NO177857B - Fremgangsmåte for reduksjon av aggregatinnholdet i veksthormonliknende materialer - Google Patents

Description

x

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte ved gjennomstrømningskromatografi eller absorbsjons/desorbsjons-eluerings-kromatografi som anvender et sterkt anionbyttermedium for separasjon av kovalente og ikke-kovalente aggregater fra monomert veksthormonlignende materiale, hvilken omfatter: ekvilibrering av mediet i en utgangsbuffer basert på et materiale med en pKa nær 11,5 og en passende konsentrasjon av et enkelt salt - i tilfellet gjennomstrømnings-kromatografi, slik at det monomere veksthormonlignende materialet ikke absorberes til mediet; tilsetning av den riktige mengde av buffermaterialet og det enkle salt til den veksthormonlignende løsningen som skal renses, slik at konsentrasjonen av hver er den samme som i utgangsbufferen, påsetting av den veksthormonlignende materialløsning og en kolonne pakket med mediet,

ved gjennomstrømningskromatografi

a) oppsamling av gjennomløpseffluenten fra påsettingsløs-ningen og fra en fortrengningsvask ved bruk av utgangsbuf feren,

eller ved absorbsjons/desorbsjons-elueringskromatografi,

b) etterfulgt av en fortrengningsvask med startbufferen; eluering av det monomere veksthormonlignende materialet

ved bruk av en isokratisk eller gradient-metodikk; og oppsamling av den gjennomstrømmede effluent fra den påsatte løsning og fra en fortrengningsvask ved bruk av

utgangsbufferen;

og vasking av kolonnemediet med sterke salt- og/eller kaus-tikkløsninger etter a), eller egnede buffere etter b), for å fortrenge de sterkt absorberte produkter fra mediet og deretter regenerere mediet for den neste syklus.

EP-A-0218374 beskriver en fremgangsmåte for rensing og aktivering av proteiner som fremstilles som uløselige, biologisk inaktive inklusjonslegemer i mikroorganismer som er blitt transformert med rekombinante DNA-ekspresjonsvektorer for å styre ekspresjon av proteinet som er av interesse. EP-A-0131843 beskriver en fremgangsmåte for å rense et veksthormon fremstilt ved DNA-teknologi ved bruk av bl.a. en gel-

filtreringskolonne.

Ingen av disse patentpublikasjoner angir bruk av anion-byttermedier i pH-området 11,3-11,7 for rensing av monomert vektshormonlignende materiale.

Det vises nå til tegningene.

Fig. 1 er SDS-PAGE av utgangsmateriale (felt 1) og krornatografert materiale (felt 2) under anvendelse av metodikken ifølge Eksempel 1. Fig. 2 er gel-gjennomtrengnings-kromatogrammer hvor det er anvendt en Superose 6 - 4/7/89 KMM JWS 9/8/89 - (Pharmacia)-kolonne. Topp-kromatogrammet er tilførselsoppløsningen, mens bunn-kromatogrammet er den lyofiliserte utløpsstrøm fra anionebytteren som beskrevet i Eksempel 2. Fig. 3 er kromatogrammet som fås ved anvendelse av elue-ringsmetoden som er beskrevet i Eksempel 3. Den anvendte kolonne var 1 cm<2> fyllmassevolum Mono-Q-anionebytter (Pharmacia).

Rekombinant DNA-teknologi har gjort det mulig å frem-stille store mengder proteiner for potensielle kommersielle anvendelser som tidligere var usannsynlig på grunn av den begrensede tilgjengelighet når det gjaldt slike proteiner fra naturlige kilder. Imidlertid er proteinene produsert av mikroorganismer som er blitt genetisk manipulert, ofte ikke riktig foldet, og er således biologisk inaktive.

I det siste har det kommet flere beskrivelser angående utvinning, isolasjon og solubilisering av inklusjonslegeme-proteiner fra bakterier. Formålet med disse har vært å beskrive fremgangsmåter som maksimaliserer omdannelsen av denaturert uløselig protein til den riktig foldede, monomere, biologisk aktive form. Feilaktig foldede ikke-kovalente aggregater eller kovalente oligomerer oppstår under solubili-seringen og renatureringen som følge av disse. Slike produkter er ikke biologisk aktive og må separeres fra det ønskede bioaktive monomere protein.

Det er følgelig formålet med denne oppfinnelse å tilveiebringe en effektiv fremgangsmåte (fremgangsmåter) for separasjon av disse biologisk inaktive aggregat- og/eller oligomer-

forurensninger fra det monomere bioaktive protein.

Denne oppfinnelse beskriver en effektiv og økonomisk fremgangsmåte (fremgangsmåter) for separasjon av forurensninger med høy molekylvekt fra monomere veksthormonliknende materialer. Forurensningene med høy molekylvekt kan være resultatet av intermolekylær kovalent binding eller ikke-kovalent sammenbinding. Den beskrevne kromatografiske fremgangsmåte (fremgangsmåter) separerer effektivt slike kovalente eller ikke-kovalente aggregater som er biologisk inaktive, fra det monomere bioaktive protein.

Den innledningsvis omtalte fremgangsmåten er særpreget ved at fremgangsmåten utføres med en pH i løsningen på 11,3 - 11,7, og det enkle salt er natriumklorid i en konsentrasjon på 50 - 1000 mM i utgangsbufferen.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendes det en kromatografisk fremgangsmåte (fremgangsmåter) basert på separasjon ved ioniske mekanismer, d.v.s. ionebytterkromatografi, som er meget mer effektivt og økonomisk enn konvensjonelle metoder for separering av aggregater fra monomer såsom gelgjennomtrengningskromatografi. Fordelene ved ionebytterkromatografi innbefatter høyere proteinmengde pr. medie-volumenhet, høyere lineær hastighet gjennom mediet uten tap av oppløsning eller overdrevent mottrykk, og evnen til fjerning av bakterievertsforurensninger såsom endotoksiner.

De første tre forannevnte fordeler resulterer i kapital- og driftsomkostnings-besparelser for et fremstillingsanlegg i kommersiell målestokk ved reduksjon av utstyrsstørrelsen og mengden kromatografisk medium som er nødvendig for en fastsatt fremstillingshastighet. Den sist angitte fordel gjør mulig eliminering av en separat enhetsoperasjon ved at to opera-sjoners funksjoner kombineres til én.

Materialet som fremstilles ved den beskrevne kromatografiske fremgangsmåte (fremgangsmåter), inneholder meget små mengder aggregat-forurensninger. Liknende renheter kan oppnås ved omfattende bearbeidelse ved kjente teknikker. Det er formålet med denne oppfinnelse å tilveiebringe et meget mer effektivt og billig alternativ til fremstilling av. materialer som hovedsakelig består av bioaktivt monomert protein. Fordelene ved oppfinnelsen for et produksjonsanlegg i kommersiell målestokk vil lett kunne forstås av fagfolk på området ut fra følgende beskrivelse og eksempler.

I denne beskrivelse angir betegnelsen "veksthormonliknende materiale" (1) animalsk veksthormon selv, derivater, analoger og fragmenter av dette av hvilken som helst type, for eksempel humane, bovine eller fra gris; (2) forløpere for veksthormon, som redusert (-SH)-veksthormon og S-beskyttet veksthormon, for eksempel veksthormon-S-sulfonat; (3) vari-anter av veksthormon eller dets forløpere, for eksempel strukturer som er blitt modifisert for forlengelse og/eller forkortelse av veksthormon-aminosyresekvensen, for eksempel 20K-varianten av humant veksthormon, humant metionylvekst-hormon og liknende; og (4) analoger til veksthormon eller dets forløpere, for eksempel strukturer hvor veksthormon-aminosyresekvensen er blitt modifisert ved erstatning av én eller flere aminosyrerester.

Denne oppfinnelse beskriver kromatografisk(e) fremgangsmåte (r) for anvendelse for separasjon av aggregater av veksthormonliknende materialer fra det ønskede bioaktive monomere materiale. Tidligere beskrivelser har fyllest-gjørende beskrevet gjenvinning, isolasjon og solubilisering av inklusjonslegemer fra vertsbakterien. På grunn av de uunn-gåelige mangler ved solubiliseringsmetoden fremstilles en del feilaktig foldede ikke-kovalente aggregater eller kovalente oligomerer med den ønskede monomer. Ultrafiltrering kan anvendes for fjerning av kolloider og forurensninger med meget høy molekylvekt; imidlertid passerer en vesentlig mengde aggregat vanligvis gjennom ultrafilteret med monomeren. Dette ultrafiltrat kan med fordel renses ved følgende kromatografiske fremgangsmåte.

Fagfolk på området vil være klar over at betegnelsen "sterk ionebytter" angir harpikser med kationiske grupper som beholder sin positive ladning ved forholdsvis høy pH, f.eks. over pH 9,0. De kationiske grupper som er festet til bæreren, kan velges blant kvaternære ammoniumgrupper såsom -CH2CH2N+(CH2CH3)2CH2CH(OH) CH3. Som eksempler på passende kommersielt tilgjengelige anionebytterharpikser for anvendelse ved utførelse av oppfinnelsen, kan nevnes QAE-Sephadex A-25, QE-52-cellulose, Cellex QAE, Q-Sepharose, 9/8/89 KMM JMS 9/8/89 og Mono-Q.

Det anvendte ionebyttermedium er en sterk anionebytter-type såsom, men ikke begrenset til, Q-Sepharose (Pharmacia). Mediet pakkes i en vanlig kromatografikolonne som er en del av en typisk kromatografisystem-pakke som består av pumper, buffer-reservoarer, UV-detektor og fraksjonskollektor. Mediet ekvilibreres i en vandig utgangsbuffer som består av piperidin eller et annet egnet bufringsmiddel med liknende pKa, ved en konsentrasjon på 20 mM, og natriumklorid, eller et liknende enkeltsalt, ved en konsentrasjon på 50-250 mM. Den fore-trukkede pH i oppløsningen er 11,3-11,7, og mer eller mindre piperidin kan anvendes for oppnåelse av den ønskede pH i utgangsbufferen. Tre fyllmassevolumer buffer er vanligvis passende for å sikre ekvilibrering.

Oppløsningen som inneholder det løselige monomere veksthormonliknende materiale og forurensninger, i det foreliggende omtalt som påsettingsoppløsningen, bringes til samme piperidin- og natriumkloridkonsentrasjon som utgangsbufferen. pH justeres for oppnåelse av det ønskede resultat ved til-setting av mer piperidin hvis nødvendig. Påsettings-oppløsningen påsettes så på kolonnen ved en overflatehastighet på opp til 300 cm/time inntil 50-150 gram protein er blitt påsatt pr. liter medium. Utløpsstrømmen overvåkes ved absorbans ved 280 nm, og fraksjoner oppsamles straks det skjer en stigning av basislinjen. Påsettingsoppløsningen følges av 3-6 fyllmassevolumer av utgangsbufferen inntil basislinjen nås igjen. Alle fraksjoner som oppsamles fra begynnelses-gjennombrytningen inntil basislinjen nås, blandes. Kolonnen kan regenereres for ytterligere anvendelse ved at den vaskes med egnede buffere for fjerning av sterkt bundne forurensninger og re-ekvilibrering i utgangsbufferen.

Det er blitt vist at den monomere form av det veksthormonliknende materiale ikke bindes til de aktive ione-bytterseter på mediet, men strømmer i stedet gjennom kolonnen og gjenvinnes i utløpsstrømmen. Imidlertid bindes aggregat-forurensningene til kolonnen og holdes tilbake inntil et passende fortrengningsmiddel anvendes til eluering av dem.

I tillegg til gjennomstrømnings-fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, er det blitt vist at en kromatografisk adsorpsjons-/desorpsjons-elueringsfremgangsmåte også er effektiv for separasjon av aggregat-forurensninger fra monomert veksthormonliknende materiale. Elueringskromatografi-fremgangsmåten er imidlertid mindre effektiv ved liknende proteinmengder pr. volumenhet medium. Ved lavere proteinmengder er den ikke desto mindre en gjennomførbar fremgangsmåte for separasjon av monomer fra aggregater.

Ionebyttermediet og tilhørende utstyr som anvendes for elueringskromatografi-fremgangsmåten, er det samme som for gjennomstrømnings-fremgangsmåten. De anvendte buffere er vandig buffer (A) som består av 20 mM piperidin, eller et annet egnet bufringsmiddel med en liknende pKa, for oppnåelse av en pH på 11,3-11,7, og vandig buffer (B) som består av 20 mM piperidin og 1000 mM natriumklorid, eller et liknende enkeltsalt. Kolonnen ekvilibreres først under anvendelse av 17 volum% av buffer (B) i buffer (A). Tre fyllmassevolumer er vanligvis tilstrekkelig for å sikre ekvilibrering. For det annet bringes påsettingsoppløsningen som består av løselig monomert veksthormonliknende materiale og forurensninger, til samme sammensetning som for buffer (A) og føres så til kolonnen inntil 5-15 gram protein er blitt påsatt pr. liter medium. Dette følges av en fortrengningsvask som består av fem fyllmassevolumer av 17 volum% av buffer (B) i buffer (A). Elueringen utføres under anvendelse av 20 fyllmassevolumer av en lineær gradient, som starter med 17 volum% av buffer (B) i buffer (A), til 47 volum% av buffer (B) i buffer (A). Eluatet overvåkes ved absorbans ved 280 nm, og fraksjoner oppsamles. Til slutt anvendes ti fyllmassevolumerr av buffer (B) til avdrivning av kolonnen for eventuelt sterkt adsorberte elementer. Kolonnen kan så regenereres for videre anvendelse ved ytterligere vaskinger med egnede buffere for fjerning av andre sterkt bundne forurensninger og re-ekvilibrering med utgangsbuf feren.

Det er blitt vist at den monomere form av det veksthormon-liknende materiale elueres tidlig i løpet av eluerings-saltgradienten og at aggregat-forurensningene elueres senere i gradienten med basislinje-oppløsning mellom de to topper.

De ovenfor beskrevne kromatografiske fremgangsmåter er blitt vist å være effektive for separasjon av monomer fra aggregat-forurensninger under anvendelse av forholdsvis ubearbeidede proteinoppløsninger, d.v.s. høye nivåer av forurensninger i forhold til den ønskede monomer. Fremgangsmåtene er også, som man vil kunne forestille seg, blitt anvendt med hell for ytterligere rensing eller bearbeidelse av forholdsvis rene proteinoppløsninger som allerede har vært gjennom flere rensetrinn. Gjennomstrømnings-fremgangsmåten er særlig egnet for økonomisk bearbeidelse av allerede renset protein som kan inneholde aggregatnivåer som bare er litt høyere enn spesifikasjonen.

Følgende eksempler er ment ytterligere å illustrere utførelsen av oppfinnelsen.

Eksempel 1

Dette eksempel beskriver gjennomstrømnings-metodikken anvendt for ytterligere rensing eller bearbeidelse ("rework") av bovint somatotropin som stammer fra rekombinante bakterier som allerede er blitt delvis renset, men inneholder en stor mengde aggregat.

En kolonne som inneholdt 200 cm<3> anionebyttergel av typen Q-Sepharose (Pharmacia), ble ekvilibrert under anvendelse av tre fyllmassevolumer av vandig utgangsbuffer som besto av 20 mM piperidin og 150 mM natriumklorid, med en pH på 11,5. 20 gram lyofilisert 9/8/89 JMS KMM rekombinant 9/8/89 bovint somatotropin fra American Cyanamid Company ble rekondisjonert i 2000 cm3 utgangsbuffer under oppnåelse av en konsentrasjon på 10 gram pr. liter og påsatt på kolonnen ved en lineær overflatehastighet på 95 cm/time. Like etter at påsettingen startet, ble gjennombryting observert ved overvåking av absorbansen for utløpsstrømmen ved 280 nm. Utløpsstrømmen ble oppsamlet straks gjennombrytingen skjedde. Påsettings-oppløsningen ble fulgt av en fortrengningsvaskevæske med samme sammensetning som utgangsbufferen inntil absorbansen var kommet tilbake til basislinjen. Utløpsstrømmen fra påsettingsfasen etter gjennombryting ble blandet med utløps-strømmen fra fortrengningsvaskingen, under oppnåelse av et totalt volum på 2840 cm<3>. Den blandede utløpsstrøm ble avsaltet og konsentrert under anvendelse av en hulfiberpatron med en utelukkelse på 10K Dalton, og deretter lyofilisert.

Utgangsmaterialet i dette eksempel inneholdt 11% aggregat ved ikke-reduserende SDS-PAGE, som alt hadde en tilsynelatende molekylvekt på 44 K eller 42 K Dalton. Dette materiale antas å være kovalent dimer dannet ved intermolekylær disulfid-brodannelse mellom bovine somatotropin-monomerer. Det er også blitt vist at den kovalente dimer ikke er biologisk aktiv. Materialet som ble oppnådd etter kromatografi, hadde 0,2% dimer ved SDS-PAGE. Aggregat-nivået, målt ved størrelses-utelukkelseskromatografi, viste også en reduksjon fra over 10% aggregat til mindre enn 1% mellom utgangs- og kromatografert materiale. På bare monomerbasis var utbyttet gjennom kromatograf itrinnet 84%, d.v.s. at 84% av monomeren i tilførsels-materialet ble gjenvunnet i den blandede utløpsstrøm. I tillegg ble materialets bioaktivitet øket fra 92 til 101% av standardverdien målt ved en radioreseptoranalyse. Resultatene av en analytisk sammenlikning mellom utgangsmaterialet og det kromatograf erte materiale er oppsummert i Tabell I. Fig. 1 viser også SDS-PAGE-gelfeltene for utgangsmaterialet og det kromatograferte materiale til sammenlikning. Isoelektrisk fokusering ble utført både for utgangsmaterialet og det kromatograferte materiale. Resultatene (ikke vist) viste at det ikke hadde funnet sted noen deamidering på grunn av kromatograf itrinnet.

<*>SDS-PAGE = natriumdodekylsulfonat-polyakrylamidgel-elektroforese-analyse

Superose 12 (Pharmacia) = gelgjennomtrengningskromatografi-analyse

Bemerk: Alle analyser er beregnet på fuktighetsfri basis.

Eksempel 2

Dette eksempel beskriver gjennomstrømnings-metodikken anvendt for kromatografisk rensning av en forholdsvis ubearbeidet proteinoppløsning som har en vesentlig mengde aggregat i størrelsesområdet fra ca. 40 K til over 100 K Dalton.

Materialet som skulle renses, var ubearbeidet proteinopp-løsning av rekombinant 9/8/89 JMS KMM 9/8/89 bovint somatotropin som stammet fra inklusjonslegemer og som var blitt underkastet ultrafiltrering for fjerning av kolloider og forurensninger med meget høy molekylvekt. Oppløsningen ble levert fra American Cyanamid Companys pilotanlegg.

En kolonne som inneholdt 135 cm<3> anionebytter av typen Q-Sepharose (Pharmacia), ble ekvilibrert under anvendelse av samme buffer som beskrevet i Eksempel 1. Den ubearbeidede proteinoppløsning som tidligere var blitt ultrafiltrert under anvendelse av et hulfiber-ultrafilter (Amicon) med en utelukkelse på 100 K Dalton, ble brakt til samme buffersalt-sammensetning som utgangs-ekvilibreringsbufferen ved tilsetning av piperidin og natriumklorid. Oppløsningens proteinkonsentrasjon var 4,71 g/l. Kolonnen ble påsatt 3180 cm3 oppløsning, og utløpsstrømmen ble oppsamlet som beskrevet i Eksempel 1. Påsettingsoppløsningen ble fulgt av en fortreng-nings-vasking som beskrevet i Eksempel 1. Det totale volum av oppsamlet utløpsstrøm var 3489 cm<3>. Utløpsstrømmen ble avsaltet, konsentrert og lyofilisert hvorved man fikk en tørrvekt på 11,4 gram.

Den ubearbeidede proteinoppløsning inneholdt 19,2% aggregat målt ved gelgjennomtrengningskromatografi (gpc). Det lyofiliserte kromatograferte materiale inneholdt mindre enn 1% aggregat målt ved gpc og 0,3% oligomer målt ved SDS-PAGE.

Fig. 2 viser gpc-kromatogrammene for påsettingsoppløsningen og den lyofiliserte utløpsstrøm fra kolonnen.

Eksempel 3

Det foreliggende eksempel illustrerer fremgangsmåtene som anvendes for kromatografisk rensing av en prøve av rekombinant bovint somatotropin under anvendelse av adsorpsjons-/desorpsjons-elueringsmetoden. Materialet ble levert fra American Cyanamid Company og inneholdt mer enn 10% aggregat målt ved SDS-PAGE.

En 1 cm<3> anionebytterkolonne av typen Mono-Q (Pharmacia) ble anvendt for det foreliggende eksempel. Bufferne var vandig buffer (A) som besto av 20 mM piperidin, pH 11,5, og vandig buffer (B) som besto av 20 mM piperidin, 1000 mM natriumklorid, pH 11,5. Kolonnen ble ekvilibrert under anvendelse av 17 volum% av buffer (B) i buffer (A), og deretter ble 200 mikroliter av en 20 mg/ml oppløsning av bovint somatotropin i buffer (A) injisert. Injiseringen ble fulgt av fem fyllmassevolumer av 17 volum% av buffer (B) i buffer (A) og deretter av 20 fyllmassevolumer av en lineær gradient fra 17 til 47 volum% av buffer (B) i buffer (A). Endelig ble det anvendt ti fyllmassevolumer av 100% buffer (B) for eluering av eventuelle sterkt adsorberte forurensninger.

De vel-definerte topper ble oppnådd i løpet av saltgra-dienten (se Fig. 3). Den første topp (282 sekunder), som kom tilsyne like etter starten av gradienten, var den største. Den annen kom tilsyne som en sammensmeltet topp (345 sekunder) på den bakre kant av den første. Den tredje topp (531 sekunder) var godt atskilt fra de første to. Dessuten ble det eluert en liten topp (796 sekunder) i løpet av vaskingen med

den isokratiske 100% buffer (B).

De individuelle topper ble isolert og undersøkt ved SDS-PAGE. Den første og annen topp ble funnet å være ren bovin somatotropin-monomer. Den tredje topp besto imidlertid av bovin somatotropin-dimer og oligomerer med høyere molekylvekt.

Eksempel 4

Dette eksempel beskriver detaljert fremgangsmåtene som ble anvendt for ytterligere rensing av grise-somatotropin som stammet fra rekombinante bakterier som allerede var blitt delvis renset, men inneholdt 22,4% aggregat bestemt ved gelgj ennomtrengningskromatografi.

En kolonne som inneholdt 4,5 1 anionebytter-gel av typen Q-Sepharose (Pharmacia), ble anvendt ved gjennomstrømnings-metoden ifølge samme fremgangsmåter som er beskrevet i Eksempel 1. Buffervolumer ble justert for tilpasnsing av forskjellen i fyllmassevolumer mellom de to eksempler. Totalt 450 gram lyofilisert rekombinant grise-somatotropin levert fra American Cyanamid Company ble regenerert i 45 1 av utgangsbuf feren og deretter tilført til kolonnen. Utløpsstrømmen ble overvåket og oppsamlet som beskrevet i Eksempel 1. Fortreng-ningsvaskings-utløpsstrømmen ble blandet med tilførsels-strøm-periode-utløpsstrømmen som beskrevet detaljert i Eksempel 1.

Den blandede hoved-utløpsstrøm viste seg å inneholde en ikke-påvisbar mengde av aggregat som bestemt ved gpc.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte ved gjennomstrømningskromatografi eller absorbsjons/desorbsjons-eluerings-kromatografi som anvender et sterkt anionbyttermedium for separasjon av kovalente og ikke-kovalente aggregater fra mono-mert veksthormonlignende materiale, hvilken omfatter: ekvilibrering av mediet i en utgangsbuf f er basert på et materiale med en pKa nær 11,5 og en passende konsentrasjon av et enkelt salt - i tilfellet gjennom-strømningskromatograf i, slik at det monomere veksthormonlignende materialet ikke absorberes til mediet; tilsetning av den riktige mengde av buffermaterialet og det enkle salt til den veksthormonlignende løsningen som skal renses, slik at

konsentrasjonen av hver er den samme som i utgangsbufferen, påsetting av den veksthormonlignende materialløsning og en kolonne pakket med mediet, ved gj ennomstrømningskromatografi a) oppsamling av gjennomløpseffluenten fra påsettingsløs-ningen og fra en fortrengningsvæske ved bruk av utgangsbuf feren, eller ved absorbsjons/desorbsj ons-elueringskromatografi, b) etterfulgt av en fortrengningsvask med startbufferen; eluering av det monomere veksthormonlignende materialet ved bruk av en isokratisk eller gradient-metodikk; og oppsamling av den gjennomstrømmede effluent fra den påsatte løsning og fra en fortrengningsvask ved bruk av utgangsbuf feren; og vasking av kolonnemediet med sterke salt- og/eller kaus-tikkløsninger etter a), eller egnede buffere etter b), for å fortrenge de sterkt absorberte produkter fra mediet og deretter regenerere mediet for den neste syklus,karakterisert ved at fremgangsmåten utføres med en pH i løsningen på 11,3 - 11,7, og det enkle salt er natriumklorid i en konsentrasjon på 50 - 1000 mM i utgangsbuf feren.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at buffermaterialet er piperidin eller et fosfatsalt.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2,karakterisert ved at det veksthormon-lig-nende materiale er rekombinant somatotropin eller storfe-eller svine-hypofyse-somatotropin.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3,karakterisert ved at løsningen av veksthormon-lignende materiale som skal renses er rått (høye nivåer av forurensninger) eller relativt rent (lave forurensnings-nivåer) .