KR0131872B1 - 성장 호르몬-유사물질로부터 응집체를 분리시키는 크로마토그래피법 - Google Patents
성장 호르몬-유사물질로부터 응집체를 분리시키는 크로마토그래피법Info
- Publication number
- KR0131872B1 KR0131872B1 KR1019890015390A KR890015390A KR0131872B1 KR 0131872 B1 KR0131872 B1 KR 0131872B1 KR 1019890015390 A KR1019890015390 A KR 1019890015390A KR 890015390 A KR890015390 A KR 890015390A KR 0131872 B1 KR0131872 B1 KR 0131872B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- growth hormone
- buffer
- medium
- concentration
- starting
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 title claims abstract description 30
- 239000000463 material Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 22
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 58
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 22
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N tetrahydropyridine hydrochloride Natural products C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical group [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 16
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 15
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 11
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 11
- 239000012527 feed solution Substances 0.000 claims description 10
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 8
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 7
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims description 6
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000002336 sorption--desorption measurement Methods 0.000 claims description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 3
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000003518 caustics Substances 0.000 claims description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims 2
- 125000003386 piperidinyl group Chemical group 0.000 claims 2
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 claims 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 12
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 9
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 6
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 6
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 5
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 5
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- XZMCDFZZKTWFGF-UHFFFAOYSA-N Cyanamide Chemical compound NC#N XZMCDFZZKTWFGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 4
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 4
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 4
- 108091006522 Anion exchangers Proteins 0.000 description 3
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 2
- 239000013632 covalent dimer Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QRZGKKJRSA-N beta-cellobiose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QRZGKKJRSA-N 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical group 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006334 disulfide bridging Effects 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- DAJSVUQLFFJUSX-UHFFFAOYSA-M sodium;dodecane-1-sulfonate Chemical group [Na+].CCCCCCCCCCCCS([O-])(=O)=O DAJSVUQLFFJUSX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108700031632 somatrem Proteins 0.000 description 1
- 238000010977 unit operation Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Catalysts (AREA)
- Silicates, Zeolites, And Molecular Sieves (AREA)
- Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Fodder In General (AREA)
Abstract
내용 없음.
Description
제1도는 출발물질의 SDS-PAGE(레인1) 및 실시예 1의 방법을 사용하여 크로마토그래피시킨 물질(레인2)이다.
제2도는 수퍼로즈6(Superose6)(조제용(Pharmacia)) 컬럼을 사용하는 겔 투과 크로마토그래프이다. 하부 크로마토그램이 실시예 2에서 기술한 바와 같은 음이온 교환체로부터 얻은 동결건조시킨 유출액인 한편, 상부 크로마토그램은 공급용액이다.
제3도는 실시예 3에서 기술한 용리법을 사용하여 얻은 크로마토그램이다. 사용된 컬럼은 1-CC흡착제부피(bed volume)의 모노-Q 음이온-교환체(조제용)였다.
본 발명은, 단량체 성장호르몬-유사물질(monomeric growth hormone-like material)이 매질로 흡수되지 않도록 하기 위해, PKa 약 11.5 및 단순염의 충분한 농도로 출발 완충액(buffer species)내에 매질을 평형시키고 ; 각각의 농도가 출발 완충액과 동일한 정도가 되도록 정제될 성장 호르몬-유사물질 용액에 적정량의 완충액 및 단순염을 첨가시키고; 매질로 채워진 컬럼상에 성장 호르몬-유사물질 용액을 장입시키고, 출발 완충액을 사용하는 치환 세정으로부터, 그리고 공급용액으로부터 병류 유출액(flow-through effluent)(유출액은 단량제 성장 호르몬-유사물질을 포함한다)을 수집하고; 고염(high salt) 및/또는 가성 알칼리 용액으로 컬럼 매질을 세정시켜 강하게 흡착 시킨 종(species)의 매질을 스트리핑시키고 나서, 다음 주기를 위해 매질을 재생성시키는 것으로 구성되는, 단량체 성장 호르몬-유사물질로부터 공유 및 비-공유 응집체를 분리시키는 강한 음이온 교환체-형 매질을 사용하는 병류크로마토그래피법에 관한 것이다. 본 발명은, PKa 약 11.5 및 단순염의 적절한 농도로 출발 완충액내에 매질을 평형시키고; 각각의 농도가 출발 완충액과 동일한 정도가 되도록 정제될 성장 호르몬-유사 물질용액을 장입시키고 나서, 출발 완충액으로 치환 세정하고; 이소크레틱(isocratio) 또는 기울기 방법을 사용하여 단량체 성장 호르몬-유사 물질을 용리시키고; 적절한 완충액으로 매질을 세정하고, 재생시켜 강하게 흡착시킨 종을 제거시키고, 다음 주기를 위한 매질을 준비하는 것으로 구성되는, 단량체 성장 호르몬-유사 물질로부터 공유 및 비-공유 응집체를 분리시키는 강한 음이온 교환체-형 매질을 사용하는 흡착/탈착 용리 크로마토그래피법을 포함한다. 천연원으로부터의 단백질 이용은 제한을 받기 때문에 재조합 DNA 기술이 이전에 받아들이기 어려웠던 잠잭적인, 상업적인 사용을 위한 다량의 단백질을 생성시키는 것을 가능케 한다. 그러나, 유전적으로 조작해왔던 미생물에 의해 생성된 단백질은 종종 정확하게 포개지지 않아서, 생물학적으로 비활성이 된다.
최근, 세균으로부터의 봉입체 단백질의 회복, 분리 및 가용화에 관한 여러 가지 발표가 있어 왔다. 이러한 발표들의 목적은, 변성된 불용성 단백질을 적절하게 포개진, 단량체의 생물학적으로 활성인 형태로 전환시키는 것을 최대화하는 방법을 기술하는 것이다. 불가피하게, 가용화 및 원형 제현동안, 부적절하게 포개진 비-공유 응집체 또는 공유 올리고머가 생성된다. 이들 생성물은 생물학적으로 활성이 아니며, 원하는 생활성(bioaotive) 단량제 단백질로부터 분리시켜야 한다
따라서, 생활성 단량제 단백질로부터 올리고머 불순물 및 또는 이들 생물학적으로 불활성인 응집체를 분리시키기 위한 효율적인 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
본 발명은, 단량체 성장호르몬-유사물질로부터 고분자량 불순물을 분리시키기 위한 효율적이고 경제적인 방법을 설명한다. 고분자량 불순물은 분자간 공유 결합 또는 비-공유 결합의 결과일 수 있다. 기술된 크로마토그래피법은 단량체인 생활성 단백질로부터 생물학적으로 비활성인 상기 공유 또는 비-공유 응집체를 효율적으로 분리시킨다.
본 발명의 방법은, 겔 투과 크로마토그래피 같은, 단량체로부터 응집체를 분리시키는 통상적인 수단보다 훨씬 더 효율적이고 경제적인 이온 메카니즘에 의한 분리에 기초한 크로마토그래피(즉, 이온-교환 크로마토그래피)과정을 적용한다. 이온-교환 크로마토그래피의 장점은 매질의 단위 부피당 더 높은 단백질 증량, 분해능 또는 과량의 배압손실없이 매질을 통한 더 높은 선 속도 및 내독소 같은 세균성 숙주 불순물을 제거시키는 능력을 포함한다는 것이다. 앞서 언급한 첫 번째 세가지 장점은, 고정된 생산률에 필요한 크로마토그래피 매질의 양 및 장치 크기를 감소시켜 상업적-규모의 생산 용이함을 위한 원금 및 운영비를 절감시킨다. 마지막에 언급한 장점은 두가지 조작 기능을 하나로 결합시켜 분리 단위 조작을 제거시킨다.
기술한 크로마토그래피법에 의해 생성된 물질은 극소량의 응집체 불순물을 포함한다. 공지 기술에 의한 광범위한 공정을 통해 비슷한 순도를 얻을 수 있다. 주로, 생활성 단량체 단백질로 구성된 물질을 생성시키는 훨씬 더 효율적이고, 값싼 대안을 제고하는 것이 본 발명의 목적이다.
상업적-규모의 생산 용이성을 위한 발명의 장점은 하기 설명과 실시예로부터 당분야의 기술자들에게 쉽게 명백해질 것이다.
본 명세서를 위해 여기 사용된 용어 성장호르몬-유사물직은 (1) 동물성장호르몬 그 자체, 유도체, 유사체 및 인간, 소, 돼지 같은 임의 종의 이들 단편; (2) 환원된(-SH) 성장호르몬 및 성장 호르몬 S- 술포네이트 같은 S- 보호된 성장호르몬같은 성장 호르몬에 대한 선구물질; (3) 성장호르몬 아미노산 서열을 길게 하기 위해 및/ 또는 짧게 하기 위해 개질시킨 구조와 같은 성장 호르몬 또는 그 선구물질의 변이체(예로, 인간성장 호르몬, 메티오닐 인간 성장 호르몬 및 그 밖의 것의 20K 변이체); 및 (4) 성장호르몬 아미노산 서열이 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 치환에 의해 개질된 구조와 같은 성장호르몬 또는 그 선구물질의 유사체를 의미한다.
본 발명은, 원하는 생활성 단량체 물질로부터 성장 호르몬-유사물질의 응집체를 분리시키는데 사용되는 크로마토그래피법의 설명에 관한 것이다. 앞선 발표들은 숙주세균으로부터의 봉입체의 회복, 분리 및 가용화를 적절하게 기술해 왔다. 가용화 방법의 피할 수 없는 비능률 때문에, 원하는 단량체와 몇가지 부적절하게 포개진 비-공유 응집체 또는 공유 올리고머를 생성시킨다. 한외여과가 콜로이드와 매우 높은 분자량의 불순물을 제거시키기 위해 적용될 수 있지만, 응집체의 상당량이 대개, 단량체와 한외여과기를 통과한다. 이 한외여액은 하기 크로마토그래피법에 의해 유리하게 정제시킬 수 있다.
당분야의 기술자들은, 용어 강한 음이온-교환체가 비교적 높은 pH(예로, pH 9.0이상)에서 그들 양전하를 유지시키는 양이온 기를 갖는 수지를 일컫는다는 것을 인식하게 될 것이다. 지지체에 부착된 양이온기는 -CH2CH2N + (CH2CH3)2CH2(OH)CH3와 같은 제4암모늄기로부터 선택될 수 있다. 발명의 실시예에서 사용하기 위한 적절한 상업적으로 구입가능한 음이온-교환수지의 예로써 언급할 수 있는 것은 QAE-세파덱스 A-25, QE-52 셀로로즈, 셀렉스 QAE, Q-세파로즈, 및 모노-Q이다.
사용된 이온-교환매질은 Q-세파로즈(조제용)같은 강한 음이온 교환체형이나 이것으로 한정되지 않는다. 펌프, 완충액 저장기, UV 검출기, 및 유분 수집기로 구성된 전형적인 크로마토그래피 시스템 팩키지의 일부분인 통상적인 크로마토그래피 컬럼으로 매질을 채운다. 20mM농도에서, 피페리딘 또는 비슷한 pKa를 가진 다른 적절한 완충제 및 50-250mM 농도에서 염화나트륨 또는 유사 단순염으로 구성된 출발 수성 완충액내에 매질을 평형시킨다. 용액의 바람직한 pH는 11.3-11.7이고, 원하는 pH의 출발완충액을 얻기 위해 다소간의 피페리딘을 사용할 수 있다. 완충액의 3흡착제 부피가 대개, 평형을 확실히 하는데 적절하다.
여기서, 공급용액으로 일컫는 가용성 단량체 성장 호르몬-유사물질 및 불순물질을 함유하는 용액을 출발 완충액과 동일한 피페리딘 및 염화나트륨 농도로 회복시킨다. 필요하다면 더 많은 피페리딘을 첨가시켜 원하는 걸과를 얻기 위해 pH를 조절한다. 그리고 나서, 매질 리터당 50-150그램의 단백질이 부하될 때까지, 300㎝-hr-1이하의 표면속도에서 공급 용액을 컬럼상에 부하시킨다. 유출액을 280mn에서 흡수도로 검사하고, 기준선에 상승이 한번 일어날 때 유분을 수집한다. 다시 한번 기준선에 도달할 때까지, 공급용액을 출발 완충액의 3-6흡착제 부피로 시험한다. 기준선에 도달할 때까지 초기 돌파점으로부터 수집한 모든 유분을 한데 모은다. 강하게 결합된 불순물을 제거시키기 위해 적절한 완충액으로 컬럼을 세정하고, 출발 완충액내에 재-평형시켜 또다른 사용을 위해 컬럼을 재생시킬 수 있다.
성장호르몬-유사 물질의 단량체 형이 매질위 활성 이온-교환 부위에 결합되지 않지만, 대신 컬럼을 통해 흘러, 유출액내에서 회복된다는 것을 증명했다. 그러나, 응집체 불순물은 컬럼에 결합되어, 적절하게 더 높은 강도의 조제용 여과기(displacer)가 그들을 용리시키는데 사용될 때까지 유지된다.
앞서 기술한 병류법에 첨가로, 단량체 성장 호르몬-유사 물질로부터 응집체 불순물을 분리시키는데 흡착/탈착 용리 크로마토그래피법이 또한 효과적임을 증명했다. 그러나 용리 크로마토그래피법은 매질의 단위 부피당 비슷한 단백질 부하에서 덜 효율적이다. 그럼에도 불구하고, 더 낮은 단백질 부하에서는 여전히, 응집체로부터의 단량체 분리에 대해 가변하는 방법이다.
용리 크로마토그래핍법에 사용되는 이온-교환 매질 및 부속 장치는 병류법에 사용되는 것과 동일하다. 사용된 완충액은 pH 11.3-11.7을 나타내는, 20mM 피페리딘, 또는 유사 pKa를 가진 다른 적절한 완충제로 구성되는 수성 완충액(A)와, 20mM 피페리딘 및 1000mM 염화나트륨 또는 유사 단순염으로 구성되는 수성 완충액(B)이다. 완충액(A)내에 완충액(B)17% v/v를 사용하여 컬럼을 처음 평형시킨다. 3흡착제 부피가 대개, 평형을 확실히 하는데 충분하다. 가용성 단량체 성장 호르몬-유사물질 및 불순물로 구성되는 공급용액을 완충액(A)와 동일한 조성물에 넣고 나서, 매질의 리터당 5-15그램의 단백질이 부하될 때까지 컬럼에 공급했다. 완충액(A)내에 17% v/v 완충액(B)의 5흡착제 부피로 구성되는 치환 세정이 따른다. 완충액(A)내 17% v/v의 완충액(B)내지 완충액(A)내 47% v/v 의 완충액(B)로 시작하는 선형 기울기의 20흡착제 부피를 사용하여 용리를 수행한다. 280nm에서 흡수도로 용출액을 검사하고, 프렉션을 수집한다. 최근, 임의 강하게 흡착된 종의 컬럼을 스트립시키는데 10흡착제 부피의 완충액(B)를 사용한다. 그리고 나서, 다른 강하게 결합된 불순물을 제거시키기 위해 적절한 완충액으로 첨가로 세정하고, 출발 완충액으로 제-평형시켜, 또다른 사용을 위해 컬럼을 재생시킬수 있다.
성장 호르몬-유사 물질의 단량체 형태를 용리염 기울기의 과정에서 초기에 용리시키고, 응집체 불순물을 두 개 -피이크 사이에 기준선 분해능을 가진 기울기내에 나중에 용리시킨다는 것을 증명했다.
비교적 조 단백질 용액(즉, 원하는 단량체에 관계되는 높은 수준의 불순물)을 사용하여 응집체 불순물로부터 단량체를 분리하는데, 앞서 기술한 크로마토그래피법이 효율적임을 보여주었다. 또한, 짐작할 수 있듯이, 이미 여러 정제 단계를 거친 비교적 깨끗한 단백질 용액을 더 정제시키거나 재가공시키기 위한 방법이 성공적으로 사용되었다. 상술한 것보다 단지 약간 더 놓은 응집체 수준을 포함할 수 있는 이미 정제시킨 단백질의 경제적인 제가공을 위해서는 병류법이 특히 적합하다.
하기 실시예는 발명의 실시를 더 예증하지만 그 범위를 제한하지는 않는다.
실시예 1
본 실시예는 이미 부분적으로 정제시켰지만, 다량의 응집체를 포함하지 않는 재결합 균으로부터 유도한 소의 소마토트로핀을 더 정제시키거나 재가공하는데 사용되는 병류법을 기술한다. pH가 11.5인 20mM 피페리딘과 150mM 염화나트륨으로 구성되는 출발 수성 완충액 3흡착제 부피를 사용하여 Q-세파로즈(조제용) 음이온 -교환체 겔 200cc를 함유하는 컬럼을 평형시켰다. 리터당 10그램의 농도를 얻기 위해, 아메리칸 시아나미드 컴퍼니(American Cyanamid Company)로부터의 동결 건조시킨 소의 소마토트로핀 20그램을 출발 완충액 2000cc 내에 환원시켰고, 95㎝-hr-1의 표면선형속도에서 컬럼상에 부하시켰다. 부하를 시작한 후 곧, 280mm에서 유출액의 흡수도를 검사하여 돌파점을 관찰했다. 돌파점이 한번 생길 때마다 유출액을 수집했다. 흡수도가 기준선까지 회복될 때까지 공급 용액을 출발 완충액과 동일한 조성물을 치환 세정했다. 부하상 뒤의 돌파점으로부터의 유출액을 치환 세정으로 부터의 유출액과 결합시켜 284cc의 총 부피를 얻었다. 결합유출액을 탈염시켰고, 10K 달통(Dalton) 커트오프 유공섬유 카아트리지를 사용하여 농축시켰고, 그리고 나서 동결건조시켰다.
본 실시예의 출발 물질은 모두 44K 또는 42K 달톤의 뚜렷한 분자량을 가진 비 환원 SDS-PAGE에 의해 110% 응집체를 포함했다. 상기 물질은, 소의 소마토트로핀 단량체 상이의 분자간 다이설파이드 브릿징에 의해 형성된 공유 이량체라고 여겨진다. 또한, 공유 이량체가 생물학적으로 활성임을 보여주었다. 크로마토그래피가 SDS-PAGE에 의해 0.2%이량체를 가진 후 물질을 얻었다. 크기-배제크로마토그래피(size-exclusion chromatography)에 의해 측정하였듯이 출발 및 크로마토그래피시킨 물질사이에 10%이상의 응집체 내지 1% 이하의 응집체 수준의 감소를 보였다. 단량체만의 기준으로 크로마토그래피 단계를 거친 nemr률은 84%였다. (즉, 공급물내 단량체 84%가 결합 유출액내에 회복되었다.) 첨가로, 물질의 생활성은, 방사-수용기 분석(radio-receptor assay)에 의해 측정했듯이, 표준의 92 내지101% 증가했다. 출발 물질과 크로마토그래피시킨 물질 사이의 분석적 비교 결과를 표1에 요약했다. 또한, 제1도는 비교를 위한, 출발 물질과 크로마토그래피시킨 물질에 대한 SDS-PAGE 겔 레인을 보여준다. 등전점 초점 조정을 출발 물질과 크로마토그래피시킨 물질 둘 다에 수행했다. 결과는(보여지지 않음), 크로마토그래피 단계로 인한 아미드 분해가 일어나지 않았음을 지지했다.
* SDS-PAGE = 나트륨 도데실술포네이트 폴리아크릴아미드 겔 전기이동 분석.
** 수퍼로즈 12 (조제용) = 겔 투과 크로마토그래피 분석.
주 : 모든 분석은 무수(moisutre-free) 기준으로 측정한다.
실시예 2
본 실시예는, 크기가 대략 40K 내지 100K 달톤 이상인 실제량의 응집체를 가진 비교적 조야한 단백질 용액을 크로마토그래피로 정제시키는데 사용되는 병류법을 기술한다.
정제시킨 물질은, 봉입체로부터 유도되고, 콜로이드와 매우 놓은 분자량의 불순물을 제거시키기 위해 한외여과를 적용시킨 소의 소마토트로핀 조 단백질 용액이었다. 아메리칸 시아나미드 컴퍼니 파일로트 공장 설비로부터 용액을 얻었다.
Q-세파로즈(조제용)음이온-교환체 135cc를 함유한 컬럼을, 실시예 1에 기술한 바와 같은 동일 완충액을 사용하여 평형시켰다. 피페리딘과 염화나트륨을 첨가하여, 100k 달톤 커트오프 유공섬유 한외여과기(아미콘)을 사용하여 앞서 한외여과시킨 조 단백질 용액을 출발 평형 완충액과 동일한 완충 염조성물로 넣었다. 용액의 단백질 농도는 4.71g/L 이었다. 컬럼을 3180cc의 용액으로 부하시켰고, 실시예 1에 기술한 바와같이 유출액을 수집했다. 공급용액을 실시예 1에 기술한 바와같은 치환 세정시켰다. 수집한 총 유출액 부피는 3489cc였다. 유출액을 탈염시키고, 농축시키고, 동결 건조시켜 11.4그램의 건조 중량을 생성시켰다.
겔투과 크로마토그래피(gpc)로 측정했듯이, 조단백질 용액은 19.2%의 응집체를 포함했다. 동결 건조시키고, 크로마토그래피시킨 물질은 gpc에 의하면 1%이하의 응집체와, SDS-PAGE에 의하면 0.3%의 올리고머를 포함했다. 제2도는 공급 용액 및 컬럼으로 부터의 동결건조시킨 유출액에 대한 gpc 크로마토그램을 보여준다.
실시예 3
본 실시예는 흡착/탈착 용리법을 사용하여 재결합 소의 소마토트로핀 시료를 크로마토그래피로 정제시키는데 사용되는 방법을 예증한다. 물질을 아메리칸 시아나미드 컴퍼니로부터 얻었고, SDS-PAGE로 측정해보니 10% 이상의 응집체를 포함했다.
본 실시예를 위해 1-cc 모노-Q(조제용)음이온-교환제 컬럼을 사용했다. 완충액은 20mM 피페리딘 (pH 11.5)으로 구성된 수성 완충액(A)와 20mM 피페리딘, 1000mM 염화나트륨(pH 11.5)으로 구성된 수성 완충액(B)였다. 컬럼을, 완충액(A)내 17% v/v의 완충액(B)를 사용하여 평형시키고 나서, 완충액(B)를 사용하여 평형시키고 나서, 완충액(A)내 소의 소마토트로핀 20mg/mL 용액 200 마이크로리터를 주입했다. 주입을 완충액(A)내 17% v/v/ 완충액(B) 5흡착제 부피로, 그리고 나서는, 완충액(A)내 17% 내지 47% v/v 완충액(B)의 선형 기울기 20흡착제부피로 수행했다. 마지막으로, 100%완충액(B)의 10흡착제 부피를 사용하여, 임의 강하게 흡착시킨 불순물을 용리시켰다.
염 기울기동안 세 개의 잘 표현된 피이크를 얻었다.(제3도를 보라). 기울기 출발 후에 짧게 나타나는 첫 번째 피이크(282초)가 가장 컸다. 두 번째 피이크는 첫 번째 피이크의 뒷전(trailing edge)상에 용융 피이크(345초)로서 나타났다. 세 번째, 첫 번째 두 개로부터 잘 분리되었다. 첨가로, 이소크레틱 100%완충액(B) 세정동안, 작은 피이크(796초)를 용리시켰다. 개개 피이크를 분리시켰고, SDS-PAGE로 조사했다. 첫 번째와 두 번째 피이크가 순수한 소의 소마토트로핀 단량체임이 밝혀졌다. 그러나, 세 번째 피이크는 소의 소마토트로핀 이량체와 더 높은 분자량의 올리고머로 구성되었다.
실시예 4
본 실시예는, 이미 부분적으로 정제시켰지만, 겔투과 크로마토그래피로 결정해보니, 22.4%응집체를 포함하는 재결합 세균으로부터 유도한 돼지의 소마토트로핀을 더 정제시키는데 사용되는 과정을 기술한다.
Q-세파로즈(조제용)음이온-교환체 겔 4.5L을 함유하는 컬럼을 실시예 1에 기술한 것과 동일한 과정에 따라 병류 모드에서 사용했다. 완충액 부피를 조절해서, 두 개 실시에 사이의 흡착제 부피에 차이를 조절한다. 아메리칸 시아나미드 컴퍼니로부터 얻은 동결건조시킨 재결합 돼지의 소마토트로핀 총 450그램을 출발 완충액 45L에서 환원시키고 나서, 컬럼에 공급했다. 유출액을 검사했고, 실시예 1에 기술한 바와 같이 수집했다. 앞서 실시예 1에서 기술한 바와같이, 치환 세정 유출액을 공급기 유출액과 결합시켰다. 벌크 결합된 유출액이, gpc에 의해 결정했듯이, 검출불가능한 량의 응집체를 포함함을 보였다.
Claims (10)
- 단량체 성장 호르몬-유사 물질이 매질로 흡수되지 않도록 하기에 충분한 농도의 단순염 및 pKa 약 11.5로 출발완충액 내에 매질을 평형시키고; 각각의 농도가 출발 완충액과 동일한 정도가 되도록 정제될 성장 호르몬-유사물질용액에 적정량의 완충액 및 단순염을 첨가시키고; 매질로 채워진 컬럼상에 성장 호르몬-유사물질 용액을 장입시키고, 출발 완충액을 사용하는 치환 세정으로부터, 그리고 공급 용액으로부터 병류 유출액을 수집하고; 고 염 및 / 또는 가성 알칼리 용액으로 컬럼 매질을 세정시켜 강하게 흡착시킨 종의 매질을 스트리핑시킨 다음 다음 주기를 위한 매질을 재생시키는 것으로 구성되는, 단량체 성장 호르몬-유사물질로부터 공유 및 비-공유 응집체를 분리시키는 강한 음이온 교환체-형 매질을 사용하는 병류 크로마토그래피법.
- 제1항에 있어서, 출발 완충액의 pH가 10.5이상이고, 단순염이 출발 완충액내 50-250mM 농도의 염화나트륨인 방법.
- 제2항에 있어서, 완충액이 피페리딘 또는 포스페이트 염인 방법.
- 제3항에 있어서, 성장호르몬-유사물질이 재조합 또는 뇌하수체 소 또는 돼지 소마토트로핀인 방법.
- 제4항에 있어서, 정제될 성장 호르몬-유사 물질 용액이 조야(불순물이 많음)하거나, 비교적 순수(불순물이 적음)한 방법.
- pKa 약 11.5 및 단순염의 적절한 농도로 출발 완충액내에 매질을 평형시키고; 각각의 농도가 출발완충액과 동일한 정도가 되도록 정제될 성장 호르몬-유사 물질 용액에 적정량의 완충액 및 단순염을 첨가시키고; 매질로 채워진 컬럼상에 성장 호르몬-유사물질 용액을 장입시키고 나서, 출발 완충액으로 치환세정하고; 이소크레틱(isocratic) 또는 기울기 방법을 사용하여 단량체 성장 호르몬-유사물질을 용리시키고; 적절한 완충액으로 매질을 세정하고, 재생성시켜 강하게 흡착된 종을 제거하고, 다음 주기를 위한 매질을 준비하는 것으로 구성되는, 단량체 성장 호르몬-유사물질로부터 공유 및 비-공유 응집체를 분리시키는 강한 음이온 교환체-형 매질을 적용하는 흡착/탈착 용리 크로마토그래피법.
- 제6항에 있어서, 출발 완충액의 pH가 10.5이상이고, 단순염이 50-1000mM 농도의 염화나트륨인 방법.
- 제7항에 있어서, 완충액이 피페리딘 또는 포스페이트 염인 방법.
- 제8항에 있어서, 성장 호르몬-유사 물질이 재조합 또는 뇌하수체 소 또는 돼지 소마토트로핀인 방법.
- 제9항에 있어서, 정제될 성장 호르몬-유사 물질 용액이 조야(불순물이 많음)하거나 비교적 순수(불순물이 적음)한 방법.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US26285588A | 1988-10-26 | 1988-10-26 | |
| US262,855 | 1988-10-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR900006011A KR900006011A (ko) | 1990-05-07 |
| KR0131872B1 true KR0131872B1 (ko) | 1998-04-11 |
Family
ID=22999350
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019890015390A KR0131872B1 (ko) | 1988-10-26 | 1989-10-25 | 성장 호르몬-유사물질로부터 응집체를 분리시키는 크로마토그래피법 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0365858B1 (ko) |
| JP (1) | JP2728524B2 (ko) |
| KR (1) | KR0131872B1 (ko) |
| AT (1) | ATE114668T1 (ko) |
| AU (1) | AU621676B2 (ko) |
| CA (1) | CA1339186C (ko) |
| DE (1) | DE68919647T2 (ko) |
| DK (1) | DK172576B1 (ko) |
| ES (1) | ES2064412T3 (ko) |
| FI (1) | FI95805C (ko) |
| IE (1) | IE66390B1 (ko) |
| IL (1) | IL91837A (ko) |
| NO (1) | NO177857C (ko) |
| NZ (1) | NZ231067A (ko) |
| PT (1) | PT92088B (ko) |
| ZA (1) | ZA898097B (ko) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3726655A1 (de) * | 1987-08-11 | 1989-02-23 | Hoechst Ag | Verfahren zur isolierung basischer proteine aus proteingemischen, welche solche basischen proteine enthalten |
| AU7877194A (en) * | 1993-09-22 | 1995-04-10 | American Cyanamid Company | Porcine somatotropin having enhanced stability; process for producing |
| DE10304066B4 (de) * | 2003-01-31 | 2007-01-18 | Henkel Kgaa | Verfahren zur Veredelung konzentrierter Enzymlösungen |
| CN104610422A (zh) | 2005-03-11 | 2015-05-13 | 惠氏公司 | 弱分配层析的方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BG49718A3 (en) * | 1983-07-15 | 1992-01-15 | Bio Technology General Corp | Method for preparing of polypeptid with superoxiddismutasne activitty |
| US4677196A (en) * | 1985-09-06 | 1987-06-30 | International Minerals & Chemical Corp. | Purification and activation of proteins from insoluble inclusion bodies |
| AT399095B (de) * | 1986-03-27 | 1995-03-27 | Vukovich Thomas Dr | Verfahren zur auftrennung von proteinen mittels gradientenelution und vorrichtung zur durchführung des verfahrens |
-
1989
- 1989-09-27 AT AT89117873T patent/ATE114668T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-09-27 ES ES89117873T patent/ES2064412T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-27 DE DE68919647T patent/DE68919647T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-09-27 EP EP89117873A patent/EP0365858B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-28 CA CA000614342A patent/CA1339186C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-09-29 IL IL9183789A patent/IL91837A/en not_active IP Right Cessation
- 1989-10-19 NZ NZ231067A patent/NZ231067A/en unknown
- 1989-10-24 PT PT92088A patent/PT92088B/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-10-25 ZA ZA898097A patent/ZA898097B/xx unknown
- 1989-10-25 DK DK198905308A patent/DK172576B1/da not_active IP Right Cessation
- 1989-10-25 FI FI895063A patent/FI95805C/fi not_active IP Right Cessation
- 1989-10-25 AU AU43774/89A patent/AU621676B2/en not_active Ceased
- 1989-10-25 JP JP1276175A patent/JP2728524B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-10-25 IE IE343789A patent/IE66390B1/en not_active IP Right Cessation
- 1989-10-25 NO NO894249A patent/NO177857C/no not_active IP Right Cessation
- 1989-10-25 KR KR1019890015390A patent/KR0131872B1/ko not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IE893437A1 (en) | 1991-05-08 |
| ES2064412T3 (es) | 1995-02-01 |
| IE893437L (en) | 1990-04-26 |
| CA1339186C (en) | 1997-07-29 |
| NO177857C (no) | 1995-12-06 |
| NO894249D0 (no) | 1989-10-25 |
| DE68919647T2 (de) | 1995-05-11 |
| EP0365858B1 (en) | 1994-11-30 |
| AU4377489A (en) | 1990-05-03 |
| JP2728524B2 (ja) | 1998-03-18 |
| NO177857B (no) | 1995-08-28 |
| DE68919647D1 (de) | 1995-01-12 |
| ATE114668T1 (de) | 1994-12-15 |
| AU621676B2 (en) | 1992-03-19 |
| DK530889A (da) | 1990-04-27 |
| NO894249L (no) | 1990-04-27 |
| FI895063A0 (fi) | 1989-10-25 |
| EP0365858A2 (en) | 1990-05-02 |
| NZ231067A (en) | 1992-07-28 |
| PT92088B (pt) | 1995-08-09 |
| KR900006011A (ko) | 1990-05-07 |
| DK530889D0 (da) | 1989-10-25 |
| FI95805C (fi) | 1996-03-25 |
| JPH02218690A (ja) | 1990-08-31 |
| FI95805B (fi) | 1995-12-15 |
| ZA898097B (en) | 1990-10-31 |
| IE66390B1 (en) | 1995-12-27 |
| DK172576B1 (da) | 1999-02-01 |
| PT92088A (pt) | 1990-04-30 |
| IL91837A (en) | 1995-06-29 |
| IL91837A0 (en) | 1990-06-10 |
| EP0365858A3 (en) | 1991-05-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0460426B1 (en) | Protein purification method | |
| DE602004006725T2 (de) | Reinigung von Antikörpern durch Protein A und Ionenaustauschromatographie | |
| US4894439A (en) | N-terminal derivatives of tumor necrosis factor purified by microporous PTFE membranes | |
| US20200283472A1 (en) | A process for purification of fc-fusion proteins | |
| Vogt et al. | Comparison of anion-exchange and hydroxypatite displacement chromatography for the isolation of whey proteins | |
| KR880000464A (ko) | 단백질의 정제 방법 | |
| KR0131872B1 (ko) | 성장 호르몬-유사물질로부터 응집체를 분리시키는 크로마토그래피법 | |
| UA92145C2 (en) | Purified lh | |
| Kågedal et al. | Chemical, physical and chromatographic properties of Superdex 75 prep grade and Superdex 200 prep grade gel filtration media | |
| EP0117470B1 (en) | Process for producing interferon (ifn-gamma) subtypes 26k and 21k | |
| US4988798A (en) | Method for recovering recombinant proteins | |
| JP3509104B2 (ja) | 塩基性線維芽細胞成長因子の精製プロセス | |
| CA1286843C (en) | Purification method for proteins | |
| US20020119539A1 (en) | Isolation of purified tgf -beta1 and tgf -beta2 from bone tissue | |
| KR101120130B1 (ko) | 피이지화 단백질의 응집물 수준을 감소시키기 위한 공정 | |
| JP3200850B2 (ja) | ヒトｂｃｄｆの精製法 | |
| US5109121A (en) | Method for recovering recombinant proteins | |
| CA2592014A1 (en) | Purified rhigf-i/rhigfbp-3 complexes and their method of manufacture | |
| AU759379B2 (en) | Novel factor IX purification methods | |
| Gu | Purification techniques for human growth hormone (hGH) and an hGH antagonist | |
| JPH013198A (ja) | インターリューキン−２の精製方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20011023 Year of fee payment: 5 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |