PT85956B

PT85956B - Processo para a purifucacao de proteinas

Info

Publication number: PT85956B
Application number: PT85956A
Authority: PT
Original assignee: Integrated Genetics Inc
Priority date: 1986-10-20
Filing date: 1987-10-20
Publication date: 1990-07-31
Also published as: FI874587A; DK544987A; PT85956A; AU7993087A; DK544987D0; CA1328538C; EP0265222A2; FI874587A0; EP0265222A3; US5179199A; AU603609B2

Description

presente invento refere-se à purificação de proteínas, por exemplo, as derivadas de células e meios de cultura de células,

A purificação de proteínas inclui, tipicamente, a absorção da proteína numa coluna de HPLC (cromatografia líquida de alto rendimento) seguida de eluição da proteína com uma solução contendo um solvente orgânico polar tal como etanol, metanol, propanol ou acetonitrilo. Depois da eluição, é muitas vezes desejável remover todo o solvente orgânico da solução que contem proteína, especialmente onde a proteína é designada para utilização como produto farmacêutico. Exemplos dos processos geralmente usados para remover o solvente orgânico incluem diálise e evaporação no vácuo.

Num aspecto, o invento caracteriza um processo para remover um solvente orgânico de uma mistura que inclui um composto que tem uma porção polipéptido e o solvente orgânico, incluindo o processo os passos de: fazer contactar a mistura com uma resina permutadora de iões sob condições que permitam ao composto ligar-se ã resina;

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Ref: IG - Protein Purification

e lavar a resina com uma primeira solução aquosa que lava o solvente orgânico da resina, ao mesmo tempo que permite que o composto permaneça ligado a resina.

Nas formas de realização preferidas, o processo inclui ainda o passo de lavagem da resina com uma segunda solução aquosa, que faz com que o composto elua da resina, produzindo o composto numa mistura livre de solvente orgânico. 0 termo livre de solvente orgânico”, aqui utilizado significa que o eluente aquoso que contem o composto tem menos do que 5 p.p.m. de solvente orgânico.

presente invento é caracterizado, num outro aspecto, por um processo de purificação de um composto que tem uma porção polipeptido, incluindo o processo os passos de: submissão de uma mistura que inclua o composto a uma coluna de HPLC de fase investida, e eluição de uma amostra que inclua o composto com um solvente orgânico, fazer contactar a amostra com uma resina permutadora de iões sob condições que permitam ao composto ligar-se à resina, e lavagem do solvente orgânico da resina, com uma solução aquosa.

Polipeptido inclui proteínas volumosas e polipéptidos demasiado pequenos para serem caracterizados como proteínas.

Nas formas de realização preferidas, o composto é uma proteína (p.e. uma proteína biologicamente derivada e o processo inclui o passo adicional, seguido da lavagem do solvente orgânico da resina, com eluição do composto da resina. Numa outra forma de realização preferida a mistura é obtida a partir de um meio de cultura de célula e de células ou fragmentos de células existentes nesse meio, e as células ou todos os fragmentos e meio de cultura sao submetidos a purificação preliminar, que compreende cromato·

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grafia de permuta de iões, na qual a mistura é obtida por eluição do composto a partir de uma coluna permutadora de iões e de uma solução aquosa.

teimo cromatografia liquida de alto rendimento aqui utilizado, refere-se à cromatografia na qual as partículas (fase estacionária) utilizadas como enchimento de colu na são pequenas (entre 3 a 50 microns) e regulares (i.e. pequena variação do tamanho escolhido). Tal cromatografia emprega, tipicamente, pressões de entrada relativamente elevadas (cerca de 500-3500 p.si).

termo HPLC de fase investida, conforme aqui utilizado, refere-se à HPLC que emprega uma fase estacionária nao polar e uma fase móvel polar.

presente invento proporciona um processo simples, barato β rápido para a remoção de solventes orgânicos a partir de uma solução de proteínas.

processo não perturba as proteínas, e não requer aparelhagem especial, e em algumas circunstâncias pode também proporcionar uma purificação adicional da proteína.

processo é bastante eficaz na remoção de pequenas quantidades de solvente orgânico.

Outras caracteristicas e vantagens do presente invento tornar-se-ão aparentes a partir da descrição das formas de realização preferidas, seguintes, e a partir das reivindicações.

A cromatografia de permuta de iões pode, geralmente, ser utilizada no presente invento. Talc romatografia emprega, geralmente, uma fase estacionária que tem uma superfície ►

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Ref: IG - Protein Purification iónicamente carregada. Compostos que tenham grupos funcionais iónicos ou ionizáveis de carga oposta à fase estacionária, serão atraídos para a fase estacionária. Quanto mais forte fôr a carga do grupo funcional do composto mais o composto será atraído para a fase estacionária, e mais tempo o composto demorará a eluir a partir de uma coluna que contenha a fase estacionária.

Quanto à discussão da cromatografia.de permuta de iões ver Yost e outros, Practical Liquid Chromatography: An Introduction 4, 106-11 (Perkin-Elmer 1980).

que se segue á um exemplo da utilização dos processos do presente invento para purificar eritropoietina (EPO). Aspectos do exemplo foram previamente descritos em Beck e outros, Pedido norte-americano No. 907.369 aqui incorporado como referência.

EPO recombinante humana pode ser facilmente purificada a partir de um meio livre de soro, condicionado por células de mamíferos produtoras de rEPO. A purificação até a homogeneidade envolve, geralmente, os passos: (1) clarificação, concentração e diálise do meio de cultura; (2) cromatografia por permuta de iões; (3) (HPLC) de fase invertida; e (4) cromatografia de permuta de iÕes. Os passou 1 e 2 eliminarão do meio de cultura, proteases e alguns componentes remanescentes do soro no meio de produção (especificamente em colheitas feitas pouco depois das culturas terem sido mudadas do soro limitador do crescimento para o meio de produção sem soro); os passos 2 e 3 dão uma maior purificação e o passo 4 destina-se a remover o solvente orgânico usado no passo 3 e a eluir a EPO purificada no tampão de formulação final. Todos os processos de purificação são realizados a 4²C, com a excepção do passo RP35

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-HPLC que é realizado ã temperatura ambiente.

Para exemplo, EPO homogénea, pura, foi preparada a partir de 11,75 litros de meio de produção de EPO sem soro, recolhida de 10 litros de culturas rotativas descritas em Beck e outros. Os níveis da EPO foram medidos através do processo de purificação que utiliza o ensaio de in— õ corporação H-thy. e uma EPO RIA. Todas as curvas de resposta ã dose nas diferentes fases de purificação, foram paralelas umas ãs outras e às curvas padrão da urina humana.

1) Clarificação, concentração e diálise do meio de cultura

11,75 litros de soro condicionado CES9 meio de cultura canino sem, recolhidos de 10 litros de frascos rotativos e contendo aproximadamente 700 unidades de EPO por ml, foram tomados em 0,01% em Tween 80, e depois clarifica·· dos de todos os fragmentos de células e microveículos por TM passagem através de um cartucho de filtro Pall Profile de 0,5 jim a um ritmo de fluxo de 2,51/minuto. A pressão do cartucho não excedeu 20 psi. Os meios clarificadoB foram então concentrados 10 vezes e o fluxo dializado em 50mM de Acetato de Na, pH5,0 contendo 15mM NaCh e 0,01% de Tween 80 o para uma condutividade final de 6,90 mS/cm . Picou completo com um sistema de fluxo tangencial: um cartucho Amicon de Ultrafiltração Espiral S1GY10 tendo uma membrana de corte YM, 10,000 MW foi usada a ritmo de retenção de fluxo de l,5-2L/minuto, um ritmo de passagem de fluxo de 0,4-0,8L/ minuto, e uma pressão de suporte mantida a 25-30psi. 0 volume do concentrado final foi de 970 ml, o pH de 5,0, e a con·· dutividade de 6,90mS/cm . A recuperação da EPO através destes passos é superior a 90%.

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2) Cromatografia de permuta de iões

Um crivo de resinas permutadoras de iões demonstrou que resinas com uma resistência iónica relativamente elevada se ajustam melhor à purificação da EPO. Neste exemplo particular foi utilizada uma coluna de fluxo rápido de S-sepharose, da Pharmacia. Uma coluna de 2,5 cm x 12,5 cm (60 ml) foi equilibrada a 4^SC com Acetato de Na 50mM, pH 5,0, contendo 15mM NaCl, e tendo uma condutividade de 6,90 mS/cm . A absorvância do efluente da coluna foi monitorizada em 280 nm com um detector (IKB) em linha. A coluna foi carregada com 960 ml dos meios concentrados a um ritmo de fluxo de 5ml/minuto (61,6cm/hora) e a coluna foi lavada com tampão equilibrados até que a absorvência voltar ao ponto de partida (aproximadamente 2 volumes da coluna). A coluna foi eluida com 300 ml de gradiente de sal linear com 0,015 M a 0,4 M NaCl em 50mM de Acetato de Na, pH. 5,0. Fracções (6ml) foram recolhidas em tubos contendo 0,15 ml de Tris-HCl 2M, pH 8,8. Isso ajustou o pH do efluente até 8,0, aproximadamente, e deu uma concentração Tris final de 0,05 M. Finalmente, a coluna foi lavada com 0,05 M de Tris-HCl, pH 9,0, contendo NaCl 2M. As fracções contendo EPO foram reunidas.

A coluna de Fluxo Rápido de S-Sepharose proporcionou uma purificação de aproximadamente 7 vezes mais e umareconversão de cerca de 60%. Perdas neste passo sao devidas a proteases presentes no meio condicionado que são activas a pH 5,0(que e o pH óptimo para purificação de EPO com esta resina). (Conforme descrito abaixo, as perdas neste passo podem ser minimizadas utilizando-se corantes imobilizados ou inibidores de protease).

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3) HPIiC de Fase Invertida Preparatória

A HPLC foi levada a efeito com um sistema de

Waters de cromatografia liquida de alta pressão constituído por um sistema de introdução de solvente modelo 6000A e um programador de solvente, modelo 660. Uma coluna preparatória de 2,2 cm x 25 cm de 0θ (tamanho de partícula Amicon, 10a®» tamanho de poro 1000A) foi equilibrada à temperatura ambiente com lOmM de tampão de fosfato de sódio, pH 6,0 . (Colunas de extensão de carbono diferente, p.e., ^c4“°18» podem também ser utilizadas, mas são menos preferidas). A amostra de S-Sepharose reunida foi prefiltrada com um filtro de Gelman Aerodisk 0,45 λ® θ carregada na coluna por injecções repetidas com utilização de uma curva de amostragem de 2 ml. A coluna funcionou a 6ml/minuto (71,0cm/h) e a absorvencia do efluente foi controlada a 280 nm. Depois de carregada a amostra, a coluna foi lavada com fosfato de sódio lOmM, pH 6,0 até a absorvência voltar ao valor inicial. A colupa foi eluida com um gradiente linear de n-propanol de 0% a 40%, durante 2,5 h (em lOmM de fosfato de sódio, pH 6). Foram recolhidas fracções de um minuto (6ml).

vários picos pequenos de material absorvente a 280 nm eluiram entre os 60 minutos e os 95 minutos do gradiente, e um pico agudo único eluiu entre os 100 minutos e os 110 minutos (Fig. 8). Os picos de eluição foram analizados por SDS PAGE. As fracções que continham EPO que coincidiram com o maior pico entre os 100 minutos e os 107 minutos (20-25% de propanol, aproximadamente). Um exame densitométrico de laser de gel de SDS colorida com Coomassie indicou que a EPO apresentava uma pureza superior a 99% nesta fase. Neste exemplo, o passo Οθ proporcionou uma purificação dupla.

A recuperação da actividade imunológica e biológica

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in vitro, neste passo, foi elevada (83%), indicando que o n-propanol não tinha efeitos adversos sobre actividade biológica in vitro.

4) Cromatografia de permuta de ioes

Para remover o propanol, a actividade reunida é diluida com 10 volumes de 50 mM de acetato de sódio, pH 5,0, de maneira a baixar o pH e a resistência iônica. A actividade reunida assim diluida foi aplicada numa coluna (2,5 i 4,5 cm) de fluxo rápido de S-Sepharose (uma resina permutadora de catiões vendida por Pharmacia) que foi previamente equilibrada com 50mM de acetato de sódio, pH 5,0, 15 mM de cloreto de sódio.

Nestas condições a EPO combina-se com a resina. A coluna foi lavada com 5 volumes de coluna do mesmo tampão para éluir o propanol que está presente na amostra. A coluna foi então lavada com uma solução aquosa de resistência iónica aumentada ( lOmM de fosfato de sódio, pH 8,0, 150 mM de cloreto de sódio) para eluir a EPO a partir da resina. A recolha final da EPO é de lOml. 0 propanol residual é inferior a 5ppm no eluente conforme deteiminado por análise cromatográfioa gasosa.

Outras Formas de Realização

Outras foimas de realização do presente invento situam-se no âmbito das reivindicações que se seguem. Por exemplo, os processos podem ser usados com qualquer proteína que se combine com ume coluna permutados?a de ioes, p.e. proteínas contendo resíduos de aminoácido, tendo grupos funcionais ionizáveis, livres (p.e., lisina, arginina, histidina,

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OUl Wl _? / ácido aspártico e ácido glutâmico). Além disso, qualquer resina permutadora de catioes que seja resistente a solventes orgânicos pode ser usada, com a condição de que o pH e a resistência iónica do tampão usado estejam ajustados para proporcionar a combinação completa da proteína (tais ajustamentos são padrão na técnica). Exemplos de outras resinas permutadoras de catioes apropriadas, incluem CM Cellufine (Amicon) cartuchos SP-zeta-Prep (AMP), e Indion SP-55 (ASTEC).

Resinas permutadoras de aniães também podem ser utilizadas, com a condição da resina ser resistente a solventer orgânicos e o pH e resistência iónica do tampão serem ajustados para se obter combinação completa de proteína com a resina (tais ajustamentos são bem conhecidos dos peritos desta técnica). Exemplos de resinas permutadoras de aniões que tem sido usadas em vez de S-Sepharose no passo 4, no exemplo de purificação da EPO, são DEAE Cellufine (Amicon), DEAE Zetaprep (AMF), e Indion DEAE (ASTEC). Todas as colunas permutadoras de aniões foram equilibradas com lOmM de fosfato de sódio, pH 7,0. A EPO foi carregada no mesmo tampão, e as colunas foram lavadas com 5 volumes na coluna do tampão e depois eluidas com NaCl 2M.

O depósito do primeiro pedido para o invento acima descrito foi efectuado nos Estados Unidos da América, em 20 de Outubro de 1986 sob ο N2 922.067.

Claims

-REIVINDI C.· A Ç (5 E S 1»,- Processo para a remoção de um solvente orgânico a partir de uma mistura que compreende um composto contendo uma porção de polipéptido, caracterizado por:

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- fazer contactar a mistura com uma resina permutadora de iões sob condições que permitam ao referido composto ser ligado à resina, e

- lavar a resina com uma primeira solução aquosa que lava o solvente orgânico a partir da resina enquanto se deixa que o composto permaneça ligado à resina.
2β.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda o passoí

- lavar a resina com uma segunda solução aquosa que origina a eluição do composto a partir da resina, ficando o composto livre do solvente orgânico.
3^a.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o composto ser uma proteína.
4^a.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o composto ser uma proteína derivada biologicamente,
5^a.- Processo para a purificação de um composto que inclui uma porção de polipéptido, a partir de uma mistura, caracter izado por

- a referida mistura ser submetida a uma coluna HPLC de fase reversiva e eluir uma amostra compreendendo o composto e um solvente orgânico da referida coluna,

- se fazer contactar a referida amostra com uma resina permutadora de iões sob condições que permitam ao compos·· to ligar-se ã resina; e o solvente orgânico da resina ser lavada com uma solução aquosa.
6^a.- Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o composto .ser uma proteína.
7^a*- Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o composto ser uma proteína derivada biologicamente.
8^a.- Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por compreender ainda o passoi

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Ref: IG - Protein Purification depois da lavagem do solvente orgânico da resina, eluir o composto a partir da resina.
9^a·- Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a mistura ser uma mistura aquosa.
10*.- Processo de acordo com a reivindicação 5, cari ίο terizado por a mistura ser obtida a partir de um maio de cultura de células, e a partir de células ou fragmentos de células no referido meio.
11^a.- Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por as células ou fragmentos de células e meio de cultura serem submetidos a purificação preliminar por cromatografia de permuta de iões obtendo-se a mistura por eluição do composto a partir de coluna permutadora de iões numa solução aquosa.