CN105431446A - 多糖蛋白质结合物的纯化 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种使用混合模式色谱法纯化多糖蛋白质结合物的方法。所述方法包括在低电导率的条件下使粗的多糖蛋白质结合物与包含惰性多孔壳和活性核的混合模式树脂接触，使污染物与混合模式树脂相结合，以及收集流经物中的未与混合模式树脂相结合的多糖蛋白质结合物。

Description

多糖蛋白质结合物的纯化
技术领域
本发明涉及用作疫苗的多糖蛋白质结合物的纯化领域。
背景技术
细菌感染仍然是折磨婴儿和儿童的疾病的主要原因之一，特别是在发展中国家(Osrin,David等.(2004)CurrentOpinioninInfectiousDiseases17(3):217-224；Thaver,Durrane,andZaidi,AnitaK.M.(2009)PediatricInfectiousDiseaseJournal28(1):S3-S9；Saez-Llorens,Xavier等.2003Lancet361(9375):2139-2148；Thapar,Nikhil等.2004Lancet363(9409):641-653)。最常见的病原体是b型流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)(Pollard,AndrewJ.等.(2009)NatureReviewsImmunology9(3):213-220)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaurous)、志贺菌(Shigella)、沙门菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)等。作为这些感染的结果，每年有大量的儿童死亡。
多糖抗原是用于预防与流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟球菌、肺炎链球菌(LarryK.Pickering等.(1985)InfectiousDiseasesNewsletter4(11):84-87)以及伤寒沙门菌(SalmonellaentericaserovarTyphi)(HesselL等.(1999)EurJClinMicrobiol&InfectDis.,18(9):609-620)相关的疾病的细菌疫苗的主要组分。然而，大多数细菌多糖是非T细胞依赖性抗原，通过阻止记忆B细胞的发育来避免小于两岁的儿童和大龄人中的上述抗原的免疫应答较差的情况。多糖抗原与蛋白质载体的共价缀合赋予其产生体液应答的能力，并且给予其T细胞依赖性抗原的能力。已经证明，这样的结合物可有效预防由细菌性病原体引起的疾病。多糖结合物疫苗已经获准在世界上许多地方使用20余年(Adams,WilliamG.等.(1993)JAMA269(2):221-226)。
多糖蛋白质结合物的纯化一直是个挑战。已知这样的结合物与例如未反应的多糖(游离多糖)、未反应的载体蛋白质(游离蛋白质)、低分子量结合物以及用于影响缀合的其他化学物质例如交联剂、偶联剂等污染物混杂在一起。在旨在用作疫苗的产品中，这样的污染物是非常不期望存在的。例如，在疫苗组合物中，大量的游离多糖是不期望存在的，因为其可干扰结合物的免疫功能(Peeters,C.A.M.等.(1992)Vaccine10(12):833-840)。污染物通常在分子大小、离子电荷和疏水性上不同，使得其难以利用单一色谱步骤来达到期望多糖蛋白质结合物用作疫苗的纯度。
已经通过多种标准技术从杂质或污染物中纯化了多糖蛋白质结合物，所述标准技术例如密度梯度离心、使用硫酸铵分级分离的超滤(US6,146,902)、乙醇沉淀、凝胶过滤或尺寸排阻色谱法、疏水性相互作用色谱法或离子交换色谱法。
已经发现，离子交换色谱法特别适用于纯化多糖，但是未发现离子交换色谱法适于纯化结合物，也没有发现离子交换色谱法适于大规模纯化结合物。Simon,Raphael(WO2012061400)描述了一种纯化多糖蛋白质结合物的方法：先让多糖蛋白质结合物与离子交换树脂结合，再将结合的多糖蛋白质结合物洗脱下来得到纯品。这样的方法还导致游离多糖的与离子交换树脂结合，因为结合物通常表现出与游离多糖类似的电荷使得结合物难以纯化。
还通过使用高浓度的盐用基于疏水性的吸附方法来纯化多糖蛋白质结合物，其吸附结合物而不是游离多糖，因为后者倾向于具有较低的疏水性(Lees,Andrew等.WO2011017101；Pawlowski,Andrzeg(2000)Vaccine18:1873-1885)。这样的纯化通过利用蛋白质的疏水性来完成，所述疏水性主要受蛋白质的非极性表面积的比例及其空间分布影响。如果经结合的蛋白质的疏水性较低，则疏水性相互作用色谱可能并不是纯化这样的结合物的优先选择。
凝胶过滤色谱法最常用于纯化多糖蛋白质结合物(Lees,Andrew等.(1996)Vaccine14(3):190-198；Libon,Christine(2002)Vaccine20:2174-2180；Jennings,H.J.andLugowski,C.(1981)J.Immunology127:1011-1018)。然而，这样的技术受到若干限制。例如，通过凝胶过滤色谱法使用分子筛的纯化只能通过牺牲产率来完成，因为粗的结合物的色谱分辨率不够。由于分级范围窄，所以含有期望结合物的适当级分的合并需要相当的技巧。在收集级分中的任何错误均可导致结合物的显著损失或增加污染物与结合物混杂的风险，因为结合物与污染物在非常窄的范围下分离(参见图1a)。此外，除了与柱填充相关的困难外，其需要大量的凝胶过滤基质，以及显著增加的处理时间。所有这些因素导致生产成本较高，这使得提供不起疫苗，限制了其在疫苗接种计划中的更广泛使用。
与缀合过程相关的复杂性通常导致污染物的高度异质排列，其通常在物理和化学性质例如分子大小、离子电荷、疏水性等上不同。这些因素使得基于单一色谱原理的分离不足以达到用作疫苗的结合物的期望纯化程度。因此，有时将大于一种的色谱步骤用于纯化多糖蛋白质结合物。Fattom,Ali等(InfectionandImmunity(1988)56(9):2292-2298)描述了纯化多糖蛋白质结合物的两步法，其中将结合物经过凝胶过滤基质部分纯化，然后捕获到疏水性介质上以获得经纯化的结合物。由于多个色谱步骤，这样的方法降低了结合物的总产率并且还导致处理时间增加。
由于现有技术方法中的复杂性导致生产的低产率和高成本，所以用于疫苗的多糖蛋白质结合物的大量生产受到阻碍。因此，需要开发提供易于制造的多糖蛋白质结合物的纯化的替选方法，其耗时少，同时提供良好的产率。本发明提供了使用混合模式色谱法从多糖蛋白质结合物中移除杂质或污染物的意外地有效的方法(Orlovsky,Vlad等(2011)ChromatographyToday,4(3)24-28；WO200508248；WO2009131526,WO2010005364)。该出乎意料地有效的方法解决了与用于纯化多糖蛋白质结合物的现有技术方法相关的长期存在的问题。本发明的方法操作上简单、易于放大、需要较少的资源并提供了较高的产率和质量一致的产品。
发明内容
因此，本发明涉及使用混合模式色谱法纯化多糖蛋白质结合物的方法，所述混合模式色谱法在移除杂质或污染物方面出乎意料地快速且高效。本发明人已经发现，通过混合模式色谱法纯化多糖蛋白质结合物简化并缩短了处理时间，有效地移除了污染物且易于放大。
在一个实施方案中，通过使多糖蛋白质结合物与混合模式树脂接触并收集流经物中的未与混合模式树脂结合的多糖蛋白质结合物，将一种或更多种污染物与多糖蛋白质结合物分离，使粗的多糖蛋白质结合物得到纯化。
在一个实施方案中，所述混合模式树脂包含惰性壳和活性核，优选为惰性多孔壳和具有携带不同官能团的固定化配体的活性核。
在一个实施方案中，通过影响基于尺寸的结合物的纯化，并通过带电荷相互作用和/或疏水性相互作用捕获一种或更多种污染物，使得所述结合物在单一色谱步骤中被纯化出来。
在单一色谱步骤的一个实施方案中，一些杂质与离子交换剂结合，更优选与正电荷离子交换剂(阴离子交换剂)结合，而一些杂质通过疏水性相互作用来结合。
在一个实施方案中，游离多糖通过离子相互作用来捕获，游离蛋白质通过离子相互作用或疏水性相互作用来捕获，而结合物以未结合方式进行收集。
在一个实施方案中，一种或更多种污染物在有利于所述污染物结合的条件下被捕获，所述污染物结合的条件优选为低电导率条件。
在一个实施方案中，所述方法包括在低电导率的条件下使粗的多糖蛋白质结合物与包含惰性多孔壳和活性核的混合模式树脂接触，使污染物与混合模式树脂相结合，收集流经物中的未与混合模式树脂相结合的多糖蛋白质结合物。
在一个实施方案中，通过本发明的方法纯化的多糖蛋白质结合物是b型流感嗜血杆菌(Hib)结合物、脑膜炎球菌结合物、肺炎球菌结合物或伤寒结合物。
附图说明
图1a表示通过实施例1的方法纯化的期望结合物(F-2)和污染物(F-l、F3和F4)的Hib结合物的凝胶过滤色谱图。
图1b表示通过实施例2a和实施例2b的方法纯化的期望结合物(I)和污染物(II)的Hib结合物的混合模式色谱图。
图2表示通过混合模式色谱法纯化的Hib结合物的分子大小分布。
发明详述
除非上下文另外指出，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”也包括复数方面。类似地，除非上下文另外指出，否则用于本说明书中的任何单数术语也意指复数或者反之亦然。
必须指出，词语“包含(comprising)”或其任意形式例如“包含(comprise)”或“包含(comprises)”，“具有(having)”或其任意形式例如“具有(have)”或“具有(has)”，“包括(including)”或其任意形式“包括(include)”或“包括(includes)”，或者“含有(containing)”或其任意形式例如“含有(contain)”或“含有(contains)”是开放式的并且并不排除其他未述及的要素或方法步骤。
无论表示任何数量或范围，本领域技术人员应承认，在所示值的10％或20％内的数量或范围也可预期为适当的，即，当表示20％时，从16％至18％到22％至24％的范围是隐含的并且可以是适当的。
本文所使用术语“缓冲液”包括将溶液的pH值保持在期望范围内的那些试剂。在一个实施方案中，缓冲液的pH值为约5.0至7.5。在另一个实施方案中，所使用的缓冲液选自磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液、柠檬酸缓冲液中的一种或几种的组合，或者更优选为磷酸盐缓冲液。
多糖意指由以直链或支链方式结合的许多重复单元形成的聚合物。如本说明书中所使用的，术语多糖可互换地用于表示糖或寡糖。在一些实施方案中，术语多糖意指包含至少约10个重复单元的聚合物。可通过本领域技术人员已知的任何方法例如酸或碱水解、臭氧分解、高碘酸盐氧化、β-消除以及酶法水解将多糖解聚或定尺寸以包含指定数量的重复单元。
对于带电荷相互作用或离子相互作用，意味着分离是受离子交换剂，即，阳离子交换剂或阴离子交换剂影响。阴离子交换剂将结合具有负电荷的化合物而留下具有正电荷的化合物，而阳离子交换剂将结合具有正电荷的化合物而留下具有负电荷的化合物。
对于疏水性相互作用，意味着分离是受生物分子的表面疏水性的不同影响。疏水性相互作用色谱法(HIC)通过利用生物分子与HIC介质的疏水性表面之间的可逆相互作用根据其表面疏水性的不同来分离生物分子。非极性表面积以及其空间排列是生物分子疏水性不同的原因。
术语树脂或基质或介质可互换地用于表示色谱固定相。术语“混合模式树脂”或“混合模式基质”或“混合模式介质”表示将官能团(称为配体)固定于其上从而给予混合模式树脂以若干不同方式与靶分子相互作用的能力的色谱树脂或基质或介质。混合模式树脂可具有在内部具有固定化配体的多孔壳。在一个实施方案中，混合模式树脂包含惰性多孔壳和配体活性核。还可将混合模式树脂称为多模式(multimodal)树脂或多模式基质或多模式介质。
在一个实施方案中，一些杂质或污染物将与配体的疏水性官能团相互作用，而另一些杂质或污染物将与配体的离子官能团相互作用，从而影响污染物从多糖蛋白质结合物中的分离。
“非结合方式”、“未结合方式”或“负色谱法”意指其中以不与色谱基质结合的方式来纯化期望的产品的色谱技术，即，期望的产品通过色谱基质的空隙空间并在流经物或捕获池中收集。
在多糖与载体蛋白质的缀合过程中，在缀合混合物中并非所有的多糖和蛋白质分子均被偶联以形成多糖蛋白质结合物。因此，结合物与例如游离多糖、游离蛋白质、用交联剂衍生的多糖、用交联剂衍生的载体蛋白质、偶联剂等污染物混杂在一起，取决于用于制备这样的结合物的缀合化学作用的类型。例如，如果通过多糖与载体蛋白质的直接连接来制备结合物，则预计结合物与游离多糖、游离载体蛋白质、残留偶联剂或其混合物混杂在一起。如果通过用交联剂衍生多糖或蛋白质来制备结合物，则预计除了未经衍生的多糖或未经衍生的载体蛋白质或其混合物之外，结合物还与经衍生的多糖或经衍生的载体蛋白质混杂在一起。
术语杂质或污染物互换地用于指除了旨在用作疫苗的多糖蛋白质结合物之外的任何化学分子或生物分子。多糖蛋白质结合物通常与污染物混杂在一起，所述污染物例如，但不限于，游离多糖、游离蛋白质、低分子量结合物、交联剂、偶联剂或其混合物。
粗的结合物或粗的多糖蛋白质结合物意指未经纯化的多糖蛋白质结合物，或经部分纯化已经去除与其共存的一种或更多种污染物的多糖蛋白质结合物。这样的粗结合物通常还混杂有杂质例如，但不限于，游离多糖、游离载体蛋白质、低分子量结合物、较高级的聚集体、残留量的交联剂、偶联剂或其混合物。本发明的方法适于将任意一种多糖蛋白质结合物和与其共存的一种或更多种污染物分离来纯化多糖蛋白质结合物。
术语游离多糖或经衍生的多糖互换地用于表示未与载体蛋白质缀合的多糖抗原。因此，术语游离多糖包含游离多糖、用交联剂衍生的多糖或其混合物。
术语游离蛋白质或经衍生的蛋白质互换地用于表示未与多糖抗原缀合的载体蛋白质。因此，术语游离载体蛋白质包含游离载体蛋白质、用交联剂衍生的载体蛋白质或其混合物。
低分子量结合物意指由于其大小而具有经过惰性壳的孔进入混合模式基质的活性核的能力之结合物。在一个实施方案中，这样的低分子量结合物的分子大小小于2000kDa、小于1800kDa、小于1600kDa、小于1400kDa、小于1200kDa、小于1000kDa、小于900kDa、小于800kDa、小于700kDa、小于600kDa、小于500kDa、小于400kDa、小于300kDa、小于200kDa、小于100kDa或上述几种的混合物。
“经纯化的多糖蛋白质结合物”或“经纯化的结合物”互换地用于表示这样的结合物，已经使所述结合物不含所结合的污染物以使得污染物的量降低了约50％或更多、约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多以及约90％或更多。在一个实施方案中，污染物的量降低了80％或更多、85％或更多、90％或更多、或者95％或更多。“经纯化的结合物”或“经纯化的多糖蛋白质结合物”还被理解为意指这样的结合物，已经使所述结合物不含所混杂的污染物，尤其是对于游离多糖和游离蛋白质含量，至药典规范、或监管部门所规定的或者由结合物的相关免疫学相关物所制定的程度。例如，在与破伤风类毒素缀合的Hib多糖的情况下，游离多糖含量应小于20％且游离破伤风类毒素应小于1％并且当通过在SepharoseCL-4B上的尺寸排阻色谱法评估时，至少60％的结合物的分子大小分布应在0.2KD内(分布系数)(HaemophilusTypebConjugateVaccine,IndianPharmacopoeia,2010第3卷第2395-2398页)。测量分子大小分布的技术是本领域技术人员公知的(WHOTechnicalReportSeries,No.897,2000第27-56页；WHOTechnicalReportSeriesNo.658,1981,Annex6；McCauley,J.A.等.JBiolStand(1981)9:461-468；Parisi,L等.(1999)JChromatogrA847:209-211)。类似地，游离多糖和游离蛋白质含量可通过本领域技术人员已知的任何定量技术来测量(Tsai,CM.等.(1994)Vaccine12(8):700-706；Ashwell,G.MethodsEnzymology,(1957)3:73-105；Guo,YY等.(1998)Biologicals26(1):33-38；Lei,QP等.(2000)DevBiol(Basel)103:259-264；Stoscheck,ChristaM.(1990)MethodsinEnzymology182:50-68)。在多糖蛋白质结合物疫苗中，最好是尽可能保持低的污染物的水平，尤其是对于游离多糖，因为结合物在储存期过程中可能经历降解从而导致疫苗中游离多糖含量的增加，其可对多糖蛋白质结合物的免疫原性具有不利影响。在一个实施方案中，游离多糖含量为15％或更低、14％或更低、13％或更低、12％或更低、11％或更低、10％或更低、8％或更低、7％或更低、6％或更低、5％或更低、4％或更低、3％或更低、或者2％或更低。在一个实施方案中，游离多糖含量为10％至15％、5％至10％或者0至5％。
可用于生产结合物的多糖抗原可从本领域技术人员已知的多种细菌中获得。示例性细菌包括—b型流感嗜血杆菌(例如，流感嗜血杆菌荚膜多糖—多聚核糖基核糖醇磷盐[PRP])、脑膜炎奈瑟球菌(例如，脑膜炎奈瑟球菌血清群A荚膜多糖(N.meningitidisserogroupAcapsularpolysaccharide(MenA))、脑膜炎奈瑟球菌血清群C荚膜多糖(N.meningitidisserogroupCcapsularpolysaccharide(MenC))、脑膜炎奈瑟球菌血清群Y荚膜多糖(N.meningitidisserogroupYcapsularpolysaccharide(MenY)、脑膜炎奈瑟球菌血清群W荚膜多糖(N.meningitidisserogroupWcapsularpolysaccharide(MenW))、肺炎链球菌(例如，血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F)、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌、霍乱弧菌、弗氏志贺菌(Shigellaflexneri)等。特别感兴趣的多糖抗原是从b型流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟球菌、肺炎链球菌、伤寒沙门菌的荚膜多糖中获得的那些。
可用于缀合多糖的载体蛋白质是本领域技术人员已知的。通常所使用的用于制造结合物的载体蛋白质是白喉类毒素或其无毒突变体例如CRM197、破伤风类毒素、百日咳类毒素、脑膜炎奈瑟球菌的外膜蛋白C、流感嗜血杆菌的蛋白D、沙门菌的外膜蛋白C、肺炎链球菌的肺炎链球菌溶血素(包括去毒变体)或肺炎球菌表面蛋白A(PspA)或肺炎球菌粘附蛋白(PsaA)、或者重组绿脓杆菌外毒素A(rEPA)等。
可通过使用多种化学方法将经纯化的细菌荚膜多糖与蛋白质分子共价连接来制备多糖蛋白质结合物疫苗。例如，可如Schneerson,R.等.(1980)J.Exp.Med.152:361-476；Chu,chiayung等.(1983)InfectionandImmunity40(1):245-256所述来制备结合物。首先，在溴化氰的存在下活化多糖以产生氰酸酯。然后，将经活化的多糖与间隔物(例如，己二酰肼)连接(衍生)。其还可直接连接间隔物而无需活化多糖。使用碳二亚胺将经衍生的多糖(PS-AH)与载体蛋白质结合，所述碳二亚胺例如，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基(EDAC或EDC)、Ν,Ν-二环己基碳二亚胺(DCC)或Ν,Ν-二异丙基碳二亚胺(DIC)。其还可首先衍生蛋白质，然后可将这样的经衍生的蛋白质与多糖结合，如由Laferriere,Craig(2011)GlycoconjugateJournal28:463-472；Silveira,L.A.等(2007)Vaccine25:7261-7270；US4,496,538所描述的。
多糖的活化还可通过有机氰化剂来完成，所述氰化剂例如，1-氰基-4-二甲基氨基－吡啶四氟化硼(CDAP)，N-氰基三乙基四氟硼酸铵(CTEA)和对硝基苯基氰酸酯(pNPC)，如由Lees,AndrewUS5693326；Lees,Andrew等.(1996)Vaccine14(3):190-198所描述的。
或者，多糖或其片段可通过引入醛在其末端还原端选择性地活化，所述醛可通过还原性胺化作用直接或间接地(经过交联剂或间隔物)与载体蛋白质偶联(Jennings,H.J.US4356170；P.W.Anderson,等.(1986)J.Immunol.137:1181-1186；GrayGR.(1978)MethodsEnzymology；50:155-160)。
考虑通过本发明的方法进行纯化的多糖蛋白质结合物优选为Hib结合物、脑膜炎球菌结合物、肺炎球菌结合物以及伤寒结合物。
流感嗜血菌多糖蛋白质结合物(Hib结合物)可通过将从b型流感嗜血菌(Hib)获得的荚膜多糖(PRP)与载体蛋白质缀合来制备。PRP是可与载体蛋白质偶联的核糖核糖醇磷酸酯的聚合物，所述载体蛋白质例如，但不限于，破伤风类毒素、白喉类毒素或其无毒突变体、流感嗜血杆菌的蛋白D、脑膜炎奈瑟球菌的外膜蛋白C、沙门菌的外膜蛋白C、肺炎链球菌溶血素(包括去毒变体)、PspA、PsaA或rEPA。制备Hib的方法是本领域技术人员公知的(Chu,chiayung等.(1983)InfectionandImmunity40(1):245-256；US4,496,538；US4,459,286；US4,619,828)。
脑膜炎球菌结合物可通过将荚膜多糖与载体蛋白质偶联由脑膜炎奈瑟球菌的荚膜多糖(例如，脑膜炎奈瑟球菌血清群A荚膜多糖(N.meningitidisserogroupAcapsularpolysaccharide(MenA)、脑膜炎奈瑟球菌血清群C荚膜多糖(N.meningitidisserogroupCcapsularpolysaccharide(MenC)、脑膜炎奈瑟球菌血清群Y荚膜多糖(N.meningitidisserogroupYcapsularpolysaccharide(MenY)、脑膜炎奈瑟球菌血清群W荚膜多糖(N.meningitidisserogroupWcapsularpolysaccharide(MenW))来制备，所述载体蛋白质例如，但不限于，破伤风类毒素、白喉类毒素或其无毒突变体、流感嗜血杆菌的蛋白D、脑膜炎奈瑟球菌的外膜蛋白C、沙门菌的外膜蛋白C、肺炎链球菌溶血素(包括去毒变体)、PspA、PsaA或rEPA。制备脑膜炎球菌结合物的方法是本领域技术人员公知的(Silveira,LA.等(2007)Vaccine25:7261-7270；US4356170；WO2007000343)。
肺炎球菌结合物可通过将荚膜多糖与载体蛋白质偶联由肺炎链球菌血清型(例如，血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F)的荚膜多糖来制备，所述载体蛋白质例如，但不限于，破伤风类毒素、白喉类毒素或其无毒突变体、流感嗜血杆菌的蛋白D、脑膜炎奈瑟球菌的外膜蛋白C、沙门菌的外膜蛋白C、肺炎链球菌溶血素(包括去毒变体)、PspA、PsaA或rEPA。制备肺炎球菌结合物的方法是本领域技术人员公知的(Laferriere,Craig等.(1997)Vaccine15(2):179-186；US4673574；WO2007000343)。
伤寒结合物可通过将获得自伤寒沙门菌的荚膜多糖(vi抗原-α-(l→4)-D-半乳糖胺醛酸的均聚物，在C-2处N-乙酰化并且在C-3上O-乙酰化)与载体蛋白质缀合来制备，所述载体蛋白质例如，但不限于，破伤风类毒素、白喉类毒素或其无毒突变体、流感嗜血杆菌的蛋白D、脑膜炎奈瑟球菌的外膜蛋白C、沙门菌的外膜蛋白C、肺炎链球菌溶血素(包括去毒变体)、PspA、PsaA或rEPA。制备伤寒结合物的方法是本领域技术人员公知的(Kossaczka等.(1999)Infection&Immunity67(11)5806-5810；MicoliF.等.(2011)Vaccine29(4):712-720)。
本发明既不限于任何可用于将多糖与载体蛋白质结合的方法，也不限于制备多糖蛋白质结合物的多糖或载体蛋白质的类型。例如，Jennings,HaroldJ.等.(Bacterialpolysaccharidevaccines:Glycoconjugatesandpeptide-mimeticsinMicrobialGlycobiologyStructures,RelevanceandApplicationsAcademicPress,2010,第933-956页)给出了可用于制备多糖蛋白质结合物的多种方法的概述。由本领域技术人员已知的任意方法制备的结合物均可通过本发明的方法来纯化。
使用混合模式色谱法纯化结合物
本发明使用混合模式色谱介质将污染物与多糖蛋白质结合物分离来纯化多糖蛋白质结合物。在混合模式色谱法中，利用两种或更多种不同的色谱原理来完成在单一步骤中将期望的分子和与其混杂在一起的的杂质分离开来。
将粗的结合物加载在混合模式色谱基质上。任选地，在加载到混合模式色谱基质上之前，待加载的混合物可优选地通过渗滤来进行膜过滤。渗滤可使用具有宽范围的截留分子量例如30kDa至1000kDa的膜以分批(不连续)或连续处理方式进行。在一个实施方案中，膜的截留分子量为30kDa至900kDa、30kDa至800kDa、30kDa至700kDa、30kDa至600kDa、30kDa至500kDa、30kDa至400kDa、30kDa至300kDa、30kDa至200kDa、30kDa至200kDa或30kDa至100kDa。混合模式色谱基质是具有惰性壳和活性核的基质。惰性壳具有赋予基质尺寸排除性质之允许分子在确定大小下进入活性核的孔，同时活性核用具有不同官能团的配体固定。通常的混合模式基质具有惰性多孔壳和配体活性核。
基质的孔隙率决定可排除进入配体活性核的分子的大小。在一个实施方案中，惰性多孔壳的孔径的截留分子大小为约100kDa、约200kDa、约300kDa、约400kDa、约500kDa、约600kDa、约700kDa、约800kDa、约900kDa、约1000kDa、约1200kDa、约1400kDa、约1600kDa、约1800kDa、或约2000kDa，其将排除大小大于截留分子大小的分子进入配体活性核。在一个实施方案中，惰性多孔壳的孔径的截留分子大小为约200kDa至约2000kDa、约500kDa至约1500kDa、约600kDa至约1000kDa。在一个优选的实施方案中，惰性多孔壳的截留分子大小为约700kDa以防止大小大于700kDa的分子进入配体活性核。
因此，通过使用适当孔隙率的基质，现在可将多糖蛋白质结合物和与其混杂的污染物分离，即后者进入核并被配体的官能团捕获，而经纯化的多糖蛋白质结合物以未结合方式在流经物中回收。
配体是具有不同官能团、有以若干不同方式与靶分子相互作用的能力的配体，例如，辛胺、N-苄基-N-甲基乙醇胺、巯基-苯并咪唑-磺酸。例如，辛胺配体可通过疏水性相互作用和离子相互作用与靶分子相互作用，这是由于烷基链(8碳辛烷链)和氨基的存在。类似地，在N-苄基-N-甲基乙醇胺中，离子季铵基由疏水性苯基补充以提供双官能团。在巯基-苯并咪唑-磺酸中，芳环赋予疏水性相互作用而SO3 -赋予离子相互作用能力。具有这样的官能团的基质可从多个制造厂家例如GEHealthCare、PallLifeSciences等获得。还可在核中具有大于一种类型的配体，每个以单一相互作用(即，疏水性或离子)参与，而不是仅具有提供双功能的一种类型的配体。在一个实施方案中，配体活性核用辛胺配体官能化。
在一个实施方案中，所述方法包括通过疏水性相互作用和/或离子相互作用捕获污染物以及以非结合方式回收或收集结合物。
在一个实施方案中，污染物或杂质经过惰性多孔壳的孔进入配体活性核并与配体的疏水性官能团和/或离子官能团相互作用，同时以非结合方式回收结合物。
在一个实施方案中，优选地用于纯化多糖蛋白质结合物的混合模式色谱介质具有截留分子大小为700kDa的惰性多孔壳和包含辛胺配体的活性核(例如，CaptoTMCore700，GEHealthCare)。
在一个实施方案中，待纯化的多糖蛋白质结合物选自Hib结合物、脑膜炎球菌结合物、肺炎球菌结合物或伤寒结合物，或者更优选为Hib结合物。
在加载之前，柱子用缓冲液预平衡。可使用本领域已知的任何合适的缓冲液，但不限于，磷酸盐、Tris、MES、HEPES、柠檬酸盐中的一种或几种的组合。优选的是，使用这样的缓冲剂，其适于将pH值范围保持在至少约pH值5.0至7.5。
在一个实施方案中，缓冲液的pH值为5.0至7.5、5.0至7.0、5.1至6.9、5.2至6.8、5.3至6.7、5.4至6.6、5.5至6.5、5.6至6.4、5.7至6.3、5.8至6.2、5.9至6.0或pH值为6.0。如果需要，可通过添加酸/碱来保持pH值。
在本发明的方法中，可使用电导率如下的缓冲液：低于20mS/cm、低于15mS/cm、低于10mS/cm、低于9mS/cm、低于8mS/cm、低于7mS/cm、低于6mS/cm、低于5mS/cm、低于4mS/cm、低于3mS/cm、低于2mS/cm、低于1mS/cm、低于0.9mS/cm、低于0.8mS/cm、低于0.7mS/cm、低于0.6mS/cm、低于0.5mS/cm、低于0.4mS/cm、低于0.3mS/cm、低于0.2mS/cm或低于0.1mS/cm。如本文所使用的，电导率是指溶液例如缓冲溶液影响污染物与基质的静电相互作用(例如，结合或释放)的能力。电导率可通过改变缓冲液组合物的离子浓度来调节。通常，低电导率缓冲液是优选的。对于低电导率，应理解的是，电导率低于10mS/cm、优选地低于5mS/cm并且最优选地低于3mS/cm。在一个实施方案中，缓冲液的电导率为约8mS/cm至约0.5mS/cm、约5mS/cm至约1mS/cm、约4mS/cm至约1.5mS/cm、约3mS/cm至约2mS/cm。
在一个实施方案中，示例性缓冲液包含10mM磷酸盐，pH值5.8至6.2，电导率约2mS/cm。
结合物以2cm/hr至120cm/hr的流速加载。优选地以10cm/hr至120cm/h、20cm/hr至110cm/h、30cm/hr至100cm/h、40cm/hr至90cm/h、50cm/hr至80cm/h或60cm/hr至70cm/h的流速。可调节流速以便允许污染物有足够的时间与基质相互作用。样品可以300cm/hr加载，具有一次或更多次重复的加载步骤。如果需要的话，在加载到色谱柱上之前，可将粗的结合物进行膜过滤。使期望的结合物通过混合模式树脂的空隙空间并在流经物中收集，而通过疏水性相互作用和/或离子相互作用将杂质截留在配体活性核内部。使用磷酸盐缓冲液，pH值5.8至6.2，冲洗柱子以收集非特异性地粘附在基质上的残留结合物。将经纯化的结合物用高电导率稀释缓冲液，pH值5.8至6.2，稀释并经过0.45μ和0.22μ过滤器过滤。
表-1通过混合模式色谱法纯化多糖蛋白质结合物(Hib结合物)之后的游 离多糖(PRP)、游离载体蛋白质(TT)和EDC含量
列(a)表示污染物。
列(b)通过混合模式色谱法纯化多糖蛋白质结合物之前污染物的量。
列(c)表示通过混合模式色谱法纯化多糖蛋白质结合物之后污染物的残留量。
列(d)表示污染物的残留量的百分比。
列(e)表示污染物的百分比降低。
游离PRP通过Tsai,CM.等.(1994)Vaccine12(8):700-706所述的方法来测定。
多糖结合物疫苗中的游离蛋白质可通过本领域技术人员已知的方法来测定。Hib结合物(PRP与破伤风类毒素相结合形成的)中的游离破伤风类毒素(游离TT)的量通过强阴离子交换色谱法使用荧光检测器来测定。首先将具有弱离子相互作用的分子(游离TT)洗脱出来，然后将具有强离子相互作用(Hib结合物)的分子洗脱出来。游离TT是通过将流动相的pH值降低到破伤风类毒素的pI以下来洗脱的。游离TT的量通过将样品的峰面积与使用破伤风类毒素所产生的相对于浓度(μg/mL)绘制的标准曲线的峰面积相比较来定量的。
将毛细管区带电泳(CZE)用于定量1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，检测方法为通过直接在毛细管中检测200nm处的UV吸收。样品中的EDC含量通过将样品的峰面积与使用不同浓度的EDC所产生的标准曲线的峰面积相比较来定量。
表-2通过混合模式色谱法纯化的Hib结合物的分子大小分布
经纯化的Hib结合物的分子大小分布通过SepharoseCL4B色谱法进行分析(WHOTechnicalReportSeries,No.897,2000第27-56页)。收集了如图2中所示的大小分布范围的3个级分，即，<0.2KD、0.2KD至0.5KD以及0.5KD至1.0KD并分析了PRP含量。结果表明79.4％的结合物在<0.2KD的分子大小范围内，表明混合模式色谱法有效地移除了低分子量的结合物。
通过以下非限制性实施例对本发明进行了进一步的举例说明。应理解，实施例是为了说明本发明而提供。本领域技术人员可从说明书和示例性实施方案以及实施例中对本发明做出多种修改或改变。认为这样的修改或改变在本发明的范围和精神内。
具体实施方式
实施例1—使用凝胶过滤色谱法纯化Hib结合物(3.0L规模)
用平衡缓冲液(含有0.2MNaCl的10mM磷酸盐缓冲液)来平衡填充有SepharoseCL-2B(GEHealthcare)的色谱柱(BPG，GEHealthcare)。将3000mL粗的Hib结合物(Hib多糖与破伤风类毒素结合形成的)加载在预平衡的柱子上。粗的结合物基于分布系数(Kd)来分级(级分-1至级分-4)，由此在流出物中收集期望的结合物(级分-2)。其余的级分(级分-1、级分-2和级分-3)包含污染物(图1a)。
实施例2a—使用混合模式色谱法纯化Hib结合物(0.08L规模)
用平衡缓冲液(10mM磷酸钠、pH值5.8并且电导率2mS/cm)将80mL粗的Hib结合物，即，Hib多糖与破伤风类毒素结合形成的(浓度10mg/mL、pH值5.8，电导率20mS/cm)稀释10倍并使用1000kDa盒(cassette)(MilliporeBiomax)将其浓缩至约5倍体积。用平衡缓冲液连续渗滤(使用30kDa膜)结合物约20次并将其浓缩至其初始体积。
用平衡缓冲液来平衡填充在BPG柱(GEHealthcare)中的混合模式基质(CaptoTMCore700matrix，GEHealthcare)并以10cm/h的速度加载结合物。收集未结合的结合物。使用平衡缓冲液冲洗柱子以收集非特异性地粘附于基质上的残留结合物。将所收集的结合物用磷酸盐缓冲液pH值5.8至6.2稀释并经过0.45μ和0.2μ过滤器过滤。
实施例2b—使用混合模式色谱法纯化Hib结合物(3.0L规模)
用平衡缓冲液(10mM磷酸钠、pH值5.8，电导率mS/cm)将3000mL粗的Hib结合物，即，Hib多糖与破伤风类毒素结合形成的(浓度10mg/mL、pH值5.8，电导率20mS/cm)稀释10倍并使用1000kDa盒(MilliporeBiomax)将其浓缩至约3倍体积。用平衡缓冲液连续渗滤(使用30kDa膜)结合物约25次并将其浓缩至其初始体积。
用平衡缓冲液来平衡填充在Axichrom柱(GEHealthcare)中的混合模式基质(CaptoTMCore700matrix，GEHealthcare)并以60cm/h的速度加载结合物。收集未结合的结合物。使用平衡缓冲液冲洗柱子以收集非特异性地粘附于基质上的残留结合物。将所收集的结合物用磷酸盐缓冲液pH值5.8至6.2稀释并经过0.45μ和0.2μ过滤器过滤。
表3—对于结合物纯化，使用混合模式色谱法相比于凝胶过滤色谱法的优点

Claims (28)

1.一种将多糖蛋白质结合物与一种或更多种污染物分离、纯化多糖蛋白质结合物的方法，包括以下步骤：
a、在低电导率的条件下，使粗的多糖蛋白质结合物与包含惰性多孔壳和活性核的混合模式树脂相接触，使污染物与混合模式树脂相结合，以及
b，收集流经物中的未与混合模式树脂结合的多糖蛋白质结合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述惰性多孔壳包含截留分子量为2000kDa至500kDa的孔。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述截留分子量为1000kDa至700kDa。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述活性核用包含官能团的配体固定化。
5.根据权利要求4所述的方法，其中在固定化配体上的所述官能团包含烷基链和氨基。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述烷基链包含4至14个碳。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述烷基链通过疏水性相互作用与所述污染物接触。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述氨基通过离子相互作用与所述污染物接触。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述污染物包含游离多糖。
10.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述污染物包含游离蛋白质。
11.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述污染物包含低分子量结合物。
12.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述污染物包含交联剂或偶联剂。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多糖蛋白质缀合物的所述多糖组分包含来自以下来源的多糖：b型流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、伤寒沙门菌(SalmonellaentericaserovarTyphi)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)或弗氏志贺菌(Shigellaflexneri)。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述多糖蛋白质结合物的载体蛋白质组分选自破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197、流感嗜血杆菌的蛋白D、百日咳毒素(化学上或遗传上去毒的)、脑膜炎奈瑟球菌的外膜蛋白C、沙门菌的外膜蛋白C、肺炎链球菌的肺炎链球菌溶血素(包括去毒变体)或肺炎球菌表面蛋白A(PspA)或肺炎球菌粘附蛋白(PsaA)、或者重组绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)外毒素A(rEPA)。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(a)通过在低电导率条件下将所述多糖蛋白质结合物加载到包含所述混合模式树脂的色谱柱上，使所述污染物与所述混合模式树脂相结合，所述混合模式树脂包含惰性多孔壳和活性核。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述加载以2cm/h至120cm/h的流速进行。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述流速为10cm/h至120cm/h、20cm/h至110cm/h、30cm/h至100cm/h、40cm/h至90cm/h、50cm/h至80cm/h或者60cm/h至70cm/h。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述流速优选为10cm/h至80cm/h。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述低电导率意指低于10mS/cm、低于5mS/cm或优选地低于3mS/cm的电导率。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述电导率通过调节缓冲液的离子浓度来保持。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述缓冲液选自磷酸盐、Tris、MES、HEPES、柠檬酸盐中的一种或几种的组合。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述缓冲液的pH值为5.0至7.5。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述缓冲液优选为磷酸盐缓冲液。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述缓冲液的电导率低于5mS/cm。
25.根据权利要求1所述的方法，其任选地在步骤(a)之前包括稀释步骤和渗滤步骤。
26.根据权利要求25所述的方法，其中将所述渗滤连续进行20次至25次。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述渗滤在截留分子量为30kDa的膜上进行。
28.用于制造多糖结合物疫苗的方法，其包括通过根据权利要求1至27中任一项所述的方法来生产经充分纯化的多糖蛋白质结合物以及将所述经充分纯化的多糖蛋白质结合物用于组合疫苗的制造。
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