DK172576B1 - Fremgangsmåde til nedsættelse af aggregatindholdet af væksthormonlignende materialer - Google Patents

Description

i DK PR 172576 B1

Den foreliggende opfindelse angår en chromatografisk gennemstrømningsfremgangsmåde, ved hvilken der anvendes et medium med en stærk anionbytter til fraskillelse af covalente og ikke-covalente aggregater fra monomert væksthormonlignende 5 materiale, ved hvilken fremgangsmåde mediet xkvilibreres i en startpufferart med en pKa nær 11,5 og en tilstrækkelig koncentration af et simpelt salt til, at det monomere væksthormonlignende materiale ikke adsorberes til mediet, og der tilsættes en passende mængde af pufferarten og det simple 10 salt til opløsningen af væksthormonlignende materiale, der skal renses, således at koncentrationen af hver er den samme som udgangspufferen, opløsningen af væksthormonlignende materiale fyldes på en søjle pakket med medium, og det gen-nemstrømmende udløb fra fødeopløsningen og fra en fortræng-15 ningsvaskning under anvendelse af startpufferen (udløbet indeholder det monomere væksthormonlignende materiale) opsamles, og søjlemediet vaskes med opløsninger med højt saltindhold og/eller med kaustiske opløsninger for at befri mediet for stærkt adsorberede arter, og mediet derefter 20 regenereres til den næste cyclus, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at pH-værdien af opløsningen er over 10,5. Opfindelsen omfatter en adsorption/desorptionselueringschro-matografimetode, ved hvilken der anvendes et medium med en stærk anionbytter til fraskillelse af covalente og ikke-25 covalente aggregater fra det monomere væksthormonlignende materiale, ved hvilken mediet ækvilibreres i en startpuffer med en pKa i nærheden af 11,5 og en passende koncentration af et simpelt salt, hvorpå en passende mængde af pufferarten og det simple salt sættes til opløsningen af væksthormonlig-30 nende materiale, som skal renses, således at koncentrationen af hver er den samme som startpufferen, hvorefter opløsningen af væksthormonlignende materiale fyldes på en søjle pakket med medium efterfulgt af fortrængningsvaskning med startpufferen, eluering af det monomere væksthormonlignende materiale 35 ved anvendelse af en isokratisk eller gradientmetodik og vaskning og regenerering af mediet med passende puffere for DK PR 172576 B1 2 at fjerne stærkt adsorberede arter og præparere mediet til den næste cyclus.

På vedlagte tegning viser fig. 1 SDS-PAGE for udgangsmateriale (bane 1) og chroma tograf eret materiale (bane 2) ved 5 anvendelse af metodikken ifølge eksempel 1.

Fig. 2 er gelpermeationschromatograferne, som fås ved anvendelse af en Superose 6-søjle (Pharmacia). Det øverste chromatogram er fødeopløsningen, medens det nederste er det lyofiliserede udløb fra anionbytteren som beskrevet i 10 eksempel 2.

Fig. 3 viser chromatogrammet fremkommet ved anvendelse af elueringsmetoden beskrevet i eksempel 3. Den anvendte søjle er en Mono-Q anionbyttersøjle med et bed-volumen på 1 cm3 (Pharmacia).

15 Rekombinant DNA teknologi har gjort det muligt at producere store mængder proteiner til potentielle kommercielle anvendelser, som tidligere var usandsynlige på grund af den begrænsede tilgængelighed af sådanne proteiner fra naturlige kilder. Proteinerne produceret af mikroorganismer, 20 som er blevet manipuleret genetisk, er imidlertid ofte ikke foldet korrekt og er således biologisk inaktive.

1 den senere tid har der været flere redegørelser om udvinding, isolering og solubilisering af inklusionslegemeproteiner fra bakterier. Formålet hermed har været at be-25 skrive fremgangsmåder, der maksimerer omdannelsen af denatureret uopløseligt protein til den rigtigt foldede monomere, biologisk aktive form. Forkert foldede, ikke-covalente aggregater eller covalente oligomerer produceres uundgåeligt under forløbet af solubiliseringen og renatureringen. Disse 30 produkter er ikke biologisk aktive og skal skilles fra det ønskede bioaktive monomere protein.

Følgelig har den foreliggende opfindelse til formål at tilvejebringe en effektiv fremgangsmåde til fraskillelse af disse biologisk inaktive aggregat- og/eller oligomeruren-35 heder fra det monomere bioaktive protein.

Den foreliggende opfindelse angår en effektiv og DK PR 172576 B1 3 økonomisk fremgangsmåde til fraskillelse af højmolekylvægtsurenheder fra monomere vsksthormonlignende materialer. Højmolekylvægt sur enhederne kan være et resultat af intermole-kylær covalent binding eller ikke-covalent association. Den 5 her beskrevne chromatografiske fremgangsmåde fraskiller effektivt sådanne covalente eller ikke-covalente aggregater, som er biologisk inaktive, fra det monomere bioaktive protein.

Ved den her omhandlede fremgangsmåde anvendes der en 10 chromatografifremgangsmåde baseret på fraskillelse ved ioni-ske mekanismer, dvs. ionbytterchromatografi, som er langt mere effektiv og økonomisk end gængse midler til fraskillelse af aggregater fra monomerer, såsom gelpermeationschromato-grafi. Fordelene ved ionbytterchromatografi omfatter højere 15 proteinpåfyldning pr. enhedsrumfang medium, højere lineær hastighed gennem mediet uden tab af opløsning eller for stort modtryk samt evne til at fjerne værtbakterieurenheder, såsom endotoksiner. Den første af de tre ovenfor nævnte fordele resulterer i kapital- og driftsomkostningsbesparelser 20 for en produktionsfacilitet i kommerciel skala ved at reducere størrelsen af udstyret og mængden af chromatografime-dium, der er nødvendig til en fast produktionshastighed. Den sidste af de anførte fordele gør det muligt at udelukke en separat enhedsoperation ved at forene funktionerne af to 25 operationer til én.

Materialet, der produceres ved den her beskrevne chromatografifremgangsmåde, indeholder meget små mængder aggregaturenheder. Tilsvarende renheder kan opnås ved omfattende bearbejdning ved kendte teknikker. Den foreliggende 30 opfindelse har til formål at tilvejebringe et meget mere effektivt og billigt alternativ til produktion af materialer, som primært består af bioaktivt monomert protein. Fordelene ved opfindelsen til en produktionsfacilitet i kommerciel skala vil være nærliggende for enhver fagmand ud fra følgende 35 beskrivelse og eksempler.

Til formålene ifølge opfindelsen betegner udtrykket DK PR 172576 B1 4 "væksthormonlignende materiale” som anvendt her (i) animalsk væksthormon selv, derivater deraf, analoger dertil samt fragmenter deraf af enhver art, f.eks. human, bovin eller porcin, (2) precursorer til væksthormon, såsom reduceret (-5 SH) væksthormon og S-beskyttet væksthormon, f.eks. vækst-hormon-S-sulfonat, (3) varianter af væksthormon eller dets precursorer, f.eks. strukturer, som er modificeret for at forlænge og/eller forkorte væksthormon-aminosyresekvensen, såsom 20 K-varianten af humant væksthormon, methionyl-humant 10 væksthormon og lignende og (4) analoger til væksthormon eller dets precursorer, såsom strukturer, hvorhos væksthor-mon-aminosyresekvensen er modificeret ved ombytning af en eller flere aminosyregrupper.

Den foreliggende opfindelse angår en chromatografisk 15 fremgangsmåde til anvendelse til fraskillelse af aggregater af væksthormonlignende materialer fra det ønskede bioaktive monomere materiale. Tidligere redegørelser har udtømmende beskrevet udvinding, isolering og solubilisering af inklusionslegemer fra værtsbakterien. På grund af den uundgåelige 20 ineffektivitet ved solubiliseringsmetoden produceres der nogle forkert foldede ikke-covalente aggregater eller cova-lente oligomerer sammen med den ønskede monomer. Ultrafiltrering kan anvendes til at fjerne kolloider og urenheder med meget høj molekylvægt, men en væsentlig aggregatmængde pas-25 serer sædvanligvis gennem ultrafilteret sammen med monomeren.

Dette ultrafiltrat kan med fordel renses ved den følgende chromatograf imetode.

Det vil være klart for enhver fagmand, at udtrykket "stærk anionbytter” refererer til harpikser med kationiske 30 grupper, som bevarer deres positive ladning ved relativt høj pH-værdi, f.eks. over pH 9,0. De kationiske grupper knyttet til understøtningen kan vælges blandt kvaternære ammoniumgrupper, såsom —CH2CH2N+(CH2CH3)2CH2CH(OH)CH3.

35 Som eksempler på egnede kommercielt tilgængelige anionbyt-terharpikser til brug ved udøvelsen af opfindelsen kan nævnes DK PR 172576 B1 5 QAE-Sephadex A-25, QE-52 cellulose, Cellex QAE, Q-Sepharose og Mono-Q.

Det anvendte ionbyttermedium er en stærk anionbyt-tertype, såsom men ikke begrænset til Q-Sepharose (Phar-5 macia). Mediet pakkes i en gængs chromatografisej le, som er en del af en typisk chromatografisystempakke bestående af pumper, pufferreservoirer, UV-detektor og fraktionsopsamler.

Mediet ækvilibreres i en vandig startpuffer bestående af piperidin eller et andet egnet puffermiddel med en tilsva-10 rende pKa ved en koncentration på 20 mM og natriumchlorid eller et lignende simpelt salt ved en koncentration på 50-250 mM. Den foretrukne pH-værdi for opløsningen er 11,3-11,7, og der kan anvendes mere eller mindre piperidin for at opnå den ønskede pH-værdi for startpufferen. 3 Bed-volumen puffer 15 er sædvanligvis tilstrækkeligt til at sikre en ækvilibre-ring.

Opløsningen indeholdende det opløselige monomere vcksthormonlignende materiale og urenheder, her omtalt som fødeopløsning, bringes op på den samme piperidin- og natrium-20 chloridkoncentration som startpufferen. pH-værdien justeres for at opnå det ønskede resultat ved tilsætning af mere piperidin om nødvendigt. Fødeopløsningen fyldes derefter på søjlen med en overfladehastighed på op til 300 cm/time, indtil der er påfyldt 50-150 g protein pr. liter medium.

25 Udløbet overvåges ved absorbans ved 280 nm, og der opsamles fraktioner, når der forekommer en stigning i basislinien.

Fødeopløsningen efterfølges af 3-6 bed-volumen startpuffer, indtil basislinien er nået igen. Alle de opsamlede fraktioner fra den initielle pludselige stigning og indtil basislinien 30 er nået samles sammen, søjlen kan regenereres til senere anvendelse ved vaskning med passende puffere for at fjerne stærkt bundne urenheder og fornyet ækvilibrering i startpufferen.

Det er blevet vist, at den monomere form af det vxkst-35 hormonlignende materiale ikke binder til de aktive ionbyt-tersteder på mediet men i stedet strømmer gennem søjlen og DK PR 172576 B1 6 udvindes i udløbet. Aggregaturenhederne binder imidlertid til søjlen og tilbageholdes, indtil der anvendes et fortræng-ningsmiddel med en passende højere styrke til eluering deraf.

Foruden den ovenfor beskrevne gennemstrømnningsmetode 5 er det blevet vist, at en adsorptions/desorptionseluerings-chromatografimetode også er effektiv til fraskillelse af aggregaturenheder fra monomert væksthormon lignende materiale. Elueringschromatografimetoden er imidlertid mindre effektiv ved tilsvarende proteinbelastninger pr. enhedsrumfang medium.

10 Alligevel er det stadig en anvendelig fremgangsmåde til fraskillelse af monomer fra aggregater ved lavere proteinbelastninger.

Ionbyttermediet og dertil knyttet udstyr anvendt ved elueringschromatografimetoden er det samme som til gennem-15 strømningsmetoden. De anvendte puffere er vandig puffer (A) sammensat af 20 mM piperidin eller et andet egnet puffermiddel med en tilsvarende pKa, således at der fås en pH-værdi på 11,3-11,7, og vandig puffer (B) bestående af 20 mM piperidin og 1000 mM natriumchlorid eller et tilsvarende simpelt 20 salt. Søjlen skvilibreres først ved anvendelse af 17% v/v puffer (B) i puffer (A). 3 Bed-volumen er sædvanligvis tilstrækkeligt til sikring af ækvilibreringen. For det andet drages der omsorg for, at fødeopløsningen bestående opløseligt monomert væksthormonlignende materiale og urenheder 25 får den samme sammensætning som puffer (A) og derefter ledes til søjlen, indtil denne er fyldt med 5-15 g protein pr. liter medium. Derefter foretages der fortrængningsvaskning med 5 bed-volumen 17% v/v puffer (B) i puffer (A). Elue-ringen gennemføres ved anvendelse af 20 bed-volumen af en 30 lineær gradient begyndende ved 17% v/v puffer (B) i puffer (A) til 47% v/v af puffer (B) i puffer (A). Eluatet overvåges ved absorbans ved 280 nm, og der opsamles fraktioner. Til sidst anvendes der 10 bed-volumen puffer (B) for at befri søjlen for eventuelt stærkt adsorberede arter. Søjlen kan 35 derefter regenereres til senere anvendelse ved yderligere vaskninger med passende puffere for at fjerne andre stærkt DK PR 172576 B1 7 bundne urenheder og påny ækvilibreres med startpufferen.

Det er blevet vist, at den monomere form af det væksthormon lignende materiale elueres tidligt i forløbet af elue-ringssaltgradienten, og at aggregaturenhederne elueres senere 5 i gradienten med basislinieopløsning mellem de to toppe.

De ovenfor beskrevne chroroatografimetoder har vist sig at være effektive til fraskillelse af monomer fra aggregaturenheder ved anvendelse af relativt rå proteinopløsninger, dvs. høje niveauer af urenheder i forhold til den 10 ønskede monomer. Fremgangsmåderne har også, som man kunne forestille sig, været anvendt med held til yderligere rensning eller oparbejdning af relativt rene proteinopløsninger, som allerede har været gennem flere rensetrin. Gennemstrømningsmetoden er især egnet til økonomisk oparbejdning af 15 allerede renset protein, som eventuelt indeholder aggregatmængder, der kun er lidt højere end specifikationen.

De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af fremgangsmåden ifølge opfindelsen uden at begrænse dens omfang og ide.

20

Eksempel 1

Dette eksempel beskriver gennemstrømningsmetodikken anvendt til yderligere rensning eller oparbejdning af bovin somatotropin hidrørende fra rekombinantbakterier, der al-25 lerede er delvis renset men indeholder en stor mængde aggregat .

En søjle indeholdende 200 cm3 Q-Sepharose (Pharmacia) anionbyttergel ækvilibreres ved anvendelse af 3 bed-volumen vandig startpuffer bestående af 20 mM piperidin og 150 mM 30 natriumchlorid med en pH-værdi på 11,5. 20 g lyofiliseret rekombinant-bovin somatotropin fra The American Cyanamid Company rekonstitueres i 2000 cm3 startpuffer, hvorved der fås en koncentration på 10 g/liter, og dette fyldes på søjlen med en lineær overfladehastighed på 95 cm/time. Lige efter 35 påfyldningen er begyndt iagttages der en pludselig stigning ved overvågning af absorbansen af udløbet ved 280 nm. Udløbet DK PR 172576 B1 8 opsamles, når denne pludselige stigning forekommer. Fødeop-løsningen efterfølges af en fortrængningsvask med samme sammensætning som startpufferen, indtil absorbansen er tilbage ved basislinien. Udløbet fra påfyldningsfasen efter 5 den pludselige stigning forenes med udløbet fra fortrængningsvasken, hvorved der fås et samlet rumfang på 2840 cm3.

Det forenede udløb afsaltes og koncentreres ved anvendelse af en 10 k-dalton afskærings-hulfiberfilterindsats og lyo-filiseres derefter.

10 Udgangsmaterialet i dette eksempel indeholder 11% aggregat ved ikke-reducerende SDS-PAGE, som har en tilsyneladende molekylvægt på 44 eller 42 k-dalton. Dette materiale antages at være covalent dimer dannet ved intermolekylær disulfidbrodannelse mellem bovine somatotropinmonomerer.

15 Det er også blevet vist, at den covalente dimer ikke er biologisk aktiv. Det efter chromatografi fremkomne materiale har 0,2% dimer ved SDS-PAGE. Aggregatniveauet, som målt ved størrelseseksklusionschromatografi, viser også en nedgang fra mere end 10% aggregat til mindre end 1% mellem udgangs-20 og chromatograferet materiale. På en monomer-alene-basis er udbyttet ved chromatograf i trinnet 84%, dvs. 84% af monomeren i fødeopløsningen udvindes i det forenede udløb. Desuden øges materialets bioaktivitet fra 92 til 101% af standard som målt ved en radioreceptoranalyse. Resultaterne af en 25 analytisk sammenligning mellem udgangsmateriale og det chromatograf erede materiale er opsummeret i tabel I. Fig. 1 viser også SDS-PAGE-gelbanerne for udgangsmaterialet og det chromatograferede materiale til sammenligning. Isoelektrisk fokusering udføres på både udgangsmateriale og det chromato-30 graferede materiale. Resultaterne (ikke vist) viser, at der ikke er sket nogen deamidering på grund af chromatografi-trinnet.

DK PR 172576 B1 9

Tabel I

Udgangs- Chromatogr a fe- materiale ret materiale 5 Protein, mg/g 1011 1008 SDS-PAGE, vægt%* 95 104 SDS-PAGE, % dimer* 11,0 0,2 "Superose 12", vægt%** 99 98 "Superose 12", % dimer** 10,4 <1,0 10 Radio-receptor analyse, vægt% 92 101 * SDS-PAGE = natriumdodecylsulfonatpolyacrylamidgelelektro-foreseanalyse.

15 ** "Superose 12" (Pharmacia) = gelpermeationschromatografi-analyse.

Note: Alle analyser er beregnet på en fugtfri basis.

20

Eksempel 2

Dette eksempel beskriver gennemstrømningsmetodikken anvendt til chromatografisk at rense en relativt rå proteinopløsning, der indeholder en væsentlig mængde aggregat med 25 en størrelse fra ca. 40 til over 100 k-dalton.

Materialet, der skal renses, er en rå proteinopløsning af rekombinant-bovin somatotropin, hidrørende fra inklusionslegemer og underkastet ultrafiltrering for at fjerne kol-loider og urenheder med meget høj molekylvægt. Opløsningen 30 fås fra The American Cyanamid Company's pilotanlægsfacilitet.

En søjle indeholdende 135 cm3 Q-Sepharose (Pharmacia) aionbytter ækvilibreres ved anvendelse af den samme puffer som beskrevet i eksempel 1. Den rå proteinopløsning, der tidligere er ultrafiltreret ved anvendelse af et 100 k-dalton 35 afskærings-hulfiberultrafilter (Aroicon), bringes op på den samme puf fer saltsammensætning som startækvilibreringspuf feren ved tilsætning af piperidin og natriumchlorid. Opløsningens proteinkoncentration er 4,71 g/liter. Søjlen fyldes med 3180 cm3 opløsning, og udløbet opsamles som beskrevet i 40 eksempel 1. Fødeopløsningen efterfølges af en fortrængnings- DK PR 172576 B1 10 vask som beskrevet, i eksempel 1. Det samlede opsamlede udløbsrumfang er 3.489 cm3. Udløbet afsaltes, koncentreres og lyofiliseres, hvorved der fås en tørvægt på 11,4 g.

Den rå proteinopløsning indeholder 19,2% aggregat 5 som målt ved gelpermeationschromatografi. Det lyofiliserede chromatograferede materiale indeholder mindre end 1% aggregat ved gelpermeationschromatografi og 0,3% oligomer ved SDS--PAGE. Fig. 2 viser chromatogrammer fra gelperraeationschro-roatografi for fødeopløsningen og det lyofiliserede udløb 10 fra søjlen.

Eksempel 3

Dette eksempel illustrerer fremgangsmåderne anvendt til chromatografisk at rense en prøve af rekombinant-bovin 15 somatotropin ved anvendelse af adsorptions/desorptionselue-ringsmetoden. Materialet fås fra The American Cyanamid Company og indeholder mere end 10% aggregat som målt ved SDS-PAGE.

Der anvendes en 1 cm3 Mono-Q (Pharmacia) anionbyt-20 tersøj le til dette eksempel. Pufferne er vandig puffer (A) bestående af 20 mM piperidin, pH-verdi 11,5, og vandig puffer (B) bestående af 20 mM piperidin og 1000 mM natriumchlorid, pH-vaerdi 11,5. Søjlen ækvilibreres ved anvendelse af 17% v/v puffer (B) i puffer (A), og derefter injiceres der 200 25 μΐ af en 20 mg/ml opløsning af bovin somatotropin i puffer (A) . Injektionen efterfølges af 5 bed-volumen 17% v/v puffer (B) i puffer (A) og derefter af 20 bed-volumen af en lineær gradient fra 17% til 47% v/v af puffer (B) i puffer (A).

Endelig anvendes der 10 bed-volumen 100% puffer (B) til elue- 30 ring af eventuelt stærkt adsorberede urenheder.

De tre veldefinerede toppe fås under saltgradienten (jfr. fig. 3). Den første top (282 sekunder), som viser sig kort efter starten af gradienten, er den største. Den anden viser sig som en sammensmeltet top (345 sekunder) på bagkan-35 ten af den første. Den tredje top (531 sekunder) er godt adskilt fra de to første. Desuden elueres der en lille top DK PR 172576 B1 11 (796 sekunder) under den isokratiske 100% puffer (B) vask.

De enkelte toppe isoleres og underseges ved SDS-PAGE.

Den ferste og anden top viser sig at være ren bovin somato-tropinmonomer. Den tredje top er imidlertid sammensat af 5 bovin somatotropindimer og hejere molekylvægtsoligomerer.

Blrsftinoel 4

Dette eksempel giver detaljer om fremgangsmåderne anvendt til yderligere rensning af porcin somatotropin hid-10 rørende fra rekombinantbakterier, der allerede er delvis renset men indeholder 22,4% aggregat som bestemt ved gelper-meationschromatografi.

Der anvendes en søjle indeholdende 4,5 liter Q-Sepha-rose (Pharmacia) anionbyttergel ved gennemstrømningsmetoden 15 ifølge de samme fremgangsmåder som beskrevet i eksempel 1. Pufferrumfangene justeres, således at de passer til forskellen i bed-volumen mellem de to eksempler. I alt 450 g lyo-filiseret rekombinant-porcin somatotropin fra The American Cyanamid Company rekonstitueres i 45 liter startpuffer og 20 ledes derefter til søjlen. Udløbet overvåges og opsamles som beskrevet i eksempel 1. Udløbet fra fortrængningsvask-ningen forenes med fødeperiodeudløbet som beskrevet detaljeret tidligere i eksempel l.

Det samlede forenede udløb viser sig at indeholde en 25 ikke-påviselig mængde aggregat som bestemt ved gelpermea-tionschromatograf i.

Claims (9)

1. Chromatografifremgangsmåde med gennemstrømning, ved hvilken der anvendes et medium med en stærk anionbytter, 5 til fraskillelse af covalente og ikke-covalente aggregater fra monomert væksthormonlignende materiale, omfattende at mediet ækvilibreres i en startpuf ferart med en pKa i nærheden af 11,5 og en koncentration af et simpelt salt, der er tilstrækkelig til at bevirke, at det monomere væksthormon1iglo nende materiale ikke adsorberes til mediet, en passende mængde af pufferarten og det simple salt sættes til opløsningen af væksthormonlignende materiale, der skal renses, således at koncentrationen af hver er den samme som startpufferen, og opløsningen af væksthormonlignende materiale 15 fyldes på en søjle pakket med medium, og det gennemstrømmende udløb fra fødeopløsningen og fra en fortrængningsvaskning under anvendelse af startpufferen opsamles, hvorpå søjlemediet vaskes med opløsninger med højt saltindhold og/eller kaustiske opløsninger for at befri mediet for stærkt adsor-20 berede arter, hvorefter mediet regenereres til den næste cyclus, kendetegnet ved, at pH-værdien af opløsningen er over 10,5.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendete g- 25 net ved, at opløsningens pH-værdi er 11,3-11,7, og det simple salt er natriumchlorid i en koncentration på 50-250 mM i startpufferen.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendete g- 30 net ved, at pufferarten er piperidin eller et phosphat- salt. 1 Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendeteg net ved, at det væksthormonlignende materiale er rekom- 35 binant eller pituitær bovin eller porcin somatotropin. DK PR 172576 B1

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at opløsningen af væksthormonlignende materiale, der skal renses, er rå (store mængder urenheder) eller er relativt ren (små mængder af urenheder). 5

6. Chromatografifremgangsmåde med adsorptions/desorp-tionseluering, ved hvilken der anvendes et medium af en stærk anionbytter, til fraskillelse af covalente og ikke--covalente aggregater fra monomert væksthormonlignende ma- 10 teriale, omfattende at mediet ækvilibreres i en startpuf-ferart med en pKa i nærheden af 11,5 og en passende koncentration af et simpelt salt, en passende mængde af pufferarten og det simple salt sættes til opløsningen af væksthormonlignende materiale, der skal renses, således at kon-15 centrationen af hver er den samme som startpufferen, opløsningen af det væksthormonlignende materiale fyldes på en søjle pakket med medium efterfulgt af en fortrængningsvask-ning med startpuf feren, det monomere væksthormonlignende materiale elueres ved anvendelse af en isokratisk eller 20 gradientmetodik, og mediet vaskes og regenereres med passende puffere for at fjerne stærkt adsorberede arter og forberede mediet til den næste cyclus, kendetegnet ved, at pH-værdien af opløsningen er over 10,5.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendeteg net ved, at opløsningens pH-værdi er 11,3-11,7, og det simple salt er natriumchlorid i en koncentration på 50-1000 mM.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendeteg net ved, at pufferarten er piperidin eller et phosphat-salt.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendete g-35 net ved, at det væksthormonlignende materiale er rekom-binant eller pituitær bovin eller porcin somatotropin. DK PR 172576 B1

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at opløsningen af væksthormonlignende materiale, der skal renses, er rå (store mængder urenheder) eller er 5 relativt ren (små mængder urenheder).