JP6093364B2 - 生体分子の精製方法 - Google Patents
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Description
本明細書には、Sepharose HFA 55に基づく3種のシェルビーズ構築物及び2種の基準プロトタイプ/樹脂が示されている(図1、表1)。
プロトタイプS6の合成:
Sepharose HFA 55のアリル活性化
Sepharose HFA 55をガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。ゲル(700mLの水切りゲル)を三つ口丸底フラスコ内に秤取した。NaOH(700mL、50%溶液)を添加し、機械的撹拌を開始した。スラリーを水浴上で50℃に加熱した。約1時間後、126mLのアリルグリシジルエーテル(AGE)を添加した。次いで、スラリーを一晩激しく撹拌し続けた。約20時間後、スラリーをガラスフィルターに移し、蒸留水(×4)、エタノール(×4)及び蒸留水(×4)で洗浄した。
アリル化ゲル(100mL)をフラスコ内に秤取し、100mLの蒸留水を添加した。0.524mLの臭素を800mLの蒸留水に溶解し、アリル化ゲルスラリーに添加した。この量の臭素は、約7.5μmのシェル厚さを与える(それに対応している)と考えられる。臭素溶液は、アリルゲルスラリーを激しく撹拌しながら瞬時に添加した。約10分後、ゲルをガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。
100mLの部分臭素化ゲル(上記参照)をフラスコに移し、100mLの蒸留水に溶解した10gの亜硫酸ナトリウムと混合した。撹拌しながら、50%NaOHを添加してpH12にし、続いて50℃で16時間撹拌し、ガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。次いで、ゲルをガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。
50mLのS−シェルゲル(上記参照)を蒸留水(50mL)に溶解した20%(v/v)チオグリセロールと混合した。pHを10に調整し、続いて50℃で20時間撹拌した。次いで、ゲルをガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。
Sepharose HFA 55のアリル活性化
Sepharose HFA 55をガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。ゲル(700mLの水切りゲル)を三つ口丸底フラスコ内に秤取した。NaOH(700mL、50%溶液)を添加し、機械的撹拌を開始した。スラリーを水浴上で50℃に加熱した。約1時間後、245mLのアリルグリシジルエーテル(AGE)を添加した。次いで、スラリーを一晩激しく撹拌し続けた。約20時間後、スラリーをガラスフィルターに移し、蒸留水(×4)、エタノール(×4)及び蒸留水(×4)で洗浄した。
アリル化ゲル(50mL)をフラスコ内に秤取し、50mLの蒸留水及び2.0gの酢酸ナトリウムを添加した。臭素(飽和水溶液)を、持続的な黄色い色が得られるまで添加し、続いて過剰の臭素をギ酸ナトリウムで分解し、ガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。
50mLの臭素化ゲル(上記参照)をフラスコに移し、25mLの蒸留水に溶解した10gの亜硫酸ナトリウムと混合した。撹拌しながら、50%NaOHを添加してpH12にし、続いて50℃で18時間撹拌した。次いで、ゲルをガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。
Sepharose HFA 55のアリル活性化
Sepharose HFA 55をガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。ゲル(700mLの水切りゲル)を三つ口丸底フラスコ内に秤取した。NaOH(700mL、50%溶液)を添加し、機械的撹拌を開始した。スラリーを水浴上で50℃に加熱した。約1時間後、126mLのアリルグリシジルエーテル(AGE)を添加した。次いで、スラリーを一晩激しく撹拌し続けた。約20時間後、スラリーをガラスフィルターに移し、蒸留水(×4)、エタノール(×4)及び蒸留水(×4)で洗浄した。
アリル化ゲル(100mL)をフラスコ内に秤取し、100mLの蒸留水を添加した。0.524mLの臭素を800mLの蒸留水に溶解し、アリル化ゲルスラリーに添加した。この量の臭素は、約7.5μmのシェル厚さを与える(それに対応している)と考えられる。臭素溶液は、アリルゲルスラリーを激しく撹拌しながら瞬時に添加した。約10分後、ゲルをガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。
100mLの部分臭素化ゲル(上記参照)をフラスコに移し、100mLの蒸留水に溶解した10gの亜硫酸ナトリウムと混合した。撹拌しながら、50%NaOHを添加してpH12.5にし、続いて50℃で18時間撹拌した。次いで、ゲルをガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。
50mLのシェルカップルドビーズ(上記参照)をフラスコ内に秤取し、50mLの蒸留水及び2.0gの酢酸ナトリウムを添加した。臭素(飽和水溶液)を、持続的な黄色い色が得られるまで添加し、続いて過剰の臭素をギ酸ナトリウムで分解し、ガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。
50gのデキストラン(MW:150000g/mol)を、周囲温度で2〜4時間ゆっくりと撹拌することで50mLの蒸留水に溶解した。50mLの水切りコア活性化HFA 55ビーズ(シェルにSO3 -基が結合したもの)をデキストラン溶液に添加し、溶液を50℃で1時間撹拌した。撹拌しながら、6.25mLの50%NaOHを添加した。溶液を50℃で16時間撹拌し、次いでガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。
Sepharose HFA 55のアリル活性化
Sepharose HFA 55をガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。ゲル(400mLの水切りゲル)を三つ口丸底フラスコ内に秤取した。NaOH(400mL、50%溶液)を添加し、機械的撹拌を開始した。スラリーを水浴上で50℃に加熱した。約1時間後、72mLのアリルグリシジルエーテル(AGE)を添加した。次いで、スラリーを一晩激しく撹拌し続けた。約20時間後、スラリーをガラスフィルターに移し、蒸留水(×4)、エタノール(×4)及び蒸留水(×4)で洗浄した。
400mLのアリル化ビーズ(上記参照)をフラスコ内に秤取し、500mLの蒸留水及び2.0gの酢酸ナトリウムを添加した。臭素(飽和水溶液)を、持続的な黄色い色が得られるまで添加し、続いて過剰の臭素をギ酸ナトリウムで分解し、ガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。
320gのデキストラン(MW:10000g/mol)を、周囲温度で2〜4時間ゆっくりと撹拌することで400mLの蒸留水に溶解した。400mLの水切り活性化HFA 55ビーズ(上記参照)をデキストラン溶液に添加し、溶液を50℃で1時間撹拌した。撹拌しながら、50mLの50%NaOHを添加した。溶液を50℃で16時間撹拌し、次いでガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。結合したデキストランの量は17mg/mLであった。
デキストラン修飾Sepharose HFA 55をガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。ゲル(200mLの水切りゲル)を三つ口丸底フラスコ内に秤取した。NaOH(200mL、50%溶液)を添加し、機械的撹拌を開始した。スラリーを水浴上で50℃に加熱した。約1時間後、36mLのアリルグリシジルエーテル(AGE)を添加した。次いで、スラリーを一晩激しく撹拌し続けた。約16時間後、スラリーをガラスフィルターに移し、蒸留水(×4)、エタノール(×4)及び蒸留水(×4)で洗浄した。
シェル活性化(部分臭素化)
アリル化ゲル(50mL)をフラスコ内に秤取し、500mLの蒸留水を添加した。0.27mLの臭素を50mLの蒸留水に溶解し、アリル化ゲルスラリーに添加した。この量の臭素は、約7.5μmのシェル厚さを与える(それに対応している)と考えられる。臭素溶液は、アリルゲルスラリーを激しく撹拌しながら瞬時に添加した。約10分後、ゲルをガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。
50の部分臭素化ゲル(上記参照)をフラスコに移し、100mLの蒸留水に溶解した5gの亜硫酸ナトリウムと混合した。撹拌しながら、50%NaOHを添加してpH12にし、続いて50℃で16時間撹拌した。次いで、ゲルをガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。
50mLのシェルカップルドビーズ(上記参照)をフラスコ内に秤取し、50mLの蒸留水及び2.0gの酢酸ナトリウムを添加した。臭素(飽和水溶液)を、持続的な黄色い色が得られるまで添加し、続いて過剰の臭素をギ酸ナトリウムで分解し、ガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。
50gのデキストラン(MW:150000g/mol)を、周囲温度で2〜4時間ゆっくりと撹拌することで50mLの蒸留水に溶解した。50mLの水切りコア活性化HFA 55ビーズ(シェルにSO3 -基が結合したもの)をデキストラン溶液に添加し、溶液を50℃で1時間撹拌した。撹拌しながら、6.25mLの50%NaOHを添加した。溶液を50℃で16時間撹拌し、次いでガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。
開裂プロインスリンからインスリンを精製する。除去すべき3種の夾雑物、即ちプレピーク、トランケート型インスリン及び主夾雑物が存在している。これは、基準樹脂Capto SP ImpResを使用することで成功裡に達成された(図2)。
高濃度のエタノールの存在下で精製を行うが、凝集/繊維化の問題が起こり得るためにロードは比較的低い(約18g/L)。エタノールの存在は、望ましくない比較的高い背圧を与える。したがって、圧流制限を回避するためにより大きいビーズ上でのシェルビーズ構築物(より低い背圧)を使用することの可能性を検討した。Capto SP ImpRes及びより大きいシェルビーズに関する背圧の比較を図3に示す。
基準樹脂Capto SP ImpRes上においては、120及び240cm/時の流量のそれぞれで分離は良好であった。しかし、シェルビーズに関しては、最大480cm/時までの流量で分離が良好であった(図5)。シェルビーズ上においては、最大480cm/時までの流量で純度は>90%であった。
シェルビーズの概念を使用すれば、大きいビーズ(77μm)上において良好な精製を達成し得ることが上記の実験で示された。
HFA SPシェルビーズプロトタイプ及びCapto SP ImpRes上において得られた推定生産性の比較を、インスリンプロセスからの現実データを用いて実施した。
●平衡化:Capto SP ImpResに関しては4CV、HFA SPシェルビーズに関しては2CV。
●ロード:50gインスリン/L樹脂。
●洗浄:3CV。
●溶出:15CV勾配0〜70%、25CV及び3CV 100%。
●CIP:15分。
●再平衡化:Capto SP ImpResに関しては4CV、HFA SPシェルビーズに関しては2CV。
Claims (8)
- プロインスリンからインスリンを精製する方法であって、
開裂プロインスリンの試料を、官能化されていない内側コアとイオン交換リガンドで官能化された外側官能化層とを有する多孔質シェルビーズを含むクロマトグラフィー媒体上にロードする段階と、
インスリンをリガンド上に吸着させる段階と、
100〜1000cm/時の流量でクロマトグラフィー媒体からインスリンを溶出する段階と
を含んでなり、溶出されたインスリンが85%を超える純度を有する方法。 - シェルビーズが20〜100μmの直径を有する、請求項1記載の方法。
- シェルビーズが20〜80μmの直径を有する、請求項1又は請求項2記載の方法。
- シェルビーズの官能化層が厚さ3〜9μmの層を含む、請求項1乃至請求項3のいずれか1項記載の方法。
- シェルビーズの官能化層が厚さ5〜7μmの層を含む、請求項1乃至請求項4のいずれか1項記載の方法。
- リガンドが、スルホネート(SO3 -)、スルフェート(−OSO3 -)、ホスフェート(−OPO3 2-)及びホスホネート(PO3 2-)からなる群から選択される強陽イオン交換基である、請求項1乃至請求項5のいずれか1項記載の方法。
- コアが、アガロース、デキストラン、セルロース、デンプン、プルラン、ポリアクリル酸アミド、ポリメタクリル酸アミド及びポリ(ヒドロキシアルキルアクリレート)からなる群から選択される極性ポリマーで満たされている、請求項1乃至請求項6のいずれか1項記載の方法。
- インスリンが細菌内で産生される、請求項1乃至請求項7のいずれか1項記載の方法。
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