FI95805B - Menetelmä kasvuhormonien kaltaisten materiaalien aggregaattipitoisuuden vähentämiseksi - Google Patents
Menetelmä kasvuhormonien kaltaisten materiaalien aggregaattipitoisuuden vähentämiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI95805B FI95805B FI895063A FI895063A FI95805B FI 95805 B FI95805 B FI 95805B FI 895063 A FI895063 A FI 895063A FI 895063 A FI895063 A FI 895063A FI 95805 B FI95805 B FI 95805B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- growth hormone
- solution
- medium
- process according
- concentration
- Prior art date
Links
- 239000000463 material Substances 0.000 title claims abstract description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 40
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 title claims abstract description 30
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 14
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 26
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 21
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N tetrahydropyridine hydrochloride Natural products C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 18
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 14
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 14
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 12
- 239000012527 feed solution Substances 0.000 claims description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 9
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims description 7
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 4
- 238000002336 sorption--desorption measurement Methods 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 4
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003637 basic solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 6
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 claims 2
- 125000002467 phosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims 2
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 claims 2
- 125000003386 piperidinyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 40
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 21
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 11
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 7
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 6
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 5
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 5
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 5
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 5
- XZMCDFZZKTWFGF-UHFFFAOYSA-N Cyanamide Chemical compound NC#N XZMCDFZZKTWFGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 4
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000012958 reprocessing Methods 0.000 description 3
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- -1 for example Proteins 0.000 description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 1
- 239000012928 buffer substance Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000013632 covalent dimer Substances 0.000 description 1
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 1
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- DAJSVUQLFFJUSX-UHFFFAOYSA-M sodium;dodecane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCS([O-])(=O)=O DAJSVUQLFFJUSX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000010977 unit operation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
- Catalysts (AREA)
- Silicates, Zeolites, And Molecular Sieves (AREA)
- Fodder In General (AREA)
Description
α 95805
Menetelmä kasvuhormonien kaltaisten materiaalien aggre-gaattipitoisuuden vähentämiseksi
Keksinnön kohteena on kromatografinen läpivirtaus-5 menetelmä, jossa käytetään voimakasta anioninvaihdon tyyppistä väliainetta kovalenttisten ja ei-kovalenttisten aggregaattien erottelemiseksi monomeerisestä kasvuhormonin kaltaisesta materiaalista, joka menetelmä käsittää: väliaineen tasapainottamisen aloituspuskuriaineessa jonka pKa 10 on lähellä 11,5 ja yksinkertaisessa suolassa, jolla on riittävä konsentraatio, jonka vaikutuksesta monomeerisen kasvuhormonin kaltainen materiaali ei absorboidu väliaineeseen; sopivan määrän puskuriainetta ja yksinkertaista suolaa lisäyksen pudistettavaan hormoninkaltaiseen mate-15 riaaliin siten, että kunkin konsentraatio on sama kuin aloituspuskuriliuoksen; kasvuhormonin kaltaisen liuoksen laittamisen pylvääseen, joka on pakattu väliaineella ja läpimenneen eluointiliuoksen keräämisen syöttöliuoksesta ja syrjäytyspesun aloituspuskuriliuoksesta (eluointiliuos 20 sisältää monomeerisen kasvuhormonin kaltaisen materiaalin) käyttäen aloituspuskuria; pylväässä olevan väliaineen pesemisen hyvin suolaisella ja/tai emäksisellä liuoksella jotta väliaineesta saadaan siihen voimakkaasti absorboituneet aineet erotettua ja väliaineen regeneroimisen seuraa- • · ·· 25 vaa sykliä varten. Keksintö käsittää myös adsorptio-/de- sorptioeluointikromatografisen menetelmän, jossa käytetään voimakasta tyypiltään anioninvaihtoväliainetta kovalentti-sen ja ei-kovalenttisen aggregaatin erottamiseksi monomeerisestä kasvuhormonin kaltaisesta materiaalista, joka kä-30 sittää väliaineen tasapainottamisen aloituspuskuriliuok- « • sessa, jonka pKa on lähellä 11,5 ja yksinkertaisessa suo lassa, jonka konsentraatio on sopiva; puskuriliuoksen ja yksinkertaisen suolan sopivan määrän lisäyksen puhdistettavan kasvuhormonin kaltaisen materiaalin liuokseen siten, 35 että kunkin konsentraatio on sama kuin aloituspuskuri- a 95805 liuoksen; kasvuhormonin kaltaisen materiaaliliuoksen laittamisen pylvääseen, joka on pakattu väliaineella, mitä seuraa syrjäytyspesu aloituspuskurilla; monomeerisen kasvuhormonin kaltaisen materiaalin eluointi isokraatti- tai 5 gradienttimetodologisesti; ja pesun väliaineen regeneroin-nin sopivalla puskuriliuoksella voimakkaasti adsorboituneiden aineiden poistamiseksi ja väliaineen valmistamiseksi seuraavaa sykliä varten.
Keksinnön mukaisille menetelmille on tunnusomaista, 10 että menetelmät suoritetaan pitäen liuoksen pH:ta yli 10,5:ssä.
Kuviossa 1 on esitetty aloitusmateriaalin SDS-PAGE (kaistale 1) ja kromatografinen materiaali (kaistale 2) , joissa käytetään esimerkin 1 metodologiaa.
15 Kuviossa 2 on esitetty geelipermetaatiokromatogra- fia, jossa käytetään Superose 4/8/89 KMM Luis 9/8/89 (Pharmacia) pylvästä. Kromatogrammin yläosassa on syöttö-liuos kun alaosassa on lyofiilinen eluointiaine anioni-vaihtimesta, kuten yllä esimerkissä 2 kuvattiin.
20 Kuviossa 3 on esitetty kromatogrammi, joka on saatu käyttäen esimerkissä 3 kuvattua eluointimenetelmää. Pylväänä käytettiin 1 - cmJ Mono-Q anioninvaihtimen (Pharmacia) peitetilavuutta.
Rekombinantti-DNA-tekniikka on mahdollistanut suu-·· 25 rien proteiinimäärien tuottamisen potentiaaliseen kaupal liseen käyttöön, mikä oli ennen epätodennäköistä, koska tällaisten proteiinien saatavuus luonnollisista lähteistä oli rajoittunutta. Mikro-organismeilla tuotetut proteiinit, joita on manipuloitu geneettisesti, eivät kuitenkaan 30 ole oikein poimuttuneita ja ovat siksi inerttejä.
Viime aikoina on ollut useita bakteerin inkluusio- . · hiukkasten proteiinien talteenottoon, eristämiseen ja liuottamiseen liittyviä kuvauksia. Näiden kuvausten kohteena on ollut sellaisten menetelmien kuvaaminen, jotka maksi-35 moivat denaturoidun, liukenemattoman proteiinin muuntami- 1
Il i »rt lilt· I t I M i 3 95805 sen kunnolla poimuttuneeksi, monomeeriseksi, biologisesti aktiiviseen muotoon. Väistämättä viallisesti poimuttuneet, ei-kovalenttiset aggregaatit tai kovalenttiset oligomeerit syntyvät liuottamisen tai renaturoinnin aikana. Nämä tuot-5 teet eivät ole biologisesti aktiivisia ja ne on erotettava halutusta bioaktiivisesta, monomeerisestä proteiinista.
Keksinnön menetelmässä käytetään kromatografista menetelmää (menetelmiä), jotka perustuvat ionimekanismilla tapahtuvaan erotteluun ts. ioninvaihtokromatografiaan, 10 joka on paljon tehokkaampi ja taloudellisempi kuin perinteiset monomeeristä tapahtuvat aggregaatin erottamismene-telmät, kuten geelinläpäisykromatografia. Ioninvaihtokromatograf iän etuihin sisältyy suurempi proteiinikuormitus väliaineen yksikkötilavuutta kohti, suurempi lineaarinen 15 väliaineen läpäisynopeus ilman resoluutiohäviötä tai ylimääräistä vastapainetta ja kyky poistaa isäntäbakteerin epäpuhtaudet, kuten endotoksiinit. Kolme ensimmäistä edellä mainittua etua johtavat pääoma- ja toimintakustannusten säästöön kaupallisen mittakaavan tuotantomahdollisuuksissa 20 alentamalla laitteiston kokoa ja kromatografisten väliaineiden määrää, joka tarvitaan kiinteään tuotantonopeuteen. Viimeksi mainittu etu sallii erillisen yksikkötoiminnan eliminoinnin yhdistämällä kaksi toimintafunktiota yhdeksi.
Materiaali, joka tuotetaan esitetyllä kromatografi-·· 25 sella menetelmällä (menetelmillä) käsittää hyvin pieniä määriä aggregaattiepäpuhtauksia. Samanlaisia epäpuhtauksia voidaan havaita käyttäen tunnetun tekniikan laajoja käsittelyjä. Tämän keksinnön kohteena on saada aikaan paljon tehokkaampi ja halvempi vaihtoehto materiaalien, jotka 30 ensisijaisesti koostuvat bioaktiivisesta, monomeerisestä « l proteiinista, valmistamiseksi. Keksinnön edut kaupallisen mittakaavan tuotantomahdollisuuksissa ilmenevät selvästi seuraavasta kuvauksesta ja esimerkeistä tekniikan tason parissa työskenteleville.
, 95805 Tämän tarkan määrittelyn tarkoituksessa termi "kasvuhormonin kaltainen materiaali", jota tässä käytetään, merkitsee (1) eläinkasvuhormonia itsessään, sen johdannaisia, analogeja ja sen osia mistä tahansa lajista, esimer-5 kiksi ihmisestä, naudasta tai siasta; (2) kasvuhormonin edeltäjää, kuten pelkistettyä (-SH) kasvuhormonia ja S-suojattua kasvuhormonia, esimerkiksi kasvuhormonin S-sul-fonaattia; (3) kasvuhormonin muunnoksia tai sen edeltäjiä, esimerkiksi rakenteita, jotka on muunneltu kasvuhormonin 10 aminohappojakson pidentämiseksi ja/tai lyhentämiseksi, esimerkiksi ihmisen kasvuhormonin 20 K muunnosta, ihmisen kasvuhormonin metionyyliä ja vastaavia; ja (4) kasvuhormonin analogeja ja sen edeltäjiä, esimerkiksi rakenteita, joissa kasvuhormonin aminohapon jaksoa on muunneltu kor-15 vaarnalla yksi tai useampi aminohapporyhmä.
Tämä keksintö keskittyy sellaisen kromatografisen menetelmän (menetelmien) kuvaamiseen, jota käytetään kasvuhormonien kaltaisten materiaalien aggregaattien erottamiseen halutusta bioaktiivisesta monomeerisestä materiaa-20 lista. Aikaisemmissa julkaisuissa on kuvattu perusteellisesti isäntäbakteerin inkluusiohiukkasten talteenottoa, eristämistä ja liuottamista. Liuottamismenetelmän väistämättömästä tehottomuudesta johtuen syntyy muutamia epätäydellisesti poimuttuneita ei-kovalenttisia aggregaatteja ·· 25 tai kovalenttisia oligomeereja toivottujen monomeerien mukana. Ultrasuodatusta voidaan käyttää kolloidien ja suu-rimolekyylipainoisten epäpuhtauksien poistamiseen, merkittävä määrä aggregaatteja läpäisee kuitenkin ultrasuodatti-men monomeerin kanssa. Tämä ultrasuodatin voidaan puhdis-30 taa edullisesti seuraavaa kromatografista menetelmää käyt-: täen.
Tekniikan tason parissa työskentelevät havaitsevat, että termi "vahva anioninvaihdin" viittaa hartseihin, joilla on kationisia ryhmiä, jotka pitävät yllä positii-35 vista varausta suhteellisen suuressa pH:ssa, esim. yli 9 il - tartuin i.ijji . . .
5 95805 pH:ssa. Kantajaan kiinnitetyt kationiset ryhmät voidaan valita kvaternaarisista ammoniumryhmistä, kuten -CH2CH2N+ (CH2CH3)2CH2CH (OH)CH3. Sopivista kaupallisesti saatavista anioninvaihtohartseista, joita voidaan käyttää 5 keksinnön käytännön sovellutuksissa, voidaan mainita QAE-Sephadex A-25, QE-52 selluloosa, Cellex QAE, Q-Sepharose, 9/8/89 KMM Luis 9/8/89 ja Mono-Q.
Käytettävä ioninvaihtoväliaine on vahva anionin-vaihtotyyppinen, kuten Q-Sepharose (Pharmacia), mutta ei 10 siihen rajoittunut. Väliaine pakataan perinteiseen kroma-tografiapylvääseen, joka on osa perinteistä kromatografia-systeemikokonaisuutta, joka koostuu pumpuista, puskuri-liuossäiliöistä, uv-detektorista ja fraktion kerääjästä. Väliaine tasapainotetaan nestemäisessä aloituspuskuri-15 liuoksessa, joka koostuu piperidiinistä tai jostain muusta sopivasta puskurointiliuoksesta, jolla on samanlainen pKa 20 mM konsentraatiossa ja natriumkloridissä tai vastaavanlaisessa yksinkertaisessa suolassa 50 - 250 mM konsentraatiossa. Liuoksen edullinen pH on 11,3 - 11,7 ja piperidii-20 niä voidaan käyttää enemmän tai vähemmän, jotta saavutetaan haluttu aloituspuskurin pH. Kolme peitetilavuutta puskuria riittää yleensä tasapainon varmistamiseen.
Liukenevaa monomeeristä kasvuhormonin kaltaista materiaalia ja epäpuhtauksia sisältävää liuosta, johon • * ·· 25 tässä viitataan syöttöliuoksena, tuodaan samaan piperidii- nin ja natriumkloridin konsentraatioon kuin aloituspuskuri. Säädetään pH siten, että saavutetaan toivottu tulos lisäämällä piperidiiniä enemmän, jos se on tarpeellista. Syöttöliuos laitetaan sitten pylvääseen pintanopeudella 30 aina 300 cm-tunti'1 kunnes 50 - 150 grammaa proteiinia on • laitettu väliainelitraa kohti. Eluointiliuosta tarkastel laan 280 nm absorbanssin avulla ja fraktiot kerätään heti kun perusviiva kohoaa. Syöttöliuosta seuraa 3-6 peitetilavuutta aloituspuskuria kunnes perusviiva saavutetaan 35 jälleen. Kaikki fraktiot, jotka kerätään alkuläpitulosta 6 95805 kunnes perusviiva saavutetaan, kootaan yhteen. Pylväs voidaan regeneroida uutta käyttöä varten pesemällä se sopivalla puskuriliuoksella voimakkaasti sitoutuneiden epäpuhtauksien poistamiseksi ja uudelleen tasapainottamiseksi 5 aloituspuskuriliuoksessa.
On osoitettu, että kasvuhormonin kaltaisen materiaalin monomeerinen muoto ei sitoudu väliaineen aktiiviseen ioninvaihtopaikkaan, vaan sen sijaan virtaa pylvään läpi ja on talteenotettavissa eluointiaineesta. Aggregaattiepä-10 puhtaudet sitoutuvat kuitenkin pylvääseen ja pysyvät siinä kunnes käytetään voimakkaampaa syrjäyttäjää niiden eluoi-miseen.
Yllä kuvatun läpivirtausmenetelmän lisäksi on osoitettu, että adsorptio-/desorptioeluointikromatografinen 15 menetelmä on myös tehokas monomeeristen kasvuhormonien kaltaisten aggregaattiepäpuhtauksien erotteluun. Eluointi-kromatografiamenetelmä on kuitenkin tehottomampi vastaavilla proteiinikuormituksilla väliaineen yksikkötilavuutta kohti. Siitä huolimatta proteiinikuormituksen ollessa al-20 haisempi se on vielä elinvoimainen menetelmä monomeerien erottelemiseksi aggregaateista.
Eluointikromatografiamenetelmässä käytetty ionin-vaihtoaine ja liitännäislaitteisto ovat samat kuin läpi-virtausmenetelmässä käytetyt. Puskuriliuoksena käytetään ♦ · ·· 25 nestemäistä puskuriliuosta (A), joka koostuu 20 mM piperi- diinistä tai jostakin muusta sopivasta puskuriaineesta, jolla on sama pKa, joilla saadaan pH 11,3 - 11,7 ja nestemäinen puskuriliuos (B), joka koostuu 20 mM piperidiinistä ja 1000 mM natriumkloridista tai vastaavanlaisesta yksin-30 kertaisesta suolasta. Pylväs tasapainotetaan ensin käyt-• täen 17 % (tilavuus) puskuriliuosta (B) puskuriliuoksessa (A). Yleensä kolme peitetilavuutta riittää tasapainon varmistamiseksi. Toiseksi liukenevasta monomeerisestä kasvuhormonin kaltaisesta materiaalista ja epäpuhtauksista 35 koostuva syöttöliuos laitetaan samaan yhdisteeseen kuin 7 95805 puskuriliuos (A) ja syötetään sitten pylvääseen, kunnes 5 - 15 grammaa proteiinia on laitettu väliainelitraa kohti.
Tätä seuraa syrjäyttämispesu, joka koostuu viidestä 17 % (tilavuus) peitetilavuudesta puskuriliuosta (B) puskuri-5 liuoksessa (A). Eluointi toteutetaan käyttäen 20 peiteti-lavuutta lineaarista gradienttia alkaen 17 % (tilavuus) puskuriliuoksesta (B) puskuriliuoksessa (A) siirtyen aina 47 % (tilavuus) puskuriliuosta (B) puskuriliuoksessa (A) . Eluointiainetta tarkastellaan monitorin avulla absor-10 banssin ollessa 280 nm ja fraktiot kerätään. Lopuksi käytetään kymmenen peitetilavuutta puskuriliuosta voimakkaasti adsorboituneiden aineiden poistamiseksi pylväästä. Pylväs voidaan regeneroida uutta käyttöä varten lisäpesuilla käyttäen sopivia puskuriliuoksia voimakkaasti sitoutunei-15 den epäpuhtauksien poistamiseksi ja tasapainottaa uudelleen aloituspuskuriliuosta käyttäen.
On osoitettu, että kasvuhormonin kaltaisen materiaalin monomeerinen muoto eluoidaan varhaisessa suolagra-dientin eluointivaiheessa ja, että aggregaattiepäpuhtaudet 20 eluoidaan myöhemmin gradientissa perusviivan resoluution ollessa kahden huipun välissä.
Yllä kuvattujen kromatografisten menetelmien on osoitettu olevan tehokkaita monomeerien erottelemiseen aggregaattiepäpuhtauksista, kun käytetään suhteellisen ·· 25 karkeita proteiiniliuoksia, esim. suuri epäpuhtaustaso suhteessa toivottuun monomeeriin. Menetelmiä on myös, kuten voidaan kuvitella, käytetty menestyksellisesti edelleen puhdistamiseen tai suhteellisen puhtaiden proteiini-liuosten, jotka ovat läpikäyneet useita puhdistusvaiheita, 30 uudelleenkäsittelyyn.
• Läpivirtausmenetelmä on erityisen sopiva jo puhdis tettujen proteiinien, jotka saattavat sisältää aggregaat-titasoja, jotka ovat ainoastaan hieman suurempia kuin laatuvaatimukset, taloudelliseen uudelleenkäsittelyyn.
« » 95805 8
Seuraavat esimerkit on tarkoitettu kuvaamaan edelleen keksinnön käytännön sovellutuksia, mutta ei rajaamaan niitä.
Esimerkki 1 5 Tämä esimerkki kuvaa läpivirtausmetodologiaa, jota käytetään edelleen puhdistamiseen tai jolla käsitellään uudelleen naudan somatotropiinia, joka on peräisin rekom-binaattibakteerista, ja joka on jo osittain puhdistettu, mutta sisältää suuren määrän aggregaatteja.
10 200 cm3 Q-Sepharose (Pharmacia) anioninvaihtogeeliä sisältävä pylväs tasapainotettiin käyttäen kolmea peiteti-lavuutta nestemäistä aloituspuskuria, joka sisältää 20 mM piperidiiniä ja 150 mM natriumkloridia, jonka pH on 11,5. Kaksikymmentä grammaa 9/8/89 lyofiilisoitua Luis KMM 9/8/ 15 89 naudan rekombinantti-somatotropiinia, jota saadaan Ame rican Cyanamid Company'sta, liuotettiin uudelleen 2000 cm3 aloituspuskuriliuosta, jotta saatiin konsentraatio 10 grammaa litraa kohti ja laitettiin pylvääseen lineaarisella pintanopeudella 95 cm - tunti'1. Pian laittamisen jälkeen 20 havaittiin läpimeno tarkkailemalla eluointiaineen absor-banssi 280 nm:ssä. Eluointiaine kerättiin heti kun läpimeno oli tapahtunut. Syöttöliuosta seurasi syrjäyttämispesu samalla koostumuksella kuin aloituspuskuriliuoksella, kunnes adsorbanssi oli palannut perusviivalle. Kuormitusfaa-*- 25 sin eluointiaine yhdistettiin läpimenon jälkeen syrjäyttä- mispesusta saatavaan eluointiaineeseen 2840 cm3 tilavuuden saamiseksi. Yhdistetystä eluointiaineesta poistettiin suola ja se konsentroitiin käyttäen 10 K Daltonin höyryllä täytettyä onttokuituista patruunaa ja sitten se lyofili-30 soitiin.
* 1 Tässä esimerkissä käytetty aloitusmateriaali sisäl si 11 % aggregaattia ei-pelkistävällä SDS-PAGE:lla määritettynä, joiden kaikkien ilmeinen molekyylipaino oli 44 K tai 42 K Daltonia. Tämän materiaalin uskotaan olevan kova-35 lenttinen dimeeri, joka muodostuu molekyylien välisenä , 95805 disulfidisiltana naudan somatotropiinimonomeerien välille.
On myös osoitettu, että kovalenttinen dimeeri ei ole biologisesti aktiivinen. Kromatografiän jälkeen havaitussa materiaalissa oli 0,2 % dimeeriä SDS-PAGEN mukaan. Aggre-5 gaattitason koonrajoitus kromatografiällä määritettynä on osoitettu pienenevän yli 10 % aggregaatista alle 1 % aloitus- ja kromatografiamateriaalin välillä. Lisäksi materiaalin bioaktiivisuutta lisättiin 92 %:sta 101 %:iin standardista radioreseptorianalyysillä mitattuna. Aloitus-10 materiaalin ja kromatograf iamateriaalin välisestä analyyttisestä vertailusta saadut tulokset on koottu taulukkoon 1. Kuviossa 1 on myös esitetty SDS-PAGE-geelin viivat aloitusmateriaalille ja kromatografiamateriaalille vertailun vuoksi. Isoelektrinen fokusointi tehtiin sekä aloitus-15 materiaalille että kromatografiamateriaalille. Tulokset (ei esitetty) osoittavat, että deaminoitumista ei tapahtunut kromatografisesta vaiheesta johtuen.
TAULUKKO 1 20 Aloitus- Kromatogra- materiaali foitu materiaali
Proteiini, mg/g 1011 1008 SDS-PGE, paino-%* 95 104 SDS-PAGE, % dimeeriä* 11,0 0,2 25 Superose 12R,paino-%** 99 98
Superose 12R, % dimeeriä** 10,4 <1,0
Radioreseptori- analyysi, paino-% 92 101 30 * SDS-PAGE = natriumdodekyylisulfonaattipolyakryyliamidin m geelielektroforees ianalyys i **Superose 12 (Pharmacia) * geelipermeaatiokromatografinen analyysi 35 HUOM: Kaikki analyysitulokset on laskettu kuivalta pohjalta.
• · 1° 95805
Esimerkki 2 Tässä esimerkissä kuvataan läpivirtausmetodologiaa, jota käytetään kromatografisesti suhteellisen raa'an pro-teiiniliuoksen, jossa on olennainen määrä aggregaatteja, 5 joiden koko on keskimäärin 40 K:sta yli 100 K Daltonia, puhdistamiseen.
Puhdistettava materiaali 9/8/89 oli raaka naudan somatotropiinin proteiiniliuos, joka oli peräisin inkluu-siohiukkasista ja joka oli ultrasuodatettu kolloidien ja 10 suurimolekyylipainoisten epäpuhtauksien poistamiseksi.
Liuos hankittiin American Cyanamid Company koetehdaslai-toksesta.
Q-Sepharosea (Pharmacia) anioninvaihdinta 135 cm3 sisältävä pylväs tasapainotettiin käyttämällä samaa pus-15 kuriliuosta kuin esimerkissä 1 kuvattiin. Raaka proteiiniliuos, joka oli aikaisemmin ultrasuodatettu käyttäen 100 K Dalton onttokuitu-ultrasuodatinta (Amicon), oli saatettu samaan puskurisuolayhdisteeseen kuin aloitustasapainopus-kuriliuos lisäämällä piperidiiniä ja natriumkloridia.
20 Liuoksen proteiinikonsentraatio oli 4,71 g/1. Pylvääseen laitettiin 3180 cm3 liuosta ja eluointiaine kerättiin, kuten esimerkissä 1 kuvattiin. Syöttöliuosta seurasi syrjäy-tyspesu, kuten esimerkissä 1 kuvattiin. Kerätyn eluointi-aineen kokonaismäärä oli 3489 cm3. Eluointiaineesta pois-·· 25 tettiin suola, se konsentroitiin ja lyofilisoitiin 11,4 gramman kuivapainon saamiseksi.
Raaka proteiiniliuos sisälsi 19,2 % aggregaattia geelipermeaatiokromatografisesti mitattuna (gpc). Lyofili-soitu kromatografoitu materiaali sisälsi alla 1 % aggre-30 gaatteja gpc:llä määritettynä ja 0,3 % oligomeerejä SDS- :* PAGE:llä määritettynä. Kuviossa 2 on esitetty gpc-kromato- grammi syöttöliuoksesta ja pylvään lyofilisoidusta eluointiaineesta.
< · al i ii»*i · · · ·· 11 95805
Esimerkki 3
Esillä oleva esimerkki kuvaa menetelmää, jota käytetään kromatografisesti pudistettuun naudan rekombinant-ti-somatotropiininäytteeseen adsorptio-/desorptiomenetel-5 mää käyttäen. Materiaali saatiin American Cyanamid Company #sta ja se sisälsi yli 10 % aggregaatteja mitattuna SDS-PAGErllä.
Esillä olevassa esimerkissä käytettiin 1 cm3 Mono-Q (Pharmacia) anioninvaihtopylvästä. Puskuriliuos oli nes-10 temäinen puskuriliuos (A), joka sisälsi 20 mM piperidii-niä, pH oli 11,5 ja nestemäinen puskuriliuos (B) , joka sisälsi 20 mM piperidiiniä, 1000 mM natriumkloridia, pH oli 11,5. Pylväs tasapainotettiin käyttäen 17 % (tilavuus) puskuriliuosta (B) puskuriliuoksessa (A) ja sitten ruis-15 kutettiin 200 mikrolitraa 20 mg/ml naudan somatotropiini-liuosta puskuriliuoksessa (A) . Ruiskutusta seurasi viisi peitetilavuutta 17 % (tilavuus) puskuriliuosta (B) puskuriliuoksessa (A) ja sitten 20 peitetilavuutta lineaarista gradienttia 17 - 47 % (tilavuus) puskuriliuosta (B) pusku-20 riliuoksessa (A) . Lopuksi käytettiin kymmenen peitetilavuutta 100 % puskuriliuosta (B) voimakkaasti adsorboitujen epäpuhtauksien eluointiin.
Suolagradientin aikana havaittiin kolme hyvin määritettyä piikkiä (katso kuviota 3) . Ensimmäinen piikki 25 (282 sekuntia), joka havaittiin hetken kuluttua gradientin aloituksesta, oli suurin. Toinen ilmaantui yhdistyneenä piikkinä (345 sekuntia) ensimmäisen reunalle. Kolmas piikki (531 sekuntia) erottui selvästi kahdesta ensimmäisestä.
Lisäksi eluoitui pieni piikki (796 sekuntia) isokrattisen 30 100 % puskuriliuoksen (B) pesussa.
: Esimerkki 4 Tässä esimerkissä kerrotaan yksityiskohtaisesti menetelmistä, joita käytetään puhdistamaan edelleen sian somatotropiinia, joka on johdettu rekombinaattibakteeris-35 ta, joka on jo osittain puhdistettu, mutta sisältää 22,4 % aggregaattia geelipermeaatiokromatografiällä määritettynä.
„ 95805 4,5 1 Q-Sepharose (Pharmacia) anioninvaihdinta sisältävää geeliä käytettiin läpivirtaustapaan esimerkissä 1 kuvatun menetelmän mukaisesti. Puskuriliuoksen tilavuudet säädettiin sovittamalla kahden esimerkin peitetilavuuksien 5 erot. Kokonaismäärältään 450 grammaa lyofilisoitua sian rekombinantti-somatotropiinia, joka oli saatu American
Cyanamid Company'lta, laitettiin uudelleen 45 l:aan aloi-tuspuskuriliuosta ja syötettiin sitten pylvääseen. Eluoin-tiainetta tarkkailtiin ja sitä kerättiin, kuten esimerkis-10 sä 1 kuvattiin. Syrjäytyspesueluointiliuos yhdistettiin syöttöperiodin eluointiaineen kanssa, kuten aikaisemmin esimerkissä 1 yksityiskohtaisesti esitettiin.
Eluointiaineen osoitettiin kokonaisuudessaan sisältävän gpc:llä määritettynä havaitsemattomia määriä aggre-15 gaatteja.
> · « 1
Il ' IN I IHII M * *» * . .
· «
Claims (10)
1. Läpivirtauskromatografinen menetelmä, jossa käytetään vahvaa anioninvaihtotyyppistä väliainetta kovalent- 5 tisten ja ei-kovalenttisten aggregaattien erotteluun mono-meerisestä kasvuhormonin kaltaisesta materiaalista, jossa menetelmässä väliaine tasapainotetaan aloituspuskurlaineessa, jonka pKa on noin 11,5 ja yksinkertaisessa suolassa, jonka 10 konsentraatio on riittävä, ettei monomeerinen kasvuhormo nin kaltainen materiaali absorboidu väliaineeseen; sopiva määrä puskuriainetta ja yksinkertaista suolaa lisätään puhdistettavaan kasvuhormonin kaltaisen materiaalin liuokseen siten, että kunkin konsentraatio on 15 sama kuin aloituspuskurin; kasvuhormonin kaltaisen materiaalin liuos laitetaan pylvääseen, joka on pakattu väliaineella, ja läpivirtaava eluointiaine kerätään syöttöliuoksesta ja syrjäytyspesusta käyttäen aloituspuskuria; ja 20 pylväsväliaine pestään hyvin suolapitoisella ja/tai emäksisellä liuoksella siihen voimakkaasti absorboituneiden aineiden poistamiseksi ja väliaine regeneroidaan seu-raavaa kierrätystä varten, tunnettu siitä, että menetelmä suoritetaan pitäen liuoksen pH:ta yli * 25 10,5:ssä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuoksen pH on noin 11,3 - 11,7 ja yksinkertainen suola on natriumkloridi, jonka konsentraatio on 50 - 250 mM aloituspuskurissa.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, . i tunnettu siitä, että puskuriaine on piperidiini tai fosfaattisuola.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kasvuhormonin kaltainen mate-35 riaali on rekombinanttiteknisesti valmistettu tai naudan tai sian aivolisäkkeestä peräisin oleva somatotropiini. 14 95805
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puhdistettavan kasvuhormonin kaltainen liuos on raaka.
6. Adsorptio-/desorptioeluointikromatografinen me-5 netelmä, jossa käytetään vahvan anioninvaihto tyyppistä väliainetta kovalenttisten ja ei-kovalenttisten aggregaattien erotteluun monomeerisestä kasvuhormonin kaltaisesta materiaalista, jossa menetelmässä väliaine tasapainotetaan aloituspuskurlaineessa, 10 jonka pKa on noin 11,5, ja yksinkertaisessa suolassa, jonka pitoisuus on 50 - 1 000 mM; sopiva määrä puskuriainetta ja yksinkertaista suolaa lisätään puhdistettavaan kasvuhormonin kaltaisen materiaalin liuokseen siten, että kunkin konsentraatio on 15 sama kuin aloituspuskurin; kasvuhormonin kaltaisen materiaalin liuos laitetaan pylvääseen, joka on pakattu väliaineella, minkä jälkeen syrjäytyspestään aloituspuskurilla; kasvuhormonin kaltainen materiaali eluoidaan käyt-20 täen isokraatti- tai gradienttimetodologiaa; ja väliaine pestään ja regeneroidaan voimakkaasti absorboidun lajin poistamiseksi ja väliaineen valmistamiseksi seuraavaa kierrätystä varten, tunnettu siitä, että !! 25 menetelmä suoritetaan pitäen liuoksen pH:ta yli 10,5:ssä.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuoksen pH on noin 11,3 - 11,7 ja yksinkertainen suola on natriumkloridi, jonka pi- 30 toisuus on 50 - 250 mm.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puskuriaine on piperidiini tai fosfaattisuola.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että kasvuhormonin kaltainen mate- i| i Sä i älli 1 1 1 SI : . i 15 95805 riaali on rekombinanttiteknisesti valmistettu tai naudan tai sian aivolisäkkeestä peräisin oleva somatotropiini.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puhdistettavan kasvuhormonin 5 kaltaisen materiaalin liuos on raaka (suuri määrä epäpuhtauksia) tai suhteellisen puhdas (pieni määrä epäpuhtauksia). 16 95805
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US26285588A | 1988-10-26 | 1988-10-26 | |
| US26285588 | 1988-10-26 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI895063A0 FI895063A0 (fi) | 1989-10-25 |
| FI95805B true FI95805B (fi) | 1995-12-15 |
| FI95805C FI95805C (fi) | 1996-03-25 |
Family
ID=22999350
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI895063A FI95805C (fi) | 1988-10-26 | 1989-10-25 | Menetelmä kasvuhormonien kaltaisten materiaalien aggregaattipitoisuuden vähentämiseksi |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0365858B1 (fi) |
| JP (1) | JP2728524B2 (fi) |
| KR (1) | KR0131872B1 (fi) |
| AT (1) | ATE114668T1 (fi) |
| AU (1) | AU621676B2 (fi) |
| CA (1) | CA1339186C (fi) |
| DE (1) | DE68919647T2 (fi) |
| DK (1) | DK172576B1 (fi) |
| ES (1) | ES2064412T3 (fi) |
| FI (1) | FI95805C (fi) |
| IE (1) | IE66390B1 (fi) |
| IL (1) | IL91837A (fi) |
| NO (1) | NO177857C (fi) |
| NZ (1) | NZ231067A (fi) |
| PT (1) | PT92088B (fi) |
| ZA (1) | ZA898097B (fi) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3726655A1 (de) * | 1987-08-11 | 1989-02-23 | Hoechst Ag | Verfahren zur isolierung basischer proteine aus proteingemischen, welche solche basischen proteine enthalten |
| WO1995008571A1 (en) * | 1993-09-22 | 1995-03-30 | American Cyanamid Company | Porcine somatotropin having enhanced stability; process for producing |
| DE10304066B4 (de) * | 2003-01-31 | 2007-01-18 | Henkel Kgaa | Verfahren zur Veredelung konzentrierter Enzymlösungen |
| CN104610422A (zh) | 2005-03-11 | 2015-05-13 | 惠氏公司 | 弱分配层析的方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BG49718A3 (en) * | 1983-07-15 | 1992-01-15 | Bio- Technology General Corp | Method for preparing of polypeptid with superoxiddismutasne activitty |
| US4677196A (en) * | 1985-09-06 | 1987-06-30 | International Minerals & Chemical Corp. | Purification and activation of proteins from insoluble inclusion bodies |
| AT399095B (de) * | 1986-03-27 | 1995-03-27 | Vukovich Thomas Dr | Verfahren zur auftrennung von proteinen mittels gradientenelution und vorrichtung zur durchführung des verfahrens |
-
1989
- 1989-09-27 DE DE68919647T patent/DE68919647T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-09-27 ES ES89117873T patent/ES2064412T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-27 EP EP89117873A patent/EP0365858B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-27 AT AT89117873T patent/ATE114668T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-09-28 CA CA000614342A patent/CA1339186C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-09-29 IL IL9183789A patent/IL91837A/en not_active IP Right Cessation
- 1989-10-19 NZ NZ231067A patent/NZ231067A/en unknown
- 1989-10-24 PT PT92088A patent/PT92088B/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-10-25 FI FI895063A patent/FI95805C/fi not_active IP Right Cessation
- 1989-10-25 ZA ZA898097A patent/ZA898097B/xx unknown
- 1989-10-25 DK DK198905308A patent/DK172576B1/da not_active IP Right Cessation
- 1989-10-25 IE IE343789A patent/IE66390B1/en not_active IP Right Cessation
- 1989-10-25 JP JP1276175A patent/JP2728524B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-10-25 KR KR1019890015390A patent/KR0131872B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1989-10-25 NO NO894249A patent/NO177857C/no not_active IP Right Cessation
- 1989-10-25 AU AU43774/89A patent/AU621676B2/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NZ231067A (en) | 1992-07-28 |
| ES2064412T3 (es) | 1995-02-01 |
| AU621676B2 (en) | 1992-03-19 |
| DK530889A (da) | 1990-04-27 |
| EP0365858A2 (en) | 1990-05-02 |
| FI895063A0 (fi) | 1989-10-25 |
| IE893437A1 (en) | 1991-05-08 |
| NO177857B (no) | 1995-08-28 |
| DE68919647T2 (de) | 1995-05-11 |
| EP0365858B1 (en) | 1994-11-30 |
| KR900006011A (ko) | 1990-05-07 |
| DK172576B1 (da) | 1999-02-01 |
| IL91837A0 (en) | 1990-06-10 |
| AU4377489A (en) | 1990-05-03 |
| JPH02218690A (ja) | 1990-08-31 |
| NO177857C (no) | 1995-12-06 |
| NO894249D0 (no) | 1989-10-25 |
| KR0131872B1 (ko) | 1998-04-11 |
| ZA898097B (en) | 1990-10-31 |
| JP2728524B2 (ja) | 1998-03-18 |
| PT92088B (pt) | 1995-08-09 |
| EP0365858A3 (en) | 1991-05-29 |
| IE66390B1 (en) | 1995-12-27 |
| NO894249L (no) | 1990-04-27 |
| DE68919647D1 (de) | 1995-01-12 |
| IE893437L (en) | 1990-04-26 |
| FI95805C (fi) | 1996-03-25 |
| ATE114668T1 (de) | 1994-12-15 |
| CA1339186C (en) | 1997-07-29 |
| IL91837A (en) | 1995-06-29 |
| PT92088A (pt) | 1990-04-30 |
| DK530889D0 (da) | 1989-10-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100566606B1 (ko) | 고순도알부민제조방법 | |
| JP4519646B2 (ja) | プレプロインスリンの精製方法 | |
| FI96210B (fi) | Plasmaproteiinien kromatograafinen erottaminen | |
| EP0460426B1 (en) | Protein purification method | |
| JP4975895B2 (ja) | 高圧液体クロマトグラフィーによるインシュリンの単離方法 | |
| JPH11506739A (ja) | 脂肪酸アシル化蛋白質のゲル化削減法 | |
| CN110526982A (zh) | 一种人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白的纯化方法 | |
| WO2000027869A1 (en) | Methods of purifying recombinant human erythropoietin from cell culture supernatants | |
| Imamura et al. | Purification of basic FGF receptors from rat brain | |
| US5853714A (en) | Method for purification of IL-12 | |
| FI95805B (fi) | Menetelmä kasvuhormonien kaltaisten materiaalien aggregaattipitoisuuden vähentämiseksi | |
| US4909941A (en) | High performance liquid chromatography mobile phase | |
| EP0117470B1 (en) | Process for producing interferon (ifn-gamma) subtypes 26k and 21k | |
| KAMP et al. | Purification of Escherichia coli 30S ribosomal proteins by high performance liquid chromatography | |
| Baker et al. | The isolation of “link proteins” from bovine nasal cartilage | |
| US4371462A (en) | Method for purification of anterior pituitary hormones | |
| Lazarovici et al. | Affinity chromatographic purification and characterization of two iodinated tetanus toxin fractions exhibiting different binding properties | |
| Seipke et al. | High‐Pressure Liquid Chromatography (HPLC) of Proteins [New Analytical Methods (29)] | |
| Welinder et al. | Separation, isolation and characterization of the four monoiodinated insulin tracers using reversed-phase high-performance liquid chromatography | |
| Wallace et al. | Preparation and rapid resolution of Xenopus phosvitins and phosvettes by high-performance liquid chromatography | |
| CA2592014A1 (en) | Purified rhigf-i/rhigfbp-3 complexes and their method of manufacture | |
| Saxena et al. | Preparation and properties of growth hormone from equine pituitary glands | |
| Gu | Purification techniques for human growth hormone (hGH) and an hGH antagonist | |
| WO2005033135A1 (en) | Process for purifying human thrombopoietin with high content of sialic acid | |
| JPH013198A (ja) | インターリューキン−２の精製方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: AMERICAN CYANAMID COMPANY |