JP2728524B2 - 生長ホルモン様物質の集合体を減少する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、強アニオン交換樹脂媒体を、11.5付近のpK
a及び単量体生長ホルモン様物質を該媒体に吸着せしめ
ない十分な量の単純な塩を含む出発緩衝剤種中で平衡化
させ；それぞれの濃度が出発緩衝剤と同一であるように
適当な量の緩衝剤種及び単純な塩を精製すべき生長ホル
モン様物質の溶液に添加し；生長ホルモン様物質の溶液
を媒体を充填したカラムに負荷し、そして原料溶液から
及び出発緩衝剤を用いる置換洗浄液からの通流流出物を
集め（流出物は単量体生長ホルモン様物質を含有す
る）；そして カラムの媒体を高塩及び／又は苛性溶液で洗浄して強く
吸着された種を媒体から除去し、次いで次のサイクルの
ために該媒体を再生する、 ことを含んでなる共有及び非共有結合の集合体を単量体
生長ホルモン様物質から分離するために該アニオン交換
樹脂型媒体を用いる通流クロマトグラフィー法に関す
る。

更に本発明は、強アニオン交換樹脂型媒体を、11.5付
近のpKa及び適当な濃度の単純な塩を含む出発緩衝剤種
中で平衡化させ；それぞれの濃度が出発緩衝剤と同一で
あるように適当な量の緩衝剤種及び単純な塩を精製すべ
き生長ホルモン様物質の溶液に添加し；生長ホルモン様
物質の溶液を該媒体を充填したカラムに負荷し、続いて
出発緩衝剤で置換洗浄し；単量体生長ホルモン様物質を
一定又はグラジエント法で流出させ；そして該媒体を強
く吸着された種を除去するために適当な緩衝剤で洗浄し
且つ再生し、次のサイクルに対して媒体を準備する、こ
とを含んでなる共有及び非共有集合体を単量体生長ホル
モン様物質から分離するために該強アニオン交換樹脂型
媒体を用いる吸着／脱着流出クロマトグラフィー法に関
する。

要するに本発明によれば、生長ホルモン様物質の集合
体量をかなり減ずる該物質のクロマトグラフィー精製法
が開示される。本方法は集合体（aggregate）不純物を
減ずるために使用されている現存法に対する非常に効率
よい且つ安価な代替法である。

第１図は実施例１の方法を用いる出発物質（レーン
１）及びクロマトグラフィーで処理した物質（レーン
２）のSDS−ページ（PAGE）である。

第２図はスーパーローズ（Superose）６（ファーマシ
ア）のカラムを用いるゲル・パーミエーション・クロマ
トグラフィーである。上のクロマトグラムは原料溶液で
あり、一方下は実施例２に記述したようなアニオン交換
樹脂からの凍結乾燥した流出物である。

第３図は実施例３に記述した流出法を用いて得たクロ
マトグラフである。用いたカラムはモノ（Mono）−Ｑア
ニオン交換樹脂（ファーマシア）1ccの容量のカラム床
であった。

組換えDNA技術は、天然起源からのそのような蛋白質
の入手性が限定されていて従来可能でなかった潜在的な
商業的適用のために多量の該蛋白を製造することを可能
にした。しかしながら遺伝子操作した微生物の産生する
蛋白質はしばしば正しく表現されず、斯くして生物学的
に不活性である。

最近封入体蛋白質の、バクテリヤからの回収、単離及
び可溶化に関していくつかの開示がある。これらの開示
の目的は、変性された不溶性の蛋白質を、適切に転写さ
れた単量体の生物学的に活性な形態に転化するのを最大
にする方法を記述している。回避できないことに、可溶
化及び再自然化の過程では不適当に転写された非共有結
合の集合体又は共有結合したオリゴマーが生成する。こ
れらの生成物は生物学的に活性でなく、所望の生物活性
単量体蛋白質から分離しなければならない。

従って本発明の目的はこれらの生物学的に不活性な集
合体及び／又はオリゴマー不純物を単量体の生物活性蛋
白質から分離するための効率的な方法を提供することで
ある。

本発明は高分子量の不純物を単量体の生長ホルモン様
蛋白質から分離するための効率良い且つ経済的な方法を
開示する。高分子量の不純物は分子間の共有結合又は非
共有結合による会合の結果であってよい。本クロマトグ
ラフィー法は、生物学的に不活性であるそのような共有
結合又は非共有結合による集合体を単量体の生物活性蛋
白質から効率良く分離する。

本発明の方法は、集合体を単量体から分離するゲル・
パーミェーション・クロマトグラフィーのような通常の
手段よりもかなり効果的且つ経済的であるイオン機構、
即ちイオン交換クロマトグラフィーに基づくクロマトグ
ラフィー法を利用する。イオン交換クロマトグラフィー
の利点は、媒体の単位容量当りの蛋白質の高負荷量、分
割の損失又は過度な背圧なしに媒体を通過する高線速
度、及びバクテリア宿主の不純物例えば内毒素を除去す
る能力を含む。最初の３つの上述した利点は装置の大き
さを減じ且つ一定の生産速度に必要とされるクロマトグ
ラフィー媒体の量を少くすることによって商業的規模の
生産装置に対して投下資本及び運転費の節約をもたら
す。最後に言及した利点は、２つの操作機能を１つに組
合せることによって分離の単位操作を排除せしめる。

開示するクロマトグラフィー法によって製造される物
質は集合体不純物を非常に少量でしか含有しない。同様
の純度は公知の技術によると厳しい過程を経て達成する
ことが可能である。本発明の目的は、宿主に生物活性な
単量体蛋白質からなる物質を得るための非常に効率良い
且つ安定な代替法を提供することである。商業的規模の
生産装置に対する本発明の利点は以下の記述及び実施例
から同業者は容易に理解するところである。

本明細書の目的に対して、ここに用いる如き「生長ホ
ルモン様物質」とは、（１）種を問わない例えば人間、
牛又は豚の動物生長ホルモンそれ自体、その誘導体、同
族体及びフラグメント；（２）生長ホルモンへの前駆物
質例えば還元された（−SH）生長ホルモン及びＳ−保護
生長ホルモン例えば生長ホルモンＳ−スルホネート；
（３）生長ホルモンの変種又はその前駆物質例えば生長
ホルモンのアミノ酸シーケンスを長く／又は短くして改
変した構造体、例えば人間の生長ホルモンの20K変種、
メチオニル人間生長ホルモンなど；及び（４）生長ホル
モンの同族体又はその前駆物質、例えば生長ホルモンの
アミノ酸シーケンスが１つ又はそれ以上のアミノ酸残基
の置換によって改変される構造体、を示す。

本発明は生長ホルモン様物質の集合体を所望の生物活
性単量体物質から分離するために使用しうるクロマトグ
ラフィー法の記述に関する。従来の開示は宿主バクテリ
アからの封入体の回収、分離、及び可溶化を適当に記述
している。この可溶化法の避けがたい効率の悪さのため
に、いくらかの不適切に転写された非共有結合の集合体
又は共有結合によるオリゴマーが所望の単量体と共に生
成する。コロイド及び非常に高分子量の不純物を除去す
るために限外過が使用できるが、普通実質的な量の集
合体は単量体と共に限外過膜を通過する。この限外
過液は有利には次のクロマトグラフィー法によって生成
しうる。

同業者は、「強アニオン交換樹脂」が、その正荷電を
比較的高いpH、例えばpH9.0以上に維持するカチオン性
基を有する樹脂に関するものであることを認識しよう。
支持体に結合するカチオン性基は四級アンモニウム基例
えば−CH₂CH₂N⁺(CH₂CH₃)₂CH₂CH(OH)CH₃から選択するこ
とができる。本発明の実施に対して用いるための適当な
市販のアニオン交換樹脂の例としては、QAE−セファデ
ックス（Sephadex）Ａ−25、QE−52セルロース、セレッ
クス（Cellex）QAE、Ｑ−セファローズ（Sepharose）及
びモノ（Mono）−Ｑを挙げることができる。

使用されるイオン交換体は、強アニオン交換樹脂型、
例えばＱ−セファローズ（ファーマシア）であるが、こ
れに限定されるものではない。この媒体は、ポンプ、緩
衝剤受器、UV検出器、及び画分捕集器からなる典型的な
クロマトグラフィー系の一部である通常のクロマトグラ
フィーのカラムに充填される。次いでこの媒体を、20mM
の程度のピペリジン又は同様のpKaの適当な緩衝剤及び5
0〜250mMの塩化ナトリウム又は同様の塩からなる適当な
出発緩衝剤中で平衡化させる、この溶液の好適なpHは1
1.3〜11.7であり、多かれ少なかれピペリジンを用いて
出発緩衝剤の所望のpHを達成する。普通床容量の３倍の
緩衝剤は平衡を保証するのに適当である。

生長ホルモン様物質及び不純物を含有する、ここでは
原料溶液として言及される溶液は出発緩衝剤と同一のピ
ペリジン及び塩化ナトリウムの濃度にせしめられる。こ
のpHは必要ならばより多くのピペリジンを添加すること
によって所望の結果が得られるように調節される。次い
で原料溶液を、媒体１当り蛋白質50〜150gが負荷され
るまで、300cm/時の線速度でカラムに負荷させる。流出
液を280nmの吸光度で監視し、ベースラインから立ち上
ってきた時に画分を集める。そしてベースラインが再び
回復されるまで床容量の３〜６倍の出発緩衝剤によって
原料溶液を処置する。最初の流出からベースラインの回
復までに集められたすべての画分を一緒に貯蔵する。こ
のカラムは、これを適当な緩衝剤で洗浄して強く結合し
た不純物を洗浄し且つ出発緩衝剤中で再平衡化すること
によって再び使用するために再生することができる。

生長ホルモン様物質の単量体形は媒体上の活性なイオ
ン交換点に結合せず、その代りにカラムを通流し、流出
液中に回収されるということが示された。しかしなが
ら、集合体不純物はカラムに結合し、そしてより強い置
換体を用いて流出させるまでカラムに保持される。

上述した通流法のほかに、単量体の生長ホルモン様物
質から集合体不純物を分離するのに吸着／脱着流出クロ
マトグラフィー法も有効であることが示された。しかし
ながら流出クロマトグラフィー法は媒体の単位容量当り
の同様の蛋白質負荷において有効性が低い。それにも拘
らず、より低い蛋白質負荷の場合には、それは単量体を
集合体から分離するのに有効な方法である。

流出クロマトグラフィー法で用いるイオン交換樹脂及
び関連する装置は、通流法に対するものと同じである。
用いる緩衝剤は、pH11.3〜11.7を与えるために20mMピペ
リジン又は同様のkPaを有する他の適当な緩衝剤からな
る水性緩衝剤（Ａ）及び20mMピペリジン及び1000mM塩化
ナトリウム又は同様の単純な塩からなる水性緩衝剤
（Ｂ）である。平衡を保証するには床容量の３倍が普通
十分である。第２に可溶性の単量体の生長ホルモン様物
質及び不純物からなる原料溶液を緩衝剤（Ａ）と同一の
組成にもっていき、次いで媒体１当り５〜15gの蛋白
質が負荷されるまでカラムに供給する。これに続いて緩
衝剤（Ａ）中緩衝剤（Ｂ）17％v/vの床容量の５倍量で
置換洗浄する。次いで緩衝剤（Ａ）中緩衝剤（Ｂ）17％
v/vから始めて緩衝剤（Ａ）中緩衝剤（Ｂ）47％v/vまで
の線状グラジエントの床容量の20倍量を用いて流出を行
なう。流出物を280nmでの吸光度により監視し、画分を
集める。最後に、緩衝剤（Ｂ）を床容量の10倍量で用い
て、いずれか強く吸着された種をカラムから脱着させ
る。次いで他の強く結合した不純物を除去するために緩
衝剤で更に洗浄し且つ出発の緩衝剤で再び平衡化するこ
とにより、更に使用するため、カラムを再生してもよ
い。

今回成長ホルモン様物質の単量体形は流出塩グラジエ
ントの過程において早く流出し、また集合体不純物はグ
ラジエントの遅い過程で流出し、２つのピークの間には
ベースラインでの分離のあることが示された。

上述したクロマトグラフィー法は、比較的粗製の蛋白
質溶液、即ち所望の単量体に対して比較的高量の不純物
を含む溶液を用いて単量体を集合体不純物から分離する
のに効果的であることが示された。また本方法は想像さ
れるように、すでに数段階の精製工程を経た比較的きれ
いな蛋白質溶液を更に精製し又は再処理するために成功
裏に使用できる。本通流法は、所望の品質よりも僅かに
だけ高量の集合体を含むすでに精製された蛋白質の経済
的な処理に特に適当である。

次の実施例は本発明の実施を例示することが意図さ
れ、その範囲を制限するものではない。

実施例１ 本実施例は、すでに部分的に精製したが、集合体を高
量で含有する組換えバクテリヤに由来する牛のリマトト
ロピンを更に精製する処理のために用いた通流法につい
て記述する。

Ｑ−セファローズ（ファーマシア）アニオン交換樹脂
ゲル200ccを含有するカラムを、20mMピペリジン及び150
mM塩化ナトリウムからなるpH11.5の出発水性緩衝剤の床
容量の３倍量を用いて平衡化した。アメリカン・サイア
ナミド社（American Cyanamide Co.）からの凍結乾燥し
た組換えの牛のソマトトロピン20gを出発緩衝剤2000cc
中で再構成して10g/lの濃度とし、95cm/時の表面線速度
でカラムに負荷した。負荷を開始して直ぐに流出物の28
0nmでの吸光度を監視することにより通流が監視され
た。通流が起こるやいなや、流出物を集めた。原料溶液
に次いで、吸光度がベースラインに戻るまで出発緩衝剤
と同一の組成の置換洗浄物を流した。通流後の負荷相か
らの流出物を置換洗浄からの流出物と一緒にし、全容量
280ccを得た。一緒にした流出物を脱塩し、10Kダルトン
排除の中空繊維カートリッジを用いて濃縮し、次いで凍
結乾燥した。

本実施例における出発物質は、SOS−ページ（PAGE）
を減じていないことにより11％の集合体を含有した。こ
れらのすべては見かけ上44K又は42Kダルトンの分子量を
有した。この物質は牛のソマトトロピン単量体間での分
子間ジスルフィド架橋により精製した共有結合二量体で
あると思われる。共有結合による二量体は生物学的に活
性でないことも示された。クロマトグラフィー処理後に
得られる物質はSDSページにより0.2％の二量体を有し
た。サイズ排除クロマトグラフィーによって測定される
如き集合体の量も、10％以上の集合体から１％以下へ
の、出発物質及びクロマトグラフィー処理物質間の減少
を示した。単量体だけの基準に基づくと、クロマトグラ
フィー工程を経た収率は84％であった。即ち原料中の単
量体の84％が一緒にした流出液で回収された。更にこの
物質の生物活性は放射性受容体分析で測定されるように
基準の92％から101％まで増大した。出発物質とクロマ
トグラフィー処理後の物質間の分析の比較結果を第Ｉ表
に要約する。第１図は出発物質及びクロマトグラフィー
処理した物質のSDS−ページのゲル・レーン（gel lan
e）を比較のために示す。出発物質及びクロマトグラフ
ィー処理した物質の双方に、導電的に焦点を当てた。結
果（示していない）は、クロマトグラフィー段階による
脱アミド化が起こらなかったことを示した。

実施例２ 本実施例は寸法で約40kから100kダルトン以上までの
範囲の集合体を実質的な量で含む比較的粗製の蛋白質溶
液をクロマトグラフィー的に精製するために用いた通流
法を記述する。

精製すべき物質は、封入体に由来し且つコロイド及び
非常に高分子量の不純物を除去するために限外過に供
した牛の組換えのソマトトロピンの粗蛋白質溶液であっ
た。この溶液はアメリカン・サイアナミド社のパイロッ
ト・プラント工場から得た。

Ｑ−セファローズ（ファーマシア）アニオン交換樹脂
135ccを含有するカラムを、実施例１に記述したものと
同一の緩衝剤を用いて平衡化させた。100Kダルトン排除
の中空繊維限外過膜［アミコン（Amicon）］を用いて
予じめ限外過した粗蛋白質溶液を、ピペリジン及び塩
化ナトリウムを添加することによって出発の平衡化と同
一の緩衝剤塩組成物にした。この溶液の蛋白質濃度は4.
71g/lであった。このカラムに溶液3180ccを負荷し、流
出物を実施例１に記述したように集めた。得られた全流
出物の容量は3489ccであった。この流出物を脱塩し、濃
縮し、そして凍結乾燥して11.1gの乾燥重量を得た。

粗蛋白質溶液はゲルパーミエーションクロマトグラフ
ィーで測定される如く19.2％の集合体を含有した。クロ
マトグラフィーにかけて凍結乾燥した物質はgpcによる
と２％以下の集合体及びSDS−ページによると0.3％のオ
リゴマーを含有した。第２図は原料溶液及びカラムから
の凍結乾燥した流出物に対するGPCクロマトグラムを示
す。

実施例３ 本実施例は、組換えの牛のソマトトロピンの試料を吸
着／脱着流出法を用いてクロマトグラフィー的に精製す
るために用いた方法を例示する。物質はアメリカン・サ
イアナミド社から入手し、SDS−ページで測定して10％
以上の集合体を含有した。

モノ−Ｑ（ファーマシア）アニオン交換樹脂1ccのカ
ラムを実施例に対して使用した。緩衝剤はpH11.5の20mM
ピペリジンからなる水性緩衝剤（Ａ）及びpH11.5の20mM
ピペリジン及び塩化ナトリウムからなる水性緩衝剤
（Ｂ）であった。カラムを緩衝剤（Ａ）中17％v/v緩衝
剤（Ｂ）を用いて平衡化し、次いで緩衝剤（Ａ）中牛の
ソマトトロピンの20mM/ml溶液200μｌを注入した。この
注入に続いて、緩衝剤（Ａ）中17％v/v緩衝剤（Ｂ）を
床容量の５倍、次いで緩衝剤（Ａ）中緩衝剤（Ｂ）17％
から47％v/vまでの直線的グラジェントを床容量の20倍
注入した。最後に100％の緩衝剤（Ｂ）を床容量の10倍
用いて、いずれか強く吸着した不純物を流出させた。

塩のグラジエント中に３つの明確なピークが得られた
（第３図）。グラジエントの開始直後に現れる第１のピ
ーク（282秒）は最大であった。第２のピークは第１の
ピークのすその端に融合した、ピーク（345秒）として
現われた。第３のピーク（531秒）は最初の２つと良く
分離していた。更にアイソクラチックな（isocratic）1
00％緩衝剤（Ｂ）での洗浄中に小さいピーク（796秒）
が流出した。

個々のピークを分画し、SDS−PAGEで試験した。第１
及び第２のピークは純粋な牛のソマトトロピン単量体で
あることがわかった。しかしながら第３のピークは牛の
ソマトトロピンの二量体及びより高分子量のオリゴマー
からなった。

実施例４ 本実施例は、すでに部分的に精製したが、ゲル・パー
ミエーション・クロマトグラフィーで決定して22.4％の
集合体を含有する組換えバクテリアに由来する豚のソマ
トトロピンを更に精製するために用いた方法を詳述す
る。

Ｑ−セファローズ（ファーマシア）アニオン交換樹脂
ゲル4.5lを含有するカラムを、実施例１に記述したもの
と同一の方法による通流法で用いた。緩衝剤の容量は２
つの実施例間の床容量での相違を考慮して調節した。ア
メリカン・サイアナミド社から得た凍結乾燥した組換え
の豚のソマトトロピン450の全量を出発緩衝剤45l中で再
構成し、次いでカラムに供給した。実施例１に記述した
ように流出物を監視し、集めた。次いで置換洗浄流出物
を実施例１で詳述したように先行する期間の流出物と一
緒にした。

かさ高の一緒にした流出物はgpcで決定して集合体を
検知できない量でしか含有しないことがわかった。

本発明の特徴及び態様は以下の通りである： 1.強アニオン交換樹脂媒体を、11.5付近のpKa及び単量
体生長ホルモン様物質を該媒体に吸着せしめない十分な
量の単純な塩を含む出発緩衝剤種中で平衡化させ； それぞれの濃度が出発緩衝剤と同一であるように適当
な量の緩衝剤種及び単純な塩を精製すべき生長ホルモン
様物質の溶液に添加し； 生長ホルモン様物質の溶液を媒体を充填したカラムに
負荷し、そして原料溶液から及び出発緩衝剤を用いる置
換洗浄液からの流通流出物を集め；そして カラムの媒体を高塩及び／又は苛性溶液で洗浄して強
く吸着された種を媒体から除去し、次いで次のサイクル
のために該媒体を再生する、 ことを含んでなる共有及び非共有結合の集合体を単量体
生長ホルモン様物質から分離するために該アニオン交換
樹脂型媒体を用いる通流クロマトグラフィー法。

2.出発緩衝剤のpHが10.5以上であり、また単純な塩が出
発緩衝剤中50〜250mMの濃度の塩化ナトリウムである上
記１の方法。

3.緩衝剤種がピペリジン又はホスフェート塩である上記
２の方法。

4.生長ホルモン様物質が組換えのまたは下垂体の牛又は
豚のソマトトロピンである上記３の方法。

5.精製すべき生長ホルモン様物質の溶液が粗製（高量の
不純物）であり、又は比較的純粋（低不純物量）である
上記４の方法。

6.強アニオン交換樹脂型媒体を、11.5付近のpKa及び適
当な濃度の単純な塩を含む出発緩衝剤種中で平衡化さ
せ； それぞれの濃度が出発緩衝剤と同一であるように適当
な量の緩衝剤種及び単純な塩を精製すべき生長ホルモン
様物質の溶液に添加し； 生長ホルモン様物質の溶液を該媒体を充填したカラム
に負荷し、続いて出発緩衝剤で置換洗浄し； 単量体生長ホルモン様物質を一定又はグラジエント法
で流出させ；そして 該媒体を強く吸着された種を除去するために適当な緩
衝剤で洗浄し且つ再生し、次のサイクルに対して媒体を
準備する、 ことを含んでなる共有及び非共有集合体を単量体生長ホ
ルモン様物質から分離するために該強アニオン交換樹脂
型媒体を用いる吸着／脱着流出クロマトグラフィー法。

7.出発緩衝剤のpHが10.5以上であり、また単純な塩が50
〜1000mMの濃度の塩化ナトリウムである上記６の方法。

8.緩衝剤種がピペリジン又はホスフェート塩である上記
７の方法。

9.生長ホルモン様物質が組換えのまたは下垂体の牛又は
豚のソマトトロピンである上記８の方法。

10.精製すべき生長ホルモン様物質の溶液が粗製（高量
の不純物）であり、又は比較的純粋（低不純物量）であ
る上記９の方法。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１の方法を用いる出発物質（レーン１）
及びクロマトグラフィーで処理した物質（レーン２）の
SDS−ページ（PAGE）であり； 第２図はスーパーローズ（Superose）６（ファーマシ
ア）のカラムを用いるゲル・パーミエーション・クロマ
トグラフィーであり、但し上のクロマトグラムは原料溶
液であり、一方下は実施例２に記述したようなアニオン
交換樹脂からの凍結乾燥した流出物であり；そして 第３図は実施例３に記述した流出法を用いて得たクロマ
トグラムである。

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】強アニオン交換樹脂媒体を、11.5付近のpK
   a及び単量体生長ホルモン様物質を該媒体に吸着せしめ
   ない十分な量の単純な塩を含む出発緩衝剤種中で平衡化
   させ； それぞれの濃度が出発緩衝剤と同一であるように適当な
   量の緩衝剤種及び単純な塩を生成すべき生長ホルモン様
   物質の溶液に添加し； 生長ホルモン様物質の溶液を媒体を充填したカラムに負
   荷し、そして原料溶液から及び出発緩衝剤を用いる置換
   洗浄液からの流通流出物を集め；そして カラムの媒体を高塩及び／又は苛性溶液で洗浄して強く
   吸着された種を媒体から除去し、次いで次のサイクルの
   ために該媒体を再生する、 ことを含んでなる共有及び非共有結合の集合体を単量体
   生長ホルモン様物質から分離するために該アニオン交換
   樹脂型媒体を用いる通流クロマトグラフィー法。
2. 【請求項２】強アニオン交換樹脂型媒体を、11.5付近の
   pKa及び適当な濃度の単純な塩を含む出発緩衝剤種中で
   平衡化させ； それぞれの濃度が出発緩衝剤と同一であるように適当な
   量の緩衝剤種及び単純な塩を精製すべき生長ホルモン様
   物質の溶液に添加し； 生長ホルモン様物質の溶液を該媒体を充填したカラムに
   負荷し、続いて出発緩衝剤で置換洗浄し； 単量体生長ホルモン様物質を一定又はグラジエント法で
   流出させ；そして 該媒体を強く吸着された種を除去するために適当な緩衝
   剤で洗浄し且つ再生し、次のサイクルに対して媒体を準
   備する、 ことを含んでなる共有及び非共有集合体を単量体生長ホ
   ルモン様物質から分離するために該強アニオン交換樹脂
   型媒体を用いる吸着／脱着流出クロマトグラフィー法。