JPH05178893A - Ｇｒｆ（１−４４）−ｎｈ２の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 臨床的に重要なＧＲＦ（１−４４）−ＮＨ₂
を得る経済的方法を提供すること。 【構成】 ＧＲＦ（１−４４）−ＮＨ₂は、Ｌｅｕ−Ｎ
Ｈ₂をＧＲＦ（１−４３）−ＯＨにトリプシンを触媒と
する酵素的カップリングにより調製される。後者の化合
物は組み換えＤＮＡ合成により得ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】動物の成長は、生物調節分子（bio-regula
tory molecules）のカスケードにより調節されると信じ
られる。視床下部（hypothalamus）は成長ホルモン解放
因子（Growth Hormone Releasing Factor）（ＧＲＦ）
と呼ぶ物質を産生し、この因子は引き続いて下垂体に作
用して、成長ホルモン（ＧＨ）を解放させる。ＧＨは肝
臓および他の末梢器官からのインスリン成長因子（ＩＧ
Ｆ）の分泌を刺激し、そしてＩＧＦは直線の成長につい
て要求される事象を刺激する種々の細胞のレセプタに結
合する。下垂体はソマトスタチンおよびＩＧＦにより負
のフィードバックの制御下に維持される。ＧＲＦは極め
て活性でありそしてμｇ／ｍｌのレベルの成長ホルモン
を血液中への解放を刺激できることが発見された。ＧＲ
Ｆは現在成長ホルモンによる処置、下垂体性小人症、成
長ホルモンの産生から生ずる糖尿病、創傷の治癒の増
強、熱傷の処置または加齢のプロセスの遅延のための候
補の領域の大部分において治療学的に利用できる。

【０００２】ＧＲＦの首尾よい単離は、膵臓の腫瘍が異
所的に大量のＧＲＦを産生する先端巨人症に関連すると
いう発見に部分的によった。４４，４０アミノ酸および
３７アミノ酸のアミノ−末端からの相同性のペプチドか
ら成る、ＧＲＦの３つの形態がグイレミン（Ｇｕｉｌｌ
ｅｍｉｎ）ら［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２１
８、５８５−５８７（１９８２）］およびリビエール
（Ｒｉｖｉｅｒ）ら［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３
００、２７６−２７８（１９８２）］により単離され
た。ＧＲＦの４４アミノ酸のアミド化形態は、親の分子
である考えられ、そしてこの分子の前述の形態の完全な
活性および最高の効力を示す。アミド化のカルボキシ−
末端はこの高いレベルの活性についての重要な構造の要
件である。なぜなら、対応する遊離酸（ＧＲＦ（１−４
３）−ＯＨ）は実質的に低いレベルの活性化を有するか
らである。これはこれらの臨床的に重要な分子を生成す
るための低いコストの方法を開発する重要な因子であ
る。

【０００３】こうして、組み換えＤＮＡ産生ペプチドの
アミド化は高い収率の工程で便利に使用できる方法によ
り従来可能でなかったので、所望の生成物、ＧＲＦ（１
−４４）−ＮＨ₂、の調製は、従来の固体相または溶液
相のペプチド合成法の使用によってのみ可能であった。
これらの方法によるこのような大きいペプチドの調製は
手におえそうにない技術的挑戦を表し、そして生産コス
トは比較的高いままである。

【０００４】組み換えＤＮＡ技術を使用することによっ
てペプチドを大規模でかつ低いコストで製造きることは
この分野においてよく知られている。こうして、アミド
官能性の導入のための基質として組み換え的に産生され
たペプチドを使用できることは、ＧＲＦ（１−４４）−
ＮＨ₂の商業化において重要な開発である。

【０００５】本発明は、ＧＲＦ（１−４３）−ＯＨを出
発物質として使用してＧＲＦ（１−４４）−ＮＨ₂をす
ぐれた収率で便利に調製できるという発見に基づく。Ｇ
ＲＦ（１−４３）−ＯＨはこの分野において利用可能な
既知の組み換えＤＮＡ法により製造することができる。
ＧＲＦ（１−４３）−ＯＨの所望の生成物、ＧＲＦ（１
−４４）−ＮＨ₂、への転化は、本発明の方法に従い−
Ｌｅｕ−ＮＨ₂をＧＲＦ（１−４３）−ＯＨをトリプシ
ン触媒カップリングにより、容易に達成される。トリプ
シンは、カルボキシ−末端のアルギニンまたはリジンを
含有するペプチドのペプチド交換を触媒することはこの
分野においてよく知られている［Ｊ．マーカッセン（Ｍ
ａｒｋｕｓｓｅｎ）、「ブタのインスリンおよび生物合
成の前駆体のペプチド交換によりヒトのインスリン（Ｈ
ｕｍａｎ Ｉｎｓｕｌｉｎ ｂｙＴｒａｎｓｐｅｐｔｉ
ｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｉｎｓｕｌｉｎ
ａｎｄ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｒｅｃｕｒｓｏ
ｒｓ）」、ＭＴＰ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．、ボストン
（１９８７）；Ｈ．ツズチ（Ｔｓｕｚｕｔｉ）ら、ジャ
ーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ）、８８、６６９−６７５（１９８０）；
およびＬ．リーチマン（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ）および
Ｖ．カシェ（Ｋａｓｃｈｅ）、バイオヒミカ・エト・バ
イオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ａｃｔａ）、８３０、１６４（１９８５）］。生成
物、ＧＲＦ（１−４４）−ＮＨ₂、は、酢酸で急冷後、
この分野において知られているペプチド精製方法によ
り、最も好ましくはＨＰＬＣおよび引き続くそれ自体既
知の脱塩法により、反応媒質から容易に単離することが
できる。

【０００６】本発明の方法は、好ましくは組み換えＤＮ
Ａ合成により得られた、ＧＲＦ（１−４３）−ＯＨを添
加したトリプシンおよびＬｅｕ−ＮＨ₂の溶液を含有す
る反応混合物を調製することによって、便利には実施す
ることができる。本発明のために使用する溶媒は、トリ
プシン合成において利用する任意の溶媒であることがで
き、そしてペプチド合成と適合性である。本発明の目的
に好ましい溶媒は、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）
である。

【０００７】好ましくは、Ｌｅｕ−ＮＨ₂溶液は、Ｌｅ
ｕ−ＮＨ₂の鉱酸（例えば、ＨＣｌ）塩を水中に溶解
し、希塩基（例えば、ＮａＯＨ）をｐＨ８.０に添加
し、凍結乾燥し、そして残留物を所望の反応溶媒、例え
ば、ＤＭＡＣ中に取ることによって調製される。

【０００８】同様に、トリプシン溶液は便利にはトリプ
シンを希水性ＣａＣｌ₂（０.１モル）中に溶解すること
によって調製される。トリプシンおよびＬｅｕ−ＮＨ₂
を混合し（２５．：７５ｖ／ｖ）そしてＧＲＦ（１−４
３）−ＯＨの添加により開始する。反応は便利には室温
において実施することができる。出発化合物の所望の最
終生成物への転化後、反応混合物からアリコートを取り
出し、酢酸で希釈して反応を急冷し、次いで溶液をＨＰ
ＬＣカラムに適用することができる。通常、反応は約
３.５時間で完結する。

【０００９】反応混合物は氷酢酸を添加し、そして水で
希釈することによって急冷する。ＨＰＬＣ［リクロソー
ブ（Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ）ＰＲ−８カラム］で分画
し、次いで脱塩し［例えば、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒ
ｓ）μボンダパック（Ｂｏｎｄａｐａｋ）Ｃ−１８］し
そして凍結乾燥すると、精製された生成物、ＧＲＦ（１
−４４）−ＮＨ₂、がすぐれた収率で得られる。

【００１０】次の実施例によって、本発明を好ましい実
施態様においてさらに説明する。これらの実施例は本発
明を限定するものではない。

【００１１】

【実施例】実施例１ すべてのアミノ酸誘導体は、Ｌ−立体配置でありそして
ベイチェム（Ｂａｃｈｅｍ）（米国カリフォルニア州ト
ランス）から購入した。ブタのトリプシンのシグマ（Ｓ
ｉｇｍａ）ＩＸ型［シグマ，ケミカル・カンパニー（Ｓ
ｉｇｍａ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）、米国
ミゾリー州セントルイス］をＮ^α−ベンゾイル−Ｌ−ア
ルギニンエステル（ＢＡＥＥ）に対してアッセイし、そ
して比活性は１.８５×１０⁴Ｕ／ｍｇであると決定され
た。それをＮ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメ
チルケトン（ＴＰＣＫ）［Ｇ．シェルマン（Ｓｃｈｏｅ
ｌｌｍａｎ）およびＥ．シャウ（Ｓｈａｗ）、バイオケ
ミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２、２５２
（１９８３）］で処理し、次いで蒸留水に対して広範に
透析し、そして凍結乾燥して、２.０２×１０⁴Ｕ／ｍｇ
が得られた。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド［コダック
（Ｋｏｄａｋ）、スペクトロ等級］および１，４−ブタ
ンジオール［シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ゴールドラベル］
を３Ｓシーブで乾燥した。０.５モルのＮＨ₄ＨＣＯ
₃（ｐＨ８.０）中のペプチド（１ｍｇ／ｍｌ）およびウ
シのトリプシン［ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、米
国マサチュセッツ州ベッドフォード、０.１ｍｇ／ｍ
ｌ］の溶液中の２０時間、トリプシン消化を実施した。
ガラス電極を使用して、すべてのｐＨの測定を実施し
た。従来記載されたように、ラットの膵臓細胞中で、特
定のラットの成長ホルモンのラジオイムノアッセイを使
用して、生体外バイオアッセイを実施した［Ｐ．ブラゼ
アウ（Ｂｒａｚｅａｕ）ら、プロシーディングス・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、７９、
７９０９（１９８２）］。ＧＲＦ（１−４３）−ＯＨ
は、次のようにして固体相合成により調製した：Ｂｏｃ
−Ｌｅｕ−フェニルアセトアミド（ＰＡＭ）−樹脂
（４.０ｇ、０.３３ミリモル／ｇ、１.３２ミリモル）
を２つの５０ｍｌの反応器の中に導入し、そして固相の
ペプチド合成をＢＯＰ手順により実施した［Ａ．フォウ
ルニーア（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ）、Ｃ．−Ｔ．ワング（Ｗ
ａｎｇ）およびＡ．Ｍ．フェリックス（Ｆｅｌｉｘ）、
インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプチド・ア
ンド・プロテイン・リサーチ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉ
ｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．）、３１、８６−９７
（１９８８）］。カップリングはその場の中和カップリ
ングのプロトコルを使用して［Ｄ．レ−ヌグエン（Ｌｅ
−Ｎｇｕｙｅｎ）、Ａ．ハーズ（Ｈｅｒｔｚ）および
Ｂ．カストロ（Ｃａｓｔｒｏ）、ジャーナル・オブ・ケ
ミカル・ソサイアティー（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）Ｐ
ｅｒｋｎ Ｔｒａｎｓ．１、１９１５−１９１９（１９
８７）］合計４２サイクルの間実施して、５.３ｇの保
護されたＧＲＦ（１−４３）−ＰＡＭ樹脂が得られた。
ペプチド−樹脂の１ｇの部分を無水のＨＦ（約２３％の
ｎ−プロパンチオールを含有する）で０℃において２時
間処理し、０℃において蒸発させ（高い真空；ＣａＯト
ラップ）、ＥｔＯＡｃで粉砕し、そしてＴＦＡで抽出
し、そして濾過した。濾液を蒸発させそして残留物を乾
燥すると、粗製のＧＲＦ（１−４３）−ＯＨが得られ
た。粗製ペプチドを２５ｍｌのＴＦＡ／Ｈ₂Ｏ中に溶解
し、濾過し（０.４５μのＨＡ型ミリポアフィルター）
そしてデュポン（Ｄｕｐｏｎｔ）Ｐｒｏ−１０Ｃ−８カ
ラム（２，２×２５ｃｍ）上に負荷した。このカラムを
（Ａ）Ｈ₂Ｏ（０５％のＴＦＡ）−（Ｂ）ＣＨ₃ＣＮ
（０.２５％のＴＦＡ）で２０％の（Ａ）〜４５％の
（Ｂ）の直線勾配で６０分以内に２１ｍｌ／分の流速に
おいて溶離した。分画を集め（１分／分画）そしてアリ
コートを分析用ＨＰＬＣ系により分析した：カラム：リ
ボソーブＲＰ−８（５ｍ）；（Ａ）０.１モルのＨＣｌ
Ｏ₄（ｐＨ２.５）−（Ｂ）ＣＨ₃ＣＮ；４０％の（Ｂ）
〜６０％の（Ｂ）２０分以内、１ｍｌ／分；０.２ＡＵ
ＦＳ；２０６ｎｍ。生成物は分画７０の中に出現し、こ
れを蒸発させ、そして凍結乾燥すると、１７ｍｇの物質
が得られた。生成物は分析用ＨＰＬＣにより均質である
ことが示され、そして酸加水分解後、期待したアミノ酸
組成が得られた：（アミノ酸分析：６ＮのＨＣｌ；１１
０℃；２４時間）：Ａｓｐ，４.０９（４）；Ｔｈｒ，
０.９１（１）；Ｓｅｒ，３.９６（４）；Ｇｌｕ，７.
７８（７）；Ｇｌｙ，３.１１（３）；Ａｌａ，４.８２
（５）；Ｖａｌ，０.９５（１）；Ｍｅｔ，１.０３
（１）；Ｉｌｅ，１.７６（２）；Ｌｅｕ，４.２９
（４）；Ｔｙｒ，１.８０（２）；Ｐｈｅ，０.８２
（１）；Ｌｙｓ，２.１５（２）；Ａｒｇ，６.０６
（６）。構造の確証はＦＡＢ質量スペクトルにより得ら
れた。計算値：（Ｍ＋Ｈ）⁺，４９２８.５。実測値：４
９２８.５。

【００１２】実施例２ Ｌｅｕ−ＮＨ₂−ＨＣｌ（１.３３ｇ、７.９８ミリモ
ル）を５.０ｍｌの水中に溶解し、１モルのＮａＯＨで
ｐＨ８.０に滴定し、凍結乾燥し、そして残留物を６.４
ｍｌのＤＭＡＣ中に取ることによって、ＤＭＡＣ中のＬ
ｅｕ−ＮＨ₂の１.２５モルの溶液を調製した。ＮａＣｌ
の沈澱を微細ガラスのフリットを通して濾過することに
よって除去すると、ｐＨ９.２５の透明な溶液が得られ
た。

【００１３】トリプシン（０.２０５ｍｇ、８.７２ミリ
モル）を０.１モルのＣａＣｌ₂（３００μｌ）中に溶解
し、次いで上のＤＭＡＣ（９５０μｌ）中の１.２５モ
ルのＬｅｕ−ＮＨ₂を添加することによって、７６：２
４（ｖ：ｖ）中のトリプシン（１４.５μモル）および
Ｌｅｕ−ＮＨ₂（０.９５モル）の溶液を調製した。ＧＲ
Ｆ（１−４３）−ＯＨ（５.１５ｍｇ、０.８６４μモ
ル）を０.６００ｍｌの上の酵素調製物中に溶解し、そ
して室温（約２２℃）に保持した。１ｍｌのアリコート
（１６μｌの合計）を取り出し、２００μｌの部分の２
０％の酢酸の中に希釈し、そしてＨＰＬＣカラムに適用
することによって、反応をモニターした。

【００１４】氷酢酸（０.２０ｍｌ）を添加しそして２.
４ｍｌに水で希釈することによって、反応を３.５時間
で中止した。この時点における収率は分析用ＨＰＬＣに
より決定して６０％であった。反応混合物の小さい部分
（５ｍｌ）を酢酸で急冷後それ以上のために取って置い
た。反応混合物を次のようにして精製した：分析用およ
び調製用のＨＰＬＣをリクロソーブＲＰ−８（５μ）カ
ラム（０.４×２５ｃｍ）で実施した。溶離剤：（Ａ）
０.１モルのＮａＣｌＯ₄（ｐＨ２.５）−（Ｂ）ＣＨ₃Ｃ
Ｎ。流速は１.５ｍｌ／分であり、そして３８〜４１％
の（Ｂ）で１０分および３１〜３５％の（Ｂ）で９０分
の勾配を、それぞれ、分析用および調製用の実験のため
に使用した。リクロソーブＲＰ−８カラムからの分画を
ウォーターズμボンダパックＣ−１８カラム（０.４×
３０ｃｍ）で脱塩した。溶離剤：（Ａ）Ｈ₂Ｏ（０.０２
５％のＴＦＡ）−（Ｂ）ＣＨ₃ＣＮ（０.０２５％のＴＦ
Ａ）および２.０ｍｌ／分の流速を使用した。試料を負
荷し、そしてカラムを１５％の（Ｂ）で２０分間洗浄
し、そしてカラムを１５〜４０％の（Ｂ）で２０分の勾
配を使用して溶離し、そして生成物を含有する分画をプ
ールし、そして凍結乾燥した。

【００１５】ＧＲＦ（１−４４）−ＮＨ₂の最終収量は
０.９５ｍｇ（０.３２２μモル、３７％）であった。Ｆ
ＡＢ−ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）⁺、計算値：５０４０.７。実測
値：５０４０.５。アミノ酸分析（６ＮのＨＣｌ；１１
０℃；７２時間）：Ａｓｐ，４.１２（４）；Ｔｈｒ，
０.９７（１）；Ｓｅｒ，３.６５（４）；Ｇｌｕ，７.
５４（７）；Ｇｌｙ，２.９９（３）；Ａｌａ，５.２７
（５）；Ｖａｌ，１.０４（１）；Ｍｅｔ，０.９２
（１）；Ｉｌｅ，２.０１（２）；Ｌｅｕ，５.１３
（５）；Ｔｙｒ，１.８７（２）；Ｐｈｅ，０.９１
（１）；Ｌｙｓ，２.０３（２）；Ａｒｇ，５.５４
（６）。試験管内の生物学的効力：０.９２±０.２２。
［ラットの膵臓の試験管内バイオアッセイ、ここでＧＲ
Ｆ（１−４４）−ＮＨ₂の効力は１.００である］。トリ
プシンのマッピングは、分析用ＨＰＬＣにより、ＧＲＦ
（１−４４）−ＮＨ₂の化学的に合成した標準のそれと
同一であった。

【００１６】本発明の主な特徴および態様は、次の通り
である。

【００１７】１、ＧＲＦ（１−４３）−ＯＨをＬｅｕ−
ＮＨ₂と触媒量のトリプシンの存在下に反応させ、そし
てＧＲＦ（１−４４）−ＮＨ₂を反応混合物から単離す
ることからなるＧＲＦ（１−４４）−ＮＨ₂の製造方
法。

【００１８】２、反応をジメチルアセトアミド中で実施
する上記第１項記載の方法。

【００１９】３、反応を室温において実施する上記第１
項記載の方法。

【００２０】４、反応の完結後、酢酸との混合により反
応混合物を急冷する上記第１項記載の方法。

【００２１】５、ＧＲＦ（１−４４）−ＮＨ₂をＨＰＬ
Ｃの使用により単離する上記第１項記載の方法。

【００２２】６、ＧＲＦ（１−４４）−ＮＨ₂を脱塩
し、そしてＨＰＬＣ後、凍結乾燥する上記第６項記載の
方法。

【００２３】７、上記第１〜６項のいずれかに記載の方
法により製造された化合物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エドガー・フイリツプ・ハイマー アメリカ合衆国ニユージヤージイ州07110 ナトレイ・プロスペクトストリート539

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＧＲＦ（１−４３）−ＯＨをＬｅｕ−Ｎ
   Ｈ₂と触媒量のトリプシンの存在下に反応させ、そして
   ＧＲＦ（１−４４）−ＮＨ₂を反応混合物から単離する
   ことを特徴とするＧＲＦ（１−４４）−ＮＨ₂の製造方
   法。
2. 【請求項２】 請求項１記載の方法により製造された化
   合物。