CN108743936B - 一种细菌多糖结合疫苗及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种细菌多糖结合疫苗及其制备方法与应用，所述细菌多糖结合疫苗包括以共价键结合的乙肝核心抗原与细菌多糖；本发明提供的细菌多糖结合疫苗可将细菌多糖非T细胞依赖性抗原转换为T细胞依赖性抗原，产生Th1型细胞免疫，相比于普通现有的多糖疫苗，显著增强特异性抗体滴度、亲和力(硫氰酸盐测定出的亲和力指数可达到2mol/L左右，最高可达到2.17mol/L)以及持效性，且具有突出的稳定性，在37℃下储存21天，游离多糖含量未见显著增加，易于放大生产，具有较高的实际应用价值。

Description

一种细菌多糖结合疫苗及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种细菌多糖结合疫苗及其制备方法与应用。

背景技术

脑膜炎球菌是世界范围内侵袭脑膜炎的主要致病菌。脑膜炎奈瑟球菌通过鼻咽部入侵人体，在脑脊髓膜形成化脓性脑脊髓膜病变，是细菌性脑膜炎最常见的致病菌，同时也是唯一能引起流脑大规模流行的细菌。当脑膜炎奈瑟球菌进入血液循环后，流脑通常会在1-3天内迅速发病，是一种有较高发病率和死亡率的疾病。即便在感染后给予抗生素治疗，10％的病人也会死于症状发作的24-48小时；另外10％-20％的治愈者会有永久性后遗症比如神经错乱或者神经性耳聋等，对机体产生严重危害，对社会和家庭造成沉重的负担。

脑膜炎球菌有13种血清型，其中六种(A、B、C、W135、X和Y)为主要致病群，可以导致疾病传播。注射疫苗是脑膜炎球菌感染的最主要预防手段。细菌荚膜多糖是脑膜炎球菌主要的毒力因子，也是保护性疫苗的基础成分。目前上市的脑膜炎疫苗主要分为两种，多糖疫苗和多糖结合疫苗。多糖疫苗以脑膜炎荚膜多糖为主要成分，能在成人中诱导产生抗体，但对小于两周岁的婴幼儿不能诱导保护性抗体，也不能产生免疫记忆。多糖结合疫苗是多糖与载体蛋白共价结合，可将T细胞非依赖性抗原转换为T细胞依赖性抗原，能对包括婴幼儿在内的所有年龄段人群产生抗体保护，从而扩大了疫苗的使用人群。

目前，多糖结合疫苗的研究正呈快速发展趋势，但是可供选择的载体蛋白仍然十分有限，上市的载体蛋白包括破伤风类毒素(TT)，白喉类毒素(DT)，非毒性白喉突变体(CRM197)，B群流脑外膜蛋白复合物(OMP)和嗜血杆菌蛋白D，随着多糖结合疫苗种类的增多，载体的单一或者重复接种可能会产生载体诱导的表位抑制效应(CIES)、载体启动效应或者旁观者效应等，导致免疫干扰越来越多。

CN104001166B公开了一种ABC群脑膜炎球菌联合疫苗及其制备方法，其由A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖分别与B群血清型4型(CMCC29356)脑膜炎球菌外膜蛋白囊(OMV)共价结合的多糖蛋白偶联物，以及B群ST 4821基因型(xrsw341215)脑膜炎球菌外膜蛋白囊(OMV)组成。这种结合疫苗的载体较为单一，产生的免疫干扰较多。

CN106075430A公开了一种多价肺炎球菌ACYW135脑膜炎球菌联合疫苗，其中每剂量含肺炎球菌荚膜糖50～500μg/mL，A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜糖50～500μg/mL和载体蛋白，载体蛋白用于与荚膜糖共价结合。肺炎球菌的血清型为以下血清型中的一种或多种：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F或23F。疫苗的载体为肺炎球菌表面蛋白A。这种联合疫苗使用乙肝表面抗原，对于B细胞的激活能力较差，并且载体稳定性较低，亲和力较差。

CN105879020A公开了一种新式的C群脑膜炎球菌荚膜多糖结合疫苗的制备方法。将纯化的C群脑膜炎球菌荚膜多糖使用EDAC催化其与连接臂ADH共价结合，制备多糖衍生物，随后将多糖衍生物与载体蛋白白喉毒素无毒突变体CRM197在EDAC催化下共价结合，形成多糖蛋白结合物；经纯化、过滤后得到C群脑膜炎球菌荚膜多糖结合疫苗原液。这种疫苗的载体使用了白喉毒素，具有局限性，可能会产生免疫干扰作用。

目前结合疫苗的载体具有一定的局限性，因此研究新型、安全有效的疫苗载体对多糖结合疫苗的发展十分有必要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种细菌多糖结合疫苗及其制备方法与应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种细菌多糖结合疫苗，所述细菌多糖结合疫苗包括以共价键结合的乙肝核心抗原与细菌多糖。

本发明提供的细菌多糖结合疫苗，由共价结合的乙肝核心抗原(HBc)与细菌多糖组成。HBc作为一种病毒样颗粒，具有高密度的重复抗原表位同时由于其颗粒性质，尺寸为30nm左右，具有佐剂的效应，是T细胞依赖和T细胞非依赖性抗原，容易被抗原呈递细胞摄取、处理加工和呈递，进而激发机体有效的细胞和体液免疫。此外，由于HBc的多聚亚基之间有很多二硫键，使其具有相比现有载体蛋白更高的稳定性，因此将HBc作为载体制备出的多糖结合疫苗具有更好的稳定性。

本发明提供的细菌多糖结合疫苗不仅具有佐剂效应，能有效激起T细胞依赖和T细胞非依赖性抗原，容易被抗原呈递细胞摄取、处理加工和呈递，进而激发机体有效的细胞和体液免疫，还具有颗粒结构稳定、储存时间长的优点；本发明制备出的细菌多糖结合疫苗可将细菌多糖非T细胞依赖性抗原转换为T细胞依赖性抗原，产生Th1型细胞免疫，相比于普通现有的多糖疫苗，显著增强特异性抗体滴度、亲和力(硫氰酸盐测定出的亲和力指数可达到2mol/L左右，最高可达到2.17mol/L)以及持效性，且在37℃下储存21天依然较稳定。

优选地，所述细菌多糖包括脑脊髓膜炎奈瑟氏球菌血清组A群的荚膜多糖、B群的荚膜多糖、C群的荚膜多糖、W135群的荚膜多糖或Y群的荚膜多糖中的任意一种或至少两种的组合，其中典型但非限制性组合包括：A群的荚膜多糖与B群的荚膜多糖的组合；A群的荚膜多糖与C群的荚膜多糖组合；A群的荚膜多糖、B群的荚膜多糖、C群的荚膜多糖和W135群的荚膜多糖的组合；B群的荚膜多糖、C群的荚膜多糖和Y群的荚膜多糖的组合。优选为使用单独的荚膜多糖。

在本发明中，细菌多糖不限于上述所列举的类型，其他可与乙肝核心抗原载体结合的细菌多糖均可用于本发明提供的结合疫苗中。例如可以是b型流感嗜血杆菌多糖，肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F，伤寒沙门氏菌Vi型多糖，副伤寒沙门菌甲型或副伤寒沙门菌乙型等等。

在本发明中，乙肝核心抗原可以是天然乙肝核心抗原，也可以是重组表达的乙肝核心抗原。

乙肝核心抗原为乙肝病毒核壳结构的蛋白，相比于乙肝表面抗原，乙肝核心抗原能够显著激活B细胞免疫应答，且本身具有很强的T细胞依赖及非T细胞依赖免疫应答，能更有效的产生免疫保护。

优选地，所述细菌多糖与乙肝核心抗原的质量比为1:(0.1-5)，例如可以是1:0.1、1:1、1:2、1:3、1:4或1:5，优选为1:1。其中，在计算质量比时，乙肝核心抗原以未进行衍生化之前的质量计算。

第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的细菌多糖结合疫苗的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)将细菌多糖进行破碎与活化；

(2)将乙肝核心抗原衍生化；

(3)将活化后的细菌多糖与衍生化的乙肝核心抗原于缓冲液中混合，得到所述细菌多糖结合疫苗。

优选地，步骤(1)中所述破碎的步骤包括将细菌多糖配制为稀释液，而后进行超声破碎得到破碎后的细菌多糖破碎液。

优选地，所述稀释液为使用氯化钠与磷酸钠缓冲液进行稀释得到的含有细菌多糖的溶液。

在本发明中，将细菌多糖采用含有氯化钠的磷酸钠缓冲液进行稀释，一般稀释到多糖终浓度为2mg/mL左右为止。

优选地，所述氯化钠的浓度为0.1-0.3mol/L，例如可以是0.1mol/L、0.15mol/L、0.2mol/L、0.25mol/L或0.3mol/L等。

优选地，所述磷酸钠缓冲液的浓度为10-30mmol/L，例如可以是10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L或30mmol/L等。

优选地，所述稀释液的pH值为7-7.5，例如可以是7、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5。

优选地，所述超声破碎的方法为：将探头伸入液面下1cm，开2s，停2s，超声0-30min。

优选地，步骤(1)中所述活化的方法包括：将破碎后的细菌多糖破碎液与活化剂在溶液中混合反应，同时使用氢氧化钠调节溶液pH值。

在本发明中，进行活化反应的同时，需要不断加入氢氧化钠调节溶液的pH值，使得反应体系的pH值趋于稳定。

优选地，所述活化剂包括溴化氰、1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯、碳二亚胺、3-(2-吡啶基二硫基)丙酸或N-羟基琥珀酰亚胺酯中的任意一种，优选为溴化氰。

优选地，所述活化剂与细菌多糖的质量比为1:(1-5)，例如可以是1:1、1:2、1:3、1:4或1:5，优选为1:2。

优选地，使用氢氧化钠调节溶液pH值的范围为10.3-10.7，例如可以是10.3、10.4、10.5、10.6或10.7。

优选地，所述混合反应的时间为20-50min，例如可以是20min、25min、30min、35min、40min、45min或50min。

在本发明中，细菌多糖活化结束后，使用0.1M的盐酸进行调节pH，使得pH值为8.5，而后终止反应。

优选地，步骤(2)中所述乙肝核心抗原衍生化的方法包括：将乙肝核心抗原首先与2-亚氨基硫烷进行活化反应，而后与双功能交联剂进行交联反应得到衍生化的乙肝核心抗原。

在本发明中，步骤(2)中第一步活化反应之后，采用脱盐柱除去未反应的2-亚氨基硫烷，然后再进行交联反应，而交联反应后，用超滤管除去未反应的双功能交联剂。

优选地，所述乙肝核心抗原单体与2-亚氨基硫烷的摩尔比为1:(2400-240000)，例如可以是1:2400、1:20000、1:100000、1:150000、1:180000、1:200000或1:240000，优选为1:72000。

在本发明中，当乙肝核心抗原单体与2-亚氨基硫烷的摩尔比在上述范围内反应时，反应所需的时间更短，巯基化程度高。

优选地，步骤(2)中所述活化反应的时间为1-12h，例如可以是1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h或12h等。

优选地，步骤(2)中所述活化反应的时间为4-25℃，例如可以是4℃、8℃、10℃、12℃、13℃、15℃、18℃、20℃、22℃或25℃等。

优选地，所述双功能交联剂包括己二酰肼、聚乙二醇、己二胺或己二醇中的任意一种，优选为聚乙二醇。

在本发明中，双功能交联剂中间链段为可替换的结构单体，如聚乙二醇、己二酰肼等，两端分别修饰有马来酰亚胺与氨基。示例性的，其可以具有如下结构(中间链段的结构单体以聚乙二醇为例，其中n的取值可以为1-1000)：

优选地，所述乙肝核心抗原与双功能交联剂的摩尔比为1:(500-2000)，例如可以是1:500、1:800、1:1000、1:1500、1:1800或1:2000，优选为1:1200。

优选地，所述聚乙二醇的包括PEG2000、PEG5000或PEG10000中的任意一种，优选为PEG10000。

优选地，所述交联反应的时间为4-24小时，例如可以是4小时、8小时、10小时、12小时、14小时、15小时、16小时、20小时、22小时或24小时等。

优选地，所述交联反应的温度为0-40℃，例如可以是0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃等。

在本发明中，如果反应的温度为室温的情况下，反应一般控制在4-12小时之间；如果反应在低温情况下进行，例如在4℃下进行，反应时间稍延长，一般控制在6-24小时之间内。

优选地，步骤(3)中所述缓冲液为磷酸钠缓冲液。

优选地，步骤(3)中所述缓冲液的浓度为10-40mmol/L，例如可以是10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、30mmol/L、35mmol/L或40mmol/L。

优选地，步骤(3)中所述缓冲液的pH值为5.5-9.5，例如可以是5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5，优选为7.2。

在本发明中，控制缓冲液在上述pH值范围内，在接近中性的pH条件下，最大程度地保证多糖、蛋白的结构以及反应基团结构稳定。减少裂解及水解等现象。同时对于在后期应用于注射剂时，其pH值也需要在4-9之间，这样可以减少反应结束后pH调节，减少机体刺激性。

在本发明中，步骤(3)混合反应时，多糖和乙肝核心抗原的浓度最终控制在1:1进行反应，并且一般在旋转混匀的条件下进行。

优选地，步骤(3)中所述混合的时间为40-50h例如可以是40h、41h、42h、43h、44h、45h、46h、47h、48h、49h或50h。

优选地，步骤(3)中制备得到细菌多糖结合疫苗后，还包括通过层析的方法进行分离纯化。

优选地，所述层析为凝胶过滤层析。

优选地，所述凝胶过滤层析的洗脱流速为2mL/min。

示例性的，具体的凝胶过滤层析方法包括如下步骤：选用Sephacryl S-500HR(1.6×70cm)凝胶层析柱，平衡洗脱缓冲液均用含0.15M的NaCl的20mM磷酸盐缓冲液，先用缓冲液平衡凝胶柱至基线平稳，将待纯化样品上样5mL，上样及洗脱流速均为2mL/min，检测波长在214nm及280nm，根据层析图谱收集制备的多糖结合疫苗。

第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的细菌多糖结合疫苗在制备免疫组合物中的应用。

本发明提供的细菌多糖结合疫苗在制备免疫组合物时，可与辅剂进行混合搭配使用，例如可以包括氢氧化铝、硫酸铝、甲酰基甲硫氨酰肽、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂等等；本发明的免疫组合物可制成液体制剂(例如等渗溶液、混悬液)、固体制剂(片剂、胶囊)等等剂型。

本发明的免疫组合物一般优选地制成液体制剂，其给药途径为肌肉或皮下注射给药，可通过直接注射给药或者通过递送装置给药。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的细菌多糖结合疫苗，由共价结合的乙肝核心抗原(HBc)与细菌多糖组成。乙肝核心抗原(HBc)作为一种病毒样颗粒，具有高密度的重复抗原表位同时由于其颗粒性质，尺寸为30nm左右，具有佐剂的效应，是T细胞依赖和T细胞非依赖性抗原，容易被抗原呈递细胞摄取、处理加工和呈递，进而激发机体有效的细胞和体液免疫。此外，由于HBc的多聚亚基之间有很多二硫键，使其具有相比现有载体蛋白更高的稳定性，因此将HBc作为载体制备出的多糖结合疫苗具有更好的稳定性。

本发明提供的细菌多糖结合疫苗不仅具有佐剂效应，能有效激起T细胞依赖和T细胞非依赖性抗原，容易被抗原呈递细胞摄取、处理加工和呈递，进而激发机体有效的细胞和体液免疫，还具有颗粒结构稳定、储存时间长的优点；本发明制备出的细菌多糖结合疫苗可将细菌多糖非T细胞依赖性抗原转换为T细胞依赖性抗原，产生Th1型细胞免疫，相比于普通现有的多糖疫苗，显著增强特异性抗体滴度、亲和力(硫氰酸盐测定出的亲和力指数可达到2mol/L左右，最高可达到2.17mol/L)以及持效性，且具有突出的稳定性，在37℃下储存21天，游离多糖含量未发生明显增加，易于放大生产，具有较高的实际应用价值。

附图说明

图1是本发明实施例1制备过程中凝胶过滤层析纯化多糖结合疫苗的图谱。

图2是本发明实施例2中多角度激光散射分析多糖结合疫苗分子量曲线图。

图3A是本发明实施例3中不同组疫苗产生的多糖特异性IgG抗体滴度图。

图3B是本发明实施例3中不同组疫苗产生的多糖特异性IgG1抗体滴度图。

图3C是本发明实施例3中不同组疫苗产生的多糖特异性IgG2a抗体滴度图。

图3D是本发明实施例3中不同组疫苗产生的多糖特异性IgG2a/IgG1抗体滴度比值图。

图4是本发明实施例3中不同组疫苗产生的多糖特异性抗体的亲和力测试图。

图5是本发明实施例3中多糖结合疫苗产生的多糖特异性抗体的免疫持效性时间曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

1.细菌多糖破碎：

脑膜炎荚膜多糖(CPS)的原多糖分子量大，粘度大，容易产生大分子交联而降低稳定性。本发明采用超声波将多糖破碎成分子量均匀的多糖。在超声波中，多糖产生快速的机械运动，分子在介质中随着波动的高速振动及剪切力作用降解成更小分子，且对多糖结构单元无影响。具体方法和步骤如下：

(1)称取一定量的C群脑膜炎球菌荚膜多糖(CPS)，采用含0.15mol/L氯化钠的pH＝7.2的20mmol/L磷酸钠缓冲液稀释，使多糖终浓度为2mg/mLl；

(2)采用3号探头进行超声破碎，将探头伸入液面1cm，功率20％，开2s，停2s，超声0-30min；

(3)采用多角度光散射仪结合高效液相色谱对破碎后多糖分子量进行检测。超声30min时，多糖出峰时间明显推后，分子量显著减小，测得多糖分子质量为100kDa左右，获得下一步进行活化的细菌多糖。

2.细菌多糖活化：

(1)取荚膜多糖破碎液4mL，缓慢加入30μL的50％w/v溶于氯仿的CNBr溶液，使其与多糖的质量比为1:2；

(2)在反应过程中检测pH值的变化，同时不断加入0.1mmol/L NaOH以使pH稳定在10.3-10.7之间，室温反应约30min后，反应体系的pH趋于稳定；

(3)活化结束后，加入0.1M盐酸调节pH为8.5，终止反应。

3.乙肝核心抗原衍生化；

取0.4mg/mL HBc，按等体积加入特定浓度的2-亚氨基硫烷盐酸盐试剂，使2-亚氨基硫烷盐酸盐试剂的终浓度为1-5mmol/L，HBc的终浓度为0.2mg/mL，4-25℃反应0-12h，活化结束后，用GE公司的HiPrepTm26/10预装脱盐柱除去未反应的2-亚氨基硫烷盐酸盐。同时通过Bradford法及Ellman's试剂对抗原蛋白浓度及巯基化程度进行测定。具体测试结果如表1所示：

表1

考虑到巯基化程度以及时间，当2-亚氨基硫烷盐酸盐浓度为3mmol/L，在25℃下反应3h时，巯基化浓度为0.106μmol/mg的HBc，为最优选。

紧接着，在活化后的HBc中加入一端为马来酰亚胺基团、一端为氨基的双功能聚乙二醇作为交联剂，采用3中分子量分别为PEG2000，PEG5000，PEG10000，进行交联，使其浓度为0.05mmol/L，即乙肝核心抗原:双功能交联剂的摩尔比为1：1200，4℃反应过夜；用截留分子量为100kDa的超滤管(密理博公司)在5000×g下离心换液，除去未反应小分子。

4.细菌多糖结合疫苗的制备

将活化后的荚膜多糖与巯基化的HBc等质量混合均匀，用20mmol/L磷酸钠缓冲液(pH＝7.2)进行稀释，使终浓度为蛋白0.5mg/mL，多糖0.5mg/mL，质量比1:1，在4℃下旋转混匀反应48h。反应结束后，获得多糖结合疫苗产物。

5.细菌多糖结合疫苗的纯化

将步骤4制备出的多糖结合疫苗反应液通过凝胶过滤层析进行分离纯化，选用Sephacryl S-500HR(1.6×70cm)凝胶层析柱，平衡洗脱缓冲液均用含0.15M的NaCl的20mM磷酸盐缓冲液，先用缓冲液平衡凝胶柱至基线平稳，上样5mL，上样及洗脱流速均为2mL/min，检测波长在214nm及280nm。

偶联产物由于体积显著增大，将最早流出，根据出峰图谱图1所示，峰1为含有多糖结合疫苗抗原的吸收峰，收集该峰。使用截留分子量为50kDa的浓缩管对流出峰浓缩，然后使用间苯二酚及Bradford法分别测定其中多糖蛋白含量。测得CPS-P2k-HBc、CPS-P5k-HBc及CPS-P10k-HBc的多糖蛋白质量比分别为0.62、0.43、0.54。

在本发明中，CPS-P2k-HBc代表的含义为细菌多糖、PEG2000和乙肝核心抗原的组别，其他组别均用此方法表示。

实施例2

细菌多糖结合疫苗的性质表征

通过多角度激光散射测定多糖结合疫苗的分子量。HBc病毒样颗粒的dn/dc值为0.185mL/g，多糖的dn/dc值为0.171mL/g，未结合的HBc及CPS分子量通过多角度激光散射分析分别为6.64×103kDa及1.08×102kDa。与未结合多糖蛋白相比，三种结合疫苗保留时间明显降低，表明多糖蛋白偶联成功。为了计算三种结合疫苗的分子量，三种结合疫苗的折光指数增量dn/dc通过以下公式I进行计算。

公式中R代表多糖蛋白比。通过考马斯亮蓝以及脱氧胆酸沉淀法测定结合疫苗中蛋白及多糖含量，对于分别用PEG2000、PEG5000、PEG10000连接的三种结合疫苗，R值分别为0.62、0.43以及0.54，因此三种结合疫苗的dn/dc值分别为0.180mL/g，0.181mL/g，0.180mL/g。采用dn/dc值以及

软件，在相同条件下，计算得到连接了不同PEG链的三种结合疫苗的分子质量分别为1.01×104kDa，9.11×103kDa，1.04×104kDa，进一步验证了结合疫苗分子质量增大(具体结果如图2所示)。

实施例3

细菌多糖的免疫效果测试

选取36只BALB/c小鼠，18-22克，雌性，随机分为5组，每组6只。共进行6组实验：纯糖组(CPS组)，CPS和HBc物理混合组(CPS+HBc组)，CPS-P2k-HBc组，CPS-P5k-HBc组，CPS-P10k-HBc组。所有组别均进行皮下注射，每只每次注射含2.5μg多糖的疫苗，每周注射一次，共注射3次。第三次注射一周后断尾取血。

(1)首先对不同组别疫苗的免疫原性进行检测

用ELISA法检测小鼠血清中抗荚膜多糖的IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度，以及多糖特异性IgG2a/IgG1抗体滴度比值。测试结果如图3A、图3B、图3C和图3D所示，本发明制备的多糖结合疫苗相比多糖疫苗的抗体滴度显著提高。CPS-P2k-HBc、CPS-P5k-HBc及CPS-P10k-HBc IgG抗体滴度分别为纯糖组IgG抗体滴度的12.8、10.4及12.8倍。IgG1抗体滴度在三次免疫后抗体滴度未发生明显变化。比较而言，IgG2a抗体滴度变化最为明显，第一针免疫后结合疫苗与多糖组无明显差别，第二次免疫后三种结合疫苗抗体滴度均明显增加，并且随着PEG链长度增加，抗体滴度差异也逐渐增大，在三针后第21天，三种结合疫苗多糖特异性抗体滴度显著高于纯糖组，分别为纯糖IgG2a抗体滴度的32、29.7及34.3倍。这说明多糖特异性免疫可以通过连接乙肝核心抗原病毒样颗粒增强，并且主要是增强多糖特异性IgGa抗体滴度来实现。如图3D所示，物理混合组与结合疫苗组IgG2a/IgG1比值均升高，这说明三次免疫后，Th1型亚群功能升高，逐渐偏向于Th1型细胞免疫。通过比较几组疫苗的IgG2a/IgG1比值，表明多糖疫苗主要产生Th2型体液免疫应答，而本发明制备的多糖结合疫苗能显著增强多糖特异性IgG2a抗体滴度，更倾向于产生Th1型免疫应答。

用竞争性ELISA法检测小鼠中抗脑膜炎多糖的IgG抗体水平。随着脑膜炎多糖加入量的增加，如图4所示，多糖特异性抗体结合固定多糖的能力逐渐减弱，当加入的多糖达到15μg时，抗体结合多糖能力基本丧失，表明通过免疫制备的3种多糖结合疫苗，小鼠产生了针对多糖的特异性抗体。

采用硫氰酸盐测定多糖的抗体亲和力。纯糖组的多糖特异性抗体指数为1.39mol/L，而CPS-P2k-HBc、CPS-P5k-HBc以及CPS-P10k-HBc组的抗体亲和力指数分别为1.93mol/L，2.17mol/L和1.93mol/L，这表明本方法制备的多糖结合疫苗能够显著性地提高多糖抗体的亲和力。

进一步对多糖特异性抗体的免疫持效性进行检测。

通过测定三针免疫18周内多糖特异性抗体滴度，来研究多糖特异性抗体的免疫持效性。如图5所示，CPS组、CPS与HBc物理混合组产生的多糖特异性IgG滴度均较低，而结合疫苗组在第四周免疫水平达到最高，同时抗体滴度水平缓慢下降，相对于纯糖组抗体滴度持续时间更长，在18周时，仍然分别保持最高抗体滴度的33.3％，17.9％，38.1％。

以上结果表明本方法制备的多糖结合疫苗能够刺激产生Th1型免疫应答，产生具有更高亲和力且更多的特异性抗体，特异性抗体持效性好。此外，本发明制备的多糖结合疫苗相比HBc与CPS物理混合的疫苗，同样具有以上显著优势，表明制备所得多糖结合疫苗免疫效果的提高不仅与HBc的使用有关，也与其化学结合以及结合的方式有关。

实施例4

多糖结合疫苗的稳定性测试

将CPS-P2k-HBc、CPS-P5k-HBc以及CPS-P10k-HBc组疫苗置于37℃下存放分别放置0、7、14、21天，检测游离多糖含量，以及多糖蛋白比。具体测试数据如表2所示：

表2

对于多糖结合疫苗而言，热稳定性是评价的一个重要指标，通过设计实验获得原料药在各种环境因素的影响下随时间变化的规律，据此为药品的处方、包装、贮藏条件和有效期提供支撑性信息。根据表2中结果显示，在37℃的储存条件下保存三周，3种多糖结合疫苗均稳定性较好，游离多糖含量并未明显增加，能够初步表明多糖结合疫苗热稳定性良好。稳定性好的疫苗，在适宜的保存条件下，有效期更长，可以保证质量，提高企业经济效益。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的细菌多糖结合疫苗及其制备方法与应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (9)

1.一种细菌多糖结合疫苗，其特征在于，所述细菌多糖结合疫苗包括以共价键结合的乙肝核心抗原与细菌多糖；

所述细菌多糖包括脑脊髓膜炎奈瑟氏球菌血清组A群的荚膜多糖、B群的荚膜多糖、C群的荚膜多糖、W135群的荚膜多糖或Y群的荚膜多糖中的任意一种或至少两种的组合；

所述细菌多糖与乙肝核心抗原的质量比为1:(0.1-5)；

所述细菌多糖结合疫苗的制备方法包括以下步骤：

(1)将细菌多糖进行破碎与活化；

(2)将乙肝核心抗原衍生化；

(3)将活化后的细菌多糖与衍生化的乙肝核心抗原于缓冲液中混合，得到所述细菌多糖结合疫苗；

步骤(1)中所述破碎的步骤包括将细菌多糖配制为稀释液，而后进行超声破碎得到破碎后的细菌多糖破碎液；所述稀释液为使用氯化钠与磷酸钠缓冲液进行稀释得到的含有细菌多糖的溶液，所述氯化钠的浓度为0.1-0.3mol/L，所述磷酸钠缓冲液的浓度为10-30mmol/L，所述稀释液的pH值为7-7.5；

步骤(1)中所述活化的方法包括：将破碎后的细菌多糖破碎液与活化剂在溶液中混合反应，同时使用氢氧化钠调节溶液pH值；所述活化剂包括溴化氰、1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯、碳二亚胺、3-(2-吡啶基二硫基)丙酸或N-羟基琥珀酰亚胺酯中的任意一种；所述活化剂与细菌多糖的质量比为1:(1-5)；使用氢氧化钠调节溶液pH值的范围为10.3-10.7；所述混合反应的时间为20-50min；

步骤(2)中所述乙肝核心抗原衍生化的方法包括：将乙肝核心抗原首先与2-亚氨基硫烷进行活化反应，而后与双功能交联剂进行交联反应得到衍生化的乙肝核心抗原；

所述乙肝核心抗原单体与2-亚氨基硫烷的摩尔比为1:(2400-240000)，所述活化反应的时间为1-12h，所述活化反应的温度为4-25℃；

所述双功能交联剂包括己二酰肼、聚乙二醇、己二胺或己二醇中的任意一种，所述乙肝核心抗原与双功能交联剂的摩尔比为1:(500-2000)，所述交联反应的时间为4-24小时，所述交联反应的温度为0-40℃；

步骤(3)中所述缓冲液为磷酸钠缓冲液，所述缓冲液的浓度为10-40mmol/L，所述缓冲液的pH值为5.5-9.5；

步骤(3)中所述混合的时间为40-50h。

2.根据权利要求1所述的细菌多糖结合疫苗，其特征在于，所述细菌多糖与乙肝核心抗原的质量比为1:1。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的细菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)将细菌多糖进行破碎与活化；

(2)将乙肝核心抗原衍生化；

(3)将活化后的细菌多糖与衍生化的乙肝核心抗原于缓冲液中混合，得到所述细菌多糖结合疫苗；

步骤(1)中所述破碎的步骤包括将细菌多糖配制为稀释液，而后进行超声破碎得到破碎后的细菌多糖破碎液；所述稀释液为使用氯化钠与磷酸钠缓冲液进行稀释得到的含有细菌多糖的溶液，所述氯化钠的浓度为0.1-0.3mol/L，所述磷酸钠缓冲液的浓度为10-30mmol/L，所述稀释液的pH值为7-7.5；

步骤(1)中所述活化的方法包括：将破碎后的细菌多糖破碎液与活化剂在溶液中混合反应，同时使用氢氧化钠调节溶液pH值；所述活化剂包括溴化氰、1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯、碳二亚胺、3-(2-吡啶基二硫基)丙酸或N-羟基琥珀酰亚胺酯中的任意一种；所述活化剂与细菌多糖的质量比为1:(1-5)；使用氢氧化钠调节溶液pH值的范围为10.3-10.7；所述混合反应的时间为20-50min；

步骤(2)中所述乙肝核心抗原衍生化的方法包括：将乙肝核心抗原首先与2-亚氨基硫烷进行活化反应，而后与双功能交联剂进行交联反应得到衍生化的乙肝核心抗原；

所述乙肝核心抗原单体与2-亚氨基硫烷的摩尔比为1:(2400-240000)，所述活化反应的时间为1-12h，所述活化反应的温度为4-25℃；

所述双功能交联剂包括己二酰肼、聚乙二醇、己二胺或己二醇中的任意一种，所述乙肝核心抗原与双功能交联剂的摩尔比为1:(500-2000)，所述聚乙二醇包括PEG2000、PEG5000或PEG10000中的任意一种，所述交联反应的时间为4-24小时，所述交联反应的温度为0-40℃；

步骤(3)中所述缓冲液为磷酸钠缓冲液，所述缓冲液的浓度为10-40mmol/L，所述缓冲液的pH值为5.5-9.5；

步骤(3)中所述混合的时间为40-50h。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述活化剂为溴化氰，所述活化剂与细菌多糖的质量比为1:2；

所述超声破碎的方法为：将探头伸入液面下1cm，开2s，停2s，超声0-30min。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述乙肝核心抗原单体与2-亚氨基硫烷的摩尔比为1:72000；

所述双功能交联剂为聚乙二醇，所述聚乙二醇为PEG10000；

所述乙肝核心抗原与双功能交联剂的摩尔比为1:1200。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述缓冲液的pH值为7.2。

7.根据权利要求3-6中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中制备得到细菌多糖结合疫苗后，还包括通过层析的方法进行分离纯化。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述层析为凝胶过滤层析，所述凝胶过滤层析的洗脱流速为2mL/min。

9.根据权利要求1-2中任一项所述的细菌多糖结合疫苗在制备免疫组合物中的应用。

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