HU215582B

HU215582B - Eljárás humán inzulin N-terminális szekvenciájának enzimes eltávolítására

Info

Publication number: HU215582B
Application number: HU902697A
Authority: HU
Inventors: Gerald Wayne Becker; Thomas Charles Furman; Warren C. Mackellar; James Patrick Mcdonough
Original assignee: Eli Lilly And Co.
Priority date: 1989-05-09
Filing date: 1990-05-07
Publication date: 1999-01-28
Also published as: HU902697D0; IE67531B1; HUT54213A; EP0397420A1; CA2016049A1; AU5483390A; AU630951B2; US5126249A; DK0397420T3; JP2592981B2; IE901673L; DE69020794D1; IL94305A; IL94305A0; ATE124997T1; DE69020794T2; JPH0334995A; US5352769A; EP0397420B1; ES2075155T3

Abstract

A találmány tárgya eljárás hűmán inzűlin vagy módősítőtt hűmán inzűlinelőanyagának előállítására, amelynek sőrán egy Met-Y-Prőtein általánős képletű vegyületet, ahől "Prőtein" jelentése a hűmán inzűlinvagy módősítőtt hűmán inzűlin prekűrzőrának aminősav-szekvenciájáttartalmazza, mely szekvencia N-terminálisa nem védet , a hasítási helykét őldalán álló aminősavgyök prőlintól eltérő, és az N-terminálisaminősavgyök lizintől és arginintől eltérő, és Y Tyr vagy Arg,katepszin C enzimmel hasítják, klőridiőn és szűlfhi ril-reagensjelenlétében. ŕ

Description

A genetikailag megváltozott prokariota sejtekben bioszintetizálódó fehéijék általában olyan proteinként nyilvánulnak meg, amelyek amino-végénél egy metionin kapcsolódik. A természetes fehérjéhez kapcsolódó metionin megváltoztatja a természetes fehérje biológiai aktivitását, konformációs stabilitását, antigenicitását stb., ezért - ha lehet - a legelőnyösebb eltávolítani a molekuláról.

Elméletileg az a leghatásosabb módja a kívánt természetes peptid előállításának, hogy a natív fehérje és az amino-terminális metionin közé egy hasítóhelyet helyezünk be. Valóságban azonban nagyon korlátozott azoknak a tényleges módszereknek a száma, melyekkel szelektív hasítást tudunk végezni.

így például azoknál a természetes fehérjéknél, melyek nem tartalmaznak máshol metionint, a bróm-ciános módszer (szelektíven a metioninnál hasít) nagyon hatásos eljárás a természetes protein előállítására. A közepes nagyságú peptideknél és proteineknél azonban ritka a metionin hiánya. Továbbá a bróm-cián igen toxikus anyag, kezelésénél nagyon nagy elővigyázatossággal kell eljárni. Ezért olyan fontos egy olyan alternatív eljárást kidolgozni, mellyel lehasíthatjuk a természetes fehérje amino-végéről a felesleges metionint.

Az N-terminális metionilcsoport eltávolítására alkalmas módszer katepszin C enzimet, más néven dipeptidilaminopeptidáz 1 enzimet (DAP-1) használ. A katepszin C olyan enzim, mely a protein vagy polipeptid N-terminális végéről két aminosavból álló egységeket hasít le. Megfelelő körülmények között megkezdődik a dipeptid lehasítása, és addig folytatódik, amíg az N-terminális aminosav nincs blokkolva; a hasítóhely bármelyik oldalán nincs egy prolin vagy az N-terminális aminosav nem lizin vagy arginin.

A bioszintetikus úton nyert protein előállításánál így felhasználhatjuk a katepszin C-t, ha a prekurzor-molekulát úgy tervezzük meg, hogy egy aminosavat tartalmaz a végső metionin és a kívánt termék között. Az ilyen prekurzort katepszin C enzimmel kezelve elérhetjük, hogy az enzim eltávolítja a végső dipeptidet és így hozzájutunk a kívánt termékhez. Ez az eljárás azonban szigorúan korlátozottan alkalmazható, minthogy a dipeptid-egységek eltávolítása várhatóan addig folytatódik, amíg a fent felsorolt befejező szekvenciák egyikéhez nem érünk. Vagyis a katepszin C alkalmazásának korlátozott felhasználhatósága általában csak azokra az esetekre szorítkozik, ahol a kívánt termék N-terminális része egyúttal egy katepszin C leállási pontot is jelent.

Felismertük azonban, hogy a prekurzor molekula N-terminális dipeptidjének milyensége befolyásolja annak mértékét, ahogyan a katepepszin C a dipeptidet eltávolítja a molekuláról. Ez a felismerés a találmányunk alapja. Felismertük, hogy ha a végálló dipeptid Met-Tyr vagy Met-Arg, a dipeptid eltávolítását óvatosan végezve a hasítás ellenőrizhető, és megkaphatjuk a kívánt terméket anélkül, hogy egy katepszin C leállítási pont lenne a következő dipeptid után.

A találmány tárgya eljárás humán inzulin vagy módosított humán inzulin előanyagának előállítására, melynek során egy

Met-Y-Protein általános képletű vegyületet, ahol „Protein” jelentése a humán inzulin vagy módosított humán inzulin prekurzorának aminosav-szekvenciáját tartalmazza, mely szekvencia N-terminálisa nem védett, a hasítási hely két oldalán álló aminosavgyök prolintól eltérő és az N-terminális aminosavgyök lizintől és arginintől eltérő, és Y Tyr vagy Arg, katepszin C enzimmel hasítjuk, kloridion és szulfhidril-reagens jelenlétében.

Ugyancsak a találmány tárgya a Met-Y-protein általános képletű vegyület.

Mint említettük, a találmány olyan vegyületekre irányul, melynek egyik részét úgy jelöltük meg, mint „protein”. A „protein” aminosavsorrendje megfelel a humán inzulin vagy egy humán inzulin-analóg előanyagának, továbbá jellemző rá, hogy az amino-terminális végénél nem tartalmaz a dipeptidet lehasító katepszin C leállási helyének megfelelő szekvenciát. A molekula általában három aminosav-szekvenciából áll, melyeket - az Nterminális végtől kezdve - Β, X és A betűkkel jelölünk. A B-vel jelölt szekvencia jelöli a humán inzulin B láncát vagy módosított B láncát. Az A-val jelölt szekvencia jelenti a humán inzulin A láncát vagy módosított A láncát. A „módosított B lánc” vagy „módosított A lánc” olyan aminosavláncot jelent, amelyik diszulfid-kötésen keresztül kapcsolódva a másik lánc natív vagy módosított alakjához, olyan molekulát alkot, mely inzulinszerű tulajdonsággal rendelkezik.

Az X csoport az inzulin A lánc vagy a módosított A lánc amino-terminális végéhez, illetve az inzulin B lánc vagy a módosított B lánc karboxil-terminális végéhez kapcsolódik. Az előanyag X kötőcsoportja változatos szerkezetű polipeptid lehet. Ez a polipeptid legalább 2, előnyösen 2-35, legelőnyösebben 6-35 aminosavból áll. Legelőnyösebb, ha az X kötőcsoport az a peptid, amelyik a humán proinzulin természetes kötőpeptidje. Ennek a kötőpeptidnek az aminosav-szekvenciája: -Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly- Ser-Leu-Gin- Lys-Arg-.

Noha mint említettük, az az előnyös, ha az X csoport aminosavsorrendje megfelel a természetes kötőcsoport szekvenciájának, az X csoport lehet rövidebb peptidszekvencia különféle változata is. A követelmény csak annyi, hogy a szekvencia hossza tegye lehetővé a diszulfid-kötés kialakulását az A és B lánc között és lehasítható legyen az inzulin vagy módosított inzulin előanyagáról, megkapva így az inzulint vagy a módosított inzulint. Tipikus ilyen dipeptid X csoport lehet az -Arg-Arg- csoport. Az említett dipeptid kibővülhet, nevezetesen egy -Arg-X’-Arg- szekvenciává, ahol X’ jelentése legalább egy aminosav. Igen előnyös az -Arg-Arg-Lys-Arg- peptid, valamint az ennél hosszabb, -Arg-Arg-X²-Lys-Arg- összetételű peptid, ahol X² jelentése legalább egy, előnyösebben legalább két aminosav. Ez a szekvencia természetesen magába foglalja a természetes kötőpeptidet is.

A natív humán inzulin B láncának aminosavsorrendje:

HU 215 582 Β

Phe^Val-Ajstr-Gln-ffi.s-Leu-Cys’-Gly-Sex’-His-Leu'-Val1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cya-Gly-Glu-Arg-Gly-Pha-Pha13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Tyr-Thr-Pr o-Lys-Thr ·

27 28 29 30

A találmány szerinti vegyületek közül az a legelőnyösebb, ha a B lánc megfelel a természetes B láncszekvenciának. Ugyancsak előnyösek azonban azok a szekvenciák is, melyeknél egymástól függetlenül, az alábbi egy vagy több aminosav-módosítás található:

1. a 28. Prolint Asp, Val, Leu, Ile, Nle, Arg, His, Lys, Phe, Alá, Gly, citrulin vagy omitin helyettesíti; ezek közül előnyös, ha a helyettesítés Val, Leu, Ile, Nle, Arg, His, Lys vagy omitin aminosavval történik; legelőnyösebb a Lys;

2. a 29. lizint L-Pro-D-Pro, D-hidroxi-prolin, Lhidroxi-prolin, L-(N-metil)-Lys, D-Lys, L-(N-metil)Arg vagy D-Arg helyettesíti; ezek közül a legelőnyösebb az L-Pro;

3. a 10. hisztidint Asp helyettesíti;

4. kiejtjük a 30. helyről a Thr-t.

A természetes humán inzulin A láncának aminosavszekvenciája:

Gly~Il9-Val-Glu~Glct“Cys“Cys~Thr“Ser~TlQ~Cys“S0r·1224 567 89 10 11 12

Leu~Tyr“Gln-Leu“Glu*“Asn*-Tyr“Cy s-Aan . 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Igen előnyös, ha a találmány szerinti vegyületben a természetes humán inzulin A lánca szerepel. Ugyancsak előnyös azonban az a módosulat is, ahol a 21. Asn-t Alá helyettesíti.

A használt rövidítések:

rövidítés aminosav

Alá	Alanin
Arg	Arginin
Asn	Aszparagin
Cys	Cisztein
Gin	Glutamin
Glu	Glutaminsav
Gly	Glicin
His	Hisztidin
Ile	Izoleucin
Leu	Leucin
Nle	Norleucin
Phe	Fenilalanin
Pro	Prolin
Ser	Szerin
Thr	Treonin
Tyr	Tirozin
Val	Valin

Azokat a találmány szerinti vegyületeket, ahol a humán inzulin vagy a humán inzulin-analóg előanyag egy Met-Tyr- vagy Met-Arg- peptiddel hosszabb, katepszin C enzimmel kezelve szelektíven át tudjuk alakítani az előanyaggá. A katepszin C-vel való kezelés röviden az alábbiak szerint történik.

A katepszin C ahhoz, hogy aktívabbá váljon, kloridion (Cl-) jelenlétét igényli. Ezért a találmány szerinti vegyületnek átalakításához kloridiont adunk a reakcióelegyhez. A kloridion mennyisége minimális lehet, elég, ha katalitikus mennyiségben van jelen. Elegendő az a mennyiség, ami a protein előzetes kezeléséből visszamarad, például nátrium-klorid formájában. Elegendő tehát a nyomnyi mennyiségű kloridion jelenléte.

Minthogy a találmány szerinti vegyületek átalakítása enzimatikus reakció, a katepszin C mennyisége ugyancsak minimális a kiindulási Met-Y-protein mennyiségéhez képest. A katepszin C/protein moláris aránya körülbelül 1:1000-100000. Előnyösen az az arány nem nagyobb, mint 1:10000, általában 1: 10000-70000.

A reakciót általában alkalmas vizes pufferben végezzük, melynek kémhatása pH=2,5-10. Előnyösen ez a kémhatás a gyengén savanyú és a semleges közé esik, azaz pH=2,5-7, legelőnyösebben pH=3,0-6,0.

Bizonyos esetekben oldódást elősegítő anyagot alkalmazhatunk, ilyen például a karbamid, nátriumdodecil-szulfát, guanidin stb.

Bármelyik olyan puffért alkalmazhatjuk, amelyikkel a kívánt pH-tartomány beállítható. Tipikus ilyen puffer például a nátrium-foszfát, nátrium-acetát, nátrium-citrát, kálium-foszfát, kálium-acetát, káliumcitrát stb. Előnyös puffer a nátrium-acetát és a kálium50 acetát.

A találmány szerinti vegyület átalakítása igényli továbbá egy szulfhidril reagens jelenlétét is. Tipikus ilyen reagens a β-merkapto-etanol, ditiotreitol, ditio-eritritol, β-merkapto-etil-amin, cisztein és hasonlók. Előnyös ezek közül a β-merkapto-etanol, ditiotreitol és a cisztein alkalmazása, legelőnyösebb a cisztein.

A szulfhidril reagens moláris koncentrációja a végső reakcióelegyben 0,1-200 mM, előnyösen 1 -20 mM.

A reakciót általában 15-45 °C közötti hőmérsékle60 ten hajtjuk végre, a reakcióidő 1-24 óra. Az előnyös

HU 215 582 Β hőmérséklet-tartomány: 20-45 °C, még előnyösebben: 22-45 °C; 6-20 óra reakcióidővel.

A találmány szerinti vegyületnek katepszin C-vel történő kezelése eredményeként keletkezik a „protein”ként jelölt szerkezet, mely a humán inzulin vagy a humán inzulin-analóg előanyagának felel meg.

Az így keletkezett „protein”-t olyan körülmények közé visszük, ahol kialakulnak a molekula diszulfid kötései („hajtogatott” molekula). A humán inzulin vagy inzulin-analóg előanyag „hajtogatott” molekulájára jellemző :

1. A humán inzulin A láncából (vagy analógjából) és a humán inzulin B láncából (vagy analógjából) áll;

2. Három diszulfid kötéssel rendelkezik, melyek az A- és B lánc Cys aminosavjainak kénatomjait köti össze, nevezetesen az A-6 és A-11, az A-7 és B-7, illetőleg az A-20 és B-19 ciszteinek között;

3. Tartalmaz egy eltávolítható kötőcsoportot az inzulin A lánc (vagy analóg) amino-terminális és az inzulin B lánc (vagy analóg) amino-terminális és az inzulin B lánc (vagy analóg) karboxil-terminális vége között.

A „protein” összehajtogatásához alkalmazott körülmények biztosításához a 20 mM glicines pufferben pH=9 készített tömény „protein”-oldatot vízzel annyira hígítjuk meg, hogy a „protein” végső koncentrációja 1 g/1 legyen. Cisztein-hidrokloridot adunk hozzá 1,25 mM koncentrációban, és a kémhatást nátriumhidroxiddal pH=10,5-10,7 értékre állítjuk be, majd az oldatot 5 °C hőmérsékleten inkubáljuk 16 órán keresztül.

Az „összehajtogatott” molekulát ezután enzimatikus kezelésnek vetjük alá, mely eltávolítja a kötőcsoportot és kialakul a humán inzulin vagy inzulinanalóg kívánt szerkezete. Ehhez a hasításhoz jól ismert módszer a tripszin és a karboxi-peptidáz B együttes alkalmazása. Ezt a módszert már évekkel ezelőtt leírták [például W. Kemmler, J. L. Clark, J. Borg és D. F. Steiner, Fed. Proc., 30: 1210 (1971); W. Kemmler, J. D. Peterson és D. F. Steiner, J. Bioi. Chem., 246: 6786-6791 (1971)].

A találmány szerinti vegyületeket a rekombináns DNS-módszerrel állítjuk elő. Előállításánál a kívánt vegyületet kódoló nukleotidszekvenciát a ma már rutinszerűen alkalmazott módszerrel készítjük el. Ez a módszer általában abból áll, hogy a kívánt szekvenciának elkészítjük az oligonukleotid fragmenseit és ezek komplementer szekvenciáit. Az oligonukleotidokat úgy tervezzük meg, hogy a kódolószekvencia egy fragmensét két komplementer szekvencia lapolja át és viszont. Az oligonukleotidokat párosítjuk és összekapcsoljuk, kialakítva a kívánt génszekvenciát.

A szekvenciát úgy építjük be egy klónozó vektorba, hogy a kódolt termék kifejeződhessen. Az alkalmas klónozó vektor az expresszió irányítószekvenciájának legalább egy részét tartalmazza.

Az elmondottak szemléltetésére az alábbiakban példákat adunk meg. A példák kizárólag szemléltető célzatúak, és a találmány oltalmi körét nem korlátozzák.

/. Példa

A „nemhajtogatott” Met-Tyr-proinzulin hasítása

Fagyasztva szárított Met-Tyr-proinzulint (cisztein formában; 36%-os tisztaságú) 0,25n ecetsav, 7M karbamidrendszerben oldunk fel, hogy a végső fehérjekoncentráció 4,68 mg/ml legyen (A₂₇₆, E= 1). Ezt az oldatot 0,25n ecetsavval kétszeresére hígítjuk. 334 pl hígított oldathoz hozzáadunk 290 μΐ 0,25n ecetsav/7M karbamid-oldatot, 136 μΐ 0,25n ecetsavat és 40 μΐ 1M nátrium-dihidrogén-foszfát-oldatot: a végső térfogat 0,8 ml. 5n nátrium-hidroxid-oldattal a kémhatást pH=6,0 értékre állítjuk be. DAP-l(cisztein)nátriumklorid-oldatot állítunk össze az alábbi alkotórészekből: 400 μΐ 1M nátrium-klorid-oldat, 250 μΐ 100 mM cisztein-hidroklorid (vízben, pH = 6) és 400 μΐ 1,93 egység/ml dipeptidil-aminopeptidáz-1 (DAP-Íjoldat, melyet 50 mM citrát, 10 mM nátrium-klorid-oldatban készítettünk, pH=5.

μΐ DAP-l(cisztein)nátrium-klorid-oldatot összekeverünk 375 μΐ meghígított Met-Tyr-proinzulinoldattal és szobahőmérsékleten (22 °C) tartjuk 30 percen át (a végső arány: DAP-1 (Met-Tyr-proinzulin = 120 Ug). Hat térfogatnyi szulfitolizil-oldat (7M karbamid, 0,5M Tris pH = 8,5, 0,2M dinátrium-szulfát, 0,01M kálium-tetrationát, K₂S₄O₆) hozzáadásával leállítjuk a reakciót és fordított fázisú HPLC-vel analizálunk. Ilyen körülmények között a Met-Tyr-proinzulin kevert diszulfid kvantitatív átalakulása megtörténik proinzulin S-szulfonáttá.

2. példa

A „ nemhajtogatott ” Met- Tyr-proinzulin-analóg (B lánc 28. aminosavja, a B-28: lizin, a B lánc

29. aminosavja, a B-29: prolin) hasítása

A Met-Tyr-proinzulin-analógot (B-28 Lys, B-29 Pro) nem oldott állapotú proteinként állítjuk elő az E. coli citoplazmájában. A nem oldott fehéijét a sejtek felszakításával és differenciál-centrifugálással különítjük el. Az oldatbavitelhez 7M karbamid, 5 mM cisztein koncentrációjú közegben, pH=ll,5 kémhatáson inkubáljuk 10 percen át a fehéijét, majd az inkubációt pH = 8,9 kémhatásnál folytatjuk. A proteint kationcserélő kromatográfíával tisztítjuk, elúcióhoz pH=4 kémhatású 50 mM ecetsav, 7M karbamidoldatban lineáris nátrium-klorid-grádienst alkalmazunk. A kapott preparátum - mely 1,5-1,7 mg/ml proinzulinanalógot tartalmaz 30-50%-os OD-tisztaság mellett kémhatását pH=5,7 értékre állítjuk be 6n nátrium-hidroxid-oldattal. Az oldat 1,5 ml kivétjét hozzáadjuk 1,35 ml pH=5,7 kémhatású puffer (50 mM ecetsav, 50 mM nátrium-dihidrogén-foszfát), 0,075 ml 200 mM ciszteinoldat (pH = 5,7 kémhatású pufferben) és 0,075 ml milliliterenként 7,76 DAP-1-egységet tartalmazó oldat (pH=5,7 kémhatású pufferben) elegyéhez. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten (22 °C) inkubáljuk 0,7—20 órán keresztül.

A reakciót 9 térfogatnyi szulfitolízis-reagens (7M karbamid, 0,5M Tris, pH=8,5, 0,2M nátriumszulfit, 0,01M kálium-tetra-tionát) hozzáadásával állítjuk le és fordított HPLC-vel analizáljuk. Ilyen

HU 215 582 Β körülmények között a Met-Tyr-proinzulin-analóg kevert diszulfíd 80-86%-os mértékben alakul át proinzulin-analóg S-szulfonáttá anélkül, hogy a további enzimatikus hasítás kimutathatóan károsítaná a terméket.

3. példa

A „nemhajtogatott”Met-Arg-proinzulin-analóg (B-28: Lys, B-29: Pro) hasítása

A Met-Arg-proinzulin-analógot (B-28 Lys, B-29 Pro) nem oldott állapotú proteinként állítjuk elő az E. coli citoplazmájában. A nem oldott fehéijét a sejtek felszakításával és differenciál-centrifugálással különítjük el. Az oldatbavitelhez 7M karbamid, 5 mM cisztein koncentrációjú közegben, pH=ll,5 kémhatáson inkubáljuk 10 percen át a fehéijét, majd az inkubációt pH=8,9 kémhatásnál folytatjuk. A proteint kationcserélő kromatográfiával tisztítjuk, elúcióhoz pH=4 kémhatású 50 mM ecetsav, 7M karbamidoldatban lineáris nátrium-klorid-grádienst alkalmazunk. A kapott preparátum - mely 1,5-1,7 mg/ml proinzulin-analógot tartalmaz 30-50%-os OD-tisztaság mellett - kémhatását pH=5,7 értékre állítjuk be 6n nátrium-hidroxid-oldattal. Az oldat 1,5 ml kivétjét hozzáadjuk 1,35 ml pH=5,7 kémhatású puffer (50 mM ecetsav, 50 mM nátrium-dihidrogén-foszfát), 0,075 ml 200 mM ciszteinoldat (pH=5,7 kémhatású pufferben) és 0,075 ml, milliliterenként 7,76 DAP-1-egységet tartalmazó oldat (pH=5,7 kémhatású pufferben) elegyéhez. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten (22 °C) inkubáljuk 0,7-20 órán keresztül.

A reakciót 9 térfogatnyi szulfitolízis-reagens (7M karbamid, 0,5M Tris, pH=8,5, 0,2M nátriumszulfít, 0,01M kálium-tetra-tionát) hozzáadásával állítjuk le és fordított fázisú HPLC-vel analizáljuk. Ilyen körülmények között a Met-Tyr-proinzulin-analóg kevert diszulfíd 80-86%-os mértékben alakul át proinzulin-analóg S-szulfonáttá anélkül, hogy a további enzimatikus hasítás kimutathatóan károsítaná a terméket.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás humán inzulin vagy módosított humán inzulin előanyagának előállítására, azzal jellemezve, hogy egy

Met-Y-Protein általános képletű vegyületet, ahol „Protein” jelentése a humán inzulin vagy módosított humán inzulin prekurzorának aminosav-szekvenciáját tartalmazza, mely szekvencia N-terminálisa nem védett, a hasítási hely két oldalán álló aminosavgyök prolintól eltérő, és az N-terminális aminosavgyök lizintől és arginintől eltérő, és Y Tyr vagy Arg, katepszin C enzimmel hasítjuk, kloridion- és szulfhidril-reagens jelenlétében.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan Met-Y-Protein általános képletű vegyületet használunk, melyben Y az 1. igénypontban megadott, „Protein” három, B, A és X jelű aminosav-szekvenciából áll, ahol B jelentése a humán inzulin B lánca vagy egy módosított B lánc, A jelentése a humán inzulin A lánca vagy egy módosított A lánc, és X egy, az inzulin A lánc vagy módosított A lánc amino-terminális végéhez és az inzulin B lánc vagy módosított B lánc karboxi-terminális végéhez kapcsolódó csoport azzal a feltétellel, hogy (1) az X csoport legalább olyan hosszú szekvencia, mely az A és B lánc között diszulfid-kötésképződést tesz lehetővé, és (2) lehasítható az inzulinról vagy módosított inzulinról.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy A részként a humán inzulin A láncát alkalmazzuk.
4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy B-részként a humán inzulin B láncát alkalmazzuk.
5. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy X részként a humán proinzulin természetes kapcsolópeptidjét alkalmazzuk.
6. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Met-Y-Protein általános képletű vegyületben Yként tirozint, B részként a 28 helyzetű prolinja helyett lizint, a 29 helyzetű lizin helyett prolint tartalmazó humán inzulin B láncot és X-ként a humán inzulin természetes kapcsolópeptidjét alkalmazzuk.