DE3686200T2

DE3686200T2 - Biologisch wirksame lysin enthaltende octapeptide.

Info

Publication number: DE3686200T2
Application number: DE8686810174T
Authority: DE
Inventors: Ren Zhi Cai; Andrew V Schally
Original assignee: Tulane University
Current assignee: Tulane University
Priority date: 1985-04-25
Filing date: 1986-04-15
Publication date: 1993-03-11
Anticipated expiration: 2006-04-16
Also published as: IE861004L; US4725577A; HK68793A; SG57793G; EP0203031A3; DK185486D0; DE3686200D1; ATE78831T1; DK174920B1; AU600895B2; CA1333646C; DK185486A; IE59621B1; AU5633886A; EP0203031A2; EP0203031B1

Description

Somatostatin ist ein cyclisches Tetradecapeptid, das die Sekretion des Hypophysenwachstumshormons hemmt. Bisher wurden verschiedene Analoge von Somatostatin beschrieben. Verber et al., Nature, 292, 55, (1981) beschrieb die Synthese und die Aktivität eines cyclischen Hexapeptidanalogs, das durch Austausch von 9 der 14 Aminosäuren von Somatostatin durch ein einfaches Prolin erhalten wird. Zusätzlich hat dieselbe Gruppe Hexapeptidderivate mit hoher Potenz beschrieben, Life Sciences, 34, 1371 (1984). Bauer et al., beschreiben in "Peptides", 1982, S. 583, Ed. K. Blaha, P. Malon - 1983 von Walter de Gruyter & Co., Berlin, New York, die Synthese und Aktivität von Octapeptidanalogen (vgl. auch Life Sciences, 31, 1133 (1982)).
US-A-4.395.403 betrifft Octapeptide, die als Somatostatinanaloge definiert sind. Von den einigen Billionen Verbindungen, die theoretisch in der darin beschriebenen allgemeinen Formel enthalten sind, wurden nur jene mit der Formel
(wobei B entweder Thr oder Ala ist) entweder im Sinne der Struktur oder der biologischen Aktivität definitiv charakterisiert. Diese Aussage wurde von Bauer et al. in Pept. Proc. Eur. Pept. Symp., 18. 1983 weiter bestätigt.
GB-A-2.095.261 beschreibt N-Acyl-polypeptide, genauer N-Acyl-octapeptide, die den obengezeigten typischen sechsgliedrigen Ring gemein haben. Tatsächlich werden Octapeptide beschrieben, wobei "A" N-Acyl-phenylalanin und "B" in den meisten Fällen eine Hydroxy-Endgruppe, genauer ThrHO, ist. Auch in diesem Fall wurden nur einige Verbindungen im Sinne der Struktur oder der biologischen Aktivität einzeln charakterisiert, ob wohl theoretisch viele Kombinationen möglich sind. Somit bleiben noch Billionen neuer Octapeptide, die bisher nicht synthetisiert wurden; ferner ist ihre biologische Aktivität völlig unvorhersagbar. Die vorliegende Erfindung ergänzt diese sehr wichtige Peptidklasse mit zusätzlichen Komponenten.
Im allgemeinen beruhen die hierin verwendeten Abkürzungen zur Bezeichnung der Aminosäuren und der Schutzgruppen auf Empfehlungen der IUPAC-IUB Commission of Biochemical Nomenclature, siehe Biochemistry, 11, 1726-1732 (1972). Zum Beispiel stellen Abu, Ala, Gly, Cys, Lys, Asn, Asp, Phe, Trp, L-Trp, D-Trp, DL-Trp, D-5-Br-Trp, L-5-F-Trp, Thr und Ser die "Reste" von -Aminobuttersäure, L-Alanin, Glycin, L-Cystein, L-Lysin, L-Asparagin, L- Asparaginsäure, L-Phenylalanin, L-Tryptophan, L-Tryptophan, D-Tryptophan, DL-Tryptophan, D-5-Brom-tryptophan, L-5-Fluorotryptophan, L-Threonin bzw. L-Serin dar. Der Begriff "Rest" betrifft ein Radikal, das von der entsprechenden Alpha-Aminosäure durch Entfernung des Hydroxyls der Carboxylgruppe und eines Wasserstoffs der Alpha-Aminogruppe erhalten wurde.
Die vorliegende Erfindung betrifft Analoge des Tetradecapeptids Somatostatin. Insbesondere betrifft diese Erfindung Octapeptid-Somatostatinanaloge mit der Formel I:
worin
a) X L-Tyrosin (L-Tyr) und Y L-Valin (L-Val) darstellen; oder
b) X L-Phenylalanin (L-Phe) und Y L-Threonin (L-Thr) darstellen; und
A eine L, D oder DL Aminosäure, die aus der Gruppe bestehend aus Phenylalanin (Phe), para-Chlorphenylalanin (p-Cl-Phe) und Tryptophan (Trp) oder deren acetylierten Derivaten ausgewählt wird; und
B eine L, D oder DL Aminosäure, die aus der Gruppe bestehend aus Threoninamid (Thr-NH&sub2;) und Tryptophanamid (Trp-NH&sub2;) ausgewählt wird, und deren pharmazeutisch akzeptable Säureadditionssalze sind, mit der Bedingung daß B nicht D-Thr-NH&sub2; darstellen kann, wenn A D-Phe, X L-Phe und Y L-Thr sind.
Einige Derivate liegen im Bereich dieser Erfindung. So bedeutet Cys alleine D- Cystein in der Sulfhydrylform, während eine Brücke zwischen zwei Cys-Gruppen als Disulfidbrücke gelesen werden sollte, wenn es keinen zusätzlichen Hinweis gibt. MBz ist p-Methoxy-benzyl, 2-ClZ ein 2-Chlorocarbobenzyloxy, 2-BrZ ist gleichermaßen die entsprechende 2-Bromocarbobenzyloxygruppe. Wenn solche Gruppen neben einer Aminosäure auftreten, entweder vor oder nach dieser aber zwischen Trennstrichen, so ist eine solche Gruppe ein Substituent der benachbarten Aminosäure.
Ferner umfaßt die vorliegende Erfindung neuartige Zwischenprodukte, welche die reduzierten Formen der Verbindungen mit der Formel I sind, und Verfahren und Zusammensetzungen, welche diese neuartigen Octapeptide zur Behandlung verschiedener Säugetiererkrankungen verwenden.
Diese Octapeptide hemmen die Freisetzung von Hormonen wie dem Wachstumshormon, Prolaktin, Insulin, Glucagon, Gastrin, Sekretin und Cholecystokinin und verringern auch die gastrinstimulierte Sekretion der Magensäure. Diese Wirkungen können unabhängig von der Verabreichung anderer physiologisch aktiver Verbindungen oder eine Auswirkung der Kombination der gegenständlichen Zusammensetzung mit anderen physiologisch aktiven Verbindungen sein.
Die Octapeptide der vorliegenden Erfindung können somit zur Behandlung von Krankheitszustanden wie diabetischer Retinopathie, Diabetes, Geschwüren, akuter Pankreatitis und Akromegalie verwendet werden. Wenn das Wachstum von geschwulstbildendem Gewebe durch eines der Hormone, die durch Octapeptide reguliert werden, verändert wird, können diese Octapeptide außerdem in der Behandlung solcher Tumore zweckmäßig sein. Solche Tumore sind zum Beispiel Prostata-Adenokarzinome, Mammakarzinome (beeinflußt durch Prolaktin und Wachstumshormon) wie auch Insulinoma, Gastrinoma, Wachstumshormon- und Insulin-abhängige Tumore wie Chondrosarkoma, Osteosarkoma, wie auch duktale und azinöse Pankreasgeschwulste (Pankreaskarzinome), die von Hormonen des Gastroinestinaltrakts abhängen.
Die Octapeptide der vorliegenden Erfindung sind von der obigen Formel I umfaßt. Diese Octapeptide bestehen in einer cyclischen Form aufgrund einer Disulfidbrücke (-S-S-) zwischen den Cys-Substituenten. Die reduzierten Formen der Octapeptide der Formel I sind von der folgenden Formel I' umfaßt. Diese reduzierten Formen sind Zwischenprodukte im Verfahren zur Herstellung der Verbindungen mit der Formel I.
Von der Verbindungen mit der Formel I werden einige Kombinationen von Substituenten bevorzugt. Zum Beispiel sind Verbindungen, worin A Phenylalanin (Phe) und B Threoninamid (Thr-NH&sub2;) oder Tryptophanamid (Trp-NH&sub2;) sind, X L-Tyrosin (L-Tyr) und Y L-Valin (L-Val) darstellen, wie auch Verbindungen, worin A Phenylalanin (Phe), Acetylphenylalanin (AcPhe) oder Tryptophan (Trp) und B Threoninamid (Thr-NH&sub2;) oder Tryptophanamid (Trp-NH&sub2;) sind, X L-Phenylalanin (L-Phe) und Y L-Threonin (L-Thr) darstellen, bevorzugte Verbindungen.
Die Octapeptide dieser Erfindung können in Form der freien Base oder in Form eines pharmazeutisch oder therapeutisch akzeptablen Säureadditionssalzes erhalten werden. Die Octapeptide in Form der freien Basen sind sofort aus dem entsprechenden Säureadditionssalz durch herkömmliche Verfahren erhältlich, zum Beispiel wird eine Lösung des Säureadditionssalzes durch ein anionisches Austauschharz (OH-Form) geleitet, um die freie Base zu erhalten. Die freie Base kann auch aus dem Essigadditionssalz durch wiederholte Lyophilisierung dieses Salzes von wässeriger Lösung erhalten werden. Das Essigsäureadditionssalz kann leicht von einem anderen Säureadditionssalz durch Behandlung mit dem geeigneten Ionenaustauschharz, zum Beispiel Sephadex G-15, unter Verwendung von 50% Essigsäure nach der von Coy et al., in Biochem. Biophys. Res. Commun., 1267-1273 (1973) beschriebenen Weise erhalten werden.
Die Octapeptide dieser Erfindung können in Form eines pharmazeutisch oder therapeutisch akzeptablen Säureadditionssalzes entweder direkt aus dem Verfahren dieser Erfindung oder durch Reaktion der Peptide mit einem oder mehreren Äquivalenten der geeigneten Säure erhalten werden. Beispiele für bevorzugte nichttoxische Salze sind jene mit pharmazeutisch oder therapeutisch akzeptablen organischen Säuren, z. B. Essig-, Milch-, Bernstein-, Benzoe-, Salicyl-, Methansulfon-, Toluensulfon- oder Pamosäure, wie auch polymere Säuren wie Tannin oder Carboxymethylcellulose und Salze mit anorganischen Säuren wie die Halogenwasserstoffsäuren z. B. Salzsäure, oder Schwefelsäure oder Phosphorsäure.
Die Octapeptide dieser Erfindung können durch Festphasensynthese hergestellt werden. Die Synthese beginnt am C-Terminus des Peptids. Die erste geschützte Aminosäure wird durch Reaktion der carboxylgruppe-geschützten Aminosäure in Gegenwart von N, N'-Dicyclohexylcarbodiimid oder N,N'-Diisopropylcarbodiimid und 1-Hydroxy-benzotriazol (HOBT) mit dem Benzhydrylaminharz verbunden. Der Sequenzaufbau des Peptids umfaßt das stufenweise Hinzufügen jeder Aminosäure im N-Endteil der Peptidkette.
Die Spaltung der N-Endschutzgruppe erfolgt durch Trifluoressigsäure. Die anderen Schutzgruppen, die auf der Peptidkette vorhanden sind, sind unter den Spaltungsbedingungen der N-Endschutzgruppe stabil. Nach Abspaltung der N-Endschutzgruppe liegt das erhaltene Produkt üblicherweise in Form des Additionssalzes der Trifluoressigsäure vor. Die freie Endaminoverbindung wird durch Behandlung mit einer milden Base, üblicherweise einem tertiären Amin wie Triethylamin oder Diisopropylethylamin gebildet. Dann ist das Peptidharz für die Kopplung mit der nächsten Aminosäure, die ein freies Carboxyl aufweist, aber an der Alpha-Aminogruppe geschützt ist, bereit.
Sobald die gewünschte Aminosäuresequenz hergestellt ist, wird das erhaltene Peptid vom Harzträger entfernt. Dies erfolgt durch Behandlung des Peptidharzes mit Fluorwasserstoff. Der Fluorwasserstoff spaltet das Peptid vom Harz und spaltet zusätzlich alle verbleibenden Schutzgruppen mit Ausnahme der Formylgruppe von Trp ab. Diese Fluorwasserstoff-Behandlung wird in Gegenwart von m-Cresol und Anisol durchgeführt, die nachweislich die mögliche Alkylierung von einigen in der Peptidkette vorhandenen Aminosäuren hemmen.
Nach Vollendung der Spaltreaktion wird das Produkt in der reduzierten Form erhalten, d. h. mit der Formel I':
A - Cys - X - D-Trp - Lys - Y - Cys - B (I'),
worin A, X, Y und B wie oben definiert sind. Durch Oxydation wird eine Disulfidbrücke erzeugt und die Produkte können in der cyclisierten Form der Formel I erhalten werden.
Obwohl die Wahl der bestimmten Schutzgruppen, die bei der Zubereitung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden, eine dem Fachmann zugehörende Angelegenheit bleibt, muß darauf geachtet werden, daß die richtige Wahl der Schutzgruppen von den besonderen nachfolgenden Reaktionen abhängt, die durchzuführen sind. So muß die gewählte Schutzgruppe sowohl gegenüber den Reagenzien als auch unter den herrschenden Bedingungen in den folgenden Schritten der Reaktionsfolge stabil sein. Zum Beispiel muß die besondere verwendete Schutzgruppe, wie bereits oben erwähnt wurde, unter den Bedingungen, die bei der Abspaltung der Alpha-Aminoschutzgruppe des Endaminosäurerestes des Peptidfragmentes herrschen, in der Vorbereitung für die Kopplung des nächstfolgenden Aminosäurefragmentes an die Peptidkette intakt bleiben. Es ist auch wichtig, eine Schutzgruppe zu wählen, die während dies Aufbaus der Peptidkette intakt bleibt und die bei Vollendung der Synthese des gewünschten Octapeptidproduktes leicht zu entfernen ist. Alle diese Punkte liegen im Bereich des Wissens und Verständnisses eines Fachmannes.
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten Octapeptide wie auch ihre entsprechenden pharmazeutisch oder therapeutisch akzeptablen Säureadditionssalze sind zweckmäßig, da sie die pharmakologische Aktivität des natürlichen Tetradecapeptids Somatostatin besitzen. Diese Aktivität kann einfach in pharmakologischen Tests nachgewiesen werden, wie in einer Abänderung des in vitro Verfahrens von Saffran und Schally, Can.J. Biochem. Physiol., 33, 405 (1955), das in Schally. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 52, 1314 (1973) und River et al., C. R. Acad. Sci. Paris, Ser. D., 276 2337 (1973) angeführt ist.
Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Octapeptide, die Hormonfreisetzung in vitro zu hemmen, wird durch das von Meyers. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 74 630 (1977) beschriebene Verfahren gezeigt. Dieses Verfahren zeigt, daß die erfindungsgemäßen Octapeptide die Freisetzung des radioimmuntestbaren Wachstumshormons und Prolaktins ja vitro von enzymatisch dispergierten Hypophysenvorderlappenzellen von Ratten hemmen, die nach der Beschreibung von. Labrie. et al., Sixth Karolinska Symp. on Res. Meth. in Reprod. Endocrinol., (E. Diczfalusy, Ed.) S. 301-328 (1973) bereitet wurden. Nach vier Tagen in der Kultur werden die Zellen gewaschen und fünf Stunden bei 37ºC in Dulbeccomodifiziertem Eagle's Medium mit oder ohne zunehmende Konzentrationen jedes Octapeptidanalogs inkubiert. Die Wachstumshormon- und Prolaktinspiegel werden durch Radioimmuntest bestimmt, unter Anwendung der Methoden, die von Birge. et al., Endocrinol., 81, 195-204 (1967) für das Rattenwachstumshormon und von Niswender, et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., V130, 793 (1969) für Prolaktin beschrieben wurden. NIAMDD Ratten GH- und Prolaktin RIA-Sätze wurden hier als Standards verwendet. Die erforderliche Dosis für eine 50%-Hemmung der Wachstumshormonfreisetzung (ED 50) wird für jedes Analog durch die Methode von Rodbard, Endocrinol., 94, 1427-1437 (1974) bestimmt.
Die in vitro-Hemmung des Wachstumshormons und Prolaktins kann auch in einem Hypophysenzellen-Superfusionssystem gemessen werden, wie von Vigh und Schally (Peptides, Bd. 5, Anhang 1., S. 241-247) beschrieben wird. Erwachsene männliche oder weibliche Sprague-Dawley Ratten werden für jedes Experiment geköpft. Die Hypophysenvorderlappen werden in kleine Stücke zerschnitten und in einem Dubnoff-Inkubator 45 Minuten bei 37ºC in 10 ml oxydiertem Medium 199 (GIBCO), das 0,5% Collagenase, 0,25% Rinderserumalbumin (BSA) und 50 ul/ml Gentamicinsulfat enthält, inkubiert. Nach dieser Inkubation können die Fragmente leicht in einzelne Zellen durch wiederholtes Ansaugen und Ausstoßen aus einem Gilson Pipetman dispergiert werden. Nach 30 bis 60 Pitpetman- Abläufen fällt das Gewebe auseinander. Die Zellsuspension wird bei Raumtemperatur 10 Minuten zu 100 g zentrifugiert. Das Zellpellet wird dann in 1,0 ml Medium resuspendiert. Eine kleine Teilmenge wird für das Zählen der Zellen verdünnt und der Rest der Suspension wird in 4 gleiche Volumina geteilt. Jedes Volumen (das etwa 5·10&sup6; Zellen enthält) wird mit 0,5 ml Sephadex G-15 vermischt, das mit zuvor oxydiertem Medium äquilibriert wurde. Das Gemisch aus Hypophysenzellen und Sephadex wird in vier Kammern des Superfusionsapparates gebracht, der aus einer Reihe von 1 ml Kunststoffspritzenzylindern besteht (die durch Abschneiden ihrer distalen Enden modifiziert sind), die vertikal in einem Plexiglasträger befestigt sind, der durch umlaufendes Wasser auf 37ºC gehalten wird. Der Fluß durch das System (0,5 ml/Min.) wird mit einer peristaltischen Mehrkanalpumpe (Vigh und Schally, Peptides, Bd. 5, Anhang 1, S. 214-247) reguliert. Ratten-Prolaktin und Ratten-GH wurden in Teilmengen der Superschmelzen durch HA zur Bestimmung der basalen oder gehemmten Sekretion gemessen.
Es wurde folgender in vivo Wachstumshormon-Biotest verwendet:
Männliche Charles River CD-Ratten (200-300 g) mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser wurden mit Natriumphenobarbital (60 mg/kg intraperitoneal) anästhesiert. Dreißig Minuten später wird Kochsalzlösung oder Octapeptid subcutan injiziert und 15 Minuten nach der subcutanen Injektion werden Blutproben aus der Jugularvene entnommen. Das Plasma wird abgetrennt und durch HA wie oben beschrieben auf Wachstumshormone untersucht. Dieser in vivo Biotest ist eine Abänderung der von Schally et al., "Hypothalamic Peptide Hormones: Basic and Clinical Studies", "Hormonal Proteins and Peptides", C.H. Li, Hrsg. Academic Press, N.Y. 1978; Meyers, C.A., Murphy, W.A., Redding, T.W., Coy, D.H. und Schally, A.V., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 77:6171, 1980; Murphy, W.A., Meyers, C.A. und Coy, D.H., Endoc. 109: 491, (1981), wie auch von Veber et al., Pro. Natl. Acad. Sci., USA 75:2636-3640 (1978), verwendeten Methoden. Bei einigen Analogen sind Dosen von nur 0,02 ug/100 g oder sogar 0,005 ug/100 g aktiv. Die Potenz der erfindungsgemäßen Octapeptide im Vergleich zu Somatostatin ist in den Tabellen A, B und C angeführt. Einzeldosistests sind in Tabelle A und 4-Punkt-Bestimmungen bei 2 Dosenhöhen in den Tabellen B und C dargestellt. TABELLE A Einzeldosistests von Somatostatin-Octapeptidanalogen im Vergleich zu Somatostatin 14. (SS-14) Hemmung der GH-Freisetzung Getestete Substanz Injizierte Menge/100 g Körpergewicht GH-Spiegel Mittel±SEM KONTROLLE KOCHSALZLÖSUNG * p (0,01 im Vergleich zu Kontrolle (Duncan-Test)) TABELLE B Vier-Punkt Bestimmung der Hemmungsaktivität auf die GH-Freisetzung von Somatostatin-Octapeptidanalogen im Vergleich zu Somatostatin-14 bei Ratten Getestete Substanz Injizierte Menge/100 g Körpergewicht GH-Spiegel Mittel±SEM KONTROLLE KOCHSALZLÖSUNG im Vergleich zu Antilog Potenz
Faktorielle statistische Analysen und Berechnungen der Potenzen in 4-Punkt-Bestimmungen wurden nach der Methode von Bliss und Marks (Bliss C.I. und Marks; H.P.: Quart. J. Pharm. and Pharmacol. 12, 82 und 182, 1946), und Pugsley, (L.I.: Endocr., 39 161-176, 1946) durchgeführt. TABELLE C Relative Potenzen von Somatostatin und Somatostatinanalogen auf die Hemmung von GH- und Insulinfreisetzung in vivo, basierend auf 4-Punkt-Bestimmungen CODE PEPTID (Somatostatin) HEMMUNGSPOTENZ in vivo INSULIN TABELLE C (Fortsetzung) Relative Potenzen von Somatostatin und Somatostatinanalogen auf die Hemmung von GH- und Insulinfreisetzung in vivo, basierend auf 4-Punkt-Bestimmungen CODE PEPTID (Somatostatin) HEMMUNGSPOTENZ in vivo INSULIN TABELLE C (Fortsetzung) Relative Potenzen von Somatostatin und Somatostatinanalogen auf die Hemmung von GH- und Insulinfreisetzung in vivo, basierend auf 4-Punkt-Bestimmungen CODE PEPTID (Somatostatin) HEMMUNGSPOTENZ in vivo INSULIN
Faktorielle statistische Analysen und Berechnungen der Potenzen in 4-Punkt-Bestimmungen wurden nach der Methode von Bliss und Marks (Bliss C.I. und Marks; H.P.: Quart. J. Pharm. and Pharmacol. 12, 82 und 182, 1946), und Pugsley, (L.I.: Endocr., 39, 161-176, 1946) durchgeführt.
Zur Bestimmung des zeitlichen Ablaufs der erfindungsgemäßen Verbindungen werden männliche Ratten mit Nembutal anästhesiert und es wird Kochsalzlösung oder das Test- Octapeptid wie bei dem obengenannten Wachstumshormon-Potenztest injiziert. 15, 30, 45, 60, 90, 120 und 180 Minuten nach der subcutanen Injektion wird Blut aus der Jugularvene entnommen. Dieses Zeitverlaufexperiment an Octapeptiden zur Wachstumshormonfreisetzung zeigt in vivo eine deutliche Suppression des Plasmawachstumshormons. Bei einer Dosis 0,1 ug/100 g, subcutan verabreicht, hemmt das Octapeptid
die Wachstumshormonfreisetzung für zumindest 3 Stunden signifikant. Bei einer Dosis von 2 ug/100 g wird die Hemmwirkung von Somatostatin auf die Wachstumshormonfreisetzung nach 30 Minuten nicht mehr beobachtet (Fig. 1). Die synthetischen Octapeptide senkten den Wachstumshormon- und Prolaktinspiegel auch in vitro.
Die Octapeptide der vorliegenden Erfindung werden auch mit synthetischem Somatostatin hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die Insulin- und Glucagonfreisetzung in vivo bei 250-300 g schweren männlichen Ratten (CD-Stamm, Charles River) zu hemmen, verglichen. Die Ratten werden 1 Woche vor dem Test bei regulierten Temperatur- (24ºC) und Lichtbedingungen (0500-1900h) gehalten. Die Ratten werden 27-30 Stunden bei freiem Zugang zu Wasser hungern gelassen und dann mit Nembutal anästhesiert (6 mg/100 g intraperitoneal). Nach 30 Minuten wird Kochsalzlösung oder das Test-Peptid in die Jugularvene injiziert und 5 Minuten später wird Blut von der Leberpfortader entnommen und dann in abgekühlte Röhrchen, die EDTA (2,5 mg/ml) und Trasylol (500 K.I.U./ml) enthalten, gefüllt. Plasma wird abgetrennt und bis zur Insulin- und Glucagonbestimmung bei -20ºC gelagert. Plasmainsulin wird durch doppelten Antikörper-Radioimmuntest unter Verwendung eines Satzes von Cambridge Medical Diagnostics, Mass., bestimmt.
Plasmaglucagon wird durch die Methode von Faloona, etal., (1974) in: Methods of Hormone Radioimmunoassay, Hrsg. Jaffe, B. und Behrman, H.R., Academic Press, New York, S. 317-330, unter Verwendung von kristallinem Glucagon (Eli Lilly) und Kaninchen Antiserum 30K gegen Glucagon (Unger Pool 4, Charge 8) bestimmt. Porcine ¹²&sup5;I-Glucagon wurde auch von Cambridge Medical Diagnostics, Cambridge, Mass., erworben.
Bei den obengenannten Testsystemen zeigt sich, daß die Octapeptide der vorliegenden Erfindung die Insulinfreisetzung in vivo auf einer Gewichtsbasis stärker hemmten als Somatostatin (siehe Tabelle C). Wegen der hohen Potenz der Octapeptide der vorliegenden Erfindung, der fehlenden Toxizität und der langen Dauer ihrer Aktivität sind diese Octapeptide zur Anwendung in der Behandlung einer Reihe von Erkrankungen und Zuständen zweckmäßig. Zum Beispiel können die Octapeptide der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung der Insulinresistenz bei fettleibigen Patienten verwendet werden. Die Verwendung dieser Verbindung verhindert die endogene Insulinsekretion. Bisher wurde Somatostatin oder Propranolol für diesen Zweck verwendet. (Shen. et al., J. Clin. Inv. 49, 2151 (1970)). Bei dieser Methode werden Standardmengen von Glukose, Insulin und Octapeptiden 150 Minuten infundiert, um eine Gesamtkörperresistenz gegenüber exogenem Insulin bei fettleibigen Patienten zu demonstrieren. Nach 90 Minuten sollte eine Gleichgewichtsspiegel von Plasmainsulin und Glucose erreicht sein. Während der Periode bleibt die endogene Insulinsekretion, die durch C-Peptid-Messung bestimmt wird, und die Glucagonsekretion gehemmt. Wenn die Gleichgewichtsspiegel des Plasmainsulins bei den Patienten aufrechterhalten werden, kann die Höhe der stationären Plasmaglucosekonzentration als Index der Gesamtkörperempfindlichkeit gegenüber insulinvermittelter Glucoseaufnahme betrachtet werden. Es kann ein positives Verhältnis zwischen der stationären Plasmaglucosekonzentration und dem Ausmaß der Fettleibigkeit gezeigt werden. Dies wird durch ähnliche Studien mit Somatostatin von Magulesparan et al., Diabetes, 28, 980 (1979) bestätigt, aber die Octapeptide sind aufgrund ihrer verlängerten Insulinhemmung besser.
Bei diabetischen Patienten, die kein Insulin erzeugen, sollte durch die Hemmung der Wachstumshormon- und Glucagonsekretion durch Verwendung der Octapeptide der vorliegenden Erfindung die Insulindosis auf 1/4-1/3 der vom Patienten bei fehlenden Octapeptiden benötigten Dosis reduzierbar sein. Dies wird durch die Arbeit von Besser. et al., Brit. Med. Journal 4, 622-627 (1974) und Gerich et al., Diabetologia, 13, 537 (1977) bestätigt. Diese Studien verwendeten Somatostatin als Adjunkt zu Insulin. Ähnlich können die Octapeptide der vorliegenden Erfindung vorteilhaft anstelle von Somatostatin verwendet werden. Zusätzlich sind die Octapeptide durch Hemmung der Wachstumshormonsekretion auch zur Behandlung der diabetischen Retinopathie zweckmäßig, die Gefäßschäden verursacht.
Bei einigen Patienten wird noch nach Entfernung der Hypophyse und nach der Bromcryptinbehandlung ein erhöhter Wachstumshormonspiegel beobachtet. Bei Verwendung der Octapeptide der vorliegenden Erfindung in Kombination mit Bromcryptin oder einem anderen ähnlich wirksamen Medikament wird der Wachstumshormonspiegel gesenkt. Zusätzlich können auch LHRH Agonisten, die bei chronischer Verabreichung zu paradoxen Hemmwirkungen führen, verwendet werden. Eine kombinierte Hormonbehandlung, bestehend aus Octapeptiden, LH-RL-Analogen und Bromcryptin kann zur Behandlung der Akromegalie verwendet werden, während ähnliche Kombinationsbehandlungen für andere Neoplasmen zweckmäßig sind. Wenn die Tumore hormonabhängig sind und diese Hormone durch Octapeptide gehemmt werden, können diese Tumore mit Octapeptiden behandelt werden. Zum Beispiel sind Maus- und andere Säugetier-Chondrosarkoma wachstumshormonabhängig. McCumbee, Fed. Proc., 30, 428 (1979) berichtete, daß Ratten (Swarm) Chondrosarkoma wachstums-hormonabhängig sind. Menschliche Chondrosarkoma sind den Swarm- Chondrosarkoma ähnlich. Somatostatinanaloge hemmen das Wachstum von Swarm- Chondrosarkoma (Redding und Schally, A.V. Proc. Nat. Acad. Sciences, 80, 1078-1082 (1983)) und die Octapeptide der vorliegenden Erfindung sind ähnlich geeignet, eine Rückbildung von menschlichen Chondrosarkoma-Tumoren herbeizuführen, die durch Chemotherapie nicht kontrolliert werden können. Gleichfalls sind Dunn-Osteosarkoma C3H/HeJ bei Mäusen den menschlichen Tumoren ähnlich und scheinen hormon- (GH-) abhängig zu sein (Ghanta et al., Natl. Cancer Inst. 57, 837-839 (1976)). Verschiedene Analoge von Somatostatin hemmen das Wachstum von Dunn-Osteosarkoma (Schally. et al., Cancer Treatment Reports, 68, 281, (1984)), Schally. et al., Proc. Soc. Exp. Med., 175, 259 (1984). Es zeigte sich, daß das Octapeptid RC-15,
bei Dosen von 5 ug/Tag das Überleben von Mäusen mit Dunn- Osteosarkoma deutlich verlängerte. Das Octapeptid RC-121-2H, D-Phe-Cys(SH)-Tyr-D- Trp-Lys-Val-Cys(SH)-ThrNH&sub2; in Dosen von 2,5 ug/b.i.d. hemmte auch deutlich das Wachstum von Dunn-Osteosarkoma Tumoren bei weiblichen C3H-Mäusen. Die Überlebensrate in % betrug 100% ± 0,0% im Vergleich zu 75% ± 22% bei Kontrollen am Tag 16.
Die Messung der Antitumoraktivität der Octapeptide dieser Erfindung in einem Mammakarzinom-Tiermodell ist wie folgt Verschiedene hormonabhängige Brusttumore bei Ratten und Mäusen wurden als östrogenabhängig und/oder prolaktinabhängig nachgewiesen (Arafah et al., Endocrinology, 107, 1364 (1980)); Schally et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 175, 259 (1984). Es ist bekannt, daß etwa 1/3 der menschlichen Brustkrebserkrankungen östrogenabhängig sind. Jüngste Anzeichen weisen darauf hin, daß ein signifikanter Teil (30-40%) der menschlichen Brustkrebserkrankungen auch prolaktinabhängig sein kann (Malarkey, et al., J. Clin. Endoc. Metab., 56, 673-677 (1983)); Ben. et al., Israeli J. Med. Sci., 17, 965 (1981). Zusätzlich ist auch das Wachstumshormon am Wachstum des Brustkrebs beteiligt. Die Octapeptide der vorliegenden Erfindung können durch Hemmung der Prolaktin- und Wachstumshormonsekretion zur Herbeiführung einer Rückbildung der menschlichen Brustkarzinome geeignet sein. Die Antitumoraktivität der Octapeptide der vorliegenden Erfindung wird im MT/W9A-Ratten Mamma-Adenokarzinommodell gemessen. Das östrogenabhängige MT/W9A-Ratten Mamma-Adenokarzinom wird von Roswell Park Memorial Institute, Buffalo, N.Y. erhalten. Der MT/W9A-Mammatumor wurde als östrogenabhängig im Wachstum charakterisiert (Kim und Depowski, Cancer Research, 35, 2068-2077 (1975)). Das Tumorgewebe wird in etwa 1 mm³ Stücke oder bis zu einer feinen Aufschlämmung zerkleinert und durch eine 18G-Nadel in den inguinalen Mammafettpolster von weiblichen Wistar Furth-Ratten (90 g Körpergewicht) injiziert. Nach etwa 3,5 Monaten waren die Tumore tastbar und das Experiment begann. Octapeptid RC-15,
in Dosen von 3 ug/b.i.d. (zweimal täglich) hemmte das Wachstum des MT/W9A-Ratten Mammatumors stark und verringerte die prozentuelle Veränderung im Tumorvolumen auf 1106 ± 447% im Vergleich zu 2808 ± 812% bei den Kontrollen nach 16 Behandlungstagen. Somit können die Octapeptide der vorliegenden Erfindung zur Behandlung menschlicher Brustkarzinoma verwendet werden. Die therapeutische Wirkung der Octapeptide beruht auf der Hemmung der Wachstumshormon- und Prolaktinsekretion. Das Octapeptid kann alleine oder in Kombination mit LH-RH-Analogen wie D-Tip-6-LH-RH verabreicht werden, wodurch das Wachstum von östrogenabhängigen Mammatumoren gehemmt wird (Redding und Schally, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80, 1459-1462 (1983)).
Zur Bestimmung der Aktivität bei Pankreaskarzinoma werden Tiermodelle mit Pankreaskrebs mit azinösen und duktalen phänotypischen Eigenschaften verwendet. (Redding und Schally, A.V. Proc. Nat. Acad. Sci., 42, 248-252 (1984)). Die transplantierbaren, gut differentierten azinösen Pankreastumore DNCP-322 (CA-20948) in Wistar/Levis-Ratten (Longnecker. et al., Cancer Research 42, 19-24, (1982)); und Longnecker. et al., Cancer Letters, 2, 197-202 (1979) werden vom Department of Pathology, Dartmouth Medical School, Hanover, N.H. erhalten. Es werden syrische Goldhamster mit gut differentiertem (WD), chemisch induzierten duktalen Adenokarzinom (Scarpeili. et al., Cancer Res., 39, 452-458 (1979) verwendet. Das Spendertumorgewebe von jeder Art wird rasch herausgeschnitten und in eiskalter gepufferter Hanks-Kochsalzlösung, pH 7,4, gewaschen und das kapsuläre Material wird vorsichtig entfernt. Dann wird das Tumorgewebe in kleine Stücke geschnitten und durch ein Sieb Nr. 30 aus rostfreiem Stahl in einen Becher mit eiskaltem Puffer geleitet. Das Pellet wird in Puffer resuspendiert und 1 bis 2 mg Teilmengen des Tumorgewebes werden subcutan in den mittleren Rückenbereich von vor kurzem entwöhnten, männlichen Tieren des jeweiligen Modells injiziert, d. h. Wistar/Levis-Ratten oder LAS syrische Hamster. Subcutan transplantierte Longnecker DNCP-322 Tumore erreichen in etwa 4 Wochen einen Durchmesser von etwa 5 cm. Der WD-Tumor bei Goldhamstern wächst langsam und verdreifacht seine Größe in etwa 45 Tagen. Bei Ratten mit azinösem Pankreastumor verringerte die chronische Verabreichung der Octapeptide dieser Erfindung das Tumorgewicht und -volumen deutlich. Bei syrischen Hamstern mit der duktalen Form des Pankreaskrebs verringerte die chronische Verabreichung der Octapeptide das Tumorgewicht und -volumen (Redding und Schally, Proc. Nat. Acad. Sci., 81, 248-252 (1984)). Die prozentuelle Veränderung im Tumorvolumen war im Vergleich zu Kontrolltieren signifikant verringert. Der LHRH-Agonist D-Trp-6-LH-RH, der zweimal täglich in Form von Mikrokapseln mit regulierter Freisetzung verabreicht oder injiziert wurde, verringerte das Tumorgewicht und -volumen signifikant. Die Octapeptide verringern das Wachstum von duktalem und azinösem Pankreaskrebs, wahrscheinlich durch Hemmung der Freisetzung und/oder stimulierenden Wirkung auf die Hormone des Gastrointestinaltrakts, Gastrin, Sekretin und Cholecystokinin auf Tumorzellen (Schally et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 175, 259 (1984)). Eine kombinierte Verabreichung eines Octapeptids dieser Erfindung mit einem LH-RH-Agonisten führt zu einer stärkeren Hemmung von Pankreaskrebs als jene, die nur mit Somatostatinanalogen erhalten wird.
Für den Vergleich einiger der biologischen Wirkungen der Octapeptide der vorliegenden Erfindung und Somatostatin auf die gastrointestinalen Sekretionen und auf die Freisetzung einiger Hormone des Gastroinstestinaltrakts bei Hunden werden folgende Verfahren verwendet:
Mongrel-Hunde mit einem Gewicht von 15-20 kg werden chirurgisch mit Magen- (GF) und Pankreas- (PF) Fisteln vorbereitet, wie von Konturek. et al., (1976) 225, 497 und Konturek. et al., Gastroenteroiogy, (1976) 58, 1-6, beschrieben wird. Sekretionen von den GF und PF werden ständig in Abständen von 15 Minuten gesammelt. Die Wasserstoffion- und Pepsinkonzentrationen im Pankreassaft werden auch in 15- oder 30 Minuten Abgaben gemessen (Konturek. et al., J. Physiol. Lond., 255, 497 (1976) und Konturek. et al., (1976) supra.). Zunächst wird die basale Sekretion für zwei Zeiträume von 15 Minuten gesammelt und dann wird das sekretorische Stimulans für die Magensaftund/oder Pankreassekretion 3,5 Stunden verabreicht. Wenn der Sekretionswert eine anhaltende Kurvenhöhe erreicht, werden die Octapeptide oder Somatostatin in Standarddosen (2-4 ug/kg/Std.) eine Stunde lang i.v. verabreicht. Bei Kontrollexperimenten erhielten die Tiere sekretorische Stimulantien über die gesamte Testdauer.
Bei Tests der gastrischen Stimulation wird Pentagastrin oder Desglugastrin (Glutaroyl-Ala-Tyr-Gly-Trp-Leu-Asp-Phe-NH&sub2;), die, wie zuvor gezeigt wurde, eine nahezu maximale Magensäuresekretion hervorrufen, i.v. in einer konstanten Dosis (3 ug/kg/Std.) verabreicht. Die Magensekretion wird gemessen und der Säuregehalt durch Titrierung mit 0,1N NaOH bestimmt. In Tests zur Pankreassekretion werden synthetische Sekretion (Squibb and Sons, Inc., New York, N.Y.) und Caerulin (Farmitalia, Italien) in konstanten Dosen verwendet, die, wie zuvor gezeigt wurde, nahezu eine maximale Stimulierung des Bicarbonates der Pankreasenzymsekretion hervorrufen (Konturek. et al., (1976) supra.).
Experimente zur Pankreasstimulierung durch endogene Stimulantien werden unter Verwendung einer Duodenalinstillation von 0,1N HCl oder eines Fleischmehls (500 g) durchgeführt (Konturek. et al., (1976) supra.). Zur Serumgastrinbestimmung werden davor und alle 15-20 Minuten Blutproben entnommen (Yalow. et al., 58, 1-14 (1970)).
Die für die Octapeptide der vorliegenden Erfindung und Somatostatin erhaltenen Ergebnisse zur Magensäurereaation auf Pentagastrin sind wie folgt Sowohl die verabreichten Octapeptide als auch Somatostatin zeigten eine starke Hemmung der Pentagastrin- oder Desglugastrin-bedingten Magensäureausschüttung von dem GF. Die Hemmung von Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 5845-5848 (1984) und ähnliches.
Weitere Beispiele für Überzugsstoffe und Verfahren, die zur Mikroeinkapselung verwendet werden, werden von J.A. Herbig in "Encyclopedia of Chemical Technology", Bd. 13, 2. Aufl., S. 436-456 (1967), Wiley, New York, beschrieben. Solche Zubereitungsformen, wie auch Suspensionen von Salzen der Peptide, die in Körperflüssigkeiten nur schwerlöslich sind, zum Beispiel Salze mit Pamosäure oder Tannin, werden zur Freisetzung von etwa 0,1 mcg bis etwa 100 mcg der aktiven Verbindung/kg Körpergewicht pro Tag bereitet und werden vorzugsweise durch intramuskuläre Injektion verabreicht. Es können aber auch einige der festen Dosierungsformen, die oben angeführt sind, wie zum Beispiel einige schwer wasserlösliche Salze oder Dispersionen in, oder Absorbate an festen Trägern aus Salzen der Peptide, zum Beispiel Dispersionen in einem neutralen Hydrogel eines Polymers von Ethylenglykolmethacrylat oder ähnliche Monomere, die wie in U.S. Patent 3.551.556 beschrieben vernetzt sind, in Form von Pellets zubereitet werden, die etwa dieselben Mengen wie oben angeführt freisetzen und subcutan oder intramuskulär implantiert werden können.
Die Erfindung geht aus den folgenden Beispielen deutlicher hervor. Diese Beispiele dienen nur zur Illustration und es versteht sich, daß die Erfindung weder in ihrem Umfang, noch in ihrem Bereich durch die darin enthaltenen Einzelheiten beschränkt sein soll, da viele Abänderungen, sowohl hinsichtlich der Stoffe als auch der Verfahren für den Fachmann offensichtlich sind. In diesen Beispielen werden die folgenden Reinigungstechniken angewendet:
(Abkürzungen: HFBA = Heptafluorbuttersäure
HPLC = Hochdruckflüssigchromatographie
TFA = Trifluoressigsäure
UV = Ultraviolett)
Zur Bereitung der HPLC-Elutionsmittel wird Acetonitril mit UV-Güte von Burdick & Jackson erworben, TFA und HFBA weisen Sequanal-Güte auf und sind von Pierce und Wasser wird in Glas doppelt destilliert und durch ein Milli-Q-System (Millipore) geleitet.
Die Hochdruckflüssigchromatographie wird auf einem Waters HPLC-System, bestehend aus einem M 680 Automated Gradient-Regler, zwei M6000A Pumpen, einem U6K-Injektor und einem Schoeffell SF 770 UV-Detektor mit variabler Wellenlänge, durchgeführt.
Sowohl zur Analyse als auch zur Reinigung der Verbindungen wird Umkehrphasen- HPLC auf C18 Säulen durchgeführt. Die Qualität und die Elutionseigenschaften der rohen Peptide werden durch analytische HPLC auf einer Vydac 218TP5 Säule (4,6 mm·25 cm) bestimmt unter Verwendung binärer Gradienten des Lösungsmittels A: 0,1% TFA in Wasser und Lösungsmittels B: 0,1% TFA in CH&sub3;CN/Wasser 70:30. Die gute Qualität der rohen synthetischen Produkte in Verbindung mit optimalen Trennungsbedingungen ermöglicht ein rasches, einstufiges Reinigungsschema. Die Auflösung, vergleichbar mit jener von analytischen Trennungen, wurde durch Verwendung eines 5 um Korngrößen-Füllkörpers und einer Probenbelastung unter der Kapazität der Säule erzielt. Es werden sechs bis dreiundzwanzig mg Octapeptid in 2-5 mg Teilen auf eine halbpräparative Vydac 218TP5-Säule injiziert (10 mm·25 cm) und isokratisch oder durch einen flachen Gradienten (0,1-0,2% B/Min.) unter Verwendung des Lösungsmittelsystems, das 0,1% TFA enthält, wie in der Folge beschrieben wird, eluiert.
Für ein optimales "Peakscheren" werden die Hauptbestandteile von Hand gesammelt. Das flüchtige Elutionsmittel wird durch Gefriertrocknung entfernt und dann werden die Produkte von 1M AcOH relyophilisiert, wodurch 0,7 mg (10-45%) des gereinigten Octapeptids erhalten werden. Die Homogenität der Octapeptide wird durch analytische HPCL in zwei verschiedenen Lösungsmittelsystemen geprüft (I: 0,1% TFA/CH&sub3;CN/Wasser, 11: 0,13% HBA/CH&sub3;CN/Wasser). Bei Verwendung dieser Techniken ist die Reinheit besser als 90%, beruhend auf UV-Extinktion bei 210 nm. BEISPIEL 1
0,50 g Benzhydrylamin- (BHA-) Harz (ca. 0,5 NH&sub2;/g Harz) werden einem 10 ml Reaktionsgefäß mit einem besonderen Fritterfilter mittlerer Porosität zugegeben, mit 10% Triethylamin in CH&sub2;Cl&sub2; zweimal jeweils drei Minuten behandelt und mit CH&sub2;Cl&sub2; sechsmal gewaschen.
Das Harz wird mit Boc-Thr(Bz) (0,75 m Mol) und HOBt (0,82 m Mol) in DMF drei Minuten vermischt. 5% Diisopropylcarbodiimid (0,82 m Mol) CH&sub2;Cl&sub2; wird zugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 90 Minuten geschüttelt. Das erhaltene Harz wird sechsmal mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen und einer Ninhydrinreaktion unterzogen (Kaiser. et al., Analytical Biochemistry, 34, 595 (1970)). Es sollte in diesem Zustand negativ sein.
Die Entfernung des Schutzes der Boc-Gruppe vom Boc-Trp(Bz)-BHA-Harz wird wie folgt durchgeführt: Das Harz wird mit einer Lösung aus Trifluoressigsäure und Methylenchlorid (1:1) 5 Minuten behandelt, filtriert und neuerlich 25 Minuten behandelt, filtriert und dann sechsmal mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen.
Die Behandlung mit 10% Triethylamin wird, wie für Benzhydrylaminharz beschrieben, durchgeführt.
Die folgenden Aminosäurereste werden dann der Reihe nach durch Kopplung, wie oben beschrieben, eingeführt.
Die Entfernung der Schutzgruppe wird, die für Boc-Trp(Bz)-BHA-Harz beschrieben wurde, durchgeführt. Nach dem Einbau von Boc-D-Trp werden 5% Mercaptoethanol zu 50% Trifluoressigsäure in CH&sub2;Cl&sub2; zugegeben; Boc-D-p-Cl.Phe-Cys(MBz)-Phe- DTrp-Lys(2-CIZ)-Thr-(Bz)-Cys(MBz)-Thr(Bz)-BHA; Harz wird erhalten. Nach der Entfernung der Schutzgruppe und Neutralisierung wird unter Verwendung von (Ac&sub2;O) in CH&sub2;Cl&sub2; 60 Minuten (12,5 m Mol) eine Acetylierung durchgeführt.
Schließlich wird das Peptidharz mit CH&sub2;Cl&sub2;, Methanol und CH&sub2;Cl&sub2; jeweils dreimal gewaschen und unter Vakuum getrocknet. 0,902 g Ac-D-p-Cl.Phe-Cys(MBz)-Phe-D- Trp-Lys(2-ClZ)-Thr(Bz)-Cys(MBz)-Thr(Bz)-BHA-Harz wird erhalten.
500 mg geschütztes Octapeptid-BHA-Harz wird mit 0,5 ml Cresol und 0,5 ml 1,2-Ethandithiol vermischt und in 10 ml Fluorwasserstoff bei 0ºC 1 Stunde gerührt. Überschüssiger Fluorwasserstoff wird unter Vakuum verdampft. Das Peptid- und Harzgemisch wird mit Ethylacetat gewaschen und mit 30% HOAc extrahiert und lyophilisiert. 112 mg rohes Produktpulver bestehend aus Ac-D-p-Cl.Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH&sub2; wird erhalten.
110 mg rohe, reduzierte Form wird in 20 ml 50% HOAc aufgelöst und mit entgastem Wasser (N&sub2;) auf 500 ml verdünnt, mit 28% Ammoniumhydroxid auf pH 6,8 eingestellt, danach wird 0,005N Kaliumferrocyanidlösung unter Rühren eingetropft, bis eine ständig gelbe Farbe beobachtet wird. Nach 15-minütigem Rühren wird der pH mit HOAc wieder auf 5 eingestellt. Es werden 5 g Bio Red AG 3 - X 4A Harz (Chloridform) zur Entfernung von Eisen(III)- und Cyanoferrat(II)-Salzen eingeführt. Das Filtrat wird lyophilisiert. Der Rest wird einer Gelfiltration auf einer Sephadex G15-Säule (1·120 cm) unterzogen und mit 50% Essigsäure eluiert. Der Hauptpeak wird lyophilisiert und 57 mg der rohen, oxydierten Form
wird erhalten und dann durch Chromatographie (Hochdruckflüssigchromatographie) gereinigt, um 10,56 mg reines Octapeptid zu erhalten. BEISPIEL 2
185 mg BHA-Harz (0,5 mm BHA/g Harz) wird in ein 20 ml Reaktionsgefäß eingebracht, das auf einem mechanischen Schüttelapparat befestigt ist.
Die folgenden Aminosäurereste, Boc-Thr(Bz), Boc-Cys(MBz), Boc-Val, Boc-Lys(2-ClZ), Boc-D-Trp, Boc-Tyr(2-Brz), Boc-Cys(MBz) und Boc-D-Phe werden der Reihe nach durch Kopplung und Entfernung der Schutzgruppe in derselben Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben ist, eingeführt. 330 mg TFA-D-Phe-Cys(MBz)-Tyr(2-BrZ)-D-Trp-Lys(2-Clz)-Val-Cys(MBz)-Thr(Bz)--BHA-Harz wird schließlich erhalten.
Das geschützte Octapeptid Amid-Harz wird mit HF behandelt, um 68,1 mg rohe, reduzierte Form zu erhalten. 6,1 mg rohe, reduzierte Form werden durch HPLC gereinigt, um 1,0 mg reines D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH&sub2; zu erhalten. 40 mg rohe Form wird, wie in Beispiel 1 beschrieben ist, oxydiert. Das lyophilisierte Pulver, das aus der oxydierten Form und Salzen besteht, wird einer Gelfiltration mit Sephadex GIS unterzogen und mit 50% Essigsäure eluiert. Der Hauptpeak wird dann lyophilisiert, um 38,1 mg zu erhalten, wovon 24,7 mg durch HPLC gereinigt wird, um 9,0 mg reines
zu halten. BEISPIEL 3
230 mg Benzhydrylaminharz (ca. 0,5 mm BHA/g Harz) werden in ein 5 ml Reaktionsgefäß eingebracht, das auf einem mechanischen Schüttelapparat befestigt ist. Das geschützte Octapeptidharz wird nach der stufenweise Kopplung von folgendem erhalten:
Boc-Pro, Boc-Cys(MBz), Boc-Thr(Bz), Boc-Lys(2-ClZ), Boc-D/L-SF-Trp, Boc-Phe, Boc-Cys(MBz), Boc-D-Phe.
Nach der letzten Entfernung der Schutzgruppe wird eine Acetylierung durchgeführt. 351 mg Ac-D-Phe-Cys(MBz)-Phe-D/L-SF-Trp-Lys(2Clz)-Thr(Bz)-Cys(MBz)-Pro-BHA-- Harz wird schließlich erhalten und mit HF behandelt, um 74,5 mg rohe, reduzierte Form zu erhalten. Das rohe Peptid in reduzierter Form wird, wie in Beispiel 1 beschrieben ist, oxydiert. Nach der Gelfiltration wird eine weitere Reinigung und Abtrennung der D/L- Diastereomere durch HPLC durchgeführt. BEISPIEL 4
200 mg Benzhydrylaminharz (ca. 0,36 m Mol NH&sub2;/g Harz) wird in ein Schüttelreaktionsgefäß gebracht. Nach der Zugabe der geschützten Aminosäuren wird TFA-D-Phe-Cys(MBz)-Tyr(2-Brz)-D/L-5F-Trp-Lys(2-ClZ)-Val-Cys(MBz)-Thr-(Bz)-BHA- Harz (394 mg) erhalten. Das geschützte Harz wird mit HF behandelt, um 97,5 mg rohes Peptid D-Phe-Cys-Tyr-D/L-SF-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH&sub2; (in reduzierter Form) zu erhalten. 80 mg rohe, reduzierte Form wird oxydiert, wie in Beispiel 1 beschrieben ist. Nach der Gelfiltration werden die Peaks I und II lyophilisiert, wobei jeweils 19,8 mg erhalten werden. Eine weitere Reinigung und Abtrennung der D/L-Diastereomere wird durch HPLC durchgeführt. BEISPIEL 5
292 mg TFA-D-Trp-Cys(MBz)-Phe-D-Trp-Lys(2-ClZ)Thr(Bz)-Cys(MBz)-Thr(Bz)- BHA-Harz wurde aus 150 mg BHA-Harz (0,5 mm BHA/g Harz) nach stufenweiser Kopplung erhalten. Das geschützte Octapeptid-Amid-Harz wurde mit HF behandelt, um 72,8 mg rohe reduzierte Form zu erhalten. 22,5 mg rohe reduzierte Form wurden durch HPLC gereinigt, um 8,0 mg reines D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH&sub2; (RC-98-I-2H) zu erhalten.
Die Oxydierung der reduzierten Form wurde wegen seiner schlechten Löslichkeit mit Jod unter den Bedingungen ausgeführt, die für die Oxydierung mit Kaliumferricyanid verwendet wurde. Das Verfahren wird in der Folge beschrieben:
50 mg rohe reduzierte Form wurden in 100 ml 95% AcOH aufgelöst, danach wurden 0,005 M Jodlösung in eisiges AcOH eingetropft, bis die gelbe Farbe bestehen blieb. Überschüssiges Jod wurde durch Zugabe von Zinkpulver entfernt. Nach der Oxydierung wurde das rohe Disulfidpeptid einer Gelfiltration auf einer Sephadex G15-Säule unterzogen. Wenn die Octapeptide zwei Trp-Reste enthielten, wurde eine zweistufige Elution durchgeführt.
Das rohe, oxydierte Produkt wurde in 50% AcOH aufgelöst und auf die Sephadex-Säule aufgebracht, die mit Wasser äquilibriert worden war. Die Salze wurden von der Säule mit Wasser abgewaschen und danach wurde das Peptid eluiert und mit 50% AcOH fraktioniert. Der Hauptpeak wurde lyophilisiert und 30 mg rohes oxydiertes Produkt wurde erhalten. Weitere Reinigungsschritte wurde durch halbpräparative HPLC durchgeführt, um 9,4 mg reines
(RC-98-I) zu erhalten. Das gereinigte Octapeptid wurde durch Aminosäureanalysen charakterisiert und analytische HPLC zeigte die erwarteten Ergebnisse. SOMATOSTATINANALOGE-POTENZTEST #1 (89. Experiment) Code Injizierte Dosis (ug/100 g Körpergewicht GH-Spiegel KONTROLLE Rinderserumalbumin
RC-98.I.2H im Vergleich zu SS-14: M = 0,6653, Antilog M = 4,63, Potenz = 92,6-fache im Vergleich zu SS-14. SOMATOSTATINANALOGE-POTENZTEST #2 (108. Experiment) Code Injizierte Dosis (ug/100 g Körpergewicht) GH-Spiegel KONTROLLE Rinderserumalbumin (Somatostatin #14) POTENZ % CODE im Vergl. zu SOMATOSTATINANALOG-POTENZTEST #3 CODE INJIZIERTE DOSIS GH-RH-Spiegel im Vergleich zu Potenz* * Beruhend auf den Zeitverlauf von CPZ und morphinstimulierter GH-Selektion.
Aus der Darstellung in Fig. 1 geht hervor, daß der Rebound von SS-14 auf der Kontrollinie höchst unerwünscht ist.

BEISPIEL 6

Die folgenden Verbindungen werden auf ähnliche Weise unter Verwendung der Techniken und Verfahren, die in den Beispielen 1-5 beschrieben sind, erhalten. TABELLE 1 Formel (I) und (I') (reduzierte Form) (oxydierte Form) Formel TABELLE 1 (Fortsetzung) Formel (I) und (I') (reduzierte Form) (oxydierte Form) Formel TABELLE 2 Formel (II) und (II') Formel TABELLE 2 (Fortsetzung) Formel (II) und (II') Formel TABELLE 3 Formel (III) und (IV') Formel TABELLE 4 Formel (V) und (VI) Formel TABELLE 5 Berechnung der gastrischen und hemmenden Aktivität des Octapeptids RC-88-II = p-Cl-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH&sub2; basierend auf 16 Experimenten an Hunden mit Magenfisteln Originaldaten Standard-Dosis Nieder Hoch Getestetes Material Summe d. Quadrate-DF Mittleres Quadrat F Verhältnis Reihe (Material) Spalte (Dosis) Wechselwirkung Zwischensumme in Dosen Gesamt:
SDT FEHLER: 7,86333
F-WERTE
REIHE (Proben) 27,6527 SIGNIFIKANT
SPALTE (Neigung) 22,3205
WECHSELWIRKUNG
(parallel) 4.78458
PROBENPOTENZ = 216,303%
POTENZBEREICH VON 140,669% bis 332,605%
LAMBDA (Genauigkeitsgrade) = 0,23486IE-01

Claims

1. Verbindung der Formel

worin

a) X L-Tyrosin (L-Tyr) und Y L-Valin (L-Val) darstellen; oder

b) X L-Phenylalanin (L-Phe) und Y L-Threonin (L-Thr) darstellen; und

A eine L, D oder DL Aminosäure die aus der Gruppe bestehend aus Phenylalanin (Phe), para-Chlorphenylalanin (p-Cl-Phe) und Tryptophan (Trp) oder deren acetylierte Derivaten ausgewählt wird; und

B eine L, D oder DL Aminosäure die aus der Gruppe bestehend aus Threoninamid (Thr-NH&sub2;) und

Tryptophanamid (Trp-NH&sub2;) ausgewählt wird, und deren pharmazeutisch akzeptable Säureadditionssalze; mit der Bedingung daß, B kann nicht D-Thr-NH&sub2; darstellen wenn A D-Phe, X L-Phe und L-Thr sind.

2. Verbindung der Formel (I) nach Anspruch 1, worin A Phenylalanin (Phe) ist, 8 Threoninamid (Thr-NH&sub2;) oder (Trp-NH&sub2;) ist, X L-Tyrosin (L-Tyr) und Y L-Valin (L-Val) darstellen.

3. Verbindung der Formel (I) nach Anspruch 1, worin A Phenylalanin (Phe). Acetylphenylalanin (Ac-Phe) oder Tryptophan (Trp) ist, ß Threoninamid (Thr-NH&sub2;) oder Tryptophanamid (Trp-NH) ist, X L-Phenylalanin (L-Phe) und Y L-Threonin (L-Thr) darstellen.

4. Verbindung der Formel (I) nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

5. Verfahren zur Herstellung eine Verbindung der Formel (I) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der Formel

A Cys - X - D-Trp- Lys - Y Cys -B (I')

worin Symbole A, B, X und Y wie im Anspruch 1 definiert sind, oxidiert.

6. Pharmazeutisches Präparat für die Behandlung von Krebsartigen Tumoren enthaltend, als aktiver Bestandteil, eine Verbindung der Formel (I) nach Anspruch 1, oder deren pharmazeutisch akzeptables Säureadditionssalze, zusammen mit einem flüssigen oder festen pharmazeutisch akzeptablen Träger.

7. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 6 für die Behandlung von Prostatakarzinoma, Mammakarzinoma, Insulinoma, Gastrinoma, Chondrosarkoma, Osteosarkoma und Pankreaskarzinoma.

8. Pharmaceutisches Präparat nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß es den aktiven Bestandteil in der Form von Mikrokapseln aus Poly (d, l-lactid-co-glycolid) enthält.

9. Pharmazeutisches Präparat nach einem des Ansprüche 6 durch 8. dadurch gekennzeichnet, daß es als aktiver Bestandteil eine Verbindung der Formel (I) nach Anspruch 1 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

und deren pharmazeutisch akzeptable Säureadditionssalze, enthält.