JP4424669B2 - クロマトグラフィー用二層粒子 - Google Patents

Description

本発明は、相異なる性質を有する二つの層からなる、クロマトグラフィー用マトリックスとして使用するための多孔質ポリマー粒子の製造方法に関する。本発明は、かかる粒子自体及びかかる粒子を使用するクロマトグラフィー方法にも関する。

クロマトグラフィーという用語は、一群の密接に関連した分離技術を包含する。かかる方法はすべて、二つの互いに混和しない相を接触させるという特徴に基づいていて、その場合に一方の相は固定相であり、他方は移動相である。クロマトグラフィーは、汚染化合物から液体を浄化するため、又は１種以上の生成化合物を液体から回収するために使用できる。

最近になってクロマトグラフィーが大きな関心を集めている一分野は、新しい薬物や診断薬の大規模で経済的な製造を目的とするようなバイオテクノロジー分野である。また、ヒトゲノムで発現されるタンパク質の機能を研究するプロテオミクス（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）分野の開拓により、タンパク質の精製は最近ではさらに一段と重要性を増してきた。一般に、タンパク質は細胞培養によって細胞内で生産されるか、又は周囲の培地中に分泌される。使用する細胞株は生物であるので、糖、アミノ酸、増殖因子などを含む複合増殖培地を供給しなければならない。細胞に供給した化合物の混合物及び細胞自体の副生物から所望のタンパク質を（例えば、ヒトの治療薬として使用するのに）十分な純度にまで分離することは、手に負えないほど困難な課題である。

従来、細胞及び／又は細胞残骸は濾過によって除去されてきた。目的のタンパク質を含む清澄な溶液が得られた後、溶液の他の成分からのタンパク質の分離は、様々なクロマトグラフィー技術の組合せを用いて行うのが通常である。これらの技術は、電荷、疎水性の程度、親和特性、サイズなどに基づいてタンパク質の混合物を分離する。これらの技術の各々に関し、数種のクロマトグラフィー用マトリックスが利用可能であり、関係する特定のタンパク質に合わせて精製方法を調整することができる。

細胞培養物又は溶解物から生産物を得るために必要な段階の数を減少させるため、改良されたクロマトグラフィー技術が提唱されてきた。例えば、流動床クロマトグラフィーとして知られる技術では、細胞及び／又は細胞残骸を除去する段階を回避する試みが行われている。流動床クロマトグラフィーは、上向きの流体の流れを作用させることで（好ましくは粒子の形態を有する）マトリックスを流動化状態又は膨張状態にする非充填層技術である。次いで、単離すべき化合物を含む溶液を流れの中に導入する。（流動床クロマトグラフィーの使用例については、例えば、国際公開第９８／３３５７２号（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）を参照されたい。）かかる流動床中では、細胞は原則として床を通過するのに対し、所望化合物は粒子上の適当なリガンドに吸着されることが証明されている。しかし、細胞表面及びマトリックスの結合基が反対の電荷を有する場合には、イオンクロマトグラフィーでは問題が起こることがある。その場合には凝集体が生じる結果、流動床のつぶれが起こり、そのためにタンパク質吸着容量の減少を引き起こすことがある。

タンパク質及び類似の化合物を分離するために利用できる方法を改良する別のやり方は、マトリックス材料の改良である。このような目的のため、２種以上の官能性を示し、したがって２種以上の化合物を選択的に吸着できるマトリックスが提唱された。

即ち、米国特許第５５２２９９４号には、２種以上の官能性を示す分離媒体を用いて２種のサイズの分子を試料から分離する方法が開示されている。かかる媒体は、その細孔中に反応基を有する多孔質材料を、多孔質材料の特定の細孔だけに浸透するサイズの修飾剤で処理することで製造できる。かくして、修飾剤はそれが浸透した細孔中の反応基だけを化学修飾する。

国際公開第９８／３９０９４号には、相異なる性質を有する分離媒体を得るため、立体効果を代わりに使用することが開示されている。この場合には、多孔質マトリックスの表面が、マトリックスのミクロ細孔系中に浸透できないような分子量を有するポリマーで被覆されている。マトリックス自体は、細孔中をデキストランで誘導体化すると共に任意に官能化したアガロースであることが好ましい。表面を被覆するポリマーは、例えば、やはりデキストラン（ただし、分子量がさらに大きいもの）、セルロースなどであり得る。場合によっては、表面を被覆するポリマーはマトリックスへの結合前に官能化されている。このように、ポリマー表面層の目的は、特定のサイズを超える化合物が内部のミクロ細孔に向かって通過するのを立体的に防止することにある。ミクロ細孔系中に存在する官能基と異なる官能基を有するポリマーを設けることで、ミクロ細孔中に吸着する小さい化合物が表面上のポリマーに吸着することが防止される系を生み出すことができる。開示されたマトリックスは、核酸、タンパク質並びにその他の有機及び無機化合物の単離のために有用である。

国際公開第９８／３９３６４号には、多孔質マトリックス中に第二の官能基を層状に導入する方法が記載されている。これは、前記マトリックスを、マトリックス中への拡散より早い反応速度でマトリックス表面上のリガンドと反応する試薬に接触させることで達成される。通常、反応性は溶媒、ｐＨなどの影響を受け、マトリックス中での拡散はマトリックス及び試薬の化学的性質に依存する。したがってこの方法は、内部細孔系中には元のリガンドがそのまま存在する一方、外層中には添加した試薬が別の官能基を与えてなるマトリックスを生み出す。その場合、外層の厚さは添加した試薬の量に依存するであろう。好ましいマトリックスはアガロースであり、試薬は常法に従って臭素であり得る。
国際公開第９８／３３５７２号パンフレット 米国特許第５５２２９９４号明細書 国際公開第９８／３９０９４号パンフレット 国際公開第９８／３９３６４号パンフレット

本発明の一目的は、相異なる性質を有する二つの画成された層からなる、クロマトグラフィー用マトリックスとして使用するための粒子を製造するための別法を提供することである。これは、一方の相中だけで反応性を示す試薬を用いてクロマトグラフィー用マトリックスの外層を修飾する二相系の使用で達成できる。

本発明の別の目的は、二つの層からなるクロマトグラフィー用粒子の製造方法であって、粒子表面に被覆ポリマーを付加する必要性を回避する方法を提供することである。これは、両層を全く同一の材料から形成すると共に、内部細孔系の化学修飾時には外層を保護し、又は外層の化学修飾時には内部細孔系を保護する二相系を使用する方法で達成できる。

本発明のさらに別の目的は、相異なる性質を有する二つの層からなるクロマトグラフィー用粒子の製造方法であって、厳密な量の試薬を添加する必要並びに試薬の拡散速度及び反応速度を測定する必要なしにこれらの層を全く同一の材料から形成する方法を提供することである。これは、粒子の内部相中で化学反応性を示さない試薬との反応で粒子の外層を保護する方法で達成できる。かくして、外層の保護表面に影響を及ぼすことなく、内層への官能基のカップリングを行うことができる。

本発明の追加の目的は、製造が容易であると共に、吸着プロセス中に細胞や細胞残骸のような巨大分子との接触が立体的に妨げられる結合基に１種の所望化合物を選択的に吸着できる、クロマトグラフィー用マトリックスとして使用するのに適した粒子を提供することである。これは、粒子全体が１種の材料から作られていると共に、外層中に非官能性表面を有する、相異なる性質を有する二つの層からなる粒子を提供することで達成できる。本発明の特定の目的は、クロマトグラフィー吸着プロセス中に巨大分子をはね返すことのできる、上述のような粒子を提供することである。これは、外層が修飾されていると共に、巨大分子を化学的にはね返す基（例えば、負に帯電した基）を有している、二つの画成された層からなる粒子によって達成できる。

本発明のさらに別の目的は、細胞及び細胞残骸の凝集を低減させ、さらには排除する吸着流動床（ＥＢＡ）法を提供することである。これは、負に帯電した基を外層上に有し、したがって細胞、細胞残骸及び核酸をはね返す、本発明に係る粒子の使用で達成できる。

本発明の上記その他の目的は、さらに具体的には、特許請求の範囲に記載されたようにして達成される。本発明のその他の実施形態及び利点は、以下の詳しい説明から明らかとなろう。

図面の簡単な説明
図１は、粒子の表面にあるアリル基を酸化するために使用する、本発明に係る二相系の略図である。

図２は、本発明によって製造された、中性の外層（即ち、非官能性の外層）及びリガンドで官能化された内部又は内層を有する粒子の略図である。

本発明の第一の態様は、クロマトグラフィー分離用マトリックスの製造方法であって、
（ａ）その細孔表面上及びその外面上に反応基を有する１以上の多孔質ポリマー粒子を用意し、
（ｂ）前記粒子を第一の溶媒で洗い、粒子から液分を除去して第一の相を閉じ込め、
（ｃ）第一の溶媒に対して実質的に不溶である第二の溶媒を添加して粒子の周囲の外層を濡らすことで、外層中に第二の相を設け、
（ｄ）第一の溶媒中で実質的に反応性を示さない試薬を添加することで、外層中の反応基を反応させ、
（ｅ）クロマトグラフィー用結合基を内層中の反応基にカップリングする
ことにより、相異なる性質を有する二つの層からなる多孔質ポリマー粒子を二相系中で製造することを含んでなる方法である。

段階（ｂ）で閉じ込められる粒子部分は、本明細書中で粒子の「内層」と示される一方、「外層」は粒子の残りの部分をいう。本明細書中で外層の表面を論じる場合には、外面及びその細孔系の表面が包含されることは言うまでもない。

好ましい実施形態では、反応基はアリル基、ビニル基などの炭素−炭素二重結合であり、この場合には試薬は酸化剤であり得る。しかし、想定し得る他の反応基は、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシ基、メルカプト基などである。

段階（ｂ）での液分除去は、第二の溶媒が粒子を濡らすのに十分な量の第一の溶媒を除去するために行われる。段階（ｃ）での濡らしは、必要ならば繰り返すことができる。段階（ｄ）での反応は外層を生じるが、その表面はさらに詳しく後述されるように非帯電状態又は帯電状態であり得る。好ましい実施形態では、本方法は段階（ｄ）後に粒子を洗う段階を含むことで、常法による結合基のカップリングを実施できる相を生み出す。本発明に関しては、第一及び第二の溶媒は、段階（ｄ）で使用する試薬がそれを添加しない相中で反応するのを防止する程度に不溶でなければならないことを理解すべきである。

有利な実施形態では、粒子はアガロースのようなペンダントヒドロキシ（−ＯＨ）基を含むポリマーから作られる。当業者であれば、多孔質で化学的に架橋したアガロース粒子を公知方法に従って製造するのは容易である。しかし、シリカ、スチレン、ジビニルベンゼンなどの他の材料を代わりに使用することもできる。当業者には理解される通り、最後に述べた２種のような合成ポリマーを使用する場合には、常法によるＯＨ基の添加のような、粒子表面を親水性にする段階が必要となろう。

別法として、（共にＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、スウェーデン国ウプサラから販売されている）Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ（商標）Ａ３００又はＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦのような市販製品が出発原料として使用される。アガロースのような天然ポリマーのアリル化は当技術分野で公知であり、当業者ならば実施するのは容易である。本方法の有利な実施形態では、アリル化はヒドロキシ基をアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）と反応させることで達成される。この実施形態は、後述の実験の部に記載される。

一実施形態では、試薬は水性相中で反応性を示す。この実施形態で有利な試薬は、酸化剤の過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ_４）であるが、水素化ホウ素、酸化クロム、四酸化オスミウム、酸化セレンのような他の酸化剤も代わりに使用できる。

別の実施形態では、試薬は有機相中で反応性を示す。当業者ならば、上述したもののような好適な試薬を選択できるが、溶液の修正が必要となろう。例えば、ＫＭｎＯ_４によるアリル基の相間移動促進酸化は、カリウムイオンをクラウンエーテルで錯化するか、又はそれを第四級アンモニウム又はホスホニウムイオンで置換することにより、ベンゼン及びジクロロメタンのような無極性溶媒中で実施できる。

一実施形態では、段階（ｂ）で閉じ込められる第一の溶媒は有機溶媒である。有機溶媒は、トルエン、ヘキサン、ジクロロメタン、又は水性相に対して不溶又は実質的に不溶であるその他任意の公知有機溶媒であり得る。この実施形態では、例えばガラスフィルター上での液分除去に先立ち、アリル化粒子をエタノールのようなアルコールで洗うのが好ましい。したがって、この実施形態では、段階（ｃ）に係る濡らしは、粒子を水溶液に添加することで実施される。

別の実施形態では、段階（ｂ）で閉じ込められる第一の溶媒は水溶液のような水性溶媒である。したがって、この実施形態では、段階（ｃ）に従った濡らしは、上記に例示したような有機溶媒に粒子を添加することで実施される。

好ましい実施形態では、水性相はＤｅｘｔｒａｎ（商標）Ｔ５００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、スウェーデン国ウプサラ）のようなエマルゲーターを含む。当業者には理解される通り、エマルゲーターの機能は外層からトルエンを除去することである。したがって、除去されるトルエン、ひいてはエマルゲーターの量が外層の厚さを間接的に決定するので、当業者であれば、エマルゲーターの量を各々の場合について注意深く決定すべきであることが理解されよう。最も好ましい実施形態では、エマルゲーターの濃度は水中で約１０％である。

特定の実施形態では、粒子中に元来存在する反応基の総数の約３０％以下が段階（ｄ）で反応する。好ましい実施形態では、３〜２０％（例えば、４〜１０％）の反応基が反応する。外層は、通常の組成のクロマトグラフィー用粒子を包囲する蓋と見なすことができる。そのため、この種の粒子に対しては、時には「リッドビーズ」という名称が使用されることがある。通常、本発明に係る方法で形成される第二の層（即ち、蓋）は、約１６０μｍのサイズの粒子に関して約３μｍである。

段階（ｅ）、即ち粒子の内層中に存在する反応基へのクロマトグラフィー用結合基のカップリングは、任意適宜の公知技術に従って容易に達成される。上述の通り、第一の溶媒が有機溶媒であれば、段階（ｅ）に先立って粒子を例えばエタノール水溶液及び水で洗うことで、カップリングのための水性環境が設けられる。

通常、活性化（即ち、官能化のために必要な追加の反応基を導入する段階）が行われる。有用な活性化剤は、求電子性薬剤、求核性薬剤、及び遊離基化学で作用する薬剤からなる群から選択できる。（各種の利用可能な活性化系のさらに詳しい説明については、例えば国際公開第９８／３９３６４号を参照されたい。）反応基がアリル基である実施形態では、段階（ｅ）に係るカップリングはラジカル活性化で行うことができる。有利な実施形態では、後記の実験の部に例示されるように、前記活性化は臭素を用いて行われる。

活性化した内部細孔系の表面にカップリングされる結合基は、アフィニティー基、疎水性相互作用基、イオン交換基（例えば、負に帯電した陽イオン交換基又は正に帯電した陰イオン交換基）などのような、クロマトグラフィーでリガンドとして通常使用される任意の公知基であり得る。このように、本発明に関しては、「結合」という用語は任意の種類の吸着又はカップリングをいう。したがって、本方法の一実施形態では、結合基はイオン交換基である。特定の実施形態では、後記の実験の部に例示されるように、陰イオン交換体はジエチルアミン（ＡＮＸ）又はエチレンジアミン（ＥＤＡ）である。

上述の通り、段階（ｄ）での反応は表面を有する外層を生じるが、この表面は非帯電状態又は帯電状態であり得る。当業者であれば、表面上に所望の性質を得るための適当な出発原料及び試薬を容易に選択するであろう。例えば、反応基がアリル基であれば、外層の表面上にカルボキシ（−ＣＯＯＨ）基及び／又はヒドロキシ（−ＯＨ）基を設けることができる。公知の通り、ＯＨ基に結合基をカップリングするためには多くの常法が存在している。ＣＯＯＨ基からなる表面は、弱い負電荷を有している。別法として、表面をさらに修飾することが所望されるならば、ＣＯＯＨ基に結合基をカップリングすることもできる。

かくして、本発明のさらに別の態様は、二官能性のクロマトグラフィー分離用マトリックスの製造方法である。この方法は、上述した方法に加え、外層中の基を修飾する追加段階及び／又は外層へのクロマトグラフィー用結合基のカップリングを含むものである。最も有利な実施形態では、外層中の基はクロマトグラフィープロセスで所望されない化合物と同じ電荷を有するものであって、例えば、細胞溶解物からタンパク質を分離する方法で細胞及び細胞残骸をはね返すための負に帯電した基である。

本発明の第二の態様は、相異なる性質を有する二つの層からなる、クロマトグラフィー分離用マトリックスとして使用するのに適した多孔質ポリマー粒子であり、ここで粒子全体は１種の材料で作られている。特定の実施形態では、粒子は中性の外層（即ち、帯電していないか、又は官能性をもたない外層）を有している。したがって、本粒子は粒子の材料と異なる材料からなるポリマー被膜を有していない点で、この実施形態は上述の国際公開第９８／３９０９４号に記載された粒子とは異なっている。また、上述の国際公開第９８／３９３６４号に記載された方法で得られる粒子の表面は中性でないので、本粒子はかかる粒子とも異なっている。

好ましい実施形態では、本発明に係る粒子は上述の方法に従って製造される。

本発明の第三の態様は、溶液中の所望化合物を他の成分から分離するための方法であって、これは本発明に従って製造したマトリックス又は本発明に係る粒子からなるマトリックスを用いるクロマトグラフィー分離方法である。

有利な実施形態では、本方法は吸着流動床（ＥＢＡ）法である。これに関連して述べれば、別法として、本方法は吸着流動床法と類似の原理に基づく別の種類の非充填層法（例えば、撹拌懸濁法）であってもよいことを理解すべきである。

最も有利な実施形態では、所望化合物はタンパク質であり、溶液は細胞溶解物である。この実施形態では、外層又は蓋は粒子への細胞吸着を防止する。

本方法の特定の実施形態では、マトリックスは陰イオン交換体である。陽イオン交換体の負に帯電した結合基から負に帯電した細胞及び細胞残骸を遮蔽する必要があることを考えれば、この実施形態は特に有利となる。

本発明の最後の態様は、本発明に係る方法で製造されるマトリックス又は上述のような粒子からなるマトリックスの、吸着流動床法での使用である。

図面の詳しい説明
図１は、粒子の表面にあるアリル基の酸化のために使用される、本発明に係る二相系の略図である。さらに具体的には、トルエンからなる第一の内部相及び酸化された表面を有するアリル化粒子が、Ｄｅｘｔｒａｎ（商標）Ｔ５００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、スウェーデン国ウプサラ）、ＫＭｎＯ_４、ＮａＯＨ及びＨ_２Ｏ_２からなる水性相中に示されている。

図２は、中性の外面（即ち、非官能性の外面）及び本発明に係る方法によりリガンドで官能化された内部又は内層を有する粒子の略図である。外層は−ＣＯＯＨ基及び／又は−ＯＨ基を含むのに対し、内層はエチレンジアミン（ＥＤＡ）、ジエチルアミン（ＡＮＸ）などのような任意のリガンドを含み得る。

実験の部
以下、実施例によって本発明を説明しよう。しかし、これらの実施例はもっぱら例示目的のために示すものであり、特許請求の範囲で定義される本発明を限定するものと解すべきでない。本明細書中の下記及びその他の箇所に示すすべての参考文献の開示内容は、援用によって本明細書の内容の一部をなす。

実施例１：アリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）によるＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ（商標）Ａ３００のアリル化のための一般手順
典型的な合成法では、機械攪拌機を備えた１Ｌ三つ口丸底フラスコに、ＮａＯＨ水溶液（５０％）（２００ｇ）、ＮａＢＨ_４（０．２ｇ）及びＮａ_２ＳＯ_４（８ｇ）を添加した。Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ（商標）Ａ３００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、スウェーデン国ウプサラ）ゲル（２００ｇ）を蒸留水で洗い、ガラスフィルター上で水切りした。続いて、撹拌下でビーズを三つ口丸底フラスコに添加し、反応混合物を５０℃まで加熱し、この温度で撹拌を１時間続けた。次いで、アリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）（３００ｍＬ）を反応混合物に添加し、撹拌を５０℃で１８時間続けた。次いで、反応混合物を室温に冷却し、濃酢酸の添加でｐＨ６〜７にした。次いで、ゲルをガラスフィルター上で濾過し、順次に蒸留水（５*２００ｍＬ）、ＥｔＯＨ（９９．５％）（５*２００ｍＬ）、最後に蒸留水（５*２００ｍＬ）で洗った。まず１ｍＬのアリル化ビーズを臭素と反応させ、次いで得られたビーズを硝酸銀で滴定することにより、アリル含有量を測定した。一般に、アリル含有量は２００〜２５０μｍｏｌ／ｍＬゲルの範囲内にあった。

実施例２：実施例１で製造したビーズの部分酸化のための一般手順
アリル化したＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ（商標）Ａ３００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、スウェーデン国ウプサラ）（５０ｍＬ）を、ガラスフィルター上でまずＥｔＯＨ（９９．５％）（４*５０ｍＬ）で洗い、次いでトルエン（９９％）（４*５０ｍＬ）で洗った。最後のトルエン洗いでは、ビーズから部分的に液分を除去した。蒸留水（１００ｍＬ）及びＤｅｘｔｒａｎ Ｔ５００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、スウェーデン国ウプサラ）溶液（水中１０％、１００ｍＬ）を１Ｌ三つ口丸底フラスコに添加した。溶液に機械撹拌を施した。部分的に液分を除去したゲルをフラスコに添加し、蒸留水（５０ｍＬ）及びＤｅｘｔｒａｎ Ｔ５００溶液（水中１０％、５０ｍＬ）をフラスコに添加した。溶液中における粒子の均質懸濁液を得、撹拌を１５分間続けた。連続撹拌下で、過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ_４）（０．８１ｇ、５．１２ｍｍｏｌ、初期アリル基に対して０．５ｅｑ）をフラスコに添加した。反応混合物は紫色になり、反応を１５分間進行させた。次いで、ＮａＯＨ（水中５０％、２０ｍＬ）をフラスコに添加すると同時に、反応混合物は褐色になり、二酸化マンガン凝集体の生成を表した。反応を室温で１時間進行させた。次いで、ｐＨが５に等しくなるまで、濃酢酸（約１０ｍＬ）を混合物に添加した。Ｈ_２Ｏ_２水溶液（水中３０％）（２ｍＬ）を混合物に注意深く添加したところ、混合物は灰色になった。次いで、ゲルをガラスフィルター上で濾過し、蒸留水（５*５０ｍＬ）、ＥｔＯＨ（９９．５％）（５*５０ｍＬ）、最後に蒸留水（５*５０ｍＬ）で洗った。実施例１に記載した手順に従ってアリル含有量を測定した。一般に、アリル含有量は初期アリル含有量に比べて５〜２０％減少した。

実施例３：実施例２で製造したビーズの臭素化のための一般手順
部分酸化したＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ（商標）Ａ３００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、スウェーデン国ウプサラ）の残留アリル基の臭素化を以下のようにして行った。機械攪拌機を備えた２５０ｍＬ三つ口丸底フラスコ内で、酢酸ナトリウム（０．１ｇ）を蒸留水（１０ｍＬ）に溶解した。次いで、部分酸化ゲル（４０ｍＬ、水切り済み）及び蒸留水（４０ｍＬ）をフラスコに添加し、混合物を室温で１５分間急速撹拌した。次いで、黄色が持続するようになるまで反応器に臭素を滴下した（約２ｍＬのＢｒ_２）。撹拌を１５分間続けた。次いで、黄色が消失するまでギ酸ナトリウムを添加した。続いて、ガラスフィルター上でゲルを蒸留水（５*５０ｍＬ）で洗った。この臭素化ゲルを陰イオン交換体への誘導体化のために直接使用した（表１）。

実施例４：陰イオン交換体への誘導体化のための一般手順
実施例４−１：ジエチルアミン（ＡＮＸ）のカップリング

通例、実施例３で製造した臭素化ゲル（５０ｍＬ、水切り済み）、ジエチルアミン（２０ｍＬ）及び蒸留水（２０ｍＬ）を５００ｍＬ三つ口丸底フラスコに添加し、混合物を室温で約１５分間機械撹拌した。ｐＨを濃ＨＣｌで１１．５に調整した。次いで、ＮａＢＨ_４（０．１３ｇ）をフラスコに添加し、反応を室温で１８時間進行させた。次いで、濃酢酸の添加で反応を停止させた。最後に、ガラスフィルター上でゲルを蒸留水（１０*５０ｍＬ）で洗った。一般に、ＡＮＸゲルに関するイオン交換容量は７８〜１４１μｍｏｌ／ｍＬゲルの範囲内にあった。

実施例４−２：エチレンジアミン（ＥＤＡ）のカップリング

通例、実施例３で製造した臭素化ゲル（５０ｍＬ、水切り済み）、エチレンジアミン（７５ｍＬ）及び蒸留水（３０ｍＬ）を５００ｍＬ三つ口丸底フラスコに添加し、混合物を室温で約１５分間機械撹拌した。次いで、反応混合物を６０℃で１８時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、フラスコを氷浴中に保ちながら濃酢酸で中和した。最後に、ガラスフィルター上でゲルを蒸留水（１０*５０ｍＬ）で洗った。一般に、ＥＤＡゲルに関するイオン交換容量は１６６〜２２４μｍｏｌ／ｍＬゲルの範囲内にあった。

実施例５：細胞吸着測定
様々なプロトタイプに関して細胞吸着測定を行った。結果を表２に報告する。結果は、様々なＮａＣｌ濃度における通過画分（ＦＴ）中及び溶離画分（Ｅ）中の細胞の百分率として示されている。ＲＥＦ．ＡＮＸ及びＲＥＦ．ＥＤＡとして示したゲルは、Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ（商標）Ａ３００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、スウェーデン国ウプサラ）のアリル化、臭素化、及び対応する陰イオン交換体のカップリングによる標準的な方法（即ち、原則として上述の通りであるが、外層の部分酸化を含まない方法）に従って製造したゲルに対応している。

粒子の表面にあるアリル基を酸化するために使用する、本発明に係る二相系の略図である。 本発明によって製造された、中性の外層（即ち、非官能性の外層）及びリガンドで官能化された内部又は内層を有する粒子の略図である。

Claims (13)

1. クロマトグラフィー分離用マトリックスの製造方法であって、
   （ａ）その細孔表面上及びその外面上に反応基を有する１以上の多孔質ポリマー粒子を用意し、
   （ｂ）前記粒子を第一の溶媒で洗い、粒子から液分を除去して、第一の溶媒からなる第一の相を該粒子中に閉じ込め、
   （ｃ）第一の溶媒に対して実質的に不溶である第二の溶媒を添加して粒子の周囲の外層を濡らすことで、外層中に第二の相を設け、
   （ｄ）第一の溶媒中で実質的に反応性を示さない試薬を添加することで、外層中の反応基を反応させ、
   （ｅ）クロマトグラフィー用結合基を内層中の反応基にカップリングする
   ことにより、相異なる性質を有する二つの層からなる多孔質ポリマー粒子を二相系中で製造することを含んでなる方法。
2. 反応基が炭素−炭素二重結合である、請求項１記載の方法。
3. 粒子が、ペンダントヒドロキシ基を含むポリマーから作られている、請求項１又は請求項２記載の方法。
4. 段階（ａ）の粒子が、上記ヒドロキシ基をアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）でアリル化して反応性アリル基を設けることで用意される、請求項３記載の方法。
5. 段階（ｄ）で添加する試薬が、水性相中で反応性を示す酸化剤である、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
6. 段階（ｄ）で添加する試薬が、有機相中で反応性を示す酸化剤である、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
7. 粒子中に閉じ込められる第一の溶媒が有機溶媒である、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
8. 粒子中に閉じ込められる第一の溶媒が水溶液である、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
9. 水溶液がエマルゲーターを含む、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
10. 粒子中に元来存在する反応基の総数の約３０％以下が段階（ｄ）で反応する、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
11. 段階（ｅ）に係るカップリングが、アリル基のラジカル活性化で結合基のカップリングを可能にすることで実施される、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法。
12. 段階（ｅ）の結合基がイオン交換基である、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法。
13. 二官能性のクロマトグラフィー分離用マトリックスの製造方法であって、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の方法、並びに外層中の基を修飾する追加段階及びクロマトグラフィー用結合基を表面にカップリングすることを含んでなる方法。

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