DE3780388T2 - Fsh-stimulierendes peptid. - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide, welche die Freisetzung von Hormonen aus der Hypophyse betreffen, und insbesondere ein Protein, welches die Freisetzung des Follikelstimulierenden Hormons aus dem vorderen Lappen der Hypophyse fördert.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
• Es besteht ein merkbares Interesse an Hormonen, welche die Freisetzung von Hormonen aus dem vorderen Lappen der Hypophyse betreffen, insbesondere das luteinisierende Hormon (LH) und das Follikel-stimulierende Hormon (FSH). Es wurde von einer Vielzahl von hypophysiotropen Peptiden und Proteinen, welche in den Säugergonaden vorliegen, berichtet. Das Gonadotropin freisetzende Hormon (GnRH), ein Decapeptid, welches auch bekannt ist als der Freisetzungsfaktor des luteinisierenden Hormons (LRF) ist ein Protein, von welchem gefunden wurde, daß es sowohl LH als auch FSH freisetzt. Proteine, welche als "Inhibine" bezeichnet sind, welche selektiv die Sekretion von FSH unterdrücken, jedoch unter den meisten Umständen die Freisetzung von LH nicht unterdrücken, wurden kürzlich aus den Gonadenflüssigkeiten von verschiedenen Spezies isoliert und charakterisiert, ROBERTSON et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 126, 220-226 (1985); MIYAMOTO et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 129, 396-503 (1985); RIVIER et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 133, 120-127 (1985); LING et al., P.N.A.S. 82, 7217-7221 (1985). MASON et al., Nature 318, 659- 663 (1985) beschrieben die vollständige Aminosäuresequenz von der Schweine-Inhibin-α-Untereinheit und zwei bestimmten β- Untereinheiten, βA und βB. Gonadotropin-freisetzende Peptide wurden auch in den Gonaden beschrieben, von welchen allgemein gezeigt wurde, daß sie eine Wirksamkeit bei den Radiorezeptor- Versuchen für GnRH besitzen, jedoch, daß sie andere chromatographische und immunologische Charakteristika als jene von GnRH zeigen, IGARASHI et al., Endocrinology 74: 446-452 (1964); IGARASHI et al., in Psychoncuroendocrinology, herausgegeben von HATOTANI et al., Seiten 178-186 (1973); LUNDANES et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 94: 827-836 (1980) und SANSON et al., Peptides 1: 97-102 (1980).
• Beschrieben ist hier ein Protein, welches in dem Säuger- Follikel-Fluid gefunden wurde, und welches eine Wirkung, welche jener von Inhibin entgegengesetzt ist, besitzt und die Freisetzung von FSH aus der Hypophyse stimuliert, jedoch nicht die Freisetzung von LH stimuliert. Dieses Peptid wurde als "FSH-Freisetzungs-Peptid" (FRP) bezeichnet und wurde bis zur, im wesentlichen vollständigen Homogenität gereinigt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
• In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde ein Protein, welches ein Molekulargewicht von 28 000 Dalton (28 kD) besitzt, und welches FSH-Freisetzungs-Wirksamkeit besitzt, erfolgreich als im wesentlichen vollständiges Homogen aus Schweine-Follikel-Fluid (pFF) isoliert. Das 28 kD-Protein übt eine FRP-Wirksamkeit aus, so daß es spezifisch die Sekretion und Synthese von FSH durch kultivierte vordere Ratten-Hypophyse-Zellen stimuliert, jedoch nicht die Freisetzung von LH oder anderen bekannten Hypophysehormonen stimuliert.
• Das Protein besitzt ein Molekulargewicht von etwa 28 kD, wie dies durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) bestimmt wurde, wobei unter reduzierenden Bedingungen eine Hauptbande mit dem Molekulargewicht von 14- 16 kD beobachtet wird, welche nahelegt, daß FRP ein Dimer ist. Es gibt Hinweise, daß FRP ein Dimer von Inhibin-βA-Ketten ist, und daß derartige βA-Inhibin-Ketten-Dimere, und möglicherweise Monomere, welche nicht an Inhibin-α-Ketten gebunden sind, funktionelle Antagonisten der Inhibin-Wirksamkeit sind, und daß sie an Säuger verabreicht werden könnten, um endogenem Inhibin entgegenzuwirken und so in eine der Richtung von Inhibin entgegengesetzte Richtung wirken können.
• Die Reinigung von 28 kD-Schweine-FRP, bis auf eine Reinheit von wenigstens 90 Gew.-% des Gesamtproteins in einer Fraktion, wurde eine Kombination von Protein-Abtrennungsverfahren, welche die Salzfällung, Ultrafiltration, präparative Hochdruck- Flüssigkeitschromatographie (HPLC), Gelfiltration, Kationenaustausch-schnelle Protein-Flüssigkeitschromatographie (FPLC), halbpräparative HPLC, Gelpermeations-FPLC und analytishe HPLC unter Verwendung einer Vydac C&sub8; stationären Phase und einer TFA/CH&sub3;CN (Trifluoressigsäure/Acetonitril) Gradienten-mobilen Phase umfassen, erreicht.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
• Fig.1 ist ein Elutionsprofil von FRP auf einer Kationenaustauscher-Chromatographie. Die gepunktete Linie zeigt die NaCl-Gradienten-Konzentration von 0 bis 1,0 M während eines Laufes an. Der schattierte Bereich zeigt die gut bestimmte FSH-Wirksamkeit nach einem Bioversuch an, wie dies hier beschrieben wurde, wobei die Wirksamkeit als ng-FSH freigesetzt nach 73 h ausgedrückt ist. Die durchgezogene Linie zeigt die Konzentrationen des Gesamtproteins, welches eluiert wurde, aufgezeichnet bei 280 nm unter Verwendung eines Ultraviolett- Detektors.
• Fig.2 ist ein Elutionsprofil von FRP während der letzten analytischen Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (RP-HPLC)-Fraktionierung.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSBILDUNGEN
• In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde ein als FRP bezeichnetes Protein in dem Säuger-Follikel-Fluid gefunden, welches die Sekretion von FSH aus kultivierten vorderen Hypophysezellen stimuliert, jedoch nicht die Freisetzung von LH oder anderen bekannten Hypophysehormonen zu stimulieren scheint. In diesem Hinblick ist die Wirkung von FRP entgegengesetzt jener von Inhibin, welches die grundsätzliche Sekretion von FSH aus kultivierten, vorderen Hypophysezellen inhibiert, jedoch nicht die grundsätzliche Freisetzung von LH inhibiert. Die Wirkung von FRP wird durch bekannte GnRH-Antagonisten, welche mit GnRH-Rezeptoren wechselwirken, nicht blockiert, was anzeigt, daß die biologische Wirksamkeit von FRP nicht über die Wechselwirkung von GnRH-Rezeptoren führt. Das Protein kann in einem Mehrstufen-Verfahren im wesentlichen rein isoliert werden, d.h. in einer Reinheit, welche höher als 75 Gew.-% des gesamten endogenen Proteins ist.
• Physikalisch hat die Hauptkomponente ein Molekulargewicht von etwa 28 000 Dalton, wie dies durch SDS-PAGE bestimmt wurde. Unter reduzierenden Bedingungen wird eine Hauptzone von etwa 14 000 Dalton gesehen, was anzeigt, daß das Protein ein Dimer ist. Am Ende eines Mehrstufen-Reinigungsverfahrens wird das Protein weiter mit Hilfe von analytischer RP-HPLC unter Verwendung einer stationären Phase von Vydac C&sub8;, 5 um, in einer 0,46 x 25 cm-Säule und einem Gradienten von Puffer A, welcher 0,1%-ige wäßrige Trifluoressigsäure (TFA) ist, und Puffer B, welcher 0,1%-ige TFA plus einer Mischung von Wasser und Acetonitril (20:80) ist, gereinigt. Außer es wird etwas Anderes angeführt, sind die Verhältnisse und Prozentsätze als Volums-verhältnisse angegeben. Wie in Fig.2 gezeigt wird, wird das FRP-Material mit einem Eingangsfluß von 20%-Puffer B und einer Flußrate von 1,2 ml/min geladen. Nach dem Laden wird die Säule mit einem Fluß von 0,7 ml/min bei einer Temperatur von 40ºC eluiert, um einen Gradienten, welcher in einer 45%-igen Puffer-B-Lösung in 30 min resultiert, zu ergeben. Das Protein eluiert aus der Kolonne, und etwa 39 min nach dem Beginn des Gradienten wird eine einzelne scharfe Bande gesammelt, welche in bezug auf ihre biologische Wirksamkeit und Potenz getestet wird, und welche als FRP identifiziert wird. Es wird dann durch Edman-Degradation charakterisiert.
• FRP wurde ursprünglich aus Schweine-Follikel-Fluid (pFF), üblicherweise gemeinsam mit der Isolation von Inhibin isoliert, RIVIER et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1985), wie oben. Von einigen chromatographischen Elutionsfraktionen von pFF wurde gefunden, daß sie die FSH-Sekretion aus vorderen Hypophysezellen inhibieren, d.h. daß sie eine Inhibin-Wirksamkeit ausüben, wohingegen von anderen Fraktionen gefunden wurde, daß sie die Sekretion von FSH durch kultivierte Zellen stimulieren, und das wirksame Material in den FSH-stimulierenden Fraktionen wurde als FRP bezeichnet. Sowohl FRP als auch die Inhibin-Fraktionen wurden weiter bearbeitet, um die wirksamen Proteine zu isolieren, wobei gereinigtes FRP der Hauptgegenstand der vorliegenden Erfindung ist.
• Kurz zusammengefaßt wird die Anfangsreinigung von FRP bis zur größten Homogenität wie folgt durchgeführt.
• Ein Salz-Fällungsschritt, ein Ultrafiltrationsschritt und eine präparative HPLC waren Teil des Verfahrens, mit welchem Schweine-Inhibin aus pFF gereinigt wurde. Die dialysierte, überstehende Lösung aus einer 50%-igen Ammoniumsulfat-Fällung von etwa 6 l pFF wurde ultrafiltriert, um Protein, welches Molekulargewichte über etwa 10 kD aufweist, zu entfernen und dann einer präparativen HPLC unter Verwendung einer Vydac C&sub4; stationären Phase und einem TEAP, pH 6,5 Puffer, Propanolgradienten-mobilen Phas, wie zuvor in RIVIER et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1985), wie oben, beschrieben, unterworfen. Die FSH-Freisetzungs-Wirksamkeit wurde in den am Beginn eluierten, zurückgehaltenen Fraktionen beobachtet und wurden daher von den zwei Haupt-FSH-Freisetzungs-inhibierenden (Inhibin)-Zonen abgetrennt, welche entweder nicht zurückgehalten wurden oder welche später eluiert wurden.
• Während des Reinigungsverfahrens wurde die FRP-Aktivität in den Elutionsfraktionen durch einen Bioversuch bestimmt. Der Bioversuch für FRP basiert auf der Fähigkeit von FRP, die FSH- Sekretion durch kultivierte, vordere Hypophysezellen zu stimulieren, wie dies in VALE et al., Endocrinology, 91, 562-572 (1972), beschrieben wurde. Unter Verwendung dieses Versuches wurde die halbe, maximale, wirksame Dosis (EC&sub5;&sub0;) für FRP und FRP-enthaltende Fraktionen bestimmt. Die halbe, maximale, wirksame Dosis ist die Konzentration des Proteins, welche die Basissekretion von FSH, auf die Hälfte des maximalen Wertes der erhöhten FSH-Sekretion erhöht, d.h. jener Wert, bei welchem ein weiterer Zusatz von FRP keine weitere Sti-mulierung in der FSH-Sekretion bewirkt. Die hier gemessenen EC&sub5;&sub0;-Werte basieren auf einer Platte von 5 x 10&sup5;-Hypophyse-zellen, welche 2,5 h bei 37ºC in 60 x 15 mm-Falcon-Kultur-schalen, welche 3 ml Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium (DMEN) plus 100 ul Protein-enthaltende Lösung enthielten, in-kubiert wurden.
• Die aus der präparativen RP-HPLC erhaltenen Zonen, welche die FSH-Freisetzungsaktivität im Bioversuch zeigten, wurden getaucht, lyophilisiert und neuerlich in einem starken Dissoziationspuffer, welcher 6 M Guanidin/HCl enthielt, gelöst. Die Lösung wurde dann Gel-filtriert durch Anwendung auf einer Sepharose-CL-6B-Säule, und die FSH-Freisetzungs-Wirksamkeit wurde mit dem selben Puffer über einem KAV-Bereich von 0,54 bis 0,71 eluiert. Es wurde an diesem Punkt festgehalten, daß FRP sich bei der Gelfiltration analog der 32K-Form von Inhibin verhielt, welche glücklicherweise früher durch die präparative HPLC abgetrennt wurde.
• Die FSH-Freisetzungs-Fraktionen wurden getaucht und dialysiert und dann einer Kationenaustauscher-Chromatographie auf FPLC unter Verwendung einer Mono-S (Mono-S ist eine Marke) stationären Phase, welche in einer Lösung von 4 M Harnstoff, 50 mM Natriumacetat äquilibriert und durch einen Salzgradienten von 0 bis 1 M NaCl in der Lösung eluiert, unterworfen. Zwei Bereiche von FSH-Freisetzungs-Aktivität wurden detektiert, FRP-I und FRP-II (Fig.1).
• Die letzteluierte FRP-II-Fraktion hatte eine höhere spezifische Aktivität und wurde weiter durch halbpräparative RP-HPLC unter Verwendung einer Vydac C&sub8; (Vidac C&sub8; ist eine Marke) Säule und eines NaCl-Gradienten die TFA/CH&sub3;CN-Lösung gereinigt. Wirksame Fraktionen aus der halbpräparativen RP-HPLC wurden Wirksame Fraktionen aus der halbpräparativen RP-HPLC wurden weiter durch Gelpermeation auf einer FPLC-Superose 12B (Superose ist eine Marke) Säule eluiert mit 6 M Guanidin.HCl gereinigt. Schließlich wurde FRP durch zwei Schritte einer analytischen RP-HPLC unter Verwendung einer Vydac C&sub8; Säule eluiert mit CH&sub3;CN-Gradienten in TFA/CH&sub3;CN-Lösung isoliert. Die FRP-Elution aus der letzten analytischen HPLC ergab einen einzigen Peak von wirksamen Material, wie dies in Fig.2 ersehen werden kann. Auf SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen lief das Protein in der gesammelten Fraktion als eine einzige Bande, welche dem Molekulargewicht von etwa 14 kD entsprach.
• Hoch gereinigtes FRP stimuliert die FSH-Sekretion durch kultivierte, vordere Hypophysezellen auf dosisabhängige Art, was eine halbe, maximale, wirksame Dosis (EC&sub5;&sub0;) von ca. 25 pM ergab, woraus sich ein Molekulargewicht von 28 kD errechnen läßt. FRP stimuliert die Sekretion von Hypophysehormonen LH, Prolaction (Prl), Wachstumshormon (GH) und Adrenocorticotrophin (ACTH) und unterdrückt tatsächlich die Basisfreisetzung von GH und ACTH.
• FRP ist in bezug auf die Wirksamkeit von GnRH auf verschiedene Wege unterscheidbar. Obwohl FRP ein potentieller Freisetzer von FSH ist, hat es keine Wirkung auf die Sekretion von LH, wohingegen GnRH beide Gonadotropine freisetzt. GnRH wirkt unmittelbar auf die Stimulation der Gonadotropin-Sekretion, wohingegen der Einsatz der Wirkung von FRP 4 bis 24 h verzögert ist und für nicht mehr als maximal 24 h wirksam ist. Jedoch sekretieren Hypophysezellen, welche mit maximalen Konzentrationen von FRP 72 h behandelt wurden, soviel FSH während diesem Zeitraum wie die Maximalniveaus von GnRH.
• GnRH-Rezeptor-Antagonisten, welche in vitro vollständig die Freisetzung von FSH und LH, was auf GnRH rückführbar ist, verhindern, haben keine Wirkung auf die Sekretion von FSH, hervorgerufen durch FRP. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, daß FRP unabhängig von dem GnRH-Rezeptor wirkt.
• Obwohl die verlängerte Aussetzung von Hypophysezellen an GnRH in einer merkbaren Entleerung der FSH-Zell-Lager resultiert, erhöht FRP, welches die Freisetzung von analogen Mengen an FSH in das Medium bewirkt, die Menge an gelagertem FSH in den Zellen. FRP scheint daher eine größere Wirksamkeit auf die Biosynthese von FSH zu besitzen, als dies GnRH tut.
• Gereinigtes Schweine-Inhibin erniedrigt die Basisproduktion von FSH und verwischt daher die Wirkungen von geringen Konzentrationen an FRP. Inhibin und FRP sind funktionell kompetitiv, jedoch wirkt jedes davon unabhängig, d.h. in Abwesenheit des Zusatzes des anderen. Die Existenz von Gonaden FRP wurde ursprünglich auf Grund der Anwesenheit von Inhibin, dessen 32 kD-Form nicht von FRP durch Gelpermeation-chromatographische Methoden abgetrennt werden kann, übersehen.
• Es gibt jedoch deutliche Indikationen aus der Sequenzanalyse, daß das 28 kD-FRP-Protein ein Homodimer von Inhibin-βA-Untereinheiten ist, in welchen die Cysteinreste der Ketten durch Disulfidbindungen verbunden sind. lnhibin-βB-Homodimere, βAβB- Heterodimere und βA und βB-Monomere können alle als funktionelle Antagonisten von Inhibin wirken, welches selbst ein Dimer einer α-Kette und einer β-Kette ist. Dementsprechend kann die Verwendung von im wesentlichen gereinigten Inhibin-β- Ketten, in monomerer oder dimerer Form, für die selektive Stimulation der FSH-Sekretion verwendbar sein.
• Obwohl die Erfindung hier in erster Linie in bezug auf Schweine-FRP beschrieben wird, und insbesondere auf die dimere Form von Inhibin-βA-Ketten, besteht eine starke Homologie zwischen verschiedenen Wirbeltier-Inhibin-β-Ketten, insbesondere Säu-ger-Inhibin-β-Ketten, d.h. Schweine, Menschen, Geflügel, Rin-der, USW., obwohl von derartigen Wirbeltier-β-Ketten im allgemeinen angenommen wird, daß sie eine biologische Kreuzreaktivität zwischen den Wirbeltierspezies bei der Stimulierung von FSH-Sekretion aufweisen.
• Die Isolation des 28 kD-Schweine-FRP bis zur im wesentlichen Homogenität wird nun in bezug auf eine spezifisches Beispiel im Detail beschrieben.
BEISPIEL
• Der Bioversuch der FSH-Freisetzungs-Wirksamkeit, welcher die Anwesenheit von FRP in den Elutionsfraktionen während der Reinigung angibt, wurde wie folgt durchgeführt. Vordere Rattenhypophysen wurden enzymatisch dissoziiert und die Zellen als Monoschicht von Zellen in einzelnen Vertiefungen in B-PJ- Medium in 2% FBS placiert. Nach 3-maligem Waschen der Zellen mit dem selben Medium wurden Aliquote des Eluens zugesetzt und auf den Zellen 48-72 h belassen, während welcher Zeit die Flüssigkeiten von den Zellen entfernt wurden und in bezug auf FSH unter Verwendung eines Radioimmuno-Versuch-Sets, welches von dem National Hormone and Pituitary Program of NIADDK zur Verfügung gestellt wurde, untersucht (NIADDK = Nationales Institut für Arthritis, Diabetes, Verdauungsstörungen und Nierenerkrankungen). Zur Untersuchung der Elutionsfraktionen von RP-HPLC-Säulen wurden Versuchsaliquote (0,1 bis 1,0% des gesamten Fraktionsvolumens, jedoch niemals weniger als 5 ml) mit Mikropipetten und Plastikspitzen abgemessen und in Polypropylen-Röhrchen transferiert, welche Rinderserum-Albumin (10 ul mit 10 mg/ml) enthielten und auf einem Savant-Rotavapor getrocknet wurden. Zur Untersuchung der Elutionsfraktionen der Gel-permeation und Ionentauscher-Säulen war es nötig, diese vor dem Versuch zu entsalzen, wobei kleine Aliquote entfernt und in Glasröhrchen, welche 0,5 ml 10 mmolares Hepes plus 0,1% BSA, pH 7,5, enthielten, transferiert wurden. Verschlüsse von Dialyseröhrchen mit einem Molekulargewichtschnitt von ca. 1000 wurden oben mit Gummibändern gesichert. Die Röhrchen wurden umgedreht und gegen 10 mM Hepes, pH 7,5, dialysiert. Die Rückstände wurden dann unter Verwendung eines Savant-Rotavapors getrocknet. Alle Fraktionen wurden neuerlich in dem Zellkultur-Versuchsmedium suspendiert.
• Das Ausgangsmaterial für das Verfahren, Schweine-Follikel- Fluid (6050 ml), wurde von dem Contraceptive Development Branch von NICHD (= Nationales Institut für Kindergesundheit und menschliche Entwicklung) erhalten. Das Material wurde aufgetaut und bei 700 x g 5 min zentrifugiert, um den Zellrückstand abzutrennen.
• Die rohe, überstehende Lösung wurde anfangs mit Ammoniumsalz- Fällung gereinigt. Zu dem rohen Überstand wurde tropfenweise über 2 bis 3 h ein äquivalentes Volumen an Schwartz/Mannhochreinem 100% gesättigtem Ammoniumsulfat, eingestellt auf 7,8, mit Ammoniumhydroxid zugesetzt. Die Mischung wurde bei 8200 x g zentrifugiert, und die überstehende Lösung und der Niederschlag wurden getrennt. Die überstehende Lösung wurde zurückgehalten.
• Die überstehende Lösung wurde ultrafiltriert und unter Verwendung eines Millipore-Pellicon-Kassettensystems mit (etwa 0,465 m²) (5 sq. ft.)-Filter mit einem Molekulargewichtsschnitt von 10 000 bei einer Rate von 300 ml/min unter Verwendung einer Peristaltikpumpe unter Druck, welche solange verwendet wurde, bis die Filtrationsrate 20 ml/min betrug, konzentriert. Der Gesamtrückstand wurde mehrere Male mit 10 mM Hepes und 0,05% Dimethylsulfid, pH 7, gewaschen. Der Endrückstand (6,050 ml-eq in 2,240 ml) wurde gesammelt. Die Proteinkonzentration des Rückstandes betrug 10 ml/ml-eq. Der Ausdruck "ml-eq" wird verwendet, um eine gegebene Menge an biologisch wirksamem Proteinmaterial, welches von 1 ml pFF stammt, anzugeben.
• Der konzentrierte Rückstand wurde dann mit präparativer RP- HPLC gereinigt. In jedem Lauf wurden 500 ml-eq Protein oder weniger auf einer Waters Prep 500A unter Verwendung von Vydac mit C&sub4;-Silikagelen verschlossenen Säulen, 15-20 um Körnchengröße in einer 5 x 30 cm Kartusche behandelt. Die Säulentemperatur war auf 60ºC thermostatisiert. Puffer A war 0,1% H&sub3;PO&sub4;, 0,28% TEA (Triethylenamin), pH 6,5; Puffer B war 60% n- Propanol in Puffer A. Die Säulen wurden mit 20% Puffer B beladen; der Gradient betrug von 20% Puffer B bis 65% Puffer B in 45 min. Die Flußrate betrug 75 ml/min. Die FSH-Wirksamkeit wurde zwischen den Retentionsvolumen (RV) 825 und 1350 ml vom Beginn des Gradienten eluiert. Wirksame Zonen aus der präparativen RP-HPLC wurden gesammelt und lyophilisiert. Die Proteinkonzentration betrug 700 ug/ml-eq, und am Bioversuch war der EC&sub5;&sub0; 2,8 ug/ml.
• Die aus der präparativen RP-HPLC gesammelten Fraktionen wurden weiter durch Gelpermeation FPLC auf einer 10 x 120 (8600 ml) Sepharose (Sepharose ist eine Marke) CL-6B-Säule gereinigt. Die gesammelten Fraktionen wurden auf einen pH 4,75 mit 6 M Guanidin.HCl, 0,1 M Ammoniumacetat, 0,05% Dimethylsulfid gebracht. Das Eluens wurde durch 0,22 um filtriert und vor der Verwendung entgast. Die Flußrate betrug 180 ml/h. Die FSH- Freisetzungs-Wirksamkeit wurde zwischen KAV 0,54 und 0,71 eluiert. Das gesammelte Retentat der wirksamen Fraktionen hatte eine Proteinkonzentration von 130 ug/ml-eq und einen EC&sub5;&sub0; von 730 ng/ml.
• Die wirksamen Fraktionen der Gelpermeations-Chromatographie wurden gesammelt und gegen Milli Q H&sub2;O plus 0,01% Dimethylsulfid unter Verwendung eines Röhrchens mit einem Molekulargewichtsschnitt von etwa 1000 dialysiert, und die Fraktionen wurden lyophilisiert. Das gesammelte Retentat von der Gelpermeation wurde dann weiter durch Kationentauscher FPLC gereinigt. Der Kationentausch wurde unter Verwendung eines Pharmacia-FPLC-Systems, welches mit einer Mono-S HR 16/10- Säule, Vt = 20 ml, ausgestattet war. Die mobile Phase bestand aus einem Gradienten des Puffers A: 50 mM Natriumformat, 4 M Harnstoff, 1 mM 3-[(Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS) in Milli Q H&sub2;O, pH 4,3, und Puffer B: 1 M NaCl in Puffer A. Die Puffer wurden durch 0,22 um filtriert und vor der Verwendung entgast. Der lyophilisierte Rückstand wurde in Puffer A gelöst und in drei gleichen Gefäßen weiterverarbeitet. Die Flußrate betrug 8 ml/min, und der Gradient war wie in Fig.1 gezeigt. Insbesondere war für 9 min das Eluens 100% Puffer A; nach 9 min wurde der Puffer abrupt in 15% Puffer B geändert und so für einen Zeitraum von 32 bis 36 min gehalten. Der Gradient wurde dann linear von 15% Puffer B auf 50% Puffer B erhöht, für einen Zeitraum von 30 bis 50 min. Der Puffer wurde dann linear von 50% Puffer B auf 100% Puffer B geändert, und die Säule wurde danach mit 100% Puffer B eluiert.
• Zwei biologisch wirksame Zonen von FRP, relativ zur Basis-FSH- Sekretion, resultierten aus der Kationenaustauscher-FPLC-Chromatographie. Die Zone, welche von ca. 0,34 bis 0,43 M NaCl eluierte, wurde als FRP-I bezeichnet. Die letzte Zone, welche von ca. 0,43 bis 0,60 M NaCl eluierte, wurde als FRP-II bezeichnet und war die aktivere Fraktion. Gesammelte FRP-II- Fraktionen hatten eine Proteinkonzentration von 8 ug/ml-eq und einen EC&sub5;&sub0; von 96 ng/ml.
• Jedes der gesammelten FRP-I- und FRP-II-Eluate wurde weiter gereinigt und durch halbpräparative RP-HPLC, unter Verwendung eines Beckman-HPLC und 1 x 30 Vydac-Säulen, gepackt mit C&sub8; Kieselgelen, 5 um Korngröße entsalzt. Das Eluens war ein Gradient von Puffer A: 0,1% TFA und Puffer B: 80% CH&sub3;CN in 0,1% TFA. Die FRP-I-Säulen wurden bei 40ºC thermostatisiert und liefen mit 2,5 ml/min isokratisch bei 25% Puffer B für 17 min, gefolgt durch einen linearen Gradienten von 55% Puffer B für 30 min. Wirksame Fraktionen eluierten zwischen den Retentionsvolumina 60 und 65 ab Beginn des Gradienten. Die Proteinkonzentration von FRP-II betrug 700 ng/ml-eq und der EC&sub5;&sub0; beim Bioversuch war 25 ng/ml.
• Wirksame Zonen aus der halbpräparativen RP-HPLC von FRP-I und FRP-II wurden getrennt durch Gelpermeation auf Pharmacia-FPLC- Systemen unter Verwendung von Tandem-Superose (Superose ist eine Marke)-12B-Säulen, 10 um, 10 x 300 mm jeweils, bearbeitet. Das Säuleneluens war 6 M Guanidin.HCl, 0,1 M Ammoniumacetat, 0,05% Dimethylsulfid, pH 4,75 in Milli Q H&sub2;O. Das Eluens wurde über 0,22 um filtriert und vor der Verwendung entgast. Die Flußrate betrug 4 ml/min. In jedem Fall wurden die aktiven Phasen zwischen KAV 0,26 und 0,31 eluiert. Die gesammelten FRP-II-Fraktionen besaßen eine Proteinkonzentration von 300 ng/ml-eq und einen EC&sub5;&sub0; von 5 ng/ml.
• Die gesammelten, wirksamen Zonen von FRP-II, welche aus der FPLC-Gelpermeation gewonnen wurden, wurden durch analytische RP-HPLC unter Verwendung einer Vydac C&sub8;, 5 um, 0,46 x 25 cm- Säule unter Verwendung eines Beckman-Systems bei 40ºC thermostatisiert, behandelt. Puffer A war 0,1% TFA, Puffer B war 0,1% TFA und eine Mischung von Waser und Acetonitril (20:80). Etwa 1,000 ml-eq wurden auf einmal geladen, beginnend mit 20% Puffer B und einem Beladungsfluß von 1,2 ml/min. Das Injektionsvolumen betrug 4,3 ml in fünf gleichen Injektionen. Der Gradient lief bis 45% Puffer B in 60 min nach dem Beladen mit einer Flußrate von 0,7 ml/min. Wirksame Fraktionen wurden gesammelt, und dieser Schritt wurde mit dem auf 30 min reduzierten Gradienten wiederholt. Die gesammelten Fraktionen von diesem zweiten Schritt wurden als ein Einzel-Peak nach 39 min, nachdem der Gradient begonnen wurde, wie dies in Fig.2 gesehen werden kann, eluiert. Die Proteinkonzentration betrug 20 ng/ml-eq und EC&sub5;&sub0; war 1 ng/ml. So wurden etwa 100 ug im wesentlichen homogenes FRP-Protein aus 390 g Gesamtprotein in den Ausgangs 6050 ml pFF gewonnen.
• Ein Aliquot des hochgereinigten FRP wurde einer Edman-Degradation unterworfen. Die ersten 32 Reste der N-terminalen Sequenz des intakten FRP wurden als identisch mit der N-terminalen Sequenz der Schweine-Inhibin-βA-Kette, d.h. Inhibin-βA (1-32) oder Reste 309-340 (basierend auf der Numerierung in der Prä-Pro-Form, MASON et al., siehe oben), gefunden. Ein weiteres Aliquot von FRP wurde reduziert, S-carboxymethyliert und einer HPLC unterworfen. Der Haupt-Peak aus der HPLC wurde mit Clostripain getrennt, und die Fragmente wurden nach der HPLC-Reinigung einer Edman-Degradation unterworfen. Die Sequenzen der bestimmten Fragmente wurden als identisch in den Resten 75-85, 88-102 und 103-116 von Schweine-Inhibin-βA gefunden. Dieses gereinigte FRP zeigt eine Hauptbande bei 28 kD auf SDS-PAGE, wobei die folgende Reduktion zu einer Hauptzone von 14-16 kD führt Diese Ergebnisse stimmen mit dem Schluß überein, daß FRP-II ein Homodimer, bestehend aus zwei Inhibin- βA-Ketten, welche durch Disulfidbindungen verbunden sind, darstellt.
• FRP ist ein Homodimer von zwei Untereinheiten von jeweils 116 Resten der folgenden Formel, welche durch Disulfidbindungen verbunden ist:
• Es ist auch möglich, eine FSH-freisetzende, biologische Wirksamkeit durch zur Verfügungstellung eines synthetischen Dimers von zwei Untereinheiten an Inhibin-βB erreicht wird, von welchen jede die folgende Formel aufweist:
• Ein Heterodimer von Inhibin-βA und Inhibin-βB besitzt ebenfalls FSH-freisetzende, biologische Wirksamkeit. Alle der oben beschriebenen Substanzen können synthetisch hergestellt werden, und biologisch wirksame Fragmente von einer oder beiden der Untereinheiten können verwendet werden. Beispielsweise kann der C- Terminus von einer oder beiden der Untereinheiten durch Entfernung von 1 bis 15 Resten in der kontinuierlichen Sequenz verkürzt werden.
• Das 28 kD-FRP-Protein ist für die Regulierung der Gonadotropin-Sekretion verwendbar und so für die Fruchtbarkeit und/oder Sexhormon-Produktion von sowohl männlichen als auch weiblichen Säugern, insbesondere von Menschen geeignet. Obwohl das isolierte FRP vom Schwein stammt, wird angenommen, daß es ebenso biologisch wirksam für die gesamte Gattung von Säugern ist, wie dies für andere neuro-regulatorische Hormone, welche zuvor isoliert wurden, beschrieben wurde, und welche charakterisiert und später synthetisch reproduziert wurden. Es ist anzunehmen, daß Gonaden-FRP eine weite Verstreuung besitzt, welche auch den Hypothalamus umfassen kann, und es ist ebenso möglich, daß FRP wichtige autokrine, parakrine und/oder hormonale Rollen bei der Regulierung von Gonaden und insbesondere anderen Funktionen spielt. Die höhere Wirksamkeit von FRP auf Hypophysezellen, um die Hormonsekretion zu modulieren, unterstützt das regulatorische Potential dieses Proteins.
• Im wesentlichen reines 28 kD FRP oder biologisch wirksame Portionen davon oder die nicht-toxischen Salze davon, kombiniert mit pharmazeutisch verträglichen Trägern zur Bildung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, können an Säuger, Menschen eingeschlossen, entweder intravenös, subkutan, perkutan, intramuskulär oder oral zur Kontrolle der Fruchtbarkeit, Gonadotropin-Sekretion oder Sexhormon-Produktion verabreicht werden. Insbesondere FRP garantiert eine Erhöhung der männlichen und weiblichen Fruchtbarkeit, sowohl bei Menschen als auch bei anderen Säugern.
• Derartige Peptide werden oft in Form von pharmazeutisch verträglichen, nicht-toxischen Salzen, wie Säureadditionssalzen oder Metallkomplexen, d.h. mit Zink, Eisen od.ä. (welche als Salze für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung betrachtet werden) verabreicht. Illustrativ für derartige Säureadditionssalze sind Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulphat, Phosphat, Maleat, Acetat, Zitrat, Benzoat, Succinat, Malat, Ascorbat, Tartrat u.ä.. Wenn der Wirkstoff in Tablettenform verabreicht werden soll, kann die Tablette ein Bindemittel, wie Polylactid/Glycolid, Tragakanth, Getreidestärke oder Gelatine; ein Disintegrationsmittel, wie Algininsäure; und ein Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, enthalten. Wenn die Verabreichung in flüssiger Form gewünscht wird, können Süßstoffe und/oder Geschmacksstoffe verwendet werden, und eine intravenöse Verabreichung kann in isotonischer Kochsalzlösung, Phosphatpuffer-Lösungen od.ä. durchgeführt werden.
• FRP sollte unter der Führung eines Arztes verabreicht werden, und die pharmazeutischen Zusammensetzungen werden üblicherweise eine wirksame Menge des Peptids, gemeinsam mit einem üblichen, pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten. Die Dosierung wird je nach dem spezifischen Zweck für das zu verabreichende Protein variieren, und die täglichen Dosierungsniveaus werden im Bereich von 0,1 bis etwa 2 mg/kg Körpergewicht liegen, wenn das Protein auf regelmäßiger Basis zur Fruchtbarkeitsregulierung verabreicht wird. Es scheint, daß FRP auch bei der Behandlung von Unfruchtbarkeit, welche durch zu niedrige FSH-Produktion hervorgerufen wird, verwendbar ist. Radioimmuno-Versuche, welche spezifisch für FRP sind, werden bei der Diagnose von Fruchtbarkeitsstörungen bei Männern und Frauen hilfreich sein.
• Obwohl das Verfahren der Reinigung von FRP zuerst in bezug auf die Isolation von pFF beschrieben wurde, kann Inhibin analog aus anderen rohen Extrakten, wobei menschliches Follikel-Fluid mitumfaßt ist, isoliert werden.
• FRP-Monomere können durch rekombinante DNA-Techniken in geeigneten Klonierungsvektoren synthetisiert werden. In bestimmten, geeigneten Vektorsystemen können die Dimere vollständig synthetisiert werden. In anderen Fällen werden die Monomere durch die Vektorsysteme ausgedrückt und dann in vitro dimerisiert.
• Alternativ ist es denkbar, daß Fragmente von FRP, welche klein genug sind, um durch Festphasen-Verfahren hergestellt zu werden, ebenfalls biologisch aktiv sein könnten.
• Das mehrstufige Reinigungsverfahren, welches hier beschrieben wurde, zweigt von einem Inhibin-Reinigungsverfahren ab. Es wird angenommen, daß FRP, als das gewünschte Produkt, mit bedeutend direkteren Verfahren, mit weniger Reinigungsschritten, isoliert werden kann.
• Verschiedene Tatsachen werden in den folgenden Patentansprüchen deutlicher.

Claims (12)

1. Follikel-stimulierendes Hormonfreisetzungsprotein (FRP) in im wesentlichen reiner Form, welches Protein dadurch gekennzeichnet ist, daß es die Sekretion und Biosynthese von FSH, welches aus vorderen Hypophysezellen kultiviert wurde, stimuliert, jedoch die Freisetzung von LH nicht stimuliert, wobei die Wirkung des Proteins durch bekannte GnRH-Antagonisten, welche mit GnRH-Rezeptoren auf derartigen Hypophysezellen wechselwirken, nicht blockiert wird und daß das Protein ein Molekulargewicht von 28 000 Dalton aufweist, welches durch SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen bestimmt wurde.

2. FRP nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in einer analytischen Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC), mit einer stationären Phase aus Vydac C&sub8; (C&sub8; beschichtetes partikelförmiges Siliziumdioxid), einer 0,46x25 cm-Säule und einer mobilen Phase bestehend aus Puffer A, nämlich 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser, und Puffer B, nämlich 20% Puffer A und 80% Acetonitril, wobei die Protein enthaltende Phase gemeinsam mit der mobilen Phase anfangs mit einem Fluß von 1,2 ml/min geladen wird, und wobei 20% Puffer B enthalten sind, und wobei danach der Fluß auf 0,7 ml/min gesenkt wird und ein geradliniger Gradient der mobilen Phase angewandt wird, um 45% Puffer B in 30 min zu erreichen, die RP- HPLC bei 40ºC durchgeführt wird, wobei das FRP-Protein als scharfe Bande 39 min nach der Startzeit des Gradienten eluiert wird.

3. FRP nach Anspruch 1 aus Säuger Follikel-Fluid isoliert.

4. FRP nach Anspruch 1 aus Schweine Follikel-Fluid isoliert.

5. FRP nach Anspruch 1 mit einem EC&sub5;&sub0; von etwa 0,5 ng/ml.

6. Im wesentlichen reine Dimere von Wirbelinhibin β-Untereinheiten oder biologisch wirksamen Fragmenten davon zur Verwendung, um die Freisetzung von FSH bei einem Wirbeltier zu bewirken.

7. Im wesentlichen reine Dimere nach Anspruch 6, worin das Dimer ein Homodimer von Inhibin βA-Untereinheiten ist.

8. Im wesentlichen reine Dimere nach Anspruch 6, worin die Dimere Homodimere von Inhibin βB-Untereinheiten sind.

9. Im wesentlichen reine Dimere nach Anspruch 6, worin die Dimere Heterodimere von Inhibin βA- und Inhibin βB-Untereinheiten sind.

10. Im wesentlichen reine Dimere nach Anspruch 6, von Schweine Inhibin βA-Untereinheiten.

11. Im wesentlichen reine Dimere nach Anspruch 6, worin jede Untereinheit eine Formel, gewählt aus den Formeln:

aufweist.

12. Im wesentlichen reine Dimere nach Anspruch 6, bestehend aus zwei 116-Reste Peptiden, welche durch Disulfidbindungen verbunden sind, welche jeweils die Formel:

aufweisen.