CN103827136B - 纯化裂解的胰岛素原的方法 - Google Patents
纯化裂解的胰岛素原的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103827136B CN103827136B CN201280047751.8A CN201280047751A CN103827136B CN 103827136 B CN103827136 B CN 103827136B CN 201280047751 A CN201280047751 A CN 201280047751A CN 103827136 B CN103827136 B CN 103827136B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- insulin
- pearl
- shell
- shell pearl
- distilled water
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
- B01D15/361—Ion-exchange
- B01D15/362—Cation-exchange
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
- B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
- B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
- B01J20/288—Polar phases
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
- B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
- B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
- B01J20/321—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions involving only carbon to carbon unsaturated bonds
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
- B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
- B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
- B01J20/3212—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3291—Characterised by the shape of the carrier, the coating or the obtained coated product
- B01J20/3293—Coatings on a core, the core being particle or fiber shaped, e.g. encapsulated particles, coated fibers
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J39/00—Cation exchange; Use of material as cation exchangers; Treatment of material for improving the cation exchange properties
- B01J39/26—Cation exchangers for chromatographic processes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
- B01D15/361—Ion-exchange
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
本发明属于生物分子纯化领域。更确切地讲,本发明涉及使用特定种类的具有内核和外部功能化层的壳珠的色谱纯化胰岛素。所述方法能够以高流速和超过90%的高纯度纯化。
Description
发明领域
本发明属于生物分子纯化领域。更确切地讲,本发明涉及使用特定种类的具有内核和外部功能化层的壳珠的色谱纯化胰岛素。所述方法能够以超过90%的非常高的纯度纯化。
发明背景
胰岛素在细菌(E.coli)或酵母中生成。在细菌的情况下,胰岛素(表达为胰岛素原)在内含体中生成,经过变性、重折叠和复性之后通过几个步骤进行纯化。通常,几个色谱步骤与过滤步骤、胰岛素原酶促裂解成胰岛素、沉淀结晶和配制步骤结合。在酵母表达体系的情况下,不形成内含体,除此之外,该过程与细菌的情况十分类似。
胰岛素以每年数吨的产量被制造,且胰岛素的使用逐年增加。越来越多的人将患糖尿病,在发展中国家同样重要。胰岛素的需求增加使得必需利用有效的制造方法和工艺。产率日益重要且获得较高产率的方法通常给出较好的工艺经济性,转变成更实惠的产品。承受能力是制造可为更广泛基数的患者所用的产品的关键参数。这对于不断饱受成本增加压力的卫生保健部门施加不必要的约束同样重要。
因此,将期望具有以高产率获得纯产物的用于制造胰岛素的更快更经济的方法。
以前并没有提出使用壳珠色谱纯化胰岛素。
发明概述
本发明提供胰岛素纯化方法,其中,与常规方法相比较,色谱介质的荷载(每毫升色谱介质荷载的产物克数)可增加三倍,降低了色谱介质的消耗。这可直接转变成更加成本有效的方法。另外,在本文所述的色谱步骤中使用壳珠的方法可以较高的速度操作,使得能够在给定的时间生成更多产物,即通过缩短该特定色谱步骤的时间而使得该方法更加经济。
本发明提供使用壳珠用于生物分子纯化的方法,所述壳珠的特征在于仅在所述珠的最外层中功能化,即功能配体仅存在于所述最外层内,而不存在于所述珠的核中。可控制所述功能化层的厚度,且所述珠的未功能化的核可用例如葡聚糖填充或可以是空的。
具有功能化层的色谱珠具有的潜能是,具有与小得多的完全功能化的珠相当的分离度,同时维持较大珠的较好的压力流动性质。所述壳珠的容量(capacity)本质上将由功能化的珠的体积分数所反映,因此将低于同样大小的完全功能化珠的容量。
因此,本发明涉及由胰岛素原纯化胰岛素的方法,所述方法包括将裂解的胰岛素原样品装载到包含多孔壳珠的色谱介质上,所述壳珠具有内核和提供有离子交换配体的外部功能化层;将胰岛素吸附在所述配体上;和以100-1000cm/h、优选300-600cm/h的流速从所述色谱介质上洗脱胰岛素,其中所述洗脱的胰岛素具有大于85%、优选大于90%的纯度。
在所述方法中使用的壳珠的直径为20-100μm,优选为40-80μm。
所述壳珠的功能化层包括3-9μm厚的层,优选为5-7μm厚的层。
所述离子交换配体为强阳离子交换基团,诸如磺酸基(SO3 -)、硫酸基(-OSO3 -)、磷酸基(-OPO3 2-)和膦酸基(PO3 2-)。
在一个实施方案中,所述壳珠的核填充有合适的极性聚合物,以使得所得核更致密,从而给出较好的分离度(窄峰)。所述极性聚合物可为琼脂糖、葡聚糖、纤维素、淀粉、支链淀粉或完全合成的聚合物,如聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚(丙烯酸羟基烷基酯)。
附图简述
图1为在本发明的纯化方法中使用的壳珠的示意图。
图2为显示使用壳珠色谱法纯化胰岛素的图。
图3为床高和流速对在充填了两种不同介质的管柱上的背压的影响。
图4为使用商品介质和在本发明中使用壳珠介质纯化胰岛素的比较。
图5显示流速对商品介质和在本发明中使用的壳珠介质的影响。
图6显示商品介质和壳珠介质的胰岛素纯化的结果。
发明详述
下文将更密切地结合一些非限制性实施例描述本发明。
材料和方法
在本文中提供基于SepharoseHFA55和两种参比原型/树脂的三种不同壳珠构建体的结果(图1,表1)。
在图1中从左至右:原型S6:S-配体在最外层中且核保持未功能化;原型S20:像原型S6一样,但核用葡聚糖T150(Mp150,000)填充;原型S26:像原型S20一样,但S-配体偶合在葡聚糖增量剂(Mp10,000)上;原型S12:参比原型,其中整个珠被功能化;以及,CaptoSPImpRes。前四种原型具有77μm的粒度,而CaptoSPImpRes具有40μm的粒度。
表1.所试验原型的性质。
制备基于SepharoseHFA55的壳介质
合成原型S6
烯丙基活化SepharoseHFA55
将SepharoseHFA55在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。称量凝胶-700ml排干凝胶(drainedgel)到三颈圆底烧瓶中。加入NaOH(/700ml,50%-溶液)并开始机械搅拌。将浆液在水浴中加热到50℃。在大约1小时之后,加入126ml烯丙基缩水甘油醚(AGE)。随后使该浆液在强烈搅拌下过夜。在约20小时之后,将该浆液转移到玻璃过滤器并用蒸馏水(x4)、乙醇(x4)和蒸馏水(x4)洗涤。
烯丙基含量随后经滴定测定:215μmol/ml。
壳活化(部分溴化)
称量100ml烯丙基化凝胶到烧瓶中,加入100ml蒸馏水。将0.524ml溴溶解于800ml蒸馏水中,并加到该烯丙基化凝胶浆液中。该用量的溴应该获得(对应于)约7.5μm的壳厚度。在强烈搅拌下将该溴溶液瞬间加到该烯丙基凝胶浆液中。大约10分钟之后,将该凝胶在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。
SO3 --基团的壳偶合
将100ml该部分溴化的凝胶(参见上文)转移到烧瓶中并与溶解于100ml蒸馏水中的10g亚硫酸钠混合。在搅拌的同时,加入50%NaOH以使pH值达到12,接着在50℃下搅拌16小时并在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。随后将该凝胶在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。
所附着SO3 --的基团的量估计为43μmol/ml。
核烯丙基去除
将50mlS-壳凝胶(参见上文)与溶解于蒸馏水(50ml)中的20%(v/v)硫代甘油混合。将pH调节到10,接着在50℃下搅拌20小时。随后将该凝胶在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。
合成原型S12
烯丙基活化SepharoseHFA55
将SepharoseHFA55在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。称量凝胶-700ml排干凝胶到三颈圆底烧瓶中。加入NaOH(/700ml,50%-溶液)并开始机械搅拌。将浆液在水浴上加热到50℃。大约1小时之后,加入245ml烯丙基缩水甘油醚(AGE)。随后使该浆液在剧烈搅拌下过夜。约20小时之后,将该浆液转移到玻璃过滤器并用蒸馏水(x4)、乙醇(x4)和蒸馏水(x4)洗涤。
烯丙基含量随后经滴定测定:290μmol/ml。
珠活化(溴化)
称量50ml烯丙基化凝胶到烧瓶中,加入50ml蒸馏水和2.0g乙酸钠。加入溴(饱和水溶液)直至获得持久的黄色,接着用甲酸钠破坏过量的溴并在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。
SO3 --基团的壳偶合
将50ml溴化的凝胶(参见上文)转移到烧瓶中并与溶解于25ml蒸馏水中的10g亚硫酸钠混合。在搅拌的同时,加入50%NaOH以使pH值达到12,接着在50℃下搅拌18小时。随后将该凝胶在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。
所附着的SO3 --基团的量估计为103μmol/ml。
合成原型S20
烯丙基活化SepharoseHFA55
将SepharoseHFA55在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。称量凝胶-700ml排干凝胶到三颈圆底烧瓶中。加入NaOH(/700ml,50%-溶液)并开始机械搅拌。将浆液在水浴中加热到50℃。大约1小时之后,加入126ml烯丙基缩水甘油醚(AGE)。随后使该浆液在剧烈搅拌下过夜。约20小时之后,将该浆液转移到玻璃过滤器并用蒸馏水(x4)、乙醇(x4)和蒸馏水(x4)洗涤。
烯丙基含量随后经滴定测定:215μmol/ml。
壳活化(部分溴化)
称量100ml烯丙基化凝胶到烧瓶中,加入100ml蒸馏水。将0.524ml溴溶解于800ml蒸馏水中并加到该烯丙基化凝胶浆液中。该用量的溴应该获得(对应于)约7.5μm的壳厚度。在强烈搅拌期间将该溴溶液瞬间加到该烯丙基凝胶浆液中。大约10分钟之后,将该凝胶在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。
SO3 --基团的壳偶合
将100ml该部分溴化的凝胶(参见上文)转移到烧瓶中并与溶解于100ml蒸馏水中的10g亚硫酸钠混合。在搅拌的同时,加入50%NaOH以使pH值达到12.5,接着在50℃下搅拌18小时。随后将该凝胶在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。
所附着的SO3 --基团的量估计为43μmol/ml。
核活化(溴化)
称量50ml壳偶合的珠(参见上文)到烧瓶中,加入50ml蒸馏水和2.0g乙酸钠。加入溴(饱和水溶液)直至获得持久的黄色,接着用甲酸钠破坏过量的溴并在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。
在珠的核中偶合葡聚糖
通过在环境温度下缓慢搅拌2-4小时,将50g葡聚糖(MW:150000g/mol)溶解于50ml蒸馏水中。在搅拌的同时,加入6.25ml50%NaOH。将该溶液在50℃下搅拌16小时,随后在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。
合成原型S26
烯丙基活化SepharoseHFA55
将SepharoseHFA55在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。称量凝胶-400ml排干凝胶到三颈圆底烧瓶中。加入NaOH(400ml,50%-溶液)并开始机械搅拌。将该浆液在水浴中加热到50℃。大约1小时之后,加入72ml烯丙基缩水甘油醚(AGE)。随后使该浆液在剧烈搅拌下过夜。约20小时之后,将该浆液转移到玻璃过滤器并用蒸馏水(x4)、乙醇(x4)和蒸馏水(x4)洗涤。
烯丙基含量随后经滴定测定:215μmol/ml。
珠活化(溴化)
称量400ml烯丙基化的珠(参见上文)到烧瓶中,加入400ml蒸馏水和2.0g乙酸钠。加入溴(饱和水溶液)直至获得持久的黄色,接着用甲酸钠破坏过量的溴并在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。
葡聚糖偶合
通过在环境温度下缓慢搅拌2-4小时,将320g葡聚糖(MW:10000g/mol)溶解于400ml蒸馏水中。将400ml排干的活化的HFA55珠(参见上文)加到该葡聚糖溶液中,且将该溶液在50℃下搅拌1小时。在搅拌的同时,加入50ml50%NaOH。将该溶液在50℃下搅拌16小时,随后在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。
所附着的葡聚糖的量为17mg/ml。
烯丙基活化葡聚糖改性的SepharoseHFA55
将葡聚糖改性的SepharoseHFA55在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。称量凝胶-200ml排干凝胶到三颈圆底烧瓶中。加入NaOH(200ml,50%-溶液)并开始机械搅拌。将该浆液在水浴中加热到50℃。在大约1小时之后,加入36ml烯丙基缩水甘油醚(AGE)。随后使该浆液在剧烈搅拌下过夜。约16小时之后,将该浆液转移到玻璃过滤器并用蒸馏水(x4)、乙醇(x4)和蒸馏水(x4)洗涤。
烯丙基含量随后经滴定测定:220μmol/ml。
壳活化(部分溴化)
称量50ml烯丙基化凝胶到烧瓶中,加入500ml蒸馏水。将0.27ml溴溶解于50ml蒸馏水中并将其加到该烯丙基化凝胶浆液中。该用量的溴应该获得(对应于)约7.5μm的壳厚度。在强烈搅拌期间将该溴溶液瞬间加到该烯丙基凝胶浆液中。大约10分钟之后,将该凝胶在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。
其余烯丙基含量(在珠的核中的烯丙基)为130μmol/ml。
SO3 --基团的壳偶合
将50ml该部分溴化的凝胶(参见上文)转移到烧瓶中并与溶解于100ml蒸馏水中的5g亚硫酸钠混合。在搅拌的同时,加入50%NaOH以使pH值达到12,接着在50℃下搅拌16小时。随后将该凝胶在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。
所附着的SO3 --基团的量估计为50μmol/ml。
核活化(溴化)
称量50ml壳偶合的珠(参见上文)到烧瓶中,加入50ml蒸馏水和2.0g乙酸钠。加入溴(饱和水溶液)直至获得持久的黄色,接着用甲酸钠破坏过量的溴并在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。
在珠的核中偶合葡聚糖
通过在环境温度下缓慢搅拌2-4小时,将50g葡聚糖(MW:150000g/mol)溶解于50ml蒸馏水中。将50ml排干的核活化的HFA55珠(SO3 --基团附着在壳中)加到该葡聚糖溶液中,且将该溶液在50℃下搅拌1小时。在搅拌的同时,加入6.25ml50%NaOH。将该溶液在50℃下搅拌16小时,随后在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。
实验1:在参比树脂CaptoSPImpRes上由裂解的胰岛素原纯化胰岛素
胰岛素由裂解的胰岛素原纯化。存在三种有待除去的污染物:前峰、截断的胰岛素(truncatedinsulin)和主要污染物。这通过使用参比树脂CaptoSPImpRes成功地完成(图2)。
图2显示在1-mlCaptoSPImpRes(0.5cm内径)上的胰岛素纯化。胰岛素进料浓度为9mg/ml树脂,荷载体积为2ml。缓冲液A为50mM乙酸钠,pH4+47.5%乙醇。缓冲液B为50mM乙酸钠,pH4、250mMNaCl+47.5%乙醇。洗脱梯度为在10柱体积中缓冲液B以0-60%变化。该主要污染物用含有1MNaCl的缓冲液A洗脱。流速为0.4ml/min(5分钟停留时间)。显示了UV迹线和传导率。
实验2:在不同壳珠原型上纯化胰岛素与在参比树脂上纯化胰岛素的比较。
在高浓度的乙醇存在下进行纯化,且由于可能的聚集/原纤维化问题,荷载相对较低(约18g/L)。乙醇的存在给出并不符合需要的相对较高的背压。因此,已经研究了使用较大珠的壳珠构建体(较低背压)以避免压力流动限制的潜在性。在图3中显示在CaptoSPImpRes和较大壳珠上的背压的比较。
图3显示床高和流速对在充填了CaptoSPImpRes(40μm)及壳珠S6、S20和S26(77μm)的管柱的背压的影响。流速0.4ml/min和0.8ml/min分别对应于120cm/h和240cm/h的线性流速。
试验壳珠构建体的胰岛素纯化潜能。结果显示用这些壳珠可以将胰岛素纯化到>90%的纯度(用原型S20)(图4)。正如所料,在完全功能化的参比原型S12上的分离度比在壳珠原型上的分离度差得多。
图4显示在1-mlCaptoSPImpRes(0.5cm内径)上纯化胰岛素和在2-ml壳珠原型(0.5cm内径)上纯化胰岛素的比较。胰岛素进料浓度为9mg/ml树脂,荷载体积为2ml(CaptoSPImpRes)或4ml(壳珠原型)。缓冲液A为50mM乙酸钠,pH4+47.5%乙醇。缓冲液B为50mM乙酸钠,pH4、250mMNaCl+47.5%乙醇。洗脱梯度为在10柱体积中缓冲液B以0-60%变化。该主要污染物用含有1MNaCl的缓冲液A洗脱。对于壳珠原型,停留时间为2.5分钟(240cm/h),而对于CaptoSPImpRes,停留时间为5分钟。
实验3:在壳珠原型和参比树脂上,流速对从污染物中分离出胰岛素的影响
该分离在参比树脂CaptoSPImpRes上,分别在120cm/h和240cm/h的流速下是良好的。然而,对于壳珠,分离在高达480cm/h的流速下良好(图5)。在壳珠上在高达480cm/h的流速下纯度>90%。
图5显示研究在CaptoSPImpRes和壳珠原型(S20)上流速的影响。对于两种树脂,柱体积为2ml。胰岛素进料浓度为9mg/ml树脂。荷载体积为4ml。缓冲液A为50mM乙酸钠,pH4+47.5%乙醇。缓冲液B为50mM乙酸钠,pH4、250mMNaCl+47.5%乙醇。洗脱梯度为在15柱体积中缓冲液B以0-90%变化。
实验4:在参考树脂上纯化胰岛素和在用与参比树脂(CaptoSPImpRes)相同的基体(basematrix)制成的壳珠原型上纯化胰岛素
在上述实验中已经显示如果使用壳珠原理,在大珠(77μm)上可实现良好的纯化。
在该实验中,将壳珠原理应用到CaptoSPImpRes的较小珠(40μm)上。将分别是2μm和5μm的两种不同壳厚度功能化。正如所料,壳珠原型具有超过CaptoSPImpRes的改善的分离度(图6)。
图6显示在CaptoSPImpRes上纯化胰岛素和在用与CaptoSPImpRes相同的基体制成的壳珠原型上纯化胰岛素。壳珠原型具有分别2μm和5μm的功能化层。荷载为在50mM乙酸钠,pH4和10%乙醇中的6.5mg裂解胰岛素/ml树脂。洗脱步骤1用50mM乙酸钠,pH4、170mMNaCl、50%乙醇进行。洗脱步骤2与洗脱步骤1一样,不同之处在于NaCl浓度为1M。
结果和讨论
使用来自胰岛素方法的实际数据,进行在HFASP壳珠原型和CaptoSPImpRes上获得的估计产率的比较。
产率计算仅在CIEX步骤审核进行。
对于所有模拟,使用得自IntelligenInc.的SuperProDesigner,8.5版,Build3。进行该模拟以便在15g/L的浓度下加工胰岛素。选择15g/L的浓度作为在该步骤中胰岛素的平均浓度。对于两种树脂,产率皆为85%。模拟使用的床高:20cm。
对于HFASP壳珠原型通过使用480cm/h的荷载步骤流速,对于CaptoSPImpRes通过使用120cm/h的荷载步骤流速来进行模拟。这对于HFASP壳珠原型产生2.5分钟的停留时间(RT),对于CaptoSPImpRes产生10分钟的停留时间(RT)。除了在再生/CIP步骤中对两种树脂均设定在限定的时间(即15分钟),对于HFASP壳珠原型,所有其他流速都设定到600cm/h,对于CaptoSPImpRes,所有其他流速都设定到250cm/h。对于两种树脂,使用20g胰岛素/L树脂的工作/有效容量。
模拟的精加工步骤(polishingstep)包括以下操作:
?平衡:对于CaptoSPImpRes,4CV;对于HFASP壳珠,2CV
?荷载:50g胰岛素/L树脂
?洗涤:3CV
?洗脱:15CV梯度0-70%25CV和3CV100%
?CIP:15分钟
?再平衡:对于CaptoSPImpRes,4CV;对于HFASP壳珠,2CV。
使用HFASP壳珠原型的工艺的操作时间为1小时8分钟,而包括CaptoSPImpRes的工艺耗时2小时39分钟。表1显示得自这两种模拟的结果。
表1.在产率模拟的结果。
基于这些模拟组可见,与CaptoSPImpRes相比,采用HFASP壳珠原型的产率大致翻倍。
Claims (10)
1.由胰岛素原纯化胰岛素的方法,所述方法包括以下步骤:将裂解的胰岛素原样品装载到包含多孔壳珠的色谱介质上,所述壳珠具有内核和提供有离子交换配体的外部功能化层;将胰岛素吸附在所述配体上;和以100-1000cm/h的流速从所述色谱介质上洗脱胰岛素,其中所述洗脱的胰岛素具有大于85%的纯度。
2.权利要求1的方法,其中以300-600cm/h的流速从所述色谱介质上洗脱胰岛素
3.权利要求1或2的方法,其中所述洗脱的胰岛素具有大于90%的纯度。
4.权利要求3的方法,其中所述壳珠的直径为20-100μm。
5.权利要求3的方法,其中所述壳珠的直径为40-80μm。
6.权利要求3的方法,其中所述壳珠的功能化层包括3-9μm厚的层。
7.权利要求3的方法,其中所述壳珠的功能化层包括5-7μm厚的层。
8.权利要求3的方法,其中所述配体为选自磺酸根(SO3 -)、硫酸根(-OSO3 -)、磷酸根(-OPO3 2-)和膦酸根(PO3 2-)的强阳离子交换基团。
9.权利要求3的方法,其中所述核用选自琼脂糖、葡聚糖、纤维素、淀粉、支链淀粉或完全合成的聚合物的合适极性聚合物填充,其中所述完全合成的聚合物选自聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺和聚(丙烯酸羟基烷基酯)。
10.权利要求3的方法,其中所述胰岛素在细菌中生成。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SE1100722-6 | 2011-09-30 | ||
SE1100722 | 2011-09-30 | ||
PCT/SE2012/051040 WO2013048330A1 (en) | 2011-09-30 | 2012-09-28 | Method for purification of cleaved pro-insulin |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103827136A CN103827136A (zh) | 2014-05-28 |
CN103827136B true CN103827136B (zh) | 2016-07-06 |
Family
ID=47996093
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201280047751.8A Active CN103827136B (zh) | 2011-09-30 | 2012-09-28 | 纯化裂解的胰岛素原的方法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9409967B2 (zh) |
EP (1) | EP2748181B1 (zh) |
JP (1) | JP6093364B2 (zh) |
CN (1) | CN103827136B (zh) |
DK (1) | DK2748181T3 (zh) |
PL (1) | PL2748181T3 (zh) |
WO (1) | WO2013048330A1 (zh) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108883394B (zh) * | 2016-04-06 | 2022-05-10 | 思拓凡生物工艺研发有限公司 | 色谱基质 |
WO2018147393A1 (ja) * | 2017-02-10 | 2018-08-16 | 三菱ケミカル株式会社 | ヒトインスリン精製用分離剤及びヒトインスリンの精製方法 |
CA3236293A1 (en) * | 2021-12-07 | 2023-06-15 | Cytiva Bioprocess R&D Ab | Separation matrix and methods for separating target molecules |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1054523A (zh) * | 1965-11-17 | 1900-01-01 | ||
GB1285024A (en) * | 1968-08-09 | 1972-08-09 | Novo Terapeutisk Labor As | Process of purifying insulin |
US20110155668A1 (en) * | 2008-07-08 | 2011-06-30 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Separation medium for chromatography of various biomolecules |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2629568C3 (de) * | 1976-07-01 | 1981-09-10 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | Verfahren zur Reinigung von Insulin, seinen Analogen und Derivaten |
AU5397579A (en) | 1978-12-26 | 1980-07-03 | Eli Lilly And Company | Purifying insulin |
DE3511270A1 (de) | 1985-03-28 | 1986-10-09 | Veb Berlin-Chemie, Ddr 1199 Berlin | Insulin aus pankreasextrakten |
DE3511269A1 (de) | 1985-04-12 | 1986-10-09 | Veb Berlin-Chemie, Ddr 1199 Berlin | Verfahren zur reinigung von insulin |
DE3726655A1 (de) | 1987-08-11 | 1989-02-23 | Hoechst Ag | Verfahren zur isolierung basischer proteine aus proteingemischen, welche solche basischen proteine enthalten |
DE19652713C2 (de) * | 1996-12-18 | 2001-11-22 | Aventis Pharma Gmbh | Verfahren zur Reinigung von Insulin und Insulinderivaten durch Chromatographie an stark saurem Kationenaustauscher |
SE9700768D0 (sv) | 1997-03-04 | 1997-03-04 | Pharmacia Biotech Ab | Förfarande för att introducera funktionalitet |
DE19838097A1 (de) * | 1998-08-24 | 2000-03-02 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Verfahren zur chromatographischen Reinigung von Insulinen |
CA2693334C (en) * | 2007-07-25 | 2015-07-07 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Separation matrix |
JP2013520647A (ja) | 2010-02-19 | 2013-06-06 | ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ | クロマトグラフィー媒体の製造方法 |
-
2012
- 2012-09-28 EP EP12837180.4A patent/EP2748181B1/en active Active
- 2012-09-28 CN CN201280047751.8A patent/CN103827136B/zh active Active
- 2012-09-28 US US14/348,634 patent/US9409967B2/en active Active
- 2012-09-28 WO PCT/SE2012/051040 patent/WO2013048330A1/en active Application Filing
- 2012-09-28 DK DK12837180.4T patent/DK2748181T3/en active
- 2012-09-28 PL PL12837180T patent/PL2748181T3/pl unknown
- 2012-09-28 JP JP2014533247A patent/JP6093364B2/ja active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1054523A (zh) * | 1965-11-17 | 1900-01-01 | ||
GB1285024A (en) * | 1968-08-09 | 1972-08-09 | Novo Terapeutisk Labor As | Process of purifying insulin |
US20110155668A1 (en) * | 2008-07-08 | 2011-06-30 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Separation medium for chromatography of various biomolecules |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
PL2748181T3 (pl) | 2016-08-31 |
EP2748181A4 (en) | 2015-04-15 |
JP6093364B2 (ja) | 2017-03-08 |
EP2748181A1 (en) | 2014-07-02 |
US9409967B2 (en) | 2016-08-09 |
WO2013048330A1 (en) | 2013-04-04 |
CN103827136A (zh) | 2014-05-28 |
US20140243498A1 (en) | 2014-08-28 |
EP2748181B1 (en) | 2016-03-30 |
DK2748181T3 (en) | 2016-05-23 |
JP2014530211A (ja) | 2014-11-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Zhang et al. | Molecularly imprinted materials for selective biological recognition | |
Lu et al. | Evaluation of immunoglobulin adsorption on the hydrophobic charge-induction resins with different ligand densities and pore sizes | |
CN103827136B (zh) | 纯化裂解的胰岛素原的方法 | |
Tse Sum Bui et al. | Molecularly imprinted polymers as synthetic antibodies for protein recognition: the next generation | |
Gomis-Fons et al. | Optimization study on periodic counter-current chromatography integrated in a monoclonal antibody downstream process | |
Chen et al. | Comparison and recent progress of molecular imprinting technology and dummy template molecular imprinting technology | |
TWI682936B (zh) | 親和性層析用擔體 | |
CN107001432A (zh) | 突变的免疫球蛋白结合多肽 | |
Rusli et al. | Recent developments of liquid chromatography stationary phases for compound separation: from proteins to small organic compounds | |
CN104645949B (zh) | 一种以四肽为功能配基的亲和层析介质及其制备方法 | |
Himstedt et al. | Responsive membranes for hydrophobic interaction chromatography | |
CN102343257B (zh) | 改进的色谱介质的制备方法以及使用方法 | |
Mi et al. | Protein adsorption on core-shell particles: comparison of Capto™ Core 400 and 700 resins | |
CN110117379A (zh) | 一种用于血液灌流去除ldl吸附材料及其制备方法 | |
CN109336967A (zh) | 基于混合填料的抗体纯化方法 | |
Winderl et al. | Exploration of fiber-based cation exchange adsorbents for the removal of monoclonal antibody aggregates | |
CN101279243B (zh) | 一种混合模式扩张吸附床介质及其制备方法 | |
CN102659859A (zh) | 单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层析介质在磺达肝癸钠柱层析纯化中的应用 | |
El‐Sayed et al. | Purification of the two major proteins from whey concentrate using a cation‐exchange selective adsorption process | |
De Vleeschauwer et al. | Design and synthesis of a new Sialyl Lewis X Mimetic: How selective are the selectin receptors? | |
CN104109204A (zh) | 一种从水稻种子中分离纯化重组人乳铁蛋白的方法 | |
CN103936846B (zh) | 一种硫酸鱼精蛋白的纯化方法 | |
CN104741090A (zh) | 一种扩张床吸附(eba)介质和其制备方法 | |
Tong et al. | Development and thermodynamic evaluation of novel lipid raft stationary phase chromatography for screening potential antitumor agents | |
Brixius et al. | Expanded bed adsorption as a primary recovery step for the isolation of the insulin precursor MI3 process development and scale up |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20160824 Address after: uppsala Patentee after: GE HEALTHCARE BIO-SCIENCES AB Address before: uppsala Patentee before: GE Health Bio-science Co., Ltd. |
|
CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: uppsala Patentee after: Situofan Biotechnology R & D Co., Ltd Address before: uppsala Patentee before: GE HEALTHCARE BIO-SCIENCES AB |