CN111295450A - 使用裂解酶、切向流过滤和多模式色谱法的用于疫苗生产的多糖纯化 - Google Patents

Abstract

公开了改进的、成本上有效的和缩短的肺炎链球菌、B族链球菌、流感嗜血杆菌、伤寒沙门菌（S.Typhoid）和脑膜炎奈瑟氏菌的荚膜多糖的纯化方法。该方法包括酶处理、切向流过滤和多模式色谱法纯化的混合物。对于革兰氏阴性细菌，内毒素去除方法涉及endotrap HD树脂。这种缩短的方法与常规方法相比，以简单的步骤和更高的产率获得了用于制备人疫苗的WHO/EP/BP所需的纯度。该方法的步骤避免了使用有机溶剂（例如醇、酚）和超速离心，否则其执行是昂贵且耗时的，和/或对于商业用途是有健康危害的。所公开的这种方法也是简单、有效率、无毒、易于放大且环境友好的。

Description

使用裂解酶、切向流过滤和多模式色谱法的用于疫苗生产的 多糖纯化

相关申请的引用

本申请要求2017年7月5日提交的美国临时申请号62/528,683的优先权，所述申请的全部内容通过引用并入本文。

背景

1. 发明领域

本发明涉及用于有效纯化细菌多糖的方法和组合物。该方法是有效率的、成本上有效的和可规模化的，并且涉及去除杂质以制备包括缀合疫苗的疫苗。

2. 背景描述

纯化的CPS (荚膜多糖)用于生产疫苗，特别是有效针对由细菌产生的感染的疫苗，CPS从所述细菌衍生。在常规方法中，在工业生物反应器中培养细菌，并将CPS纯化至预定或所需的纯度要求。用于疫苗生产的细菌CPS的传统纯化方法基于用溶剂（如乙醇和苯酚）以及阳离子去污剂的若干选择性沉淀步骤。

流感嗜血杆菌(H. Influenzae)、脑膜炎奈瑟氏菌(N. meningitidis)、B族链球菌(Group B Streptococcus)和肺炎链球菌(S. pneumonia)是婴儿和免疫缺陷成人中脑膜炎、肺炎和菌血症的最常见的媒介物中的一些。荚膜多糖(CPS)充当针对宿主免疫系统的防御机制，这使得它们成为这些细菌毒力的主要因素。基于衍生自这些生物体的多糖的疫苗对成年人群有效。关于多糖疫苗的免疫原性特征有若干研究。纯化方法的目的是获得具有所需规格的产物，同时使产率最大化并使方法成本最小化。常规程序的最终纯化步骤涉及一系列纯化步骤，其中在生产效率和污染物的去除之间存在折衷。CPS纯化中的污染物例如是蛋白质、核酸、色素和不希望有的多糖，例如革兰氏阳性细菌的细胞壁多糖或革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)。

常规的CPS纯化方法遵循通过乙醇和/或阴离子去污剂选择性沉淀进行浓缩/纯化、通过苯酚提取蛋白质以及对于革兰氏阴性细菌通过超速离心以去除LPS的一般方法。

例如，对来自脑膜炎奈瑟氏菌的多糖的常规纯化包括用阳离子去污剂cetavlon沉淀，在1M CaCl₂中将沉淀物重悬，用乙醇沉淀两次，通过用苯酚的三个提取步骤脱蛋白，透析，以及进一步的乙醇沉淀。通过超速离心从CPS中分离LPS。

对肺炎链球菌CPS的常规的纯化方法包括用去污剂脱氧胆酸盐进行的总细胞裂解、浓缩/渗滤、四个步骤的乙醇沉淀、通过苯酚处理进行的脱蛋白和活性炭。

对流感嗜血杆菌PRP的常规的纯化方法用通过苯酚、甲醛或硫柳汞对细胞进行的灭活和通过离心对培养肉汤进行的分离开始。然后用50-100kDa截断膜通过切向流超滤浓缩澄清的上清液，用阳离子去污剂cetavlon沉淀，以及用氯化钙使复合物PRP-cetavlon溶解，然后进行若干次乙醇沉淀，并通过用苯酚提取进行脱蛋白，以及进一步的乙醇沉淀。通过超速离心从PRP中分离脂多糖。

目前可获得许多纯化程序，其涉及从荚膜多糖中去除蛋白质和其它杂质（如细胞壁C-多糖）。例如，美国专利号4,242,501涉及肺炎球菌荚膜多糖的纯化，并涉及从微生物荚膜多糖中去除蛋白质和其它杂质(C-多糖)的方法。1572 MUM/2010。美国专利号5,714,354、5,847,112和4,242,501各自涉及从肺炎球菌多糖中纯化的方法。国际公开号WO 2006/082527涉及无乳链球菌(S. agalactiae)荚膜多糖的纯化方法，其涉及用阳离子去污剂沉淀。国际申请公开号WO 2008/045852涉及纯化肺炎球菌多糖的方法，其中采用加热和低pH沉淀法。国际申请公开号WO 2012/127485涉及用于纯化肺炎球菌多糖的不含醇和CTAB的方法。关于CPS纯化的其它出版物包括“Purification of Capsular PolysaccharideProduced by Streptococcus pneumoniae Serotype 19A” J. Microbiol. Biotechnol,21(7), 734–738, 2011; “Production of Capsular Polysaccharide of Streptococcus pneumoniae Type 14 and Its Purification by Affinity Chromatography,” Appl Environ Microbiol, 67(2): 969–971, 2011年2月。

常规的CPS纯化方法是冗长且复杂的，并且需要高度训练的个人并利用许多昂贵的供应物和组合物。此外，错误的风险大，并且经常发生错误，使得该方法在时间和资源两者上都非常低效。因此，仍然需要有效率的且有效的多糖纯化程序。

发明内容

本发明克服了与当前策略和设计相关的问题和缺点，并提供了用于纯化多糖的新的组合物和程序。

本发明的一个实施方案涉及纯化细菌细胞表面多糖的方法，其包括：提供革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌的发酵收获物。澄清发酵收获物，优选在酸性pH（如pH 3.5-5.0）下用脱氧胆酸盐或功能相似的物质澄清。优选通过渗滤浓缩澄清的多糖，并用酶处理以去除杂质，例如宿主细胞蛋白、核酸和细胞壁多糖，其可以附着于肽聚糖和/或其它细胞膜结构。优选用乙酸沉淀该酶，并将酶处理过的多糖通过渗滤浓缩以及以流过式模式、切向流过滤和/或过滤的方式经由CAPTO^TM Adhere树脂通过多模式色谱树脂。优选地，细菌细胞表面多糖包含荚膜多糖和/或胞外多糖。优选地，细菌的收获物包含肺炎链球菌、B族链球菌、流感嗜血杆菌、鼠伤寒沙门菌(S. typhimurium)或脑膜炎奈瑟氏菌。优选地，澄清后使用乙酸将pH调节至酸性pH 3.5-5或使用2M乙酸将pH调节至低于pH 3.5或低于pH 4.5。优选地，酶选自由以下组成的组：Benzonase、变溶菌素/溶菌酶、β-D-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和蛋白酶K。优选地，酶处理是单独地或在组合中依次进行的。优选地，发酵收获物包含革兰氏阴性细菌，并且使用脱氧胆酸盐/EDTA/Ca盐缓冲液使经酶处理和渗滤过的多糖通过切向流过滤。优选地，切向流过滤包括将多糖通过50-100kDa膜。优选地，发酵收获物包含革兰氏阳性细菌，并且使经酶处理和渗滤过的多糖通过用CAPTO^TM Adhere树脂的多模式色谱法。优选地，发酵收获物包含革兰氏阴性细菌，并且进一步包含使用树脂色谱法，更具体地使用EndoTrap HD树脂以流过式模式去除内毒素。优选地，发酵收获物包含肺炎链球菌，其包含血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24、33F和35B中的一种或多种或用于疫苗制备的其它血清型。优选地，发酵收获物包含B族链球菌，其包含血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII、VIII和IX中的一种或多种。优选地，发酵收获物包含流感嗜血杆菌，其包含a、b、c、d、e和f血清型亚株。优选地，发酵收获物包含含有Vi多糖的伤寒沙门菌（S. typhi）。优选地，发酵收获物包含脑膜炎奈瑟氏菌，其包含血清型A、B、C、X、Y和W-135中的一种或多种。

本发明的另一个实施方案包含通过本文所述的本发明的方法纯化的多糖。

本发明的另一个实施方案包含免疫组合物，如掺入或衍生自本发明纯化的多糖的疫苗。根据本公开制备的疫苗可以包含或可以不包含佐剂。

本发明的其它实施方案和优点部分地在以下描述中阐述，并且部分地可以从本描述中显而易见，或者可以从本发明的实践中获知。

附图的描述

图1：经纯化的多糖的¹H NMR分析，其显示使用纯化策略-1，多糖不含细胞壁多糖(CWPS)。3型肺炎链球菌多糖——尺寸减小的多糖，通过SEC-HPLC进行的分子尺寸分布＜50kDa (在3.2 PPM处未检测到C-多糖)。

图2：经纯化的多糖的¹H NMR分析，其显示使用纯化策略-1，多糖不含细胞壁多糖(CWPS)。1型肺炎链球菌多糖——尺寸减小的多糖，通过SEC-HPLC进行的分子尺寸分布＜50kDa (在3.2 PPM处未检测到C-多糖)。

本发明的描述

从液体中分离固体是基于在纯化的CPS中的连续离心，所述纯化的CPS用于生产针对这些细菌的疫苗。从液体中分离固体是基于在防爆装置中的连续离心。

已经令人惊奇地开发出纯化CPS的方法，该方法去除了常规程序中的乙醇沉淀、苯酚的使用和超速离心步骤。本公开的方法包含使用具有所需分子量截断值(例如30-100kDa)的膜的超滤步骤，并通过酶消化和切向流过滤(TFF)（优选用30-100kDa截断的膜）去除残余蛋白质和核酸。所得纯化的CPS具有大于70%的产率，以及相对于总CPS，小于或等于1%的蛋白质且小于或等于1%的核酸。纯化的CPS没有蛋白水解酶活性，并通过了必要的质量测试。

本发明的总的优点包括提供了快速、有效率的且有效的细菌细胞表面荚膜多糖(CPS)纯化方法，该方法通过简单、有效率的和商业上可规模化的步骤在非常短的时间内纯化多糖同时去除杂质，从而产生满足或超过相关WHO规格和其它质量标准的高质量多糖。

本发明的一个实施方案涉及多糖的纯化方法。该方法描述了新的、快速的、成本上有效的且可规模化的方法，其中将多糖在显著减少的时间内纯化。在发酵罐中，将选择的细菌菌株培养在优化的培养基上，并且通过进行已发酵的收获物的离心以去除细胞碎片，随后进行使用分子量截断膜的TFF来进行该方法。本发明的方法与现有技术相比显示出若干优点，例如提供了新的且快速的制备多糖的方法。该方法是成本上有效的，因为它减少了步骤的总数并且需要单次色谱筛选。另外的优点是该方法是完全可规模化的。

尽管大多数任意的多糖的纯化可以根据本公开的方法进行，但特别地，优选的方法包含来自脑膜炎奈瑟氏菌、肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌、鼠伤寒沙门菌和B族链球菌的多糖的纯化，用于疫苗生产。该方法包含提供细菌或其它多糖源的发酵收获物，用脱氧胆酸盐在例如约3.5-5.0的pH下澄清发酵收获物，通过第一渗滤浓缩澄清的多糖，并用酶处理经过第一渗滤的多糖以去除杂质，用乙酸沉淀该酶使得多糖保留在上清液中，通过第二渗滤浓缩上清液的多糖；用脱氧胆酸盐/EDTA/Ca盐缓冲液，通过切向流过滤，将经过第二渗滤的多糖通过多模式色谱树脂和/或内毒素去除树脂；以及收集纯化的多糖。

本公开的方法去除了对乙醇、苯酚和去污剂沉淀的需要和使用，而是取而代之涉及连续的裂解酶处理，随后进行超滤，并且如果需要，优选通过疏水相互作用色谱法或混合模式离子交换树脂色谱法进一步纯化。

核酸酶Benzonase水解残余基因组DNA和RNA，以及所得低分子量寡核苷酸在第二TFUF中通过膜过滤。肽聚糖和附着于肽聚糖的细胞壁多糖(CWPS或B族糖)，被变溶菌素/溶菌酶/B-D-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶酶(活性单位比例1:1:0.1)的混合物组合降解和/或减小尺寸。在酶处理和用TFUF 30-100 kDa进行第二浓缩/渗滤之后，去除蛋白质和LPS。对于革兰氏阴性细菌，LPS的去除优选在去污剂和螯合剂(优选DOC/EDTA)的存在下用TFUF进行。去污剂脱氧胆酸盐DOC破坏脂质部分的脂肪酸的疏水相互作用，使聚集体分离，并产生可在30-100kDa膜中被自由过滤的LPS的低分子量单体。

本发明的纯化方法部分基于分子尺寸。在第一TFUF中，尺寸小于孔截断的分子被去除，它们中的大部分来自培养基。在酶降低了污染物、蛋白质和核酸的尺寸后，第二TFUF提供了它们的去除。在去污剂和螯合剂存在下，超滤来自LPS的低分子量单体。

本发明的方法去除了使用醇、酚或阳离子去污剂的常规方法中所需的多个沉淀步骤，而是取而代之涉及酶处理和/或超滤以获得所需或期望的纯度的最终产物。

与超速离心相比，酶处理和切向超滤的组合更易于放大并且更便宜。用于切向流的膜在适当的位置被清洁并被储存以便重复使用(例如使用一次性的膜)。本公开的方法提供了一种简单、有效率且环境友好的方法，其易于放大以便商业开发。

以下实施例说明本发明的实施方案，但不应视为限制本发明的范围。

实施例

实施例1

细菌的培养

在适合于每种菌株的含有培养基的5～10L发酵罐中和条件下进行细菌的培养。用0.15%脱氧胆酸盐沉淀生物反应器的全部肉汤，将其倾析并离心。通过切向微过滤从培养肉汤中分离细胞。无细胞微滤液用于肺炎链球菌以及其它菌株的CPS纯化。

浓缩/去过滤

通过30-100kDa的切向流超滤(TFUF)膜将无细胞CPS浓缩至1-20倍。用缓冲液对浓缩物进行生物过滤。

酶处理和浓缩/渗滤

将来自奈瑟氏菌(Neisseria)或链球菌(Streptococcus)的可溶性CPS部分的pH调节至pH 7。连续地添加重组酶：Benzonase (含有2mM MgCl₂和20mM NaCl的Tris-HCl 50 mM)；变溶菌素/溶菌酶(1:1)；β-D-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶；和蛋白酶K以在它们之间2-4小时的间隔添加，并在37℃-56℃、碱性pH (pH 8.8-10.5)和50-100 rpm的条件下孵育12-24小时。通过30-100kDa截断的第二TFUF膜去除由酶降解和去污剂处理产生的低分子量污染物。纯化的CPS经0.2μm膜无菌过滤并在-20℃下储存。

使用两种不同的纯化策略来纯化多糖。一种纯化方法通常用于革兰氏阳性细菌多糖纯化方法(纯化策略-1)，以及一种用于革兰氏阴性细菌多糖纯化方法(纯化策略-2)。

纯化策略-1 (用于革兰氏阳性细菌)

多糖纯化使用含有Benzonase、变溶菌素/溶菌酶组合、β-D-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、蛋白酶K的酶混合物，随后切向流过滤(TFF)和最后多模式阴离子交换剂CAPTO^TM Adhere树脂色谱法(设计用于以生产规模进行单克隆抗体的蛋白A后纯化的多模式介质树脂)。

纯化来自肺炎链球菌或B族链球菌血清型的多种血清型多糖。所有纯化的多糖都满足或超过WHO/或BP /或EP的多糖纯度标准。通过针对残余蛋白、核酸和内毒素的重量的多模式色谱法步骤获得进一步的纯度。也使用多模式色谱法来去除纯化步骤期间使用的残余的酶。

通过切向超滤进行细胞分离、浓缩.

在培养细菌后，用0.15%脱氧胆酸盐(pH调节至4.5-5)灭活发酵液，通过倾析去除细胞，然后离心，并将无细胞的澄清的肉汤使用50KDa-100KDa PES膜，使用0.9%盐水，然后用Tris-HCl缓冲液(50mM，pH7.0) 浓缩和渗滤。

酶处理和通过切向超滤的第二浓缩.

将多糖溶液的pH从pH 7.0升至pH 9-9.5，添加2mM MgCl2并在42℃、50-75 rpm下孵育15分钟。以10-20单位/ml PS溶液添加酶Benzonase并孵育1-2小时。随后以50单位/ml溶液添加酶组合变溶菌素/溶菌酶(1:1)并孵育1-2小时。以1单位/100ml多糖溶液添加酶β-N-乙酰基-D-氨基葡萄糖苷酶。添加蛋白酶K并在56℃、pH 9.5-10.5下孵育2-4小时。在6-8小时内完成总的酶反应。所用的所有酶都是重组酶。

酶处理后，用乙酸(2M)将溶液的pH值降至3.5-4.5，通过深层过滤去除沉淀，并将多糖溶液的pH调至pH 7.0。将澄清的多糖溶液使用0.9%盐水，然后使用50mM磷酸钠缓冲液(50mM，pH 7.4-7.6)通过50kDa-100kDa PES膜浓缩和渗滤。

使用CAPTO^TM Adhere树脂的柱色谱法

使用CAPTO^TM Adhere树脂色谱法以简单的流过式模式完成多糖的最终纯化，并最后在pH 7.4-7.6下用50mM磷酸钠+ 1.0M NaCl洗脱。结果在表1和图1中显示。

表1

肺炎链球菌和B族链球菌多糖血清型的纯化

纯化策略-2 (用于革兰氏阴性细菌)

多糖纯化使用含有Benzonase、蛋白酶K的酶混合物，随后切向流过滤(TFF)，和多模式阴离子交换剂CAPTO^TM Adhere树脂色谱法和/或通过ENDOTRAP®-HD树脂去除LPS。

纯化了来自流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌或鼠伤寒沙门菌血清型的多种血清型多糖。所有纯化的多糖都满足或超过WHO/或BP /或EP的多糖纯度标准。内毒素去除步骤用于去除残余的内毒素。将多模式色谱法保持为任选，以去除纯化步骤期间使用的残余的酶。

通过切向超滤进行细胞分离、浓缩.

在培养细菌后，用0.15%脱氧胆酸盐或用0.6%甲醛灭活发酵液。通过倾析和/或离心去除细胞，并将无细胞的澄清的肉汤使用50KDa-100KDa PES膜，使用0.9%盐水，然后用Tris-HCl缓冲液(50mM，pH7.0) 浓缩和渗滤。

酶处理和通过切向超滤的第二浓缩

将多糖溶液的pH从7.0升至8.5-8.8，添加2mM MgCl2并在37℃、50-75 rpm下孵育15分钟。以10-20单位/ml PS溶液添加酶Benzonase，并将溶液孵育1-2小时。添加蛋白酶K并在45℃、pH 9.5-10.5下孵育2-4小时。在6-8小时内完成总的酶反应。所用的所有酶都是重组酶。

酶处理后，用乙酸(2M)将溶液的pH值降至3.5-4.5。通过深层过滤去除沉淀，并将多糖溶液的pH调至pH 7.0。将澄清的多糖溶液使用0.2% DOC和1-2mM EDTA，然后使用50mM磷酸钠缓冲液(50mM，pH 6.0-6.4)通过50kDa-100kDa PES膜浓缩和渗滤，以减少内毒素杂质。

使用Endotrap HD树脂去除内毒素

通过使用ENDOTRAP®-HD树脂(内毒素去除树脂；Hyglos GmbH，德国)以简单的流过式模式去除多糖溶液中的残余的内毒素。所用缓冲液为具有50-80mM NaCl的在pH 6.4-7.4下的100-200mM TRIS或HEPES。缓冲液中存在的钙离子和EDTA也增强内毒素的去除。ENDOTRAP®-HD树脂在再生后可以使用若干次。

使用CAPTO^TM Adhere树脂的柱色谱法

使用CAPTO^TM Adhere树脂色谱法以简单的流过式模式完成多糖的纯化，并在pH 7.4-7.6下用50mM磷酸钠+ 1.0M NaCl洗脱。如果观察到残余的酶活性，并且如果观察到来自ENDOTRAP®-HD树脂的任何渗漏，则将该色谱法步骤保持为任选。结果在表2和图2中显示。

表2

a/b型流感嗜血杆菌、W-135型脑膜炎奈瑟氏菌和伤寒沙门菌多糖的纯化

通过考虑本文公开的本发明的说明书和实践，本发明的其它实施方案和用途对于本领域技术人员将是显而易见的。本文引用的所有参考文献（包括所有出版物、美国和外国专利和专利申请）都明确地且全部通过引用并入。意图是说明书和实施例仅被认为是示例性的，而本发明的真正范围和精神由所附权利要求书指出。此外，术语“包含”包括术语“由……组成”和“基本上由……组成”。

Claims (38)

1.纯化多糖的方法，其包括：

提供革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌的发酵收获物；

用脱氧胆酸盐澄清所述发酵收获物；

通过第一渗滤浓缩所述澄清的多糖；

用酶处理所述经过第一渗滤的多糖以消化杂质；

用乙酸沉淀所述酶；

通过第二渗滤浓缩所述多糖；

使所述经过第二渗滤的多糖通过多模式色谱树脂和/或内毒素去除树脂；以及

收集所述纯化的多糖。

2.权利要求1所述的方法，其中所述多糖包含细菌细胞表面多糖。

3.权利要求2所述的方法，其中所述细菌细胞表面多糖包含荚膜多糖和/或胞外多糖。

4.权利要求1所述的方法，其中所述发酵收获物包含肺炎链球菌、B族链球菌、流感嗜血杆菌、鼠伤寒沙门菌和/或脑膜炎奈瑟氏菌。

5.权利要求1所述的方法，其中澄清之后将pH调节至约pH 3.5-5.0。

6.权利要求5所述的方法，其中所述pH调节包含添加酸。

7.权利要求6所述的方法，其中所述酸包含乙酸。

8.权利要求1所述的方法，其中所述酶包含Benzonase、变溶菌素/溶菌酶、β-D-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和/或蛋白酶K中的一种或多种。

9.权利要求1所述的方法，其中用酶处理是用多种不同的酶依次地、单独地或在组合中进行的。

10.权利要求1所述的方法，其中所述杂质包含蛋白质、核酸、细胞壁组分和/或肽聚糖。

11.权利要求1所述的方法，其中所述通过多模式色谱树脂以流过式模式、切向流过滤模式和/或过滤模式进行。

12.权利要求1所述的方法，其中所述通过多模式色谱树脂以切向流过滤模式进行。

13.权利要求1所述的方法，其中所述发酵收获物包含革兰氏阴性细菌。

14.权利要求13所述的方法，其进一步包括将经过第一渗滤的多糖通过切向流过滤。

15.权利要求14所述的方法，其中所述切向流过滤包含脱氧胆酸盐/EDTA/Ca盐缓冲液。

16.权利要求13所述的方法，其中所述切向流过滤进一步包含通过50-100kDa膜。

17.权利要求1所述的方法，其中所述发酵收获物包含革兰氏阳性细菌。

18.权利要求17所述的方法，其进一步包括将经过第一渗滤的多糖通过切向流过滤。

19.权利要求18所述的方法，其中所述切向流过滤包含脱氧胆酸盐/EDTA/Ca盐缓冲液。

20.权利要求17所述的方法，其中所述切向流过滤进一步包含通过50-100kDa膜。

21.权利要求1所述的方法，其中将所述经过第二渗滤的多糖通过内毒素去除树脂。

22.权利要求1所述的方法，其中所述发酵收获物包含肺炎链球菌。

23.权利要求22所述的方法，其中所述肺炎链球菌包含血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24、33F和35B中的一种或多种。

24.权利要求1所述的方法，其中所述发酵收获物包含B族链球菌。

25.权利要求24所述的方法，其中所述B族链球菌包含血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII、VIII和IX中的一种或多种。

26.权利要求1所述的方法，其中所述发酵收获物包含流感嗜血杆菌。

27.权利要求26所述的方法，其中所述流感嗜血杆菌包含血清型a、b、c、d、e和f中的一种或多种。

28.权利要求1所述的方法，其中所述发酵收获物包含伤寒沙门菌。

29.权利要求28所述的方法，其中所述伤寒沙门菌包含Vi多糖。

30.权利要求1所述的方法，其中所述发酵收获物包含脑膜炎奈瑟氏菌。

31.权利要求30所述的方法，其中所述脑膜炎奈瑟氏菌包含血清型A、B、C、X、Y和W-135中的一种或多种。

32.通过权利要求1所述的方法纯化的多糖。

33.免疫组合物，其掺入或衍生自权利要求32所述的纯化的多糖。

34.权利要求33所述的免疫组合物，其进一步包含佐剂。

35.权利要求33所述的免疫组合物，其不包含佐剂。

36.针对感染对人进行治疗的方法，其包括给予权利要求33所述的免疫组合物。

37.权利要求36所述的方法，其中所述感染包含肺炎链球菌、B族链球菌、流感嗜血杆菌、鼠伤寒沙门菌和/或脑膜炎奈瑟氏菌。

38.纯化多糖的方法，其包括：

提供肺炎链球菌、B族链球菌、流感嗜血杆菌、鼠伤寒沙门菌和/或脑膜炎奈瑟氏菌细菌的发酵收获物；

在pH为约3.5-5.0下，用脱氧胆酸盐澄清所述发酵收获物；

通过第一渗滤浓缩所述澄清的多糖；

用酶处理所述经过第一渗滤的多糖以去除杂质；

用乙酸沉淀所述酶，使得多糖保留在上清液中；

通过第二渗滤浓缩所述上清液的多糖；

用脱氧胆酸盐/EDTA/Ca盐缓冲液，通过切向流过滤，将所述经过第二渗滤的多糖通过多模式色谱树脂和/或内毒素去除树脂；以及

收集所述纯化的多糖。

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