことを含んでなる共有及び非共有集合体を単量体生長ホ
ルモン様物質から分離するために該強アニオン交換樹脂
を媒体を用いる吸着／脱着流出クロマトグラフィー法。

７、出発緩衝剤のｐＨが１０００以上であり、また単純
な塩が５０−１０００ｍＭの濃度の塩化ナトリウムであ
る上記６の方法。

８、緩衝剤種がピペリジン又はホスフェート塩である上
記７の方法。

９、生長ホルモン様物質が組換えのまたは下垂体の牛又
は豚のソマトトロピンである上記８の方法。

１０、精製すべき生長ホルモン様物質の溶液が粗製（高
量の不純物）であり、又は比較的純粋（低不純物量）で
ある上記９の方法。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１の方法を用いる出発物質（レーンｌ）
及びクロマトグラフィーで処理した物質（レーン２）の
５ＤＳ−ページ（ＰＡＧＥ）であり　　； ８２図はスーパーローズ（Ｓ　ｕｐｅｒｏｓｅ）　６　
（ファーマシア）のカラムを用いるゲル・パーミェーシ
ョン・クロマトグラフィーであり、但し上のクロマトグ
ラムは原料溶液であり、一方下は実施例２に記述したよ
うなアニオン交換樹脂からの凍結乾燥した流出物であり
：そして 第３図は実施例３に記述した流出法を用いて得たクロマ
トグラムである。 ＦＩＧ、　１ ＦＩＧ、２ 吟 間

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、強アニオン交換樹脂媒体を、１１．５付近のｐＫａ
   及び単量体生長ホルモン様物質を該媒体に吸着せしめな
   い十分な量の単純な塩を含む出発緩衝剤種中で平衡化さ
   せ； それぞれの濃度が出発緩衝剤と同一であるように適当な
   量の緩衝剤種及び単純な塩を生成すべき生長ホルモン様
   物質の溶液に添加し； 生長ホルモン様物質の溶液を媒体を充填したカラムに負
   荷し、そして原料溶液から及び出発緩衝剤を用いる置換
   洗浄液からの通流流出物を集め；そして カラムの媒体を高塩及び／又は苛性溶液で洗浄して強く
   吸着された種を媒体から除去し、次いで次のサイクルの
   ために該媒体を再生する、 ことを含んでなる共有及び非共有結合の集合体を単量体
   生長ホルモン様物質から分離するために該アニオン交換
   樹脂型媒体を用いる通流クロマトグラフィー法。 ２、強アニオン交換樹脂型媒体を、１１．５付近のｐＫ
   ａ及び適当な濃度の単純な塩を含む出発緩衝剤種中で平
   衡化させ； それぞれの濃度が出発緩衝剤と同一であるように適当な
   量の緩衝剤種及び単純な塩を精製すべき生長ホルモン様
   物質の溶液に添加し； 生長ホルモン様物質の溶液を該媒体を充填したカラムに
   負荷し、続いて出発緩衝剤で置換洗浄し； 単量体生長ホルモン様物質を一定又はグラジエント法で
   流出させ；そして 該媒体を強く吸着された種を除去するために適当な緩衝
   剤で洗浄し且つ再生し、次のサイクルに対して媒体を準
   備する、 ことを含んでなる共有及び非共有集合体を単量体生長ホ
   ルモン様物質から分離するために該強アニオン交換樹脂
   型媒体を用いる吸着／脱着流出クロマトグラフィー法。