JPH0334995A - タンパク質アミノ末端配列の酸素的除去 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子変更した原核細胞においてタンパクを生合成させ
ると、通常、アミノ末端にメチオニンか結合したタンパ
クが発現される。天然のタンパクにメチオニンか付加す
ると、その生物学的活性、コンフォーメーンヨン安定性
、抗原性等を変更することかあるので、可能であればそ
れを除去することが非常に望ましい。

アミノ末端メチオニンと所望の天然のペプチドの間に切
断部位を挿入することによって、所望の天然のペプチド
の製造方法を、理論」二、より自由に選択することがで
きる。しかしながら、実際には、選択的切断を行うため
に有用な方法は、非常に限られた数しかなかった。

例えば、メチオニンか存在しない天然のタンパクでは、
臭化シアンに媒介される切断（メチオニンが選択的切断
部位である）が、天然のタンパクを製造するための非常
に有効な方法であることかわかっている。しかしなから
、丈際には、中程度の大きさのペプチドおよびタンパク
にメチオニンか存在しないことはめったにない。また、
臭化シアンは強い青性を有するので、その使用はあまり
望ましくなく、その取り扱いに大ぎな注意を払う必要が
ある。従って、アミノ末端メチオニンを除去し、天然の
、生合成的に生産されるタンパクを製造し得る別の方法
を見いたすことは、非常に重要な課題である。

Ｎ−末端メチオニンの除去に有用であると認識されてい
る１つの方法は、ジペプチノルーアミノペプチターセ１
．（ＤＡＰ−］）とも呼ばれるカテブンンＣの使用であ
る。カテプシンＣは、タンパクまたはポリペプチドのア
ミノ末端から２個のアミノ酸を１単位として除去する醇
素である。適当な条件下で、ジペプチド゛の除去か始ま
り、（１）Ｎ宋！’：！Ａアミノ酸のアミノ１．（かブ
ロノクされるが、（２）除去の部位かプロリンのいずれ
かの側であるが、またはＮ−末端アミノ酸かりンンまた
はアルキニンでない場合、そうなるまで継続するであろ
う。

従って、ノノテプソンＣは、開始メチオニンと所望の生
成物の間にアミノ酸残基を含むように前駆体分子をデザ
インすることによって、この様な前駆体分子から所望の
生合成的に生産されるタンパクを製造する場合、有用と
なり得る。前駆体分子をカテプンンＣで処理すると、開
始ジペプチドが除去され、所望の生成物を製造すること
ができる。

しかしなから、ンペプチト゛の除去は前記終止配列の１
つに到達するまで連続して続（と予想されるので、この
方法は、その適用か厳しく制限されることかある。即ち
、カテプンンＣのアプローチには有用性に制限があり、
通常、所望の生成物のＮ末端部分がそれ自体力テプシン
Ｃ終止点である場合にのみ適用し得る。

しかしながら、本発明者らは、前駆体分子のＮ末端ジペ
プチドの種類が、カテプシンＣによるジペプチドの除去
をコント０−ルし得る度合に関係かあることを見いたし
た。この知見が、本発明の基礎を構成する。即ち、本発
明者らは、開始ジペプチドがＭｅｔ−ＴｙｒまたはＭｅ
ｔ−Ａｒｇである１１８ｔ、配列における次のジペプチ
ドかカテプシンＣ終止点であるか否かに関係なく、それ
以上分解されることなく所望の生成物が得られるように
、ンペプチトの除去を注意深くコント・ロールし得るこ
とを見いだした。本発明は、この発見に関するものであ
る。

即ち、本発明は、式 ；Ｍｅｔ−Ｙ− ［式中、「タンパク］はヒトインシュリンまたは修飾ヒ
トインシュリンへの前駆体として有用なアミノ酸配列を
含有し、該配、列のアミノ末端部分はカテプンンＣによ
るジペプチド除去終止点を意味せず、ＹはＴｙｒまたは
Ａｒｇである］ で示される化合物に関するものである。

本発明はまた、式 ；Ｍｅｔ−Ｙ− １式中、［タンパク］はヒトインシュリンまたは修飾ヒ
トイン／ニリンへの前駆体として有用なアミノ酸配列を
含有し、該配列のアミノ末端部分はカテブンンＣによる
ンペブチト除去終止点を意味せず、ＹはＴｙｒまたはＡ
ｒｇである］ で示される化合物をカテプシンＣ１塩素イオンおよびス
ルフヒドリル部分を与える化合物の存在下で処理するこ
とからなるヒトインシュリンまたは修飾ヒトインシュリ
ンの前駆体の製造方法に関するものである。

前記の様に、本発明は、［タンパク］として定義した部
分を含む化合物に関するものである。この［タンパク］
は、配列がカテブシンＣの使用によるンペプチトの除去
のための天然の終止点を意味しないアミノ末端部分を有
する、ヒトインシュリンまたはヒトインシュリン類似体
の前駆体として有用なアミノ酸配列を含有する。通常、
この配列は、Ｎ−末端から順に、Ｂ、ＸおよびＡで示さ
れる３個のアミノ酸配列単位で構成される。Ｂ”′で示
される配列は、ヒトイン／ニリンのＢ−鎖または修飾Ｂ
−鎖を表わす。“Ａ゛で示される配列は、ヒトインシュ
リンのＡ−鎖または修飾Ａ−鎖を表わす。

パ修飾Ｂ−鎖パまたは゛修飾Ａ−鎖゛は、天然または修
飾形態のもう一方の鎖に７スルフイド拮合によって連結
されるとインシュリン様特性を有する分子を与えるアミ
ノ酸配列を意味する。

基・ＸはインシュリンＡ−鎖または修飾Ａ−鎖のＡ−鎖
アミノ末端およびインシュリンＢ−鎖または修飾Ｂ−鎖
のＢ−鎖カルボキシ末端に結合している部分を表わす。

前駆体の連結部分、Ｘは、広範なポリペプチド構造のい
ずれであってもよい。

ポリペプチドは通常、少なくとも２、好ましくは約２〜
約３５、最も好ましくは約６〜約３５アミノ酸残基を有
する。連結部分、Ｘは、これかペプチドである場合、式 ％式％ を有する連結ペプチドの様な、ヒトプロインシュリンの
天然の連結ペプチドであるのか最も好ましい。

前記の様に、Ｘは天然の連結配列であるのが好ましいが
、Ｘは広範な、より短いペプチド配列のいずれかであっ
てもよい。（１）配列が八−およびＢ−踏量に適当なジ
スルフィド結合を形成させるのに十分な長さであり、（
２）インシュリンまたは修飾インシュリン前駆体から、
イン／ニリンまたは修飾イン／ニリンの生成を伴って切
断し得ることのみか必要である。Ｘのための代表的ンペ
プチドは−Δｒｇ−Ａｒｇ、−とすることかできる。ま
た、Ｘは前記ンペプチドの伸長形、即ら、式・−Ａｒｇ
ｘ’−Ａｒｇ−を有する配列とすることができる（Ｘ’
は少なくとも１個のアミノ酸残基を表わす）。

非常に好ましい連結ペプチドは−Ａ　ｒｇ−Ａ　ｒｇ−
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−１および構造式：　−Ａｒｇ−Ａｒｇ
　−Ｘ’−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｘ’は少なくとも１個の
アミノ酸残基、好ましくは少なくとも２個のアミノ酸残
基である）を有する、まり長鎖のペプチドである。もち
ろん、これらの後者には天然の連結ペプチドが包含され
る。

天然のヒトインシュリンでは、Ｂ−鎖は以下の配列を有
している： 本発明の化合物のうち、非常に好ましいのは天然のし１
−Ｉ３−鎖配列である。しかしながら、個別に１または
それ以」二の、下記のアミノ酸修飾を有する配列も好ま
しい。

（１）Ａｓｐ、　Ｖａｌ、Ｌｅｕ、　　Ｉ　ｌｅ、　Ｎ
ｌｅ、　Ａｒｇ。

１−（ｉｓ、　Ｌｙｓ、　Ｐｈｅ、　ＡｈａＳＧａｙ、
　シトルリンおよびオルニチンのいずれかによる２８位
のＰｒｏの置換。これらの置換の内、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、
　　ｌ　Ｉｅ、　Ｎｌｅ。

Ａ　ｒｇ、　ｌ−［ｉｓ、　Ｌ　ｙｓおよびオルニチン
がより好ましく、これらの内、Ｌｙｓが最も好ましい。

（２）Ｌ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｄ−ヒドロキシプロリ
ン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−（Ｎ−メチル）ｌ−
、ｙｓ。

Ｄ　−Ｌ　ｙｓ、　Ｉ−−（Ｎ−メチル）Ａｒｇおよび
Ｄ−Ａｒｇのいずれかによる２９位のＬｙｓの置換。

（３）Ａｓｐによる１０位のＨｉｓの置換。

（４）３０位のＴｈｒの欠失。

天然のヒトインシュリンでは、Ａ−鎖は以下の配列を有
している Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｏｌｕ−Ｇｉｎ−Ｃｙｓ−Ｃ
ｙｓ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−１１ｅ１、　　２　　３　　４
　　５　　６　　７　　８　　９　１．０Ｃｙｓ−３ｅ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌ　ｕ
−Ａｓ　ｎ−Ｔｙ　ｒ−Ｃｙｓ　−Ａｓ　ｎ０１１　１
２　　＋３　１４　１５　１６　１７　１８　１９　２
０　２１本発明の化合物の内、非常に好ましいのは天然
のヒトＡ−鎖配列である。しかしながら、２１位のＡｓ
ｎがＡｌａで置換されている配列も好ましい。

木明細書ては、通常のアミノ酸略号か使用され、以下の
意味を有している： 堅塁　　　アミノ酸 Ａｌａ　　　　アラニン Ａｒｇ　　　　アルギニン Ａｓｎ　　　　アスパラギン Ｃｙｓ　　　　／スティン Ｇｌｎ　　　　グルタミン Ｇｌ［Ｉ　　　　グルタミン酸 Ｇｌｙ　　　　グリンン Ｉ Ｈｉｓ　　　　ヒスチソン １１ｅ　　　　イソロイシン Ｌｅｕ　　　　ロイシン Ｎｌｅ　　　　ノルロイシン Ｐｈｅ　　　　フェニルアラニン Ｐｒｏ　　　　フロリン Ｓｅｒ　　　セリン Ｔｈｒ　　　　スレオニン Ｔｙｒ　　　　チロンン Ｖａｌ　　　バリン ヒトイン／ニリンまたはヒトインシュリン類似体・＼の
前駆体のＭｏｔ　−ＴｙｒまたはＭｅｔ−Ａｒｇ伸長形
である本発明の化合物は、カテプンンＣで処理すること
によって、選択的にこの様な前駆体に変換される。カテ
プンンＣによる処理を、以下に簡単に説明する。

カテプンンＣを活性化するために、塩素イオン＜ｃｒｔ
−）の存ａ−か必要である。従って、本発明の化合物の
変換では、媒体にＣ（−か加えられる。塩素イオンの量
は、触媒的でさえあれば最小量でよい。

２ 事実、例えば、塩化すトリウムの存在下でタンパクの一
次処理を行うと、存在する残留物の量は全く相応である
ことがわかっている。従って、少なくとも微量の塩素イ
オンの存在で十分である。

また、本発明の化合物を変換するための方法は酵素的な
ので、Ｍ（３Ｌ−Ｙ［タンパク］出発物質に比較して少
量のカテプシンＣか使用される。通常、タンパク基質に
比較して、モル基準で約１１０００〜約１　：　１００
，０００の比てカテプシンＣを存在させる。この比は約
１：１．０．０００より大きくないのが好ましく、通常
、約１・ｉｏ、。

ＯＯ〜約１．１７０，０００となろう。

反応は通常、約２５〜約１０のｐＨを得、維持するよう
に好適に緩衝化された水性媒質中で行われる。媒質のｐ
Ｈは約２５〜約７の範囲の、わずかに酸性から中性であ
るのか好ましく、約３０〜約６．０であるのか最も好ま
しい。

場合によって、尿素、ドデシル硫酸ナトリウム、グアニ
ジン等の様な可溶化剤を使用してもよい。

広範な緩衝剤を使用することかでき、所望の範囲のｐＨ
を生じる活性が必要であるたけである。

この様な緩衝剤の代表例は、リン酸すトリウム、酢酸す
トリウム、クエン酸すトリウム、リン酸カリウム、酢酸
カリウム、クエン酸カリウム等である。好ましい緩衝剤
は、酢酸すトリウムおよび酢酸カリウムである。

本発明の化合物の変換には更に、スルフヒドリル部分を
与える試薬の存在か必要である。代表的なこの様な試薬
は、β−メルカプトエタノール、ジチオスレイＩ・−ル
、ジチオエリスリ！・−ル、βメルカプトエチルアミノ
、システィン等である。

この用途に好ましいスルフヒドリル試薬は、βメルカプ
トエタノール、ジチオスレイト−ルおよびシスティンで
あり、システィンか最も好ましい。

スルフヒドリル試薬は通常、最終反応媒体中に約０．］
ｍＭ〜約２００ｍＭのモルｌ農度で存在さぜ、約１ｍＭ
〜約２０ｍＭか好ましい。

反応は通常、約１５°Ｃ〜約４５°Ｃの温度で約１時間
〜約２４時間行われる。反応の高度は約２０°Ｃ〜約４
５°Ｃか好ましく、約２２°Ｃ〜約４２°Ｃが最も好ま
しく、反応は約６時間〜約２０時間進行する。

カテプシンＣ処理によって本発明の化合物から製造され
る生成物は、ヒトインシュリンまたはヒトインシュリン
類似体の前駆体を表わす“［タンパク］′°で定義され
る構造を有するであろう。

Ｍｅｔ−Ｙ［タンパク］をカテプシンＣ処理することに
よってしタンパク］が製造されたら、分子の適当なジス
ルフィド結合形成（ひだ形成）を誘導する条件に付す。

得られた、ひだ形成されたヒトインシュリンまたはヒト
インシュリン類似体への前駆体は通常、（１）ヒトイン
シュリンＡ、鎖（または類似体）およびヒトインシュリ
ンＢ−鎖（または類似体）を含有し、（２）Ａ−および
Ｂ−鎖中、（ａ）Ａ−６およびＡ−１１、（ｂ）Ａ−７
およびＢ−７、および（ｃ）Ａ−２０およびＢ−１９に
それぞれ位置するＣｙｓ部分の各イオウの結合で示され
る３個の７スルフイト結合を有し、（３）インシュリン
Ａ鎖（または類似体）のアミノ基およびインシュリンＢ
−鎖（または類似体）のカルボキシル基に結合５ している除去可能な連結部分を有する分子によって表わ
される。

［タンパク］をひた形成させるための通常の条件は、２
０ｍＭグリシン、ｐＨ９中濃［タンパク］溶液を水で］
ｇｍ／Ｌの最終［タンパク］構度に希釈することである
。１．２５ｍＭの終濃度までシスティン−ＨＣｌ２を加
えた後、ｐＨをＮａＯＨて１０．５１０．７に調節し、
溶液を５°Ｃて約１６時間までインキュベートする。

次いで、ひた形成した分子を酵素処理に付し、連結部分
を除去し、所望のヒトインシュリンまたはヒトインシュ
リン類似体を生成させることができる。この様な切断を
行うための非常に好ましい条件は、トリプシンおよびカ
ルボキシペプチターゼＢの組合わせの使用であり、当業
者に周知である。この方法は、何年も前に初めて知られ
た［例えば、ケムラー、クラーク、ボルダおよびシュタ
イナー（Ｋｅｍｍｌｅｒ、　！、　、　Ｃ１ａｒｋ、　
Ｊ、　Ｌ、　、　Ｂｏｒｇ、　Ｊ、　ａｎｄＳｔｅｉｎ
ｅｒ、　Ｄ、　Ｆ、　、　Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、　３０
（１９７１）１２１０）　：ケムラ、ピーターソンおよ
び’／−Ｌタイナー（Ｋｅｍｍｌｅｒ。

１６ Ｗ、、　　Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、Ｊ、Ｄ、、　　ａｎｄ　
５ａｔｅｉｎｅｒ、Ｄ、Ｆ、、　　Ｊ、ＢｉｏｌＣｈｅ
ｍ、　、　２４６（１９７１）　６７８６−６７９１）
参１１Ｇ］。

本発明の化合物は、組換えＤＮＡ法によって製造される
。これらの製造では、所望の化合物をコードしているヌ
クレオチド配列は、この様な合成のために現在では通常
となっている方法を使用して製造される。これらの方法
は通常、所望のコード配列のフラグメントおよびその相
補的配列の両者をコードしているオリゴヌクレオチドの
製造を含む。オリゴヌクレオチドは、コード配列の１個
のフラグメントに、相補的配列およびその逆の２個のフ
ラグメントを与えるようにデザインされる。

オリゴヌクレオチドは対合されて結合され、最終的に所
望の遺伝子配列を生成する。

配列は、それか発現されるべくコードしている生成物を
与える位置でクローニングヘクターに挿入される。好適
なりローニングベクターは、発現コントロール配列の少
なくとも１部分を含んでいる。

以下に実施例を挙げ、本発明を説明する。これらは本発
明を限定するものと理解されるへきてはない。

実施例１　ひた形成していないＭｅｔ−Ｔｙｒ−プロイ
ンシュリンの開裂 凍結乾燥したＭｅｔ−Ｔｙｒ−プロインシュリン（シス
テイニル形、３６％純度）を０．２５Ｎ酢酸、７Ｍ尿素
に溶解し、４−６８　ｍｇ／　ｍｌ（Ａ　ｖｑａ、Ｅ−
１）の最終組タンパクａ度にした。この溶液を０２５Ｎ
酢酸で２倍希釈した。終容量０．８ＭＱとするために、
この希釈液３３４μｇに、０．２５Ｎ酢酸、７Ｍ尿素２
９０μｆｆ、０．２５Ｎ酢酸Ｂ６ｕＱおよびＬＭ　Ｎａ
Ｈ，ＰＯ４４０ｔｌＱを加えた。

この溶液のｐＨを５ＮＮａＯＨによって６０に調節した
。ＩＭ　ＮａＣ＆　４００μ（！、Ｉ　００ｍＭンステ
システィン（水中、ｐＨ６）２５０μＱ、および５Ｑｍ
Ｍクエン酸塩、１０ｍＭ　ＮａＣＱＸｐＨ５中、１．９
３単位／ｍＱのＤ　Ａ　＋）−］溶液４００μＣを混合
することによって、ＤＡＰ−１／／ステイン／ＮａＣＱ
溶液を調製した。ＤＡＰ−］／／スティン／　Ｎ　ａ　
ＣＱ溶液（５３μ（りを、Ｍｅｔ−Ｔｙｒプロイン／ニ
リン希釈液とｄ合し、室温（２２°Ｃ）て３０分間イン
キュへ−ｉ・した（最終ＤＡ、Ｐ−１／Ｍｅｔ−Ｔｙｒ
−プロインシュリン−１２０Ｕ／ｙ）。

６倍容量のスルフィトリシス試薬（７Ｍ尿素、０５Ｍト
リスｐＨ８，５，０，２Ｍ　Ｎａ２５ｏ３．０３０１Ｍ
　Ｋ２Ｓ、Ｏ，）で反応を停止させ、逆相ＨＰ　ＬＣに
よって分析した。これらの条件下で、ＭｅｔＴｙｒ−プ
ロインンユリン混合ジスルフィドのプロインシュリンＳ
−スルホネートへの定量的変換が行われた。

実施例２　ひだ形成していないＭｅｔ−Ｔｙｒ−プロイ
ンシュリン類似体（Ｂ　２８　Ｌｙｓ、　Ｂ　２９　Ｐ
ｒｏ）の開裂 Ｅ、コリの細胞質において、Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−プロイン
シュリン類似体（Ｂ　２８　Ｌｙｓ、　Ｂ　２９　Ｐｒ
ｏ）を不溶性タンパクとして産生させた。細胞破壊およ
び分画遠心分離によって、不溶性タンパクを分離した。

７Ｍ尿素、５ｍＭシスティン中、ｐＨを一次的に１１５
に上昇させ（１０分間）、次いで、ｐＨ８９でインキュ
ベートすることによって、溶解９ させた。ＮａＣＱ直線グラジェントを使って、５０ｍＭ
酢酸、７Ｍ尿素、ｐＨ４中、陽イオン交換クロマトグラ
フィーによって、タンパクを精製した。

この生成物く１５〜］、　、　７　ｍｑ／　ｙｔｒＯ，
、プロインシュリン類似体、３０−５０％○Ｉ）純度）
を、６ＮＮａＯＨを使用してｐｌ（５，７に調節した。

溶液の１部分（１，５ｉＣ）を、ｐＨ５，７緩衝液（５
０ｍＭ酢酸、５０ｍＭ　Ｎａ１（、Ｐ　０４）　１．３
５ｚ（！１２００ｍＭシスティン（ｐＨ５，７緩衝液中
）０．０７５村、およびｌＲＱ当たり７．７６単位のＤ
ＡＰ−］（ｐＨ５７緩衝液中）０．０７５ｍＱに加えた
。混合物を室温（２２°Ｃ）で０７〜２０時間イ時間イ
ンキュベートウシ倍容量のスルフィトリンス試薬（７Ｍ
尿素、０５ＭトリスｐＨ８，５，０，２Ｍ　Ｎａ２５ｏ
３．０．ＯＩＭ　Ｋ、Ｓ、００）で反応を停止させ、逆
相ＨＰ　ＬＣによって分析した。これらの条件下で、Ｍ
ｅｔＴｙｒ−プロインシュリン類似体混合ジスルフィド
はプロインシュリン類似体Ｓ−スルホネートに８０−８
６％変換され、それ以」二の酵素的切断による生成物の
分解は検出されなかった。

０ 実施例３　ひだ形成していないＭｅｔ−Ａｒｇ−プロイ
ンシュリン類似体（Ｂ　２８　Ｌｙｓ、　Ｂ　２９　Ｐ
ｒｏ）の開裂 Ｅ　コリの細胞質において、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−フロイン
シュリン類似体（Ｂ　２８　Ｌｙｓ、　Ｂ　２９　Ｐｒ
ｏ）を不溶性タンパクとして産生させた。細胞破壊およ
び分画遠心分離によって、不溶性タンパクを分離した。

７Ｍ尿素、５ｍＭシスティン中、ｐＨを一次的に１１．
５に上昇させ（１０分間）、次いで、ｐＨ８，９でイン
キュベートすることによって、溶解させた。ＮａＣＱ直
線グラジェントを使って、５０ｍＭ酢酸、７Ｍ尿素、ｐ
Ｈ４中、陽イオン交換クロマトグラフィーによって、タ
ンパクを精製した。

この生成物（１，５〜］、７ｍｇ／１１（２、プロイン
シュリン類似体、３０−５０％ＯＤ純度）を、６ＮＮａ
Ｏｌ−］を使用してｐＨ５，７に調節した。溶液の１部
分（、１、５ｆｆＱ）を、ｐＨ５，７緩衝液（５０ｍＭ
酢酸、５０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ−）１．３５！１２．２
００ｍＭ／スティン（ｐＨ５，７緩衝液中）０．０７５
村、および１ｘｉ７当たり７．７６単位のＤＡＰ−］（
ｐＨ５７緩衝肢中）０．０７５ｚｆｆに加えた。混合物
を室荒１、（２２°Ｃ）で０．７〜２０時間イ時間イン
キュベートウシ倍容量のスルフィトリシス試薬（７Ｍ尿
素、０５Ｍ）リスｐＨ８，５，０，２Ｍ　Ｎａ２ＳＯ３
、ＯｌＯＩＭ　Ｋ、Ｓ、０６）で反応を停止させ、逆相
ＨＰ　ＬＣによって分析した。これらの条件下で、Ｍｅ
ｔＡｒｇ−プロインシュリン類似体混合ジスルフィドは
プロインシュリン類似体Ｓ−スルホネートに８０−８６
％変換され、それ以上の酵素的切断による生成物の分解
は検出されなかった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式： Ｍｅｔ−Ｙ−［タンパク］ ［式中、［タンパク］はヒトインシュリンまたは修飾ヒ
   トインシュリンの前駆体として有用なアミノ酸配列を含
   有し、該配列のアミノ末端部分はカテプシンＣによるジ
   ペプチド除去終止点を意味せず、ＹはＴｙｒまたはＡｒ
   ｇである］ で示される化合物。 ２、［タンパク］が、ＢはヒトインシュリンのＢ−鎖ま
   たは修飾Ｂ−鎖を表し、ＡはヒトインシュリンのＡ−鎖
   または修飾Ａ−鎖を表し、ＸはインシュリンＡ−鎖また
   は修飾Ａ−鎖のＡ−鎖アミノ末端およびインシュリンＢ
   −鎖または修飾Ｂ−鎖のＢ−鎖カルボキシ末端に結合し
   ている部分を表す、Ｂ、Ａおよびｘで示される３個のア
   ミノ酸配列単位を含有する請求項１に記載の化合物。 ３、Ｘがヒトプロインシュリンの天然の連結ペプチドで
   ある請求項２に記載の化合物。 ４、式； Ｍｅｔ−Ｙ−［タンパク］ ［式中、［タンパク］はヒトインシュリンまたは修飾ヒ
   トインシュリンへの前駆体として有用なアミノ酸配列を
   含有し、該配列のアミノ末端部分はカテプシンＣによる
   ジペプチド除去終止点を意味せず、ＹはＴｙｒまたはＡ
   ｒｇである］ で示される化合物をカテプシンＣ、塩素イオンおよびス
   ルフヒドリル部分を与える化合物の存在下で処理するこ
   とからなるヒトインシュリンまたは修飾ヒトインシュリ
   ンの前駆体の製造方法。 ５、［タンパク］が、ＢはヒトインシュリンのＢ−鎖ま
   たは修飾Ｂ−鎖を表し、ＡはヒトインシュリンのＡ−鎖
   または修飾Ａ−鎖を表し、ＸはインシュリンＡ−鎖また
   は修飾Ａ−鎖のＡ−鎖アミノ末端およびインシュリンＢ
   −鎖または修飾Ｂ−鎖のＢ−鎖カルボキシ末端に結合し
   ている部分を表す、Ｂ、ＡおよびＸで示される３個のア
   ミノ酸配列単位を含有する請求項４に記載の方法。 ６、Ｘがヒトプロインシュリンの天然の連結ペプチドで
   ある請求項５に記載の方法。