JP2020533439A - 肺炎球菌多糖体および免疫原性多糖体−キャリアタンパク質コンジュゲートでのその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＮＭＲを使用して同定されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の莢膜多糖体を提供する。本発明はさらに、これらの血清型のうちの１つ以上に由来する莢膜多糖体がＣＲＭ１９７のようなキャリアタンパク質にコンジュゲートされている多糖体−タンパク質コンジュゲートを提供する。これらの血清型のうちの１つ以上に由来する多糖体−タンパク質コンジュゲートは、複数の追加のストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖体を有する多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンに含まれてもよい。【選択図】図1Ａ

Description

本発明は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２４Ｆ由来の精製された莢膜多糖体、およびこの血清型由来の多糖体を有する多糖体−タンパク質コンジュゲートを提供する。この血清型由来の多糖体−タンパク質コンジュゲートは、多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンに含まれ得る。

被包性細菌の一例であるストレプトコッカス・ニューモニエは、世界的に見て、重篤な疾患の重大な原因である。１９９７年、疾病管理予防センター（ＣＤＣ）は、米国では、毎年３，０００例の肺炎球菌性髄膜炎、５０，０００例の肺炎球菌性菌血症、７，０００，０００例の肺炎球菌性中耳炎および５００，０００例の肺炎球菌性肺炎が発生していると推定した。Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ Ｍｏｒｔａｌ Ｗｋｌｙ Ｒｅｐ １９９７，４６（ＲＲ−８）：１−１３を参照されたい。さらに、これらの疾患の合併症は重大となり得、いくつかの試験では、肺炎球菌性髄膜炎による死亡率は最大８％および神経学的後遺症発生率は２５％と報告されている。Ａｒｄｉｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ １０２：１０８７−９７を参照されたい。

長年にわたって認可されてきた多価肺炎球菌多糖体ワクチンは、成人、特に高齢者および高リスク者の肺炎球菌疾患を予防する点で極めて有益であることが証明されている。しかし、乳児および幼児では非コンジュゲート肺炎球菌多糖体に対する応答が不良である。細菌多糖体はＴ細胞非依存性免疫原であり、乳児では弱い応答を誘発するか応答がない。キャリアタンパク質への細菌多糖体免疫原の化学的コンジュゲーションは、乳児の免疫応答をＴ細胞依存性の応答に変化させる。ジフテリアトキソイド（ＤＴの化学的解毒版であるＤＴｘ）およびＣＲＭ１９７は、それらのアミノ酸配列にＴ細胞刺激エピトープが存在するため、細菌多糖体免疫原のためのキャリアタンパク質として記載されている。

肺炎球菌コンジュゲートワクチンＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）は、当時幼児および乳児に侵襲性肺炎球菌疾患を引き起こしていた最も高頻度に単離された７つの血清型（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ）を含有しており、２０００年２月に米国で初めて認可された。米国でのＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）の普遍的な使用に続いて、Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）に存在する血清型により、小児の侵襲性肺炎球菌疾患が大幅に減少した。Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ Ｍｏｒｔａｌ Ｗｋｌｙ Ｒｅｐ ２００５，５４（３６）：８９３−７を参照されたい。ただし、世界の特定の地域ではＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）による血清型適用範囲には限界があり、米国では特定の血清型（例えば、１９Ａなど）が新たに出現していることを示すいくつかの証拠がある。Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ａｍ Ｊ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ １５９：６３４−４４；Ｗｈｉｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４８：１７３７−４６；Ｋｙａｗ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５４：１４５５−６３；Ｈｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １９６：１３４６−５４；Ｔｒａｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ４８：Ｓ１８１−Ｓ１８９を参照されたい。

Ｐｒｅｖｎａｒ１３（登録商標）は、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆを含む１３価肺炎球菌多糖体−タンパク質コンジュゲートワクチンである。例えば、米国特許出願公開番号２００６／０２２８３８０Ａ１、Ｐｒｙｍｕｌａ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｌａｎｃｅｔ ３６７：７４０−４８、および２００８年１０月２５〜２８日にワシントンＤＣでの４８^ｔｈ Ａｎｎｕａｌ ＩＣＡＡＣ／ＩＳＤＡ ４６^ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇで発表されたＫｉｅｎｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ｎｏｎ−ｉｎｆｅｒｉｏｒｉｔｙ ｏｆ １３−ｖａｌｅｎｔ Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ７−ｖａｌｅｎｔ Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｇｉｖｅｎ ａｓ ａ ４−Ｄｏｓｅ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｉｎｆａｎｔｓ ａｎｄ Ｔｏｄｄｌｅｒｓを参照されたい。また、Ｄａｇａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．６６：２０９３−２０９８ ａｎｄ Ｆａｔｔｏｍ，１９９９，Ｖａｃｃｉｎｅ １７：１２６を参照されたい。

Ｓ．ニューモニエは、莢膜多糖体の構造に基づいて９０超の血清型に分類されている。既知の肺炎球菌莢膜多糖体構造の一覧は、Ｇｅｎｏ，２０１５，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２８：８７１−８９９に記載されている。

現在の多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンは、ワクチン中に存在する血清型に関連する肺炎球菌疾患の発生率を低下させるのに効果的である。しかし、ワクチン中に存在しない血清型を発現する肺炎球菌の有病率は増加している。したがって、今後のワクチンに含めるために、新たに出現した肺炎球菌血清型を同定および特性評価する必要がある。

米国特許出願公開番号２００６／０２２８３８０Ａ１

Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ Ｍｏｒｔａｌ Ｗｋｌｙ Ｒｅｐ １９９７，４６（ＲＲ−８）：１−１３ Ａｒｄｉｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ １０２：１０８７−９７ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ Ｍｏｒｔａｌ Ｗｋｌｙ Ｒｅｐ ２００５，５４（３６）：８９３−７ Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ａｍ Ｊ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ １５９：６３４−４４ Ｗｈｉｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４８：１７３７−４６ Ｋｙａｗ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５４：１４５５−６３ Ｈｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １９６：１３４６−５４ Ｔｒａｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ４８：Ｓ１８１−Ｓ１８９ Ｐｒｙｍｕｌａ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｌａｎｃｅｔ ３６７：７４０−４８ Ｋｉｅｎｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ｎｏｎ−ｉｎｆｅｒｉｏｒｉｔｙ ｏｆ １３−ｖａｌｅｎｔ Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ７−ｖａｌｅｎｔ Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｇｉｖｅｎ ａｓ ａ ４−Ｄｏｓｅ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｉｎｆａｎｔｓ ａｎｄ Ｔｏｄｄｌｅｒｓ Ｄａｇａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．６６：２０９３−２０９８ ａｎｄ Ｆａｔｔｏｍ，１９９９，Ｖａｃｃｉｎｅ １７：１２６ Ｇｅｎｏ，２０１５，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２８：８７１−８９９

本発明は、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２４Ｆ由来の精製された莢膜多糖体、およびこの血清型を有する多糖体タンパク質コンジュゲートを提供する。本発明は、この血清型由来の莢膜多糖体の構造的同定に部分的に基づく。

したがって、一実施形態では、本発明は、以下の繰り返し単位を有する多糖体を提供する：

ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２４Ｆ由来の多糖体は、以下によって表すことができ、
式中、ｎは繰り返し単位の数を表す。

特定の実施形態では、多糖体は５〜５０００の繰り返し単位を有する。特定の態様では、多糖体は、１０〜３，０００、２０〜２，０００、５０〜１，５００または１００〜１，０００の繰り返し単位を有する。

特定の実施形態では、多糖体は、５ｋＤａ〜５，０００ｋＤａの分子量を有する。特定の態様では、多糖体は、１０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜１，５００ｋＤａまたは１００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの分子量を有する。

本発明はさらに、上記実施形態のいずれかから生成される活性化多糖体を提供し、ここで、多糖体は、化学試薬によって活性化されて、リンカーまたはキャリアタンパク質へのコンジュゲーションのための反応基を生成する。特定の実施形態では、活性化はアラビニトール−１−ＰＯ_４で起こる。特定の実施形態では、多糖体は、過ヨウ素酸塩によって活性化される。この実施形態の特定の態様では、活性化はアラビニトール−１−ＰＯ_４の炭素２位で起こる。

本発明はさらに、上記で提供される多糖体または活性化多糖体がキャリアタンパク質にコンジュゲートされている多糖体−タンパク質コンジュゲートを提供する。特定の態様では、キャリアタンパク質は、ＣＲＭ１９７、ジフテリア毒素フラグメントＢ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢ Ｃ８、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴのフラグメントＣ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＴ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＴ、およびシュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の外毒素Ａから選択される。特定の一態様では、キャリアタンパク質はＣＲＭ１９７である。

特定の態様では、多糖体−タンパク質コンジュゲートは、水性条件下、またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような非プロトン性溶媒中で還元的アミノ化化学を使用して調製される。特定の態様では、多糖体−タンパク質コンジュゲートは、ＤＭＳＯ中の還元的アミノ化化学を使用して調製される。

一実施形態では、本発明は、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２４Ｆ由来の非コンジュゲート多糖体または多糖体−タンパク質コンジュゲートと、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｂ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８のうちの１つ以上に由来する非コンジュゲート多糖体または多糖体−タンパク質コンジュゲートとを含む多価免疫原性組成物を提供する。１つの下位実施形態では、多価免疫原性組成物は、非コンジュゲート多糖体または多糖体−キャリアタンパク質コンジュゲートを含むが、両方は含まない。１つの下位実施形態では、多価免疫原性組成物は、非コンジュゲート多糖体または多糖体−キャリアタンパク質コンジュゲートの混合物を含む。特定の下位実施形態では、本発明の多価免疫原性組成物は、最大４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５または９０までの血清型を有する。

Ｓ．ニューモニエ血清型２４Ｆ多糖体の繰り返し単位構造の画像表示を示す。 過ヨウ素酸塩活性化Ｓ．ニューモニエ血清型２４Ｆ繰り返し構造の画像表示を示す。図１Ｂに示す構造は、主要な活性化部位（活性化された糖として）を示すものであることに留意されたい。多糖鎖内では、図１Ｂに示すようにあらゆる繰り返し単位が活性化される必要はない。 ５０℃のＤ_２Ｏ中のＳ．ニューモニエ血清型２４Ｆ由来の莢膜多糖体の６００ＭＨｚ １次元１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。内部標準（ＤＭＳＯおよびＤＳＳ−ｄ６）、残留水（ＨＯＤ）、および精製プロセス由来の他の残留成分（エタノール（ＥｔＯＨ）、イソプロパノール（ＩＰＡ）およびアセテート）から生じるシグナルを示す。＊により標識された軽微なシグナルは、Ｃ−多糖体および／またはペプチドグリカンのようなＳ．ニューモニエ細胞壁残留物によるものである。 Ｓ．ニューモニエ血清型２４Ｆの血清型同定に使用された１次元（１Ｄ）^１Ｈ ＮＭＲ同一性領域を示す。各単糖残基からの繰り返し単位の各アノマープロトンのシグナル位置を示す。 繰り返し構造の糖残基間の共有結合を確立する、Ｓ．ニューモニエ血清型２４Ｆの部分的な２次元（２Ｄ）^１Ｈ−^１３Ｃ多重結合相関ＮＭＲスペクトルを示す。図中ではグリコシド結合を確立する相関が表示されている。 Ｓ．ニューモニエ血清型２４Ｆの莢膜多糖体繰り返し単位内のホスホジエステル結合の確立を示す。 上部スペクトル；３．８６ｐｐｍのシグナルに対する単一相関を示す、５．１９ｐｐｍのピークを中心とした励起を示す、活性化された血清型２４Ｆ多糖体の１Ｄ ＴＯＣＳＹである。下部スペクトルは、血清型２４Ｆの標準的な１Ｄプロトンスペクトルであり、５．１９ｐｐｍのトリプレットを同定する。 上部スペクトルは、活性化された血清型２４Ｆ多糖体の１Ｄ ＴＯＣＳＹを示し、励起は５．１９ｐｐｍのシグナルを中心としている。下部の図は、多重度編集ｇＨＳＱＣＡＤである。黒い楕円はメチルおよびメチン基であり、白い楕円はメチレンである。 ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、リン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）で製剤化されたＳ．ニューモニエ一価血清型を用いて免疫したウサギのＥＬＩＳＡ ＩｇＧ抗体価（投与後２）を示す。エラーバーは、幾何平均＋９５％信頼区間を表す。 ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、リン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）で製剤化されたＳ．ニューモニエ一価血清型を用いて免疫したウサギの血清型特異的ＯＰＡ力価（投与後２）を示す。エラーバーは、幾何平均＋９５％信頼区間を表す。 リン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）で製剤化された２４Ｆ−ＣＲＭ１９７一価コンジュゲートワクチンを用いて免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスのＳ．ニューモニエ血清型２４Ｆ気管内惹起からの防御を示す。Ｍａｎｔｅｌ Ｃｏｘログランク検定は、２４Ｆ−ＣＲＭ１９７／ＡＰＡワクチンを用いて免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスが、ＡＰＡ免疫マウス（Ｐ＝０．０００４）およびナイーブマウス（Ｐ＜０．０００１）の両方と比較して、惹起から有意に防御されたことを示す。 リン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）で製剤化された２４Ｆ−ＣＲＭ１９７一価コンジュゲートワクチンを用いて免疫したＣＤ−１マウスのＳ．ニューモニエ血清型２４Ｆ気管内惹起からの防御を示す。Ｍａｎｔｅｌ Ｃｏｘログランク検定は、２４Ｆ−ＣＲＭ１９７／ＡＰＡワクチンを用いて免疫したＣＤ−１マウスが、ＡＰＡ免疫マウス（Ｐ＝０．００９９）およびナイーブマウス（Ｐ＝０．００７６）の両方と比較して、惹起から有意に防御されたことを示す。 リン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）で製剤化されした２４Ｆ−ＣＲＭ１９７一価コンジュゲートワクチンを用いて免疫したＳｗｉｓｓ ＷｅｂｓｔｅｒマウスのＳ．ニューモニエ血清型２４Ｆ気管内惹起からの防御を示す。Ｍａｎｔｅｌ Ｃｏｘログランク検定は、２４Ｆ−ＣＲＭ１９７／ＡＰＡワクチンを用いて免疫したＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスが、ＡＰＡ免疫マウス（Ｐ＜０．０００１）およびナイーブマウス（Ｐ＝０．０００２）の両方と比較して、惹起から有意に防御されたことを示す。 多価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（２μｇ／ＰｎＰｓ）を用いて免疫したウサギの血清型特異的（Ｓ．ニューモニエ血清型１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１）免疫前、ＰＤ１およびＰＤ２の幾何平均抗体価を示す。エラーバーは、各血清型（Ｘ軸）の幾何平均力価の２つの標準誤差を表す。 多価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（２μｇ／ＰｎＰｓ）を用いて免疫したウサギの血清型特異的（Ｓ．ニューモニエ血清型１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１）免疫前、ＰＤ１およびＰＤ２のＯＰＡ希釈力価を示す。記号は個々の力価を示し、エラーバーは幾何平均力価（ＧＭＴ）の９５％信頼区間（ＣＩ）を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意差なし。

本発明は、ＮＭＲ技術による新規肺炎球菌多糖体構造（類）の同定に部分的に基づいている。本明細書で提供される構造は、Ｓ．ニューモニエ血清型２４Ｆの最初の同定または最初の正しい同定であると考えられている。

Ｓ．ニューモニエ血清型２４Ｆ多糖体は、そのそれぞれの株から生産され、精製された。生産された（および精製された）多糖体を使用して、個々のＰｓ−ＣＲＭ１９７コンジュゲートを作製した。Ｓ．ニューモニエ血清型２４Ｆは、固有の多糖体を有し、これにより、固有のコンジュゲート作製プロセスが生じる。得られたコンジュゲート（類）は、動物試験で免疫原性であることが実証された。

本明細書で使用される用語「多糖体」（Ｐｓ）は、限定するものではないが、「糖」、「オリゴ糖」、「多糖体」、「リポ糖（ｌｉｐｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）」、「リポオリゴ糖（ＬＯＳ）」、「リポ多糖体（ＬＰＳ）」、「グリコシレート」、「グリココンジュゲート」、「誘導体化または活性化多糖体またはオリゴ糖」などを含め、免疫学および細菌ワクチンの分野で一般的に使用される任意の抗原性糖要素（または抗原単位）を含むことを意味する。特に指定のない限り、本明細書で使用される多糖体の名称は、ＩＵＢ−ＩＵＰＡＣ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ＪＣＢＭ）Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ １９８０に従う。ＪＣＢＮ，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３３５２−３３５４を参照されたい。

本明細書で使用される「免疫原性組成物」とは、哺乳動物のような宿主に対して、体液性にもしくは細胞性に媒介された、または体液性におよび細胞性に媒介された免疫応答を誘発する能力を有する細菌莢膜多糖体または多糖体−タンパク質コンジュゲートのような抗原を含有する組成物を指す。免疫原性組成物は、細胞表面でのＭＨＣ分子に関連した抗原の提示により宿主を感作するのに役立ち得る。さらに、抗原特異的Ｔ細胞または抗体を作製して、免疫された宿主を将来にわたって保護することができる。したがって、免疫原性組成物は、細菌による感染から宿主を保護し、重症度を低下させることができ、または細菌感染による死から宿主を保護することができるかもしれない。免疫原性組成物はまた、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を作製するために使用され得、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、対象に受動免疫を付与するために使用され得る。また、免疫原性組成物を使用して、動物の有効性モデルでまたはオプソニン食作用傷害アッセイを介して細菌を死滅させることによって測定されるように機能的な抗体を作製してもよい。

本明細書で使用される場合、多糖体に関連する「単離された」という用語は、遠心分離、深層濾過、沈殿、限外濾過、活性炭を用いた処理、ダイアフィルトレーションおよび／またはカラムクロマトグラフィーの使用を含め、当技術分野で公知の精製技術を使用した、精製された多糖体からのＳ．ニューモニエ血清型特異的莢膜多糖体の単離を指す。一般に、単離された多糖体とは、タンパク質、核酸、および非特異的な内因性の多糖体（Ｃ多糖体）の部分的な除去を指す。単離された多糖体は、１０％、８％、６％、４％または２％未満のタンパク質不純物および／または核酸を含有する。単離された多糖体は、型特異的多糖体に対して２０％未満のＣ多糖体を含有する。

本明細書で使用される場合、細菌莢膜多糖体に関連する「精製された」という用語は、遠心分離、沈殿および限外濾過のような手段による細胞溶解物からの多糖体の精製を指す。一般に、精製された多糖体とは、細胞片およびＤＮＡの除去を指す。

本明細書で使用される用語「Ｍｗ」は、重量平均分子量を指し、典型的にはＤａまたはｋＤａで表される。Ｍｗは、小さな分子が含有するよりも大きな分子の方がポリマー試料の総質量を多く含有することを考慮に入れる。Ｍｗは、静的光散乱、中性子線小角散乱、Ｘ線散乱および沈降速度のような技術によって決定することができる。

本明細書で使用される用語「Ｍｎ」は、数平均分子量を指し、典型的にはＤａまたはｋＤａで表される。Ｍｎは、試料の総重量を試料中の分子数で割ることによって計算され、ゲル浸透クロマトグラフィー、（Ｍａｒｋ−Ｈｏｕｗｉｎｋ方程式）による粘度測定、束一法（ｃｏｌｌｉｇａｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄｓ）、例えば、蒸気圧浸透圧測定、末端基決定またはプロトンＮＭＲのような技術によって決定することができる。Ｍｗ／Ｍｎは多分散性を反映する。

本明細書で使用される用語「モル比」は、典型的には、１０分の１の位または１００分の１の位までの小数として表される割合である。例えば、１０分の１で表される０または０．１〜１．０のモル比には、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０のいずれかが含まれる。

本明細書で使用される略語「ＰｎＰｓ」は、肺炎球菌多糖体を指す。

本明細書で使用される場合、本発明の免疫原性組成物とともに使用する場合の「含む」という用語は、アジュバントおよび賦形剤のような任意の他の成分の包含を指す（抗原混合物では「からなる」という言葉の制限を受ける）。本発明の多価多糖体−タンパク質コンジュゲート混合物とともに使用される場合の「からなる」という用語は、それらの特定のＳ．ニューモニエ多糖体タンパク質コンジュゲートを有し、異なる血清型由来の他のＳ．ニューモニエ多糖体タンパク質コンジュゲートを有しない混合物を指す。

本明細書で使用される場合、糖上の「活性化部位」という語句は、部位が化学的に修飾されて反応基を形成することができることを意味する。活性化部位は、特定の部位で反応する活性化剤の好ましい傾向を考慮に入れる。

本明細書で使用される語句「活性化多糖体」は、多糖鎖中に反応基を形成するように化学的に修飾された多糖体を指す。活性化多糖体とは、利用可能なあらゆる活性化部位が化学的に修飾されていることを必ずしも意味しない。

本明細書で使用される場合、多糖鎖上の「活性化の程度」という語句は、活性化された化学基の数と多糖鎖上の繰り返し単位の数との全体的な比を指す。

特に指定のない限り、本明細書で提供されるあらゆる範囲は、列挙された下限および上限を含む。

Ｓ．ニューモニエ血清型２４Ｆの単糖分析では、構成成分として、Ｇｌｃ、Ｒｈａ、ＧｌｃＮ、Ｒｉｂ（リボース）およびＲｉｂ−ｏｌ−Ｐ（リボースリン酸）が示された（構造情報は入手することができなかった）。Ｋａｍｅｒｌｉｎｇ，２０００，Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：ａ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖｉｅｗ，ｐ．８１−１１４．Ｉｎ Ｔｏｍａｓｚ（ｅｄ），Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ＆ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｍａｒｙ Ａｎｎ Ｌｉｅｂｅｒｔ，Ｉｎｃ．，Ｌａｒｃｈｍｏｎｔ，ＮＹを参照されたい。実施例で同定された構造は、以前に同定された糖組成と一致している。比較のための血清型２４Ａまたは２４Ｂ多糖体の構造情報は、これまで入手することができなかった。

これらの多糖体血清型（類）の構造を同定することにより、非コンジュゲート多糖体または多糖体−タンパク質コンジュゲートとして肺炎球菌ワクチンにそれらを組み込むことが可能になり得る。連鎖球菌および肺炎球菌Ｐｓを含むコンジュゲートワクチンは、当技術分野で周知である。例えば、米国特許第６，２４８，５７０号、米国特許第５，８６６，１３５号および米国特許第５，７７３，００７号を参照されたい。

莢膜多糖体
本発明の血清型（類）からのストレプトコッカス・ニューモニエ由来の莢膜多糖体は、当業者に公知の標準的な技術により調製することができる。例えば、多糖体は、細菌から単離することができ、既知の方法によって（例えば、欧州特許番号ＥＰ４９７５２４および欧州特許番号ＥＰ４９７５２５を参照）、好ましくは、ホモジナイザーを使用して達成されるマイクロ流動化または化学的加水分解によって、ある程度までサイズ調整され得る。一実施形態では、各多糖体血清型に対応するＳ．ニューモニエ株を大豆ベースの培地で増殖させる。次いで、遠心分離、沈殿および限外濾過を含む標準的な工程によって個々の多糖体を精製する。例えば、米国特許出願公開番号２００８／０２８６８３８および米国特許第５，８４７，１１２号を参照されたい。多糖体をサイズ調整して、粘度を低下させる、および／またはその後のコンジュゲート生成物の濾過性を改善することができる。化学的加水分解は、酢酸を使用して行われ得る。機械的サイジングは、高圧ホモジナイズ化せん断を使用して行われてもよい。

いくつかの実施形態では、コンジュゲーション前の精製された多糖体は、５ｋＤａ〜４，０００ｋＤａの分子量を有する。分子量は、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）と屈折率検出器（ＲＩ）と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により計算することができる。他のそのような実施形態では、多糖体は、１０ｋＤａ〜４，０００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜４，０００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜３，０００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜７５０ｋＤａ、５０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜４，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜３，０００ｋＤａ、５ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、１０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜７５０ｋＤａ、１００ｋＤａ〜５００ｋＤａ、１００〜４００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜４，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜３，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａまたは２００ｋＤａ〜５００ｋＤａの平均分子量を有する。特定の実施形態では、多糖体は、５０ｋＤａ〜５，０００ｋＤａの分子量を有する。特定の態様では、多糖体は、１０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜１，５００ｋＤａまたは７５ｋＤａ〜２００ｋＤａの分子量を有する。

特定の実施形態では、Ｓ．ニューモニエ血清型２４Ｆ多糖体は、５〜２，０００の繰り返し単位を有する。特定の態様では、多糖体は、１５〜１，５００、２０〜４００、３０〜３００、４０〜２５０または５０〜２００の繰り返し単位を有する。

キャリアタンパク質
血清型のうちの１つ以上に由来する多糖体は、キャリアタンパク質（「Ｐｒ」）にコンジュゲートされ、小児、高齢者および／または免疫不全患者の免疫原性を改善することができる。多価組成物に複数の血清型が使用される場合、同じキャリアタンパク質または異なるキャリアタンパク質を用いて血清型が調製されてもよい。同じ血清型の各莢膜多糖体は、典型的には、同じキャリアタンパク質にコンジュゲートされる。

本発明の特定の実施形態では、ＣＲＭ１９７がキャリアタンパク質として使用される。ＣＲＭ１９７は、ジフテリア毒素（ＤＴ）の非毒性変異体である。ＣＲＭ１９７キャリアタンパク質は、残基５２にあるフラグメントＡの単一のアミノ酸置換によって非毒性にされるＤＴの変異体である。一実施形態では、ＣＲＭ１９７キャリアタンパク質は、カザミノ酸および酵母エキスベースの培地で増殖させたコリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）株Ｃ７（β１９７）の培養物から単離される。別の実施形態では、ＣＲＭ１９７は、米国特許第５，６１４，３８２号に記載された方法に従って組換えにより調製される。典型的に、ＣＲＭ１９７は、限外濾過、硫酸アンモニウム沈殿およびイオン交換クロマトグラフィーの組合せにより精製される。いくつかの実施形態では、ＣＲＭ１９７は、Ｐｆｅｎｅｘ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標）（Ｐｆｅｎｅｘ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）において調製される。

他の好適なキャリアタンパク質には、追加の不活化細菌毒素、例えば、ＤＴ、ジフテリアトキソイドフラグメントＢ（ＤＴＦＢ）、ＴＴ（破傷風トキソイド）、またはＴＴのフラグメントＣ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド（例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２００４／０８３２５１に記載される）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＴ（熱不安定エンテロトキシン）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＴ（熱安定エンテロトキシン）、およびシュードモナス・エルギノーサ由来の外毒素Ａが含まれる。また、細菌の外膜タンパク質、例えば、外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポーリン、トランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ；国際出願特許公開番号ＷＯ０２／０９１９９８を参照）、肺炎球菌付着因子タンパク質（ＰｓａＡ）、Ａ群もしくはＢ群のストレプトコッカス由来のＣ５ａペプチダーゼ、またはヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のプロテインＤ、肺炎球菌ニューモリシン（Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６３；２７０６−１３）、例えば、何らかの様式で無毒化されたｐｌｙ、例えば、ｄＰＬＹ−ＧＭＢＳ（国際特許出願公開番号ＷＯ０４／０８１５１５を参照）またはｄＰＬＹ−ホルモール、ＰｈｔＸ、例えば、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、およびＰｈｔタンパク質の融合体、例えば、ＰｈｔＤＥ融合体、ＰｈｔＢＥ融合体（国際特許出願公開番号ＷＯ０１／９８３３４および国際特許出願公開番号ＷＯ０３／５４００７を参照）も使用することができる。他のタンパク質、例えば、オボアルブミン、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、またはツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、ＰｏｒＢ（Ｎ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来）、ＰＤ（ヘモフィルス・インフルエンザエのプロテインＤ；例えば、欧州特許番号ＥＰ０５９４６１０Ｂを参照）、またはその免疫学的機能等価体、合成ペプチド（欧州特許番号ＥＰ０３７８８８１および欧州特許番号ＥＰ０４２７３４７を参照）、熱ショックタンパク質（国際特許出願公開番号ＷＯ９３／１７７１２および国際特許出願公開番号ＷＯ９４／０３２０８を参照）、百日咳タンパク質（国際特許出願公開番号ＷＯ９８／５８６６８および欧州特許番号ＥＰ０４７１１７７を参照）、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子もしくはホルモン（国際特許出願公開番号ＷＯ９１／０１１４６を参照）、様々な病原体由来抗原に由来する複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質（Ｆａｌｕｇｉ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３１：３８１６−３８２４を参照）、例えばＮ１９タンパク質（Ｂａｒａｌｄｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７２：４８８４−７を参照）、鉄取込みタンパク質（国際特許出願公開番号ＷＯ０１／７２３３７を参照）、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素ＡもしくはＢ（国際特許公開番号ＷＯ００／６１７６１を参照）、およびフラジェリン（Ｂｅｎ−Ｙｅｄｉｄｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ６４：９を参照）もまた、キャリアタンパク質として使用することができる。

キャリアタンパク質として、他のＤＴ変異体、例えば、ＣＲＭ１７６、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５（Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，１９７３，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２１８：３８３８−３８４４）；ＣＲＭ９、ＣＲＭ４５、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３およびＣＲＭ１０７、ならびにＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔｏｘｉｎｓ，Ｅｄ：Ｆｒａｎｋｅｌ，Ｍａｅｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ，１９９２にＮｉｃｈｏｌｌｓおよびＹｏｕｌｅによって記載された他の変異；Ｇｌｕ−１４８からＡｓｐ、ＧｌｎまたはＳｅｒおよび／またはＡｌａ１５８からＧｌｙへの欠失または変異、および米国特許第４，７０９，０１７号または米国特許第４，９５０，７４０号に開示された他の変異；少なくとも１つ以上の残基Ｌｙｓ５１６、Ｌｙｓ５２６、Ｐｈｅ５３０および／またはＬｙｓ５３４の変異、および米国特許第５，９１７，０１７号または米国特許第６，４５５，６７３号に開示された他の変異；または米国特許第５，８４３，７１１号に開示されたフラグメントを使用することもできる。

多価ワクチンが使用される場合、抗原のうちの１つ以上に対して第２のキャリアタンパク質を使用することができる。第２のキャリアタンパク質は、好ましくは、非毒性かつ非反応原性であり、十分な量および純度で入手可能なタンパク質である。第２のキャリアタンパク質はまた、抗原の免疫原性を高めるために、抗原、例えばＳ．ニューモニエ多糖体とコンジュゲートまたは接合される。キャリアタンパク質は、標準的なコンジュゲーション手順に適しているべきである。一実施形態では、第１のキャリアタンパク質にコンジュゲートされていない各莢膜多糖体が、同じ第２のキャリアタンパク質にコンジュゲートされる（例えば、各莢膜多糖体分子が単一のキャリアタンパク質にコンジュゲートされる）。別の実施形態では、第１のキャリアタンパク質にコンジュゲートされていない莢膜多糖体が、２つ以上のキャリアタンパク質にコンジュゲートされる（各莢膜多糖体分子が単一のキャリアタンパク質にコンジュゲートされる）。そのような実施形態では、同じ血清型の各莢膜多糖体が、典型的には、同じキャリアタンパク質にコンジュゲートされる。

コンジュゲーション
コンジュゲーションの前に、精製された多糖体を、糖をキャリアタンパク質と反応させて活性化多糖体を形成させることができるように化学的に活性化され得る。本明細書で使用される用語「活性化多糖体」は、リンカーまたはキャリアタンパク質へのコンジュゲーションを可能にするために、以下に記載されるように化学的に修飾された多糖体を指す。精製された多糖体は、リンカーに接続されてもよい。活性化されるかリンカーに接続されると、各莢膜多糖体は、キャリアタンパク質に別個にコンジュゲートされてグリココンジュゲートを形成する。多糖体コンジュゲートは、既知のカップリング技術によって調製され得る。

本発明はさらに、上記実施形態のいずれかから生成される活性化多糖体を提供し、ここで、多糖体は、化学試薬によって活性化されて、リンカーまたはキャリアタンパク質へのコンジュゲーションのための反応基を生成する。特定の実施形態では、活性化はアラビニトール−１−ＰＯ_４で起こる。特定の実施形態では、多糖体は過ヨウ素酸塩によって活性化される。この実施形態の特定の態様では、活性化はアラビニトール−１−ＰＯ_４の炭素２位で起こる。過ヨウ素酸塩活性化血清型２４Ｆ多糖体の構造については、図１Ｂを参照されたい。主に第２の炭素でのアルデヒドの形成は、ビシナルジオールによる２，３−炭素の選択的開裂、またはビシナルジオール（またはアルデヒド）によるさらに高い番号の炭素での好ましい連続した一連の酸化が、最終的にアラビニトール糖の第２の炭素での酸化まで必要であるという点で驚くべきことであった。特定の実施形態では、本発明は、活性化多糖体および（過ヨウ素酸塩活性化による）アルデヒド基の５０％、６０％、７０％または８０％超がアラビニトールにある活性化多糖体の混合物を提供する。この実施形態の一態様では、活性化多糖体は図１Ｂに示すような構造を有する。

特定の実施形態では、多糖体はリンカーに結合され、リンカーの遊離末端がエステル基である多糖体−リンカー中間体を形成することができる。したがって、リンカーは、少なくとも１つの末端がエステル基であるリンカーである。もう一方の末端は、それが多糖体と反応して多糖体−リンカー中間体を形成することができるように選択される。

特定の実施形態では、多糖体中の第一級アミン基を使用して、多糖体をリンカーに結合することができる。この場合、リンカーは、典型的には、両末端にエステル基を有する。これは、カップリングが、求核アシル基置換によって１つのエステル基を多糖体中の第一級アミン基と反応することを引き起こすことを許容する。この反応により、アミド結合を介して多糖体がリンカーに結合する多糖体−リンカー中間体となる。したがって、リンカーは、多糖体中の第一級アミン基と反応するための第１のエステル基と、キャリア分子中の第一級アミン基と反応するための第２のエステル基とを提供する二官能性リンカーである。典型的なリンカーは、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステル（ＳＩＤＥＡ）である。

特定の実施形態では、カップリングは間接的に、すなわち、リンカーへのカップリングの前に多糖体を誘導体化するために使用される付加的リンカーを用いて行うこともできる。多糖体は、多糖体の還元末端でカルボニル基を使用して付加的リンカーに結合される。このカップリングは、２つの工程、すなわち、（ａ１）カルボニル基を付加的リンカーと反応させる工程、及び（ａ２）付加的リンカーの遊離末端をリンカーと反応させる工程、を含む。これらの実施形態では、付加的リンカーは、典型的には、両末端に第一級アミン基を有するため、還元的アミノ化によって第一級アミン基のいずれかを多糖体のカルボニル基と反応させることにより工程（ａ１）を起こさせることを許容する。多糖体中のカルボニル基と反応する第一級アミン基が使用される。ヒドラジドまたはヒドロキシルアミノ基が適している。典型的には、付加的リンカーの両末端に同じ第一級アミン基が存在する。この反応により、多糖体がＣ−Ｎ結合を介して付加的リンカーに結合される多糖体−付加的リンカー中間体が得られる。

特定の実施形態では、多糖体の異なる基、特にカルボキシル基を使用して、付加的リンカーに多糖体を結合することができる。このカップリングは、２つの工程、すなわち、（ａ１）基を付加的リンカーと反応させる工程、および（ａ２）付加的リンカーの遊離末端をリンカーと反応させる工程、を含む。この場合、付加的リンカーは、典型的には、両末端に第一級アミン基を有するため、ＥＤＡＣ活性化によって第一級アミン基のいずれかを多糖体のカルボキシル基と反応させることにより工程（ａ１）を起こさせることを許容する。多糖体中のＥＤＡＣ活性化カルボキシル基と反応する第一級アミン基が使用される。ヒドラジド基が適している。典型的には、付加的リンカーの両末端に同じ第一級アミン基が存在する。この反応により、多糖体がアミド結合を介して付加的リンカーに結合される多糖体−付加的リンカー中間体が得られる。

一実施形態では、多糖体の化学的活性化、およびその後の還元的アミノ化によるキャリアタンパク質へのコンジュゲーションは、米国特許第４，３６５，１７０号、米国特許第４，６７３，５７４号および米国特許第４，９０２，５０６号、米国特許出願公開番号２００６／０２２８３８０、米国特許出願公開番号２００７／１８４０７２、米国特許出願公開番号２００７／０２３１３４０および米国特許出願公開番号２００７／０１８４０７１、ならびに国際特許出願公開番号ＷＯ２００６／１１０３８１、国際特許出願公開番号ＷＯ２００８／０７９６５３および国際特許出願公開番号ＷＯ２００８／１４３７０９に記載されている手段によって達成することができる。その化学は、酸化体の存在下でのＴＥＭＰＯのような、アルデヒドに対する第一級ヒドロキシル基である任意の酸化剤との反応（ＷＯ２１０４／０９７０９９）、または過ヨウ素酸塩（過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウムまたは過ヨウ素酸を含む）のような、アルデヒドに対する２つのビシナルヒドロキシル基の反応による肺炎球菌多糖体の活性化を伴ってもよい。この反応は、反応性アルデヒド基の形成を伴う、炭水化物の第一級ヒドロキシル基のランダム酸化またはビシナルヒドロキシル基のランダム酸化的開裂をもたらす。

この実施形態では、キャリアタンパク質へのカップリングは、タンパク質のリジル基への直接的なアミノ化を介した還元的アミノ化による。例えば、コンジュゲーションは、ニッケルの存在下で、活性化多糖体とキャリアタンパク質との混合物をシアノ水素化ホウ素ナトリウムのような還元剤と反応させることにより行われる。コンジュゲーション反応は、水溶液下でまたはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在下で起こり得る。例えば、米国特許出願公開番号ＵＳ２０１５／０２３１２７０および米国特許出願公開番号ＵＳ２０１１／０１９５０８６ならびに欧州特許番号ＥＰ０４７１１７７Ｂ１を参照されたい。次いで、水素化ホウ素ナトリウムのような強力な還元剤を加えて、未反応アルデヒドをキャップする。

還元的アミノ化には、２つの工程、すなわち、（１）多糖体の酸化による反応性アルデヒドの形成、（２）活性化多糖体とキャリアタンパク質との間に形成されたイミン（シッフ塩基）の還元による安定なアミンコンジュゲート結合の形成が含まれる。任意に、酸化の前に、多糖体のサイズを縮小してもよい。機械的方法（例えば、均質化）または化学的加水分解が使用されてもよい。化学的加水分解は、酢酸を使用して行われ得る。酸化工程は、過ヨウ素酸塩との反応を含み得る。本発明の目的では、用語「過ヨウ素酸塩」には、過ヨウ素酸塩および過ヨウ素酸の両方が含まれ；この用語にはまた、メタ過ヨウ素酸塩（ＩＯ_４ ⁻）およびオルト過ヨウ素酸塩（ＩＯ_６ ^５−）も含まれ、過ヨウ素酸塩の様々な塩（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素酸カリウム）も含まれる。一実施形態では、莢膜多糖体は、メタ過ヨウ素酸塩の存在下、好ましくは過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ_４）の存在下で酸化される。別の実施形態では、莢膜多糖体は、オルト過ヨウ素酸塩の存在下、好ましくは過ヨウ素酸の存在下で酸化される。

一実施形態では、酸化剤は、ピペリジン−Ｎ−オキシまたはピロリジン−Ｎ−オキシ化合物のような、第一級ヒドロキシルを選択的に酸化する酸化体の存在下で安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物である（例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１４／０９７０９９に記載される）。上記反応では、実際の酸化体は、触媒サイクルにおけるＮ−オキソアンモニウム塩である。一態様では、上記安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物は、ピペリジン−Ｎ−オキシまたはピロリジン−Ｎ−オキシ化合物である。一態様では、上記安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物は、ＴＥＭＰＯ（２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ）またはＰＲＯＸＹＬ（２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ）部分を有する。一態様では、上記安定なニトロキシルラジカル化合物は、ＴＥＭＰＯまたはその誘導体である。一態様では、上記酸化体は、Ｎ−ハロ部分を有する分子である。一態様では、上記酸化体は、Ｎ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−ヨードスクシンイミド、ジクロロイソシアヌル酸、１，３，５−トリクロロ−１，３，５−トリアジナン−２，４，６−トリオン、ジブロモイソシアヌル酸、１，３，５−トリブロモ−１，３，５−トリアジナン−２，４，６−トリオン、ジヨードイソシアヌル酸および１，３，５−トリヨード−１，３，５−トリアジナン−２，４，６−トリオンからなる群から選択される。好ましくは、上記酸化体はＮ−クロロスクシンイミドである。

特定の態様では、酸化剤は、共酸化体としての２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）フリーラジカルおよびＮ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）である（国際特許出願公開番号ＷＯ２０１４／０９７０９９に記載される）。したがって、一態様では、Ｓ．ニューモニエ由来のグリココンジュゲートは、以下の工程、すなわち、ａ）水性溶媒中で糖を２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）およびＮ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）と反応させて活性化された糖を生成する工程、および、ｂ）活性化された糖を１つ以上のアミン基を含むキャリアタンパク質と反応させる工程を含む方法によって得ることができる（上記方法は、以降「ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ還元的アミノ化」と呼ばれる）。

任意に、クエンチ剤を加えることにより酸化反応がクエンチされてもよい。クエンチ剤は、ビシナルジオール、１，２−アミノアルコール、アミノ酸、グルタチオン、サルファイト、バイサルフェート、ジチオナイト、メタバイサルファイト、チオサルフェート、ホスファイト、ハイポホスファイトまたは亜リン酸（グリセロール、エチレングリコール、プロパン−１，２−ジオール、ブタン−１，２−ジオールまたはブタン−２，３−ジオール、アスコルビン酸のような）から選択され得る。

還元的アミノ化のためのコンジュゲーションプロセスの第２の工程は、安定なコンジュゲート結合（いわゆる還元的アミノ化）を形成するための還元剤を使用する、活性化多糖体とキャリアタンパク質との間のイミン（シッフ塩基）結合の還元である。好適な還元剤には、シアノ水素化ホウ素（例えばシアノ水素化ホウ素ナトリウム）または水素化ホウ素ナトリウムが含まれる。一実施形態では、還元剤はシアノ水素化ホウ素ナトリウムである。

本発明の方法の特定の実施形態では、還元的アミノ化反応は、非プロトン性溶媒（または非プロトン性溶媒の混合物）中で行われる。一実施形態では、還元反応は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）またはＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）溶媒中で行われる。凍結乾燥されている場合、ＤＭＳＯまたはＤＭＦ溶媒を使用して、活性化多糖体およびキャリアタンパク質を再構成してもよい。一実施形態では、非プロトン性溶媒はＤＭＳＯである。

還元反応の最後に、コンジュゲート中に未反応のアルデヒド基が残存し得、これは、好適なキャッピング剤またはクエンチ剤を使用してキャップまたはクエンチングされ得る。一実施形態では、このキャッピング剤またはクエンチ剤は、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ_４）である。好適な代替物には、ブレンステッド酸またはルイス酸の存在下でのトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムまたは水素化ホウ素ナトリウムもしくは水素化ホウ素亜鉛）、ピリジンボラン、２−ピコリンボラン、２，６−ジボラン−メタノール、ジメチルアミン−ボラン、ｔ−ＢｕＭｅ’ＰｒＮ−ＢＨ_３、ベンジルアミン−ＢＨ_３もしくは５−エチル−２−メチルピリジンボラン（ＰＥＭＢ）のようなアミンボラン、または水素化ホウ素交換樹脂が含まれる。

非プロトン性溶媒中の還元的アミノ化を使用して調製されたグリココンジュゲートは、一般に多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンに使用される。したがって、あらゆる血清型が非プロトン性溶媒中で調製されるわけではない多価組成物の特定の実施形態では、残りの血清型の還元反応は、水性溶媒（例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ、（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、ビス−トリス、ＡＤＡ（Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸））、ＭＯＰＳＯ（３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＤＩＰＳＯ（３−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−２−ヒドロキシプロパン−１−スルホン酸）、ＭＯＢＳ（４−（Ｎ−モルホリノ）ブタンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸））、ＴＥＡ（トリエタノールアミン）、ＥＰＰＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸）、ビシンまたはＨＥＰＢから選択される、ｐＨ６．０〜８．５、７．０〜８．０または７．０〜７．５において）中で行われる。

いくつかの実施形態では、本発明のグリココンジュゲートは、１０ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａの分子量を有する多糖体を含む。他のそのような実施形態では、多糖体は、２５ｋＤａ〜５，０００ｋＤａの分子量を有する。他のそのような実施形態では、多糖体は、５０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの分子量を有する。他のそのような実施形態では、多糖体は、７０ｋＤａ〜９００ｋＤａの分子量を有する。他のそのような実施形態では、多糖体は、１００ｋＤａ〜８００ｋＤａの分子量を有する。他のそのような実施形態では、多糖体は、２００ｋＤａ〜６００ｋＤａの分子量を有する。さらなるそのような実施形態では、多糖体は、１００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜９００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜８００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜７００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜６００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜５００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜４００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜３００ｋＤａ、１５０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、１５０ｋＤａ〜９００ｋＤａ、１５０ｋＤａ〜８００ｋＤａ、１５０ｋＤａ〜７００ｋＤａ、１５０ｋＤａ〜６００ｋＤａ、１５０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、１５０ｋＤａ〜４００ｋＤａ、１５０ｋＤａ〜３００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜９００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜８００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜７００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜６００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜５００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜４００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜３００、２５０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、２５０ｋＤａ〜９００ｋＤａ、２５０ｋＤａ〜８００ｋＤａ、２５０ｋＤａ〜７００ｋＤａ、２５０ｋＤａ〜６００ｋＤａ、２５０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、２５０ｋＤａ〜４００ｋＤａ、２５０ｋＤａ〜３５０ｋＤａ、３００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、３００ｋＤａ〜９００ｋＤａ、３００ｋＤａ〜８００ｋＤａ、３００ｋＤａ〜７００ｋＤａ、３００ｋＤａ〜６００ｋＤａ、３００ｋＤａ〜５００ｋＤａ、３００ｋＤａ〜４００ｋＤａ、４００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、４００ｋＤａ〜９００ｋＤａ、４００ｋＤａ〜８００ｋＤａ、４００ｋＤａ〜７００ｋＤａ、４００ｋＤａ〜６００ｋＤａまたは５００ｋＤａ〜６００ｋＤａの分子量を有する。

特定の実施形態では、コンジュゲーション反応は還元的アミノ化によって行われ、コンジュゲーション反応の効率を高め、遊離シアン化物の除去を促進するためにニッケルが使用される。遷移金属はシアン化物と安定な錯体を形成することが知られており、シアノ水素化ホウ素ナトリウムによるタンパク質アミノ基とホルムアルデヒドとの還元的メチル化を改善することが知られている（Ｓ Ｇｉｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１９８２，２０３：３３１−３３４；Ｊｅｎｔｏｆｔ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８０，１０６：１８６−１９０）。ニッケルの添加は、残存する抑制性シアン化物と複合体を形成することにより、コンジュゲーション中のタンパク質の消費を増加させ、さらに大きく、潜在的にさらに免疫原性の高いコンジュゲートの形成をもたらす。

好適な代替化学には、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）による糖の活性化によるシアネートエステルの形成が含まれる。したがって、活性化された糖は、直接またはスペーサー（リンカー）基を介してキャリアタンパク質上のアミノ基に結合され得る。例えば、スペーサーは、チオール化多糖体をもたらすシスタミンまたはシステアミンであり得、これは、マレイミド活性化キャリアタンパク質（例えば、ＧＭＢＳを使用して）またはハロアセチル化キャリアタンパク質（例えば、ヨードアセトイミド［例えば、エチルヨードアセトイミドＨＣｌ］またはＮ−スクシンイミジルブロモアセテートまたはＳＩＡＢ、またはＳＩＡ、またはＳＢＡＰを使用して）との反応後に得られるチオエーテル結合を介してキャリアに結合することができる。好ましくは、シアネートエステル（ＣＤＡＰ化学により作製されてもよい）は、ヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）と結合し、アミノ誘導体化糖は、カルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）化学を使用して、タンパク質キャリア上のカルボキシル基を介してキャリアタンパク質にコンジュゲートされる。そのようなコンジュゲートは、国際特許出願公開番号ＷＯ９３／１５７６０、国際特許出願公開番号ＷＯ９５／０８３４８および国際特許出願公開番号ＷＯ９６／２９０９４ならびにＣｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４０：２４５−２５６に記載されている。

他の好適な技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボルネン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを使用する。多くは国際特許出願公開番号ＷＯ９８／４２７２１に記載されている。コンジュゲーションには、糖の遊離ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応（Ｂｅｔｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：２５７２−４；Ｈｅａｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２１８：５０９−１８を参照）、次いでタンパク質との反応によりカルバメート結合を形成することにより形成され得るカルボニルリンカーが含まれ得る。これには、第一級ヒドロキシル基へのアノマー末端の還元、任意に第一級ヒドロキシル基の保護／脱保護、第一級ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応によるＣＤＩカルバメート中間体の形成、およびＣＤＩカルバメート中間体とタンパク質上のアミノ基とのカップリングが含まれ得る。

コンジュゲーション（還元反応および任意にキャッピングまたはクエンチング反応）に続いて、グリココンジュゲートは、当業者に公知の様々な技術によって精製（多糖体−タンパク質コンジュゲートの量に関して濃縮）されてもよい。これらの技術には、透析、濃縮／ダイアフィルトレーション操作、接線流濾過、限外濾過、沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、マルチモーダルイオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥまたは疎水性相互作用クロマトグラフィー）および深層濾過が含まれる。例えば、米国特許第６，１４６，９０２号を参照されたい。一実施形態では、グリココンジュゲートは、ダイアフィルトレーションまたはイオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーにより精製される。

本発明のグリココンジュゲートを特徴付ける１つの方法は、糖にコンジュゲートされるキャリアタンパク質中（例えば、ＣＲＭ１９７）のリジン残基の数によるものであり、これは、コンジュゲートされたリジンの範囲（コンジュゲーションの程度）として特徴付けることができる。多糖体への共有結合によるキャリアタンパク質のリジン修飾の証拠は、当業者に公知のルーチンの方法を使用したアミノ酸分析により得ることができる。コンジュゲーションにより、コンジュゲート材料を作製するために使用されるキャリアタンパク質出発材料と比較して、回収されるリジン残基の数が減少する。好ましい実施形態では、本発明のグリココンジュゲートのコンジュゲーションの程度は、２〜１５、２〜１３、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜５、２〜４、３〜１５、３〜１３、３〜１０、３〜８、３〜６、３〜５、３〜４、５〜１５、５〜１０、８〜１５、８〜１２、１０〜１５または１０〜１２である。一実施形態では、本発明のグリココンジュゲートのコンジュゲーションの程度は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４または約１５である。好ましい実施形態では、本発明のグリココンジュゲートのコンジュゲーションの程度は４〜７である。いくつかのそのような実施形態では、キャリアタンパク質はＣＲＭ１９７である。

本発明のグリココンジュゲートはまた、糖とキャリアタンパク質との比（重量／重量）によって特徴付けられてもよい。いくつかの実施形態では、グリココンジュゲート中の多糖体とキャリアタンパク質との比（ｗ／ｗ）は、０．５〜３．０（例えば、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９または約３．０）である。他の実施形態では、糖とキャリアタンパク質との比（ｗ／ｗ）は、０．５〜２．０、０．５〜１．５、０．８〜１．２、０．５〜１．０、１．０〜１．５または１．０〜２．０である。さらなる実施形態では、糖とキャリアタンパク質との比（ｗ／ｗ）は０．８〜１．２である。好ましい実施形態では、コンジュゲート中の莢膜多糖体とキャリアタンパク質との比は０．９〜１．１である。いくつかのそのような実施形態では、キャリアタンパク質はＣＲＭ１９７である。本発明のグリココンジュゲートおよび免疫原性組成物は、キャリアタンパク質に共有結合的にコンジュゲートされていない遊離糖を含有してもよく、それにもかかわらずグリココンジュゲート組成物中に存在する。遊離糖は、グリココンジュゲートと非共有結合的に結合（すなわち、グリココンジュゲートに非共有結合、吸着またはグリココンジュゲートに捕捉もしくはグリココンジュゲートによって捕捉）され得る。

好ましい実施形態では、グリココンジュゲートは、多糖体の総量と比較して約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％または１５％未満の遊離多糖体を含む。好ましい実施形態では、グリココンジュゲートは、多糖体の総量と比較して約２５％未満の遊離多糖体を含む。好ましい実施形態では、グリココンジュゲートは、多糖体の総量と比較して約２０％未満の遊離多糖体を含む。好ましい実施形態では、グリココンジュゲートは、多糖体の総量と比較して約１５％未満の遊離多糖体を含む。

多価多糖体−タンパク質コンジュゲートワクチン
本発明の特定の実施形態では、多価肺炎球菌ワクチンを提供するために、遊離多糖体、多糖体−タンパク質コンジュゲートの成分またはそれらの組合せとして、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２４Ｆ由来の非コンジュゲート多糖体または多糖体−タンパク質コンジュゲートと、Ｓ．ニューモニエ血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｂ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８のうちの１つ以上に由来する莢膜多糖体とを含む多価多糖体ワクチン。本発明の特定の実施形態では、免疫原性組成物は、１つ以上のキャリアタンパク質に個々にコンジュゲートされた、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４のＳ．ニューモニエ血清型由来の莢膜多糖体を含むか、それから本質的になるか、それからからなる。好ましくは、特定の血清型に由来する糖は、複数のキャリアタンパク質にはコンジュゲートされていない。

個々のグリココンジュゲートを精製した後、それらを配合して、本発明の免疫原性組成物を製剤化する。これらの肺炎球菌コンジュゲートは、別個のプロセスによって調製され、単一の投与製剤にバルク製剤（ｂｕｌｋ ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）される。

医薬組成物／ワクチン組成物
本発明はさらに、薬学的に許容される担体およびアジュバントとともに、上記の多糖体Ｓ．ニューモニエ血清型の組合せのいずれかを含むか、それから本質的になるか、それからなる医薬、免疫原性およびワクチン組成物を含む組成物を提供する。

本発明の多糖体−タンパク質コンジュゲートの製剤化は、当技術分野で認識されている方法を使用して達成され得る。例えば、個々の肺炎球菌コンジュゲートは、組成物を調製するために生理学的に許容されるビヒクルを配合され得る。そのようなビヒクルの例には、限定するものではないが、水、緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）およびデキストロース溶液を含む。

好ましい実施形態では、ワクチン組成物は、塩化ナトリウムを含むＬ−ヒスチジン緩衝液と製剤化される。

本明細書で定義されるように、「アジュバント」とは、本発明の免疫原性組成物の免疫原性を高めるのに役立つ物質である。免疫アジュバントは、単独で投与された場合に弱い免疫原性である、例えば、抗体価をまったく誘発しないか、弱い抗体価を誘発するか、細胞性免疫応答を誘発する抗原に対する免疫応答を増強し、抗原に対する抗体価を増加させ得、および／または個体の免疫応答を達成するのに有効な抗原の用量を低下させる。したがって、アジュバントは、しばしば免疫応答を促進するために投与され、当業者に周知である。組成物の有効性を高めるための好適なアジュバントには、限定するものではないが、以下が含まれる：
（１）アルミニウム塩（ミョウバン）、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど；
（２）（ムラミルペプチド（以下に定義）などの特定の免疫刺激剤または細菌細胞壁成分の有無にかかわらず）水中油型エマルジョン製剤、例えば、（ａ）モデル１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）のようなマイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に配合された５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ ８０および０．５％Ｓｐａｎ ８５を含有する（様々な量のＭＴＰ−ＰＥを含有してもよい）ＭＦ５９（国際特許出願公開番号ＷＯ９０／１４８３７）、（ｂ）サブミクロンエマルジョンにマイクロ流動化されるか、大きな粒径のエマルジョンを生成するためにボルテックスされた１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ、（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ ８０、ならびに米国特許第４，９１２，０９４号に記載の３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ（商標））、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））からなる群からの１つ以上の細菌細胞壁成分を含有するＲｉｂｉ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）；（ｄ）Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ；
（３）Ｑｕｉｌ ＡまたはＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）のようなサポニンアジュバント（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号を参照）が使用されるか、ＩＳＣＯＭ（コレステロール、サポニン、リン脂質および両親媒性タンパク質の組合せにより形成された免疫刺激複合体）およびＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ（登録商標）（ＩＳＣＯＭと本質的に同じ構造を有するが、タンパク質を含まない）のようなそれから生成された粒子；
（４）Ｃｏｒｉｘａから入手可能であり、米国特許第６，１１３，９１８号に記載されているアミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物（ＡＧＰ）またはその誘導体もしくは類似体などの細菌リポ多糖、合成脂質Ａ類似体；そのようなＡＧＰの１種は、水性形態または安定なエマルジョンとして製剤化されている５２９としても知られている（以前はＲＣ５２９として知られていた）２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドである；
（５）（１または複数の）ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチドなどの合成ポリヌクレオチド（米国特許第６，２０７，６４６号）；
（６）サイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８など）、インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロン）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、共刺激分子Ｂ７−１およびＢ７−２など；ならびに
（７）補体、例えば、補体成分Ｃ３ｄの三量体。

別の実施形態では、アジュバントは、上記のアジュバントのうちの２つ、３つまたはそれ以上の混合物、例えば、ＳＢＡＳ２（３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡおよびＱＳ２１も含有する水中油型エマルジョン）である。

ムラミルペプチドには、限定するものではないが、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニン−２−（１’，２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などを含む。

特定の実施形態では、アジュバントはアルミニウム塩である。アルミニウム塩アジュバントは、ミョウバン沈殿ワクチンまたはミョウバン吸着ワクチンであり得る。アルミニウム塩アジュバントは、当技術分野で周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（１９８８；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）およびＮｉｃｋｌａｓ，Ｗ．（１９９２；Ａｌｕｍｉｎｕｍ ｓａｌｔｓ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４３：４８９−４９３）に記載されている。アルミニウム塩には、限定するものではないが、水和アルミナ、アルミナ水和物、アルミナ三水和物（ＡＴＨ）、アルミニウム水和物、アルミニウム三水和物、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）、Ｓｕｐｅｒｆｏｓ、Ａｍｐｈｏｇｅｌ（登録商標）、水酸化アルミニウム（ＩＩＩ）、ヒドロキシリン酸アルミニウム（リン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ））、非晶質アルミナ、三水和アルミナまたはトリヒドロキシアルミニウムを含む。

ＡＰＡは、ヒドロキシリン酸アルミニウムの水性懸濁液である。ＡＰＡは、塩化アルミニウムとリン酸ナトリウムとを１：１の体積比でブレンドして、ヒドロキシリン酸アルミニウムを沈殿させることにより製造される。ブレンドプロセス後、高せん断ミキサーを用いて材料のサイズを縮小して、単分散の粒径分布を達成する。次いで、生理食塩水に対して生成物をダイアフィルトレーションし、蒸気滅菌する。

特定の実施形態では、市販のＡｌ（ＯＨ）_３（例えば、Ｄｅｎｍａｒｋ／Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）またはＳｕｐｅｒｆｏｓ）を使用してタンパク質を吸着する。別の実施形態では、タンパク質の吸着は、タンパク質のｐＩ（等電ｐＨ）および培地のｐＨに依存する。ｐＩが低いタンパク質は、ｐＩが高いタンパク質よりも強力に正荷電アルミニウムイオンに吸着する。アルミニウム塩は２〜３週間かけてゆっくりと放出されるＡｇの貯蔵部を確立し、マクロファージの非特異的活性化および補体の活性化に関与し得、および／または（おそらくは尿酸の刺激を通じた）先天性免疫機構を刺激し得る。例えば、Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１：２３を参照されたい。

一価のバルク水性コンジュゲートは、典型的には一緒にブレンドされ、希釈される。希釈したら、バッチを滅菌濾過する。リン酸アルミニウムアジュバントを無菌的に加えて、血清型６Ｂを除くあらゆるＳ．ニューモニエ血清型の最終濃度４μｇ／ｍＬを目標とし、これを８μｇ／ｍＬの目標値まで希釈し、最終アルミニウム濃度を２５０μｇ／ｍＬにする。アジュバント化された製剤バッチを、バイアルまたはシリンジに充填する。

特定の実施形態では、アジュバントは、ＣｐＧ含有ヌクレオチド配列、例えば、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、特にＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）である。別の実施形態では、アジュバントは、Ｃｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐから入手することができるＯＤＮ １８２６である。

「ＣｐＧ含有ヌクレオチド」、「ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド」、「ＣｐＧオリゴヌクレオチド」および同様の用語は、非メチル化ＣｐＧ部分を含む長さ６〜５０ヌクレオチドのヌクレオチド分子を指す。例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｖａｃｃｉｎｅ ２１：４２９７を参照されたい。別の実施形態では、この用語の当技術分野で認められた任意の他の定義が意図されている。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドには、任意の合成ヌクレオシド間結合、修飾塩基および／または修飾糖を使用した修飾オリゴヌクレオチドが含まれる。

ＣｐＧオリゴヌクレオチドの使用方法は当技術分野で周知であり、例えば、Ｓｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：６２８４−９３；Ｖｅｒｔｈｅｌｙｉ，２００６，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．１２７：１３９−５８；およびＹａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．２３：８９−１１０に記載されている。

投与／投与量
本発明の組成物および製剤は、全身または粘膜経路を介してワクチンを投与することにより、感染症、例えば肺炎球菌感染症に易感染性のヒトを防御または治療するために使用することができる。一実施形態では、本発明は、Ｓ．ニューモニエ莢膜多糖体コンジュゲートに対する免疫応答を誘発する方法であって、本発明の免疫原性組成物の免疫学的有効量をヒトに投与することを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、肺炎球菌感染に対してヒトをワクチン化する方法であって、本発明の免疫原性組成物の免疫学的有効量をヒトに投与する工程を含む方法を提供する。

特定のワクチンに対する成分の最適量は、対象の適切な免疫応答の観察を含む標準的な試験によって確認することができる。例えば、別の実施形態では、ヒトワクチン化の投与量は、動物試験からヒトデータに外挿することにより決定される。別の実施形態では、投与量は経験的に決定される。

本発明の組成物の「有効量」とは、後続のチャレンジ中に、微生物、例えばＳ．ニューモニエの感染の可能性または重症度を顕著に低下させる抗体を誘発するのに必要な用量を指す。

本発明の方法は、侵襲性感染症（髄膜炎、肺炎および菌血症）および非侵襲性感染症（急性中耳炎および副鼻腔炎）の両方を含む、微生物、例えばＳ．ニューモニエによって引き起こされる原発性臨床症候群の予防および／または軽減に使用することができる。

本発明の組成物の投与には、筋肉内、腹腔内、皮内もしくは皮下経路を介した注射、または口腔／消化管、呼吸器管もしくは泌尿生殖器管への粘膜投与を介したもののうち１つ以上を含み得る。一実施形態では、肺炎または中耳炎の治療に鼻腔内投与が使用される（肺炎球菌の鼻咽頭保菌を比較的効果的に予防し、ひいては初期段階で感染を減弱させることができるため）。

各ワクチン用量中のコンジュゲートの量は、重大な有害作用を伴うことなく免疫防御応答を誘発する量として選択される。そのような量は、肺炎球菌血清型によって異なり得る。一般に、多糖体ベースのコンジュゲートの場合、各用量は０．１〜１００μｇの各多糖体、具体的には０．１〜１０μｇ、さらに具体的には１〜５μｇを含む。例えば、各用量は、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００もしくは７５０ｎｇまたは１、１．５、２、３、４、５、６、７、７．５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００μｇの各多糖体を含むことができる。

特定のワクチンに対する成分の最適量は、対象の適切な免疫応答の観察を含む標準的な試験によって確認することができる。例えば、別の実施形態では、ヒトワクチン化の投与量は、動物試験からヒトデータに外挿することにより決定される。別の実施形態では、投与量は経験的に決定される。

一実施形態では、アルミニウム塩の用量は、１０、１５、２０、２５、３０、５０、７０、１００、１２５、１５０、２００、３００、５００もしくは７００μｇまたは１、１．２、１．５、２、３、５ｍｇまたはそれ以上である。さらに別の実施形態では、上記のアルミニウム塩の用量は、組換えタンパク質１μｇ当たりである。

一般に、各０．５ｍＬ用量は、４μｇの血清型６Ｂ多糖体を除き、２μｇの各Ｓ．ニューモニエ多糖体、約３２μｇのＣＲＭ１９７キャリアタンパク質（例えば、３２μｇ±５μｇ、±３μｇ、±２μｇまたは±１μｇ）、０．１２５ｍｇの元素アルミニウム（０．５ｍｇのリン酸アルミニウム）アジュバント、ならびに塩化ナトリウムおよびＬ−ヒスチジン緩衝液を含有するように製剤化される。塩化ナトリウム濃度は、約１５０ｍＭ（例えば、１５０ｍＭ±２５ｍＭ、±２０ｍＭ、±１５ｍＭ、±１０ｍＭまたは±５ｍＭ）であり、そして約２０ｍＭ（例えば、２０ｍＭ±５ｍＭ、±２．５ｍＭ、±２ｍＭ、±１ｍＭまたは±０．５ｍＭ）のＬ−ヒスチジン緩衝液である。

本発明の方法のいずれかによれば、一実施形態では、対象はヒトである。特定の実施形態では、ヒト患者は、乳児（１歳未満）、歩き始めの幼児（約１２〜２４カ月）または幼児（約２〜５歳）である。他の実施形態では、ヒト患者は高齢患者（６５歳超）である。本発明の組成物はまた、年長の小児、青少年および成人（例えば、１８歳〜４５歳または１８歳〜６５歳）に使用するのに適している。

本発明の方法の一実施形態では、本発明の組成物は単回接種として投与される。別の実施形態では、組成物は、適切に間隔を空けて２回、３回または４回以上投与される。例えば、組成物は、１、２、３、４、５もしくは６カ月間隔で、またはそれらの任意の組合せで投与され得る。予防接種スケジュールは、肺炎球菌ワクチン用に指定されたスケジュールに従うことができる。例えば、Ｓ．ニューモニエによって引き起こされる侵襲性疾患に対する乳幼児のルーチンのスケジュールは、月齢２、４、６および１２〜１５カ月である。したがって、好ましい実施形態では、組成物は、月齢２、４、６および１２〜１５カ月での４回投与シリーズとして投与される。

本発明の組成物はまた、Ｓ．ニューモニエ由来の１つ以上のタンパク質を含み得る。含めるのに適したＳ．ニューモニエタンパク質の例には、国際特許出願公開番号ＷＯ０２／０８３８５５および国際特許出願公開番号ＷＯ０２／０５３７６１で同定されたものを含む。

製剤
本発明の組成物は、非経口的、経粘膜的、経皮的、筋肉内、静脈内、皮内、鼻腔内、皮下、腹腔内のような当業者に公知の１つ以上の方法によって対象に投与することができ、それに応じて製剤化することができる。

一実施形態では、本発明の組成物は、液体製剤の表皮注射、筋肉内注射、静脈内、動脈内、皮下注射または呼吸器内粘膜注射を介して投与される。注射用の液体製剤は、溶液などを含む。

本発明の組成物は、単回用量バイアル、複数回用量バイアルまたは事前充填シリンジとして製剤化することができる。

別の実施形態では、本発明の組成物は経口投与され、したがって、経口投与に適した形態で、すなわち、固体または液体製剤として製剤化される。固体経口製剤には、錠剤、カプセル、丸薬、顆粒、ペレットなどが含まれる。液体経口製剤には、溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン、油類などが含まれる。

液体製剤用の薬学的に許容される担体は、水性もしくは非水性の溶液、懸濁液、エマルジョンまたは油類である。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、およびオレイン酸エチルのような注射用有機エステルである。水性担体には、水、アルコール性溶液／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液、例えば、生理食塩水および緩衝媒体が含まれる。油類の例は、動物、植物または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、別の魚油、または乳汁もしくは卵に由来する脂質である。

医薬組成物は、等張性、低張性または高張性であり得る。しかし、注入または注射用の医薬組成物は、投与時に本質的に等張性であることがしばしば好ましい。したがって、医薬組成物は、保存のために好ましくは等張性または高張性であり得る。医薬組成物が保存のために高張性である場合、投与前に希釈して等張性溶液にすることができる。

等張剤は、塩のようなイオン性等張剤または炭水化物のような非イオン性等張剤であり得る。イオン性等張剤の例には、限定するものではないが、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ_２、ＫＣｌおよびＭｇＣｌ_２を含む。非イオン性等張剤の例には、限定するものではないが、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトールおよびグリセロールを含む。

また、少なくとも１つの薬学的に許容される添加剤は、緩衝液であることが好ましい。いくつかの目的のために、例えば、医薬組成物が注入または注射用を意味する場合、組成物は、４〜１０、例えば５〜９、例えば６〜８の範囲のｐＨに溶液を緩衝することができる緩衝液を含むことがしばしば望ましい。

緩衝液は、例えば、トリス、アセテート、グルタメート、ラクテート、マレエート、タータレート、ホスフェート、シトレート、カーボネート、グリシネート、Ｌ−ヒスチジン、グリシン、スクシネートおよびトリエタノールアミン緩衝液からなる群から選択され得る。

緩衝液は、例えば、特に医薬製剤が非経口使用用である場合、非経口使用用のＵＳＰ適合緩衝液からさらに選択され得る。例えば、緩衝液は、一塩基酸、例えば酢酸、安息香酸、グルコン酸、グリセリン酸および乳酸；二塩基酸、例えばアコニット酸、アジピン酸、アスコルビン酸、炭酸、グルタミン酸、リンゴ酸、コハク酸および酒石酸、多塩基酸、例えばクエン酸およびリン酸；ならびに塩基、例えばアンモニア、ジエタノールアミン、グリシン、トリエタノールアミンおよびトリスからなる群から選択され得る。

非経口ビヒクル（皮下、静脈内、動脈内または筋肉内注射用）には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液および固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、液体および栄養補給液、リンゲルデキストロースに基づくものなどのような電解質補給液が含まれる。例には、界面活性剤および他の薬学的に許容されるアジュバントの添加の有無にかかわらず、水および油類のような滅菌液体である。一般に、水、生理食塩水、水性デキストロースおよび関連糖溶液、グリコール、例えば、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール、ポリソルベート８０（ＰＳ−８０）、ポリソルベート２０（ＰＳ−２０）およびポロキサマー１８８（Ｐ１８８）が、特に注射用溶液に好ましい液体担体である。油類の例は、動物、植物または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、別の魚油、または乳汁もしくは卵に由来する脂質である。

製剤はまた、界面活性剤を含有してもよい。好ましい界面活性剤には、限定するものではないが、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、特にＰＳ−２０およびＰＳ−８０；ＤＯＷＦＡＸ（商標）の商品名の下に販売されているエチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー、例えば、直鎖ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；反復エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が様々であり得るオクトキシノール、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン（レシチン）；ノニルフェノールエトキシレート、例えば、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標）ＮＰシリーズ；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコール（Ｂｒｉｊ界面活性剤として知られる）から誘導されたポリオキシエチレン脂肪エーテル、例えばトリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）；ならびにソルビタンエステル（一般にＳＰＡＮとして知られている）、例えば、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ ８５）およびソルビタンモノラウレートが含まれる。エマルジョンに含めるのに好ましい界面活性剤は、ＰＳ−２０またはＰＳ−８０である。

界面活性剤の混合物、例えば、ＰＳ−８０／Ｓｐａｎ ８５混合物を使用することができる。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ＰＳ−８０）のようなポリオキシエチレンソルビタンエステルとｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）のようなオクトキシノールとの組合せも適している。別の有用な組合せは、ラウレス９＋ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。

界面活性剤の好ましい量は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（ＰＳ−８０など）０．０１〜１％ｗ／ｖ、特に約０．１％ｗ／ｖ；オクチルまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の洗浄剤など）０．００１〜０．１％ｗ／ｖ、特に０．００５〜０．０２％ｗ／ｖ；ポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９など）０．１〜２０％ｗ／ｖ、好ましくは０．１〜１０％ｗ／ｖ、特に０．１〜１％ｗ／ｖまたは約０．５％ｗ／ｖである。

特定の実施形態では、組成物は、２５０μｇ／ｍＬのＡＰＡ（リン酸アルミニウムアジュバント）とともにＬ−ヒスチジン（２０ｍＭ）、生理食塩水（１５０ｍＭ）、およびｐＨ５．８の０．２％ｗ／ｖのＰＳ−２０から本質的になる。ＰＳ−２０は０．００５から０．１％ｗ／ｖの範囲であり得、製剤中のＰＳ−２０またはＰＳ−８０の存在は、製造のシミュレーション中、および一次包装を使用した出荷中の凝集を制御する。プロセスは、Ｌ−ヒスチジン、塩化ナトリウムおよびＰＳ−２０中の最大４４のＳ．ニューモニエ多糖体血清型のブレンドを組み合わせることと、次いでこのブレンドされた材料とＡＰＡおよび塩化ナトリウムとを、抗菌防腐剤の有か無で組み合わせることからなる。

界面活性剤の選択は、異なる薬物製品および薬物物質に合わせて最適化する必要があり得る。１５以上のＳ．ニューモニエ多糖体血清型を含有する多価ワクチンの場合、ＰＳ−２０およびＰ１８８が好ましい。コンジュゲートの調製に使用される化学の選択も、製剤の安定化に影響を与える可能性がある。特に、以下に例示されるように、水性またはＤＭＳＯ溶媒中で調製され、多価組成物に組み合わされた肺炎球菌多糖体−タンパク質コンジュゲートは、製剤に使用される特定の界面活性剤系に依存して安定性に顕著な差を示す。

本明細書に記載の製剤では、ポロキサマーは、一般に、１，１００Ｄａ〜１７，４００Ｄａ、７，５００Ｄａ〜１５，０００Ｄａまたは７，５００Ｄａ〜１０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。ポロキサマーは、ポロキサマー１８８またはポロキサマー４０７から選択することができる。本発明の製剤中のポロキサマーの最終濃度は、０．００１〜５％ｗ／ｖまたは０．０２５〜１％ｗ／ｖである。ポロキサマーを含む界面活性剤系は、ポリオールをさらに含まなければならない。特定の態様では、ポリオールはプロピレングリコールであり、１〜２０％ｗ／ｖの最終濃度にある。特定の態様では、ポリオールはポリエチレングリコール４００であり、１〜２０％ｗ／ｖの最終濃度にある。

製剤に適したポリオールは、ポリマー性ポリオール、特に、限定するものではないが、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールモノメチルエーテルを含むポリエーテルジオールである。プロピレングリコールは、約４２５Ｄａ〜約２，７００Ｄａのモノマーの分子量の範囲で入手可能である。ポリエチレングリコールおよびポリエチレングリコールモノメチルエーテルはまた、限定するものではないが、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ ＭＭＥ ５５０、ＰＥＧ ＭＭＥ ６００、ＰＥＧ ＭＭＥ ２０００、ＰＥＧ ＭＭＥ ３３５０およびＰＥＧ ＭＭＥ ４０００を含め、約２００Ｄａ〜約３５，０００Ｄａの範囲の分子量の範囲で入手可能である。好ましいポリエチレングリコールは、ポリエチレングリコール４００である。製剤中のポリオールの最終濃度は、１〜２０％ｗ／ｖまたは６〜２０％ｗ／ｖであってよい。

製剤はまた、ｐＨ緩衝生理食塩水を含有する。緩衝液は、例えば、トリス、アセテート、グルタメート、ラクテート、マレエート、タータレート、ホスフェート、シトレート、カーボネート、グリシネート、Ｌ−ヒスチジン、グリシン、スクシネート、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）およびトリエタノールアミン緩衝液からなる群から選択されてもよい。緩衝液は、溶液を４〜１０、５．２〜７．５または５．８〜７．０の範囲のｐＨに緩衝することができる。特定の態様では、ホスフェート、スクシネート、Ｌ−ヒスチジン、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、アセテートまたはシトレートからなる群から選択される緩衝液である。緩衝液は、例えば、特に医薬製剤が非経口使用用である場合、非経口使用用のＵＳＰ適合緩衝液からさらに選択され得る。緩衝液の濃度は、１ｍＭ〜５０ｍＭまたは５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲である。特定の態様では、緩衝液は、５ｍＭ〜５０ｍＭの最終濃度のＬ−ヒスチジンまたは１ｍＭ〜１０ｍＭの最終濃度のスクシネートである。特定の態様では、Ｌ−ヒスチジンは２０ｍＭ±２ｍＭの最終濃度にある。

生理食塩水（すなわち、ＮａＣｌを含有する溶液）が好ましいが、製剤に適した他の塩には、限定するものではないが、ＣａＣｌ_２、ＫＣｌおよびＭｇＣｌ_２ならびにそれらの組合せが含まれる。限定するものではないが、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトールおよびグリセロールを含む非イオン性等張剤が塩の代わりに使用されてもよい。好適な塩の範囲には、限定するものではないが、２５ｍＭ〜５００ｍＭまたは４０ｍＭ〜１７０ｍＭが含まれる。一態様では、生理食塩水はＮａＣｌであり、場合により２０ｍＭ〜１７０ｍＭの濃度で存在してもよい。

好ましい実施形態では、製剤は、塩化ナトリウムとともにＬ−ヒスチジン緩衝液を含む。

別の実施形態では、医薬組成物は制御放出システムで送達される。例えば、薬剤は、静脈内注入、経皮パッチ、リポソームまたは他の投与様式を使用して投与することができる。別の実施形態では、例えば、ポリマー材料は、微小球内またはインプラント内で使用される。

本発明の組成物はまた、Ｓ．ニューモニエ由来の１つ以上のタンパク質を含み得る。含めるのに適したＳ．ニューモニエタンパク質の例には、国際特許出願公開番号ＷＯ０２／０８３８５５および国際特許出願公開番号ＷＯ０２／０５３７６１で同定されたものを含む。

分析方法
ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩアッセイを使用したコンジュゲートの分子量および濃度分析
高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）によって、コンジュゲート試料が注入および分離される。紫外線（ＵＶ）、多角度光散乱（ＭＡＬＳ）および屈折率（ＲＩ）検出器を順次使用して検出が達成される。吸光係数を使用してＵＶ２８０からタンパク質濃度が計算される。ｍＬ／ｇで報告された溶質濃度の変化を伴う、溶液の屈折率の変化であるｄｎ／ｄｃ因子を使用して、ＲＩシグナル（タンパク質および多糖体の両方によってもたらされる）から多糖体濃度がデコンボリューションされる。全試料ピークにわたる測定濃度および光散乱情報を使用するＡｓｔｒａソフトウェア（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）によって、試料の平均分子量が計算される。多分散分子の分子量の平均値には複数の形態がある。例えば、数平均分子量Ｍｎ、重量平均分子量Ｍｗおよびｚ平均分子量Ｍｚ（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１５，２０：１０３１３−１０３４１）である。指定されない限り、本明細書全体にわたって使用される用語「分子量」は、重量平均分子量である。

多糖体とキャリアタンパク質との間の共有結合の数の尺度としてのコンジュゲートされたタンパク質のリジン消費の決定
コンジュゲート試料のコンジュゲーションの程度を測定するために、Ｗａｔｅｒｓ ＡｃｃＱ−Ｔａｇアミノ酸分析（ＡＡＡ）が使用される。Ｅｌｄｅｘワークステーションにおいて気相酸加水分解を使用して試料を加水分解して、キャリアタンパク質をそれらの成分のアミノ酸に分解する。６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＱＣ）を使用して遊離アミノ酸を誘導体化する。次いで、Ｃ１８カラム上でのＵＶ検出を伴うＵＰＬＣを使用して誘導体化された試料を分析する。リジン以外の代表的なアミノ酸を使用して平均タンパク質濃度を得る。コンジュゲーション中のリジン消費（すなわちリジン損失）は、コンジュゲート中の平均測定リジン量と出発タンパク質中の予測リジン量との差によって決定される。

遊離多糖体試験
コンジュゲート試料中の遊離多糖体（すなわち、ＣＲＭ１９７とコンジュゲートしていない多糖体）を、遊離タンパク質、ならびにデオキシコレート（ＤＯＣ）および塩酸とのコンジュゲートを最初に沈殿させることによって測定する。次いで、沈殿物を濾過し、濾液を、遊離多糖体濃度についてＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩにより分析する。遊離多糖体は、ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩによって測定された総多糖体の割合として計算される。

遊離タンパク質試験
ミセル動電クロマトグラフィー（ＭＥＫＣ）モードのキャピラリー電気泳動により、コンジュゲート試料中の遊離多糖体、多糖体‐ＣＲＭ１９７コンジュゲートおよび遊離ＣＲＭ１９７を分離する。簡潔には、試料を２５ｍＭボレート、１００ｍＭ ＳＤＳ、ｐＨ９．３を含有するＭＥＫＣランニング緩衝液と混合し、プレコンディションされた裸溶融シリカキャピラリーで分離する。分離を２００ｎｍでモニターし、ＣＲＭ１９７標準曲線を用いて遊離ＣＲＭ１９７を定量する。遊離タンパク質の結果は、ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩ手順によって決定された総タンパク質含有量の割合として報告される。

添付の説明および図面を参照して本発明の様々な実施形態を説明してきたが、本発明はこれらの正確な実施形態に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲または精神から逸脱することなく、当業者によって様々な変更および修正が行われ得ることを理解されたい。

以下の実施例は、本発明を例示するが限定するものではない。

［実施例］
［実施例１］
Ｓ．ニューモニエ莢膜多糖体の調製
肺炎球菌を培養する方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｃｈａｓｅ，１９６７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １：５２を参照されたい。肺炎球菌莢膜多糖体を調製する方法も当技術分野で周知である。例えば、欧州特許番号ＥＰ０４９７５２４Ｂ１を参照されたい。以下に説明するプロセスは、一般に、欧州特許番号ＥＰ０４９７５２４Ｂ１に記載された方法に従い、特に変更された場合を除き、あらゆる肺炎球菌血清型に一般に適用可能である。

肺炎球菌サブタイプ２４Ｆの単離株は、Ｍｅｒｃｋ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得た。必要に応じて、特異的抗血清を使用したＱｕｅｌｌｉｎｇ反応に基づいてサブタイプを区別することができる。例えば、米国特許第５，８４７，１１２号を参照されたい。大豆ペプトン、酵母エキス、および、ヘミンを含まないグルコースを含有する動物成分不含培地からなる寒天プレート上に二段階で連続的に播種することにより、得られた単離株をさらにクローン単離した。大豆ペプトン、酵母エキス、ＨＥＰＥＳ、塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カリウム、グルコースおよびグリセロールを含有する動物成分不含培地を使用した液体培養で、各血清型のクローン単離株をさらに増殖させて、プレマスター細胞バンクを調製した。

肺炎球菌多糖体の各血清型の生成は、細胞増殖と、バッチ生産発酵、それに続く下流精製前の化学的不活化とからなった。大豆ペプトンまたは大豆ペプトン限外濾過物、酵母エキスまたは酵母エキス限外濾過物、ＨＥＰＥＳ、塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびグルコースを含有する予め滅菌された動物成分不含増殖培地を含む振盪フラスコまたは培養ボトルを使用して、各血清型からの解凍された細胞バンクのバイアルを増殖させた。密閉振盪フラスコまたはボトル内で細胞増殖培養物を増殖させて、温度および撹拌制御によるガス交換を最小限に抑えた。６００ｎｍでの光学密度によって測定されるように、特定の培養密度を達成した後、大豆ペプトンまたは大豆ペプトン限外濾過物、酵母エキスまたは酵母エキス限外濾過物、塩化ナトリウム、リン酸カリウムおよびグルコースを含有する予め滅菌された動物成分不含増殖培地を含む生産発酵槽に細胞増殖培養物の一部を移した。温度、ｐＨ、圧力および撹拌を制御した。スパージングを使用しなかったため、気流オーバーレイ（Ａｉｒｆｌｏｗ ｏｖｅｒｌａｙ）も制御した。

グルコースがほぼ枯渇した際に、化学的不活化剤、フェノールを加えることによりバッチ発酵を終了した。純粋なフェノールを０．８〜１．２％の最終濃度まで加えて、細胞を不活化し、細胞壁から莢膜多糖体を遊離させた。一次不活化は、温度および撹拌が継続して制御される発酵槽内で特定の時間にわたり起こる。一次不活化後、バッチを別の容器に移し、そこで、完全に不活化するために、温度および撹拌を制御しながらさらに特定の時間にわたり保持した。これは、微生物プレーティング技術によって、またはフェノール濃度および特定の時間の検証によって確認した。次いで、不活化されたブロスを精製した。

Ｐｓの精製
肺炎球菌多糖体の精製は、いくつかの遠心分離、深層濾過、濃縮／ダイアフィルトレーション操作および沈殿工程からなった。特に指定のない限り、手順はいずれも室温で行った。

カチオン性ポリマー（ＢＰＡ−１０００、Ｐｅｔｒｏｌｉｔｅ「Ｔｒｅｔｏｌｉｔｅ」および「Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ８１６０」およびポリ（エチレンイミン）、「Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｐＤＡＤＭＡＣ」など）を用いて、Ｓ．ニューモニエの発酵槽培養物からの不活化ブロスを凝集させた。カチオン性ポリマーは、不純物タンパク質、核酸および細胞片を結合した。凝集工程および熟成期間の後、遠心分離および複数の深層濾過工程によって、凝集した固体を除去した。精製したブロスを濃縮し、１００ｋＤａ〜５００ｋＤａのＭＷＣＯ（分子量カットオフ）フィルターを使用してダイアフィルトレーションした。トリス、ＭｇＣｌ_２緩衝液およびリン酸ナトリウム緩衝液を使用してダイアフィルトレーションを行った。ダイアフィルトレーションにより、残留核酸およびタンパク質が除去された。

さらに、変性アルコールおよび／またはイソプロパノールを用いた酢酸ナトリウムおよびフェノール中の多糖体の再沈殿によって、不純物を除去した。フェノール沈殿工程中、ダイアフィルトレーションした保持液に、リン酸ナトリウム生理食塩水緩衝液中の酢酸ナトリウムとフェノール（液状フェノールまたは固体フェノール）とを加えた。次いで、多糖体のアルコール分画を２段階で行った。第一段階では、調製物に低パーセントのアルコールを加えて細胞片および他の望ましくない不純物を沈殿させたが、粗多糖体は溶液中に残った。不純物は、遠心分離に続いて深層濾過工程により除去した。次いで、追加のイソプロパノールまたは変性アルコールをバッチに加えることにより、溶液から多糖体を回収した。沈殿した多糖体ペレットを遠心分離により回収し、粉砕し、粉末として乾燥させ、−７０℃で凍結保存した。

［実施例２］
多糖体のＮＭＲ構造分析
多糖体構造を決定するための戦略には、Ａｂｅｙｇｕｎａｗａｒｄａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｂｙ Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９３，Ｖｏｌ ３，ｐａｇｅｓ １９９−２４９，ＪＡＩ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．に記載されているように実質的に行われる複数工程のプロセスを含めた。標準の１Ｄおよび２Ｄ ＮＭＲ技術を使用して、精製された多糖体を調査した。最後に、^３１Ｐ ＮＭＲを使用して、ホスフェートの存在について多糖体を調査した。

^１Ｈ−^１Ｈ ＣＯＳＹ、二重量子フィルタ等核ＣＯＳＹ（ｄｏｕｂｌｅ ｑｕａｎｔｕｍ ｆｉｌｔｅｒｅｄ ｈｏｍｏｎｕｃｌｅａｒ ＣＯＳＹ）および全相関分光法（ＴＯＣＳＹ）により、単糖残基の帰属を行った。異種核単一量子コヒーレンス分光法（ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｓｉｎｇｌｅ ｑｕａｎｔｕｍ ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）（ＨＳＱＣ）、およびＨＳＱＣ‐ＴＯＣＳＹの組合せにより、^１３Ｃ化学シフトを帰属した。多重度編集ＨＳＱＣを使用して、メチレン基とメチン基とを区別した。ＨＭＢＣおよびＮＯＥＳＹ分光法の組合せにより、残基間結合を決定した。アノマープロトンならびに炭素化学シフト、^３Ｊ_{Ｈ１、Ｈ２}および^１Ｊ_{Ｈ１、Ｃ１}値から残基のアノマー配置を決定した。^３Ｊ_{Ｈ１、Ｈ２}および^１Ｊ_{Ｈ１、Ｃ１}値からフラノース環のアノマー配置を評価することは困難であるため、この決定にアノマー炭素からの環プロトンの長距離カップリングを利用した。

１ＤリンＮＭＲ分光法は、血清型２４Ｆ多糖体が構造内にリンを含むことを示した。精製された（図５Ａ）多糖体および過ヨウ素酸塩酸化（図５Ｂ）多糖体に対する^１Ｈ−^３１Ｐ ＨＭＢＣ分光法により、リン結合部位の帰属を行った。

図２〜図５のＮＭＲデータに基づいて、Ｓ．ニューモニエ血清型２４Ｆ多糖体の構造を以下のように決定し、
式中、ｎは多糖体を構成する繰り返し単位の数を表す。図１Ａも参照されたい。

糖残基は、ラムノース（Ｒｈａ）、リボース（Ｒｉｂ）、グルコース（Ｇｌｃ）およびアラビニトールを含む。グルコース残基の１つはＮ−アセチル化されている。リボースはフラノースの形態である。

イタリック体（ｐおよびｆ）は、ピラノース（６つの原子からなる閉環）およびフラノース（５つの原子からなる閉環）を指す。

αおよびβは、糖単位のアノマー炭素に結合したプロトンの立体配置を指す。糖単位で炭素原子を標識する場合、アノマー炭素は常に１番である（通常１〜６）。αは、アノマープロトンが３Ｄ構造内でエクアトリアル位にあることを意味する。βは、アノマープロトンがアキシアル位にあることを意味する。

矢印に関連付けられた数字は、個々の糖単位がどのように互いに接続されているかを示している。例えば、α−Ｒｈａｐ−（１→３）−α−Ｇｌｃｐ−という命名は、ラムノースの１番炭素がグルコースの３番炭素に結合していることを意味する（ｐはこれらがいずれもピラノース環であることを意味する）。

Ｓ．ニューモニエ血清型２４Ｆ多糖体の主な活性化部位の同定
Ｓ．ニューモニエ血清型２４Ｆの主な活性化部位は、アラビニトール側鎖の第２の炭素にあることが分かった。

酸化血清型２４Ｆ多糖体を凍結乾燥させ、次いで、ＮＭＲ分析のために重水を用いて再溶解させた。極低温に冷却されたプローブを使用して、３７℃のプローブ温度で６００ＭＨｚでＮＭＲ実験を行った。１６トランジェントの９０度パルスと、パルス間の１０秒遅延（取得時間３秒を含む）とを使用して、１次元（１Ｄ）プロトンスペクトルを取得した。第１次元では４および１６トランジェント（それぞれ）、第２次元では５１２インクリメントにより勾配ＣＯＳＹおよびＴＯＣＳＹデータを取得した。リサイクル時間１０秒（取得時間３秒を含む）および混合時間９０ｍｓで１０２４トランジェントにより、５．１９ｐｐｍのトリプレットを中心とする１Ｄ ＴＯＣＳＹを取得した。６４トランジェントおよび５１２インクリメントにより多重度編集ｇＨＳＱＣＡＤを取得した。

１Ｄプロトンスペクトルは、非活性化多糖体と比較して、５．１９ｐｐｍのアノマー領域に追加のシグナル（トリプレット）を示した。ｇＣＯＳＹおよびＴＯＣＳＹデータは、５．１９ｐｐｍのシグナルから３．８６ｐｐｍのシグナルへのクロスピークを示した。５．１９ｐｐｍを中心とする選択バンドを有する１Ｄ ＴＯＣＳＹは、３．８６ｐｐｍのトリプレットとの単一相関のみを示した（図６）。ｇＨＳＱＣＡＤデータにより、９１．１３ｐｐｍ（５．１９ｐｐｍのシグナル）および７０．７９ｐｐｍ（３．８６ｐｐｍのシグナル）の炭素化学シフトが得られた。９１．１３ｐｐｍでの炭素化学シフトは、アノマーシグナルが典型的に観察される場所からややアップフィールドであり、これが水和アルデヒドであることを示している。７０．６９ｐｐｍでのもう１つのシグナルはメチレンであることが同定された（多重度編集ｇＨＳＱＣＡＤ実験では、メチレン炭素はメチン炭素およびメチル炭素の逆相を有する；図７）。このデータは、５．１９ｐｐｍのプロトン（水和アルデヒド由来）がメチレン基（３．８６ｐｐｍのプロトンおよび７０．６９ｐｐｍの炭素）に隣接していることを示している。これが発生し得る唯一の場所は、２４Ｆ多糖体の構造に基づいて炭素２のアラビニトール側鎖上である。

主に第２の炭素でのアルデヒドの形成は、ビシナルジオールによる２，３−炭素の選択的開裂、またはビシナルジオール（またはアルデヒド）によるさらに高い番号の炭素での好ましい連続した一連の酸化が、アラビニトール糖の第２の炭素での最終的な酸化まで必要であるという点で驚くべきことであった。

［実施例３］
ジメチルスルホキシド中の還元的アミノ化を使用したＣＲＭ１９７へのＳ．ニューモニエ血清型２４Ｆ多糖体のコンジュゲーション
多糖体を溶解させ、目標分子量にサイズ調整し、化学的に活性化し、限外濾過により緩衝液交換した。活性化多糖体および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥させ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に再溶解させた。次いで、再溶解させた多糖体およびＣＲＭ１９７溶液を組み合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。最終的な０．２ミクロン濾過の前に、得られたコンジュゲートを、限外濾過により精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような、各工程内のいくつかのプロセスパラメーターを制御して、望ましい属性を有するコンジュゲートを得た。

多糖体のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解させ、０．４５ミクロンで濾過した。溶解させた多糖体のサイズを、酢酸を２００ｍＭまで加え、９２℃で５０分間インキュベートし、次いで、冷リン酸カリウムｐＨ７緩衝液を４００ｍＭまで加えて中和することによる酸加水分解により縮小した。

サイズが縮小された多糖体を濃縮し、５ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、水に対してダイアフィルトレーションした。

次いで、酢酸ナトリウム緩衝液を用いて多糖体溶液を２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖体のサイズ縮小を最小限に抑えた。１００ｍＭメタ過ヨウ素酸塩ナトリウム溶液を加えることにより、多糖体の活性化を開始した。多糖体活性化の目標レベルを達成するために、加えられたメタ過ヨウ素酸塩ナトリウムは、多糖体繰り返し単位１モル当たりメタ過ヨウ素酸塩ナトリウム０．１８〜０．２１モルであった（多糖体繰り返し単位１モル当たりのアルデヒドのモル数）。酸化反応は２２℃で２時間進行させた。

１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対して、活性化された生成物をダイアフィルトレーションし、続いて５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２〜８℃で行った。

ＣＲＭ１９７への多糖体のコンジュゲーション
前述のように（ＷＯ２０１２／１７３８７６Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスでの発現により得られた精製されたＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、２ｍＭホスフェート、ｐＨ７．０緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、そして、０．２ミクロンで濾過した。

活性化多糖体は、１０％ｗ／ｖのスクロース濃度を有する２ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７は、１％ｗ／ｖのスクロース濃度を有する６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。

製剤化されたＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥させた。凍結乾燥させたＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、等量のＤＭＳＯに個別に再溶解させた。多糖体溶液に塩化ナトリウムを２０〜５０ｍＭの最終濃度まで添加した。多糖体溶液とＣＲＭ１９７溶液とをブレンドして、多糖体濃度１．４〜１．５ｇ Ｐｓ／Ｌ（多糖体のグラム数／リットル）および多糖体とＣＲＭ１９７との質量比１．５を達成した。質量比を選択して、得られたコンジュゲート中の多糖体とＣＲＭ１９７との比を制御した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖体繰り返し単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃で２時間コンジュゲーションを進行させた。

水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲーション反応に続いて、水素化ホウ素ナトリウム（多糖体繰り返し単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で１時間インキュベートした。約４℃で、約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムでバッチを希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を加えてｐＨを中和した。いくつかのバッチについては、バッチを濃縮し、３０ｋＤ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対して約４℃でダイアフィルトレーションした。

最終濾過および生成物保存
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ７．０中の１０ｍＭヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。

保持液バッチを０．２ミクロンで濾過し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む、追加の１５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ７．０中の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、≦−６０℃で凍結させた。

表１は、ＤＭＳＯ中で調製されたＳ．ニューモニエ血清型２４Ｆ多糖体コンジュゲートの属性を示す。

［実施例４］
一価コンジュゲートの製剤化
実施例３に記載されているように、肺炎球菌多糖体−ＣＲＭ１９７コンジュゲートを調製した。個々のバルク多糖体濃度のバッチ容量および濃度に基づいて、個々の血清型の目標濃度を得るのに必要なバルクコンジュゲートの必要量を計算した。Ｓ．ニューモニエ血清型２４Ｆのバルクコンジュゲートを賦形剤と組み合わせ、滅菌濾過し、混合条件下でＡＰＡに加えた。２０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％（ｗ／ｖ）ＰＳ−２０、およびＡＰＡの形態の０．２５０ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ Ａｌ）を含むＳ．ニューモニエ血清型２４Ｆ一価コンジュゲートワクチンの最終濃度は、４μｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ ＰｎＰｓ）であった。

［実施例５］
一価コンジュゲートニュージーランド白ウサギ免疫原性試験
ニュージーランド白ウサギ（ＮＺＷＲ）モデルにおいて、一価コンジュゲートの免疫原性を評価した。０日目および１４日目（交互の体側部）に、各一価コンジュゲートワクチン０．２５ｍｌを用いて、成体ニュージーランド白ウサギ（ＮＺＷＲ、ｎ＝３／群）を筋肉内（ＩＭ）免疫した。免疫１回当たり、６２．５μｇのリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）とともに１μｇのＰｎＰｓ（ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＳ．ニューモニエ血清型２４Ｆ多糖体）の用量で一価肺炎球菌ワクチンを投与した。試験開始前（免疫前）および１４日目（投与後１、ＰＤ１）および２８日目（投与後２、ＰＤ２）に血清を採取した。病気または苦痛の徴候がないか、訓練を受けた動物ケアスタッフがＮＺＷＲを少なくとも連日観察した。ＮＺＷＲに対するワクチン製剤は安全で忍容性が高いとみなされた。動物実験はいずれも、国立衛生研究所のＧｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの推奨事項に厳密に従って行った。ＮＺＷＲ実験プロトコルは、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ（Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，ＮＪ）およびＣｏｖａｎｃｅ（Ｄｅｎｖｅｒ，ＰＡ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓによって承認された。

１〜２ｍｇ／ｍｌの各ＰｎＰｓコーティング濃度を使用して、ＮＺＷＲ血清をＥＬＩＳＡアッセイで試験してＩｇＧの免疫原性を評価した。前述のプロトコルに基づいてオプソニン化貪食作用アッセイ（ＯＰＡ）によって機能的抗体を決定した。例えば、Ｃａｒｏ−Ａｇｕｉｌａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｖａｃｃｉｎｅ ３５：８６５−７２およびＢｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３（９）：１００４−９を参照されたい。

Ｓ．ニューモニエ血清型２４Ｆ由来の一価肺炎球菌コンジュゲートワクチンは、ウサギに対して免疫原性であり（図８）、各細菌株を死滅させる機能的抗体を産生することが見出された（図９）。

［実施例６］
一価コンジュゲートマウスチャレンジ試験
Ｓ．ニューモニエ血清型２４グリココンジュゲートの免疫原性を検証するために、マウスチャレンジモデルを対象にそれらを試験した。０日目、１４日目および２８日目に０．１ｍｌの２４Ｆ−ＣＲＭ１９７一価コンジュゲートワクチンを用いて、幼若マウス（６〜８週齢）を免疫した（ｎ＝１０／群）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスは、１つの部位に０．１ｍｌを注射して腹腔内（ＩＰ）免疫した。ＣＤ−１マウスは、２つの部位に０．０５ｍｌを注射して筋肉内（ＩＭ）免疫した。免疫１回当たり、２５μｇのリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）とともに０．４μｇのＰｎＰｓ（ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた２４Ｆ多糖体）の用量で一価肺炎球菌ワクチンを投与した。病気または苦痛の徴候がないか、訓練を受けた動物ケアスタッフがマウスを少なくとも連日観察した。マウスに対するワクチン製剤は安全で忍容性が高いとみなされた。

５２日目にＳ．ニューモニエ血清型２４Ｆを用いて、マウスを気管内チャレンジした。Ｓ．ニューモニエの対数期培養物を遠心分離し、洗浄し、滅菌ＰＢＳに懸濁した。チャレンジの前にイソフルランを用いてマウスを麻酔した。切歯によって直立に吊したマウスの喉に、０．１ｍｌのＰＢＳ中の１０^６ｃｆｕのＳ．ニューモニエを入れた。舌を外側に軽く引っ張り、鼻孔を覆うことにより、細菌の吸引を誘導した。マウスの体重を連日測定し、体重減少が開始時体重の２０％を超えた場合は安楽死させた。２４時間、４８時間および７２時間の時点で血液を採取して、菌血症を評価した。病気または苦痛の徴候がないか、訓練を受けた動物ケアスタッフがマウスを少なくとも１日２回観察した。動物実験はいずれも、国立衛生研究所のＧｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの推奨事項に厳密に従って行った。マウスの実験プロトコルは、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ．のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。

２４Ｆ−ＣＲＭ１９７一価肺炎球菌コンジュゲートワクチンは、Ｓ．ニューモニエ２４Ｆを用いたチャレンジ後のマウスの３系統いずれにも防御的であることが分かった。図１０〜図１２を参照されたい。

［実施例７］
ウサギ多価試験のための肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製剤化
肺炎球菌多糖体−ＣＲＭ１９７コンジュゲートを使用して、様々なコンジュゲートバルクブレンド調製物（Ｓ．ニューモニエ血清型１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆおよび３１由来のものを含む）からなる多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンを調製し、総多糖体濃度８４μｇ／ｍＬに対して各血清型４μｇ／ｍＬで、２０ｍＭヒスチジンｐＨ５．８および１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび０．１％ｗ／ｖのポリソルベート−２０（ＰＳ−２０）に製剤化した。肺炎球菌多糖体（ＰｎＰｓ）型（Ｓ．ニューモニエ血清型１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆおよび３１由来のものを含む）にＣＲＭ１９７タンパク質を個別にコンジュゲートさせることによりコンジュゲートを調製した。個々のバルク多糖体濃度のバッチ容量および濃度に基づいて、個々の血清型の目標濃度を得るのに必要なバルクコンジュゲートの必要量を計算した。個々のコンジュゲートを、ヒスチジン、塩化ナトリウムおよびポリソルベート−２０（ＰＳ−２０）の溶液に加えてコンジュゲートブレンドを作製した。磁気撹拌棒を使用して、コンジュゲートブレンドを含む製剤容器を混合し、滅菌濾過して別の容器に入れた。次いで、製剤を、プラスチック製シリンジ、ガラス製シリンジまたはバイアルに充填し、２〜８℃で保存した。

［実施例８］
ニュージーランド白ウサギにおける多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンの免疫原性
０日目および１４日目（交互の体側部）に、実施例７に記載の２１価肺炎球菌コンジュゲートワクチン０．５ｍｌを用いて、成体ニュージーランド白ウサギ（ＮＺＷＲ、ｎ＝５／群）を筋肉内（ＩＭ）免疫した。免疫１回当たり各コンジュゲートＰｎＰｓ ２μｇでＰＣＶ２１肺炎球菌ワクチンを投与した。試験開始前（免疫前）および１４日目（投与後１、ＰＤ１）および２８日目（投与後２、ＰＤ２）に血清を採取した。病気または苦痛の徴候がないか、訓練を受けた動物ケアスタッフがＮＺＷＲを少なくとも連日観察した。ＮＺＷＲに対するワクチン製剤は、安全で忍容性が高いとみなされた。動物実験はいずれも、国立衛生研究所のＧｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの推奨事項に厳密に従って行った。ＮＺＷＲ実験プロトコルは、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，ＩｎｃおよびＣｏｖａｎｃｅ（Ｄｅｎｖｅｒ，ＰＡ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓによって承認された。

多重化電気化学発光（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）（ＥＣＬ）アッセイを使用して、ＮＺＷＲ血清のＩｇＧ免疫原性を評価した。電気化学的刺激により発光するＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）標識を利用する、ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤの一部門）によって開発された技術を使用する、Ｍａｒｃｈｅｓｅ ｅｔ ａｌ．（Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ，ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ｓｅｒｏｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ．Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６（３）：３８７−９６（２００９））によって記載されたヒトアッセイに基づいて、ウサギ血清に使用するためにこのアッセイを開発した。ＮＺＷＲ血清試料を試験するための二次抗体としてＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）標識抗ウサギＩｇＧを使用した。Ｏｐｓｏｔｉｔｅｒ（登録商標）３ソフトウェア（ＵＡＢ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｃａｒｏ−Ａｇｕｉｌａｒ ｅｔ ａｌ，２０１７、上記参照、Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００６、上記参照）を使用する、アラバマ大学バーミングハム校のＢａｃｔｅｒｉａｌ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙでオンラインで入手可能な前述のプロトコルに基づいて、ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ａｓｓａｙｓ（ＭＯＰＡ）によって機能的抗体を決定した。

多価肺炎球菌コンジュゲートワクチン中の、Ｓ．ニューモニエ血清型１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆおよび３１から調製された多糖体−タンパク質コンジュゲートは、投与後１（ＰＤ１）および投与後２（ＰＤ２）のいずれでもウサギに対して免疫原性であることが見出された（図１３）。これらはまた、ワクチン型細菌株を死滅させる機能的抗体を生成した（図１４）。２μｇの用量の多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンを用いて免疫したウサギでは、免疫前のウサギ血清と比較して、４つの血清型についてＰＤ１のＭＯＰＡ力価が有意に高かった（図１４）。２μｇの用量のＰＣＶ２１を用いて免疫したウサギでは、免疫前のウサギ血清と比較して、５つの血清型いずれについてもＰＤ２のＭＯＰＡ力価が有意に高かった（図１４）。ダネットの検定を用いた一元配置分散分析によって、Ｌｏｇ変換されたデータを分析して、有意性を決定した。

Claims (26)

1. 以下の構造を有する繰り返し単位を含む精製された多糖体：
   
2. 前記多糖体が５〜５０００の繰り返し単位を有する、請求項１に記載の多糖体。
3. 前記多糖体が５０〜１５００の繰り返し単位を有する、請求項１に記載の多糖体。
4. 前記多糖体が、ＭＡＬＳにより決定される１０ｋＤａ〜２０００ｋＤａの平均分子量を有する、請求項１に記載の多糖体。
5. 前記多糖体が、ＭＡＬＳにより決定される５０ｋＤａ〜１５００ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載の多糖体。
6. 以下の構造の繰り返し単位を有する多糖体から生成された活性化多糖体であって、
   前記多糖体は、化学試薬によって活性化されて、リンカーまたはキャリアタンパク質へのコンジュゲーションのための反応基を生成する、活性化多糖体。
7. 前記多糖体が過ヨウ素酸塩によって活性化される、請求項６に記載の活性化多糖体。
8. 以下の構造のいくつかの繰り返し単位を有する、請求項７に記載の活性化多糖体：
   
9. 以下の構造の繰り返し単位を有し、
   キャリアタンパク質にコンジュゲートされている多糖体を有する多糖体−タンパク質コンジュゲート。
10. 前記キャリアタンパク質が、ＣＲＭ１９７、ジフテリア毒素フラグメントＢ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢ Ｃ８、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴのフラグメントＣ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＴ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＴ、またはシュードモナス・エルギノーサ由来の外毒素Ａである、請求項９に記載の多糖体−タンパク質コンジュゲート。
11. 前記キャリアタンパク質がＣＲＭ１９７である、請求項１０に記載の多糖体−タンパク質コンジュゲート。
12. 前記多糖体−タンパク質コンジュゲートが１０００ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａの分子量を有する、請求項１１に記載の多糖体−タンパク質コンジュゲート。
13. 前記多糖体−タンパク質コンジュゲートが、０．４〜２．０の多糖体対タンパク質比を有する、請求項１１に記載の多糖体−タンパク質コンジュゲート。
14. 前記タンパク質が、アラビニトール糖の第２の炭素を介して前記多糖体にコンジュゲートされている、請求項１３に記載の多糖体−タンパク質コンジュゲート。
15. 請求項９から１４のいずれか一項に記載の多糖体−タンパク質コンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む免疫原性組成物。
16. ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８のうちの少なくとも１つに由来する莢膜多糖体を含む多糖体−タンパク質コンジュゲートをさらに含む、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
17. 存在する場合０．８〜８μｇ／ｍＬの多糖体を含有する血清型６Ｂ多糖体を除いて、０．４〜４μｇ／ｍＬの各多糖体と、多糖体の総量の約０．５倍〜３倍の量のＣＲＭ１９７キャリアタンパク質とを含有するように製剤化される、請求項１６に記載の免疫原性組成物。
18. １５０ｍＭ塩化ナトリウムと、２０ｍＭ Ｌ−ヒスチジン緩衝液と、０．０５〜２％ｗ／ｖの界面活性剤とをさらに含む、請求項１７に記載の免疫原性組成物。
19. アジュバントをさらに含む、請求項１８に記載の免疫原性組成物。
20. 前記アジュバントがアルミニウムベースのアジュバントである、請求項１９に記載の免疫原性組成物。
21. 前記アジュバントが、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムからなる群から選択される、請求項２０に記載の免疫原性組成物。
22. 前記アジュバントがリン酸アルミニウムである、請求項２１に記載の免疫原性組成物。
23. 前記リン酸アルミニウムアジュバントが０．０５〜０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項２２に記載の免疫原性組成物。
24. １５０ｍＭ塩化ナトリウムと、２０ｍＭ Ｌ−ヒスチジン緩衝液と、０．０５〜２％ｗ／ｖの界面活性剤とをさらに含む、請求項２３に記載の免疫原性組成物。
25. ストレプトコッカス・ニューモニエ莢膜多糖体に対する免疫応答を誘発する方法であって、請求項１５から２４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の免疫学的有効量をヒトに投与することを含む方法。
26. 前記免疫原性組成物が、存在する場合４μｇである血清型６Ｂ多糖体を除いて、２μｇの各多糖体と、約３２μｇのＣＲＭ１９７キャリアタンパク質と、０．１２５ｍｇのリン酸アルミニウムアジュバントと、１５０ｍＭ塩化ナトリウムと、２０ｍＭ Ｌ−ヒスチジン緩衝液と、０．２％ｗ／ｖのＰＳ−２０とを含有するように製剤化された単一の０．５ｍＬ用量である、請求項２５に記載の方法。