CN101610785A

CN101610785A - 多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物

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Publication number: CN101610785A
Application number: CNA2007800516615A
Authority: CN
Inventors: W·P·豪斯多夫; G·R·西贝尔; P·R·帕拉迪索; A·K·普拉萨德
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 2006-12-22
Filing date: 2007-12-10
Publication date: 2009-12-23
Anticipated expiration: 2027-12-10
Also published as: KR20090096731A; SI2417983T1; ATE545431T1; WO2008143709A2; KR101511392B1; PL2417983T3; CL2007003782A1; ES2424940T3; AU2007353769B2; DK2094298T3; WO2008143709A3; EP2094298A2; HK1191567A1; IL222793A; DK2417983T3; CA2673477A1; KR101700837B1; AU2007353769A1; JP5523836B2; PL2094298T3

Abstract

描述了具有13种不同的多糖－蛋白质缀合物和任选地基于铝的佐剂的免疫原性组合物。每种缀合物含有缀合到载体蛋白的从肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的不同血清型(1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F)制备的荚膜多糖。配制为疫苗的免疫原性组合物总体上增加对婴儿和幼儿中肺炎球菌疾病的覆盖，并且提供了对血清型6A和19A的覆盖，其中所述血清型6A和19A不依赖于血清组交叉保护的限制。还描述了制备包含与载体蛋白共价连接的肺炎链球菌血清型3多糖的免疫原性缀合物的方法，该方法包括在二价阳离子的存在下用高碘酸氧化所述多糖。

Description

多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物

发明领域

本发明总体上涉及医药领域，并具体地涉及微生物学、免疫学、疫苗和通过免疫预防细菌病原体感染。

发明背景

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是世界上婴儿和幼儿中脑膜炎、肺炎和严重侵入性疾病的主要病因。多年前就批准了多价肺炎球菌多糖疫苗并且已经证明其在老年人和高危病人中预防肺炎球菌疾病是有价值的。然而，婴儿和幼儿对多数肺炎球菌多糖应答很弱。7价肺炎球菌缀合物疫苗(7vPnC，

)是第一种表明对婴儿和幼儿中侵入性疾病和中耳炎具有高度免疫原性和有效的疫苗。该疫苗现在在世界上许多国家被批准。Prevnar含有来自血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的荚膜多糖，每种多糖缀合到称作CRM₁₉₇的载体蛋白。Prevnar在美国、欧洲和世界的其他地区分别覆盖约80-90％、60-80％和40-80％侵入性肺炎球菌疾病(IPD)[1，2]。Prevnar的引入后数年中收集的监视数据已经清楚地表明如所预期的，在美国婴儿中侵入性肺炎球菌疾病减少(图1)[3，4]。

在Prevnar引入前美国婴儿中进行的IPD监视表明由于血清群6和19的疾病的大部分是由于6A(约1/3)和19A(约1/4)血清型[5，6]导致的。在Prevnar批准后，在美国进行的肺炎球菌侵入性疾病监视表明大部分的疾病仍然归因于血清型6A和19A(图1)[3]。此外，这两种血清型造成比血清型1、3、5和7F总和还要多的侵入性疾病病例(100,000个2岁以下儿童中8.2对3.3例)。此外，血清型6A和19A与高比率的抗生素抗性有关(图2)[7，8，9]。尽管随着更多儿童被免疫，可能血清组交叉保护将导致血清型6A和19A疾病的下降，但是有证据表明该下降将很有限，并且由于这些血清型引起的疾病的很大负担将保持(见下文)。

考虑到由于血清型1、3、5、6A、7F和19A的侵入性肺炎球菌疾病的相对负担和重要性，向Prevnar制剂中加入这些血清型将在美国和欧洲增加侵入性疾病的覆盖率到＞90％，在亚洲和拉丁美洲高达70％-80％。该疫苗将显著扩大Prevnar的覆盖度，并且提供对6A和19A的覆盖，其不依赖于血清组交叉保护的限制。

发明概述

因此，本发明总体上提供了包含13种不同的多糖-蛋白质缀合物的多价免疫原性组合物，其中每种缀合物含有缀合到载体蛋白的来自不同血清型的肺炎链球菌的荚膜多糖，以及生理学上可接受的载体。任选地，在该制剂中包含佐剂，如基于铝的佐剂。更具体地，本发明提供了13价肺炎球菌缀合物(13vPnC)组合物，其包含7vPnC疫苗中的7种血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)加上6种附加的血清型(1、3、5、6A、7F和19A)。

本发明还提供了多价免疫原性组合物，其中荚膜多糖来自肺炎链球菌的血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F并且载体蛋白是CRM₁₉₇。

本发明还提供了多价免疫原性组合物，其中荚膜多糖来自肺炎链球菌的血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F，载体蛋白是CRM₁₉₇，并且佐剂是基于铝的佐剂，诸如磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝。在本发明的一个具体实施方案中，佐剂是磷酸铝。

本发明还提供了多价免疫原性组合物，其包含多糖-蛋白质缀合物以及生理学上可接受的载体，其中每种缀合物包含缀合到载体蛋白的来自肺炎链球菌的不同血清型的荚膜多糖，并且所述荚膜多糖制备自血清型3和至少一种额外的血清型。

在该多价免疫原性组合物的一个实施方案中，额外的血清型选自血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。在另一实施方案中，载体蛋白是CRM₁₉₇。在再一个实施方案中，组合物包含佐剂，诸如选自磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝的基于铝的佐剂。在一个具体实施方案中，佐剂是磷酸铝。

本发明还提供了多价免疫原性组合物，其包含多糖-蛋白质缀合物和生理学上可接受的载体，其中每种缀合物包含缀合到载体蛋白的来自肺炎链球菌的不同血清型的荚膜多糖，并且该荚膜多糖制备自血清型4、6B、9V、14、18C、19F、23F和至少一种额外的血清型。

在该多价免疫原性组合物的一个实施方案中，额外的血清型选自血清型1、3、5、6A、7F和19A。在另一实施方案中，载体蛋白是CRM₁₉₇。在再一个实施方案中，组合物包含佐剂，诸如选自磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝的基于铝的佐剂。在一个具体实施方案中，佐剂是磷酸铝。

本发明还提供了诱导对肺炎链球菌荚膜多糖缀合物的免疫应答的方法，其包括对人施用免疫有效量的前述任一种免疫原性组合物。

本发明还提供了施用的任一种免疫原性组合物是单个的0.5mL剂量，其经配制成含有：除了4μg6B外，2μg每种糖；约29μg CRM₁₉₇载体蛋白；0.125mg元素铝(0.5mg磷酸铝)佐剂；和作为赋形剂的氯化钠和琥珀酸钠缓冲剂。

还提供了制备包含与载体蛋白共价连接的肺炎链球菌血清型3(Pn 3)多糖的免疫原性缀合物的方法。在一个实施方案中，该方法包括(i)使纯化的Pn 3多糖与温和的酸反应，得到水解的Pn 3多糖；(ii)在二价阳离子的存在下使水解的Pn 3多糖与氧化剂反应，得到活化的Pn 3多糖；(iii)使活化的Pn 3多糖与载体蛋白混合；(iv)使混合且活化的Pn 3多糖和载体蛋白与还原剂反应，得到Pn 3多糖：载体蛋白缀合物；和(v)封闭Pn 3多糖：载体蛋白缀合物中未反应的醛，得到包含与载体蛋白共价连接的肺炎链球菌Pn 3多糖的免疫原性缀合物。

在一个其它实施方案中，该方法包括：(i)使纯化的Pn 3多糖与乙酸反应，得到水解的Pn 3多糖；(ii)在MgCl₂的存在下使水解的Pn 3多糖与高碘酸反应，得到活化的Pn 3多糖；(iii)纯化活化的Pn 3多糖；(iv)使活化的Pn3多糖与载体蛋白混合；(v)共同冻干混合且活化的Pn 3多糖和载体蛋白；(vi)使共同冻干且活化的Pn 3多糖和载体蛋白与氰基硼氢化钠反应，得到Pn3多糖：载体蛋白缀合物；和(vii)用硼氢化钠封闭Pn 3多糖：载体蛋白缀合物中未反应的醛，得到包含与载体蛋白共价连接的肺炎链球菌Pn3多糖的免疫原性缀合物。

还提供了制备活化的肺炎链球菌Pn3多糖的方法。该方法包括：(i)使纯化的Pn 3多糖与温和的酸反应，得到水解的Pn 3多糖；和(iii)在二价阳离子的存在下使水解的Pn 3多糖与氧化剂反应，得到活化的Pn 3多糖。

附图简述

图1描绘了在美国年龄＜2岁的儿童从基线(1998/1999)到2001年按照血清型的IPD比率的改变。

图2描绘了在＜5岁的儿童中具有青霉素(PCN)抗性的肺炎球菌分离株的分布(1998)。

图3描绘了来自D118-P16 Prevnar试验的第三次剂量后OPA的倒数累积分布曲线(reverse cumulative distribution；RCDC)。

发明详述

Prevnar血清型4、6B、9V、14、18C、19F、23F的包括

来自1995-1998年间IPD监视的数据估计Prevnar中的7种血清型造成＜2岁年龄的儿童中约82％的IPD[5]。在加利福尼亚北部功效试验地点，Prevnar血清型占婴儿和幼儿中所有IPD病例的90％[10]。自从在2000年引入Prevnar疫苗，由于该疫苗血清型引起的疾病的下降，总的IPD率显著降低[3，4]。因此，在此时没有理由从下一代肺炎球菌缀合物疫苗除去任一种Prevnar血清型，而是加入血清型以得到更宽的覆盖范围。

血清型1、3、5和7F的包括

在美国，5岁以下儿童中血清型1引起的IPD率＜2％，对于血清型3和7F的每一种大概相同[1，6]。血清型1和5占具有侵入性肺炎球菌疾病的高危美国人口中IPD的较高发病率。具体地，血清型1引起阿拉斯加＜2岁的本地儿童中3.5％的IPD，和2-4岁儿童中18％的IPD[11]。血清型1和血清型5在世界的其他地方和发达国家的土著人口中显著致病[12，13，14]。

与其他肺炎球菌血清型相比，血清型1也与更严重的疾病有关[15]。该观察是基于美国和欧洲之间病例鉴定率的差异，和医疗实践中相关的差异。总体上，IPD的发病率在欧洲低于美国。然而，在欧洲由血清型1引起的IPD的百分比不成比例地高于美国(分别为6-7％对1-2％)。在欧洲，血液培养物主要从住院儿童得到。在美国，在门诊病人从发热≥39℃并且具有升高的白细胞数的儿童得到血液培养物是常规的医疗实践。考虑到医疗实践的差异，推测在美国血清型1引起的疾病的较低百分比可能被引起较轻的疾病的其他血清型的较高比率稀释，而欧洲的较高百分比反映了更严重的疾病。此外，具有并发肺炎的儿童的血清流行病学研究表明血清型1被不成比例地表示[16，17，18]。这提示血清型1的包括可以降低严重肺炎球菌疾病的量，以及促进侵入性肺炎球菌疾病的总的减少。

加入血清型3和7F将在世界上的多数地区对IPD的覆盖率增加约3％-7％，在亚洲增加约9％。从而，11价疫苗将覆盖亚洲中的约50％和所有其他地区中IPD的约80％[1，2]。这些血清型对于中耳炎覆盖率也是重要的[19]。在引起中耳炎的肺炎球菌血清型的多国家研究中，Hausdorff等人发现血清型3是第8位最普遍的总体中耳液分离物[20]。血清型3占与中耳炎相关的肺炎球菌血清型的高达8.7％。因而，在中耳炎以及IPD中血清型3和7F的重要性保证它们包括在肺炎球菌缀合物疫苗中。

然而，产生显示出就血清型3多糖而言的显著免疫原性的多价肺炎球菌缀合物疫苗的尝试没有成功。例如，在11价肺炎球菌蛋白D缀合物疫苗(11-Pn-PD)的免疫原性和安全性研究中，在接受三剂该疫苗接着接受相同疫苗或者肺炎球菌多糖疫苗的加强剂量的婴儿中没有观察到血清型3的引发效果(Nurkka等人(2004)Ped.Inf.Dis.J.，23：1008-1014)。在另一研究中，来自已经接受11-Pn-PD剂量的婴儿的调理吞噬测定(OPA)没有显示出在与其他测试的血清型相当的水平上对血清型3的抗体应答(Gatchalian等人，17^th Annual Meeting of the Eur.Soc.Paed.Inf.Dis.(ESPID)，Poster No.4，P1A Poster Session 1，Istanbul Turkey，2001年3月27日)。在再一个研究中，评估了11-Pn-PD在预防急性中耳炎中的功效，疫苗没有提供对血清型3引起的发作的保护(Prymula等人(2006)Lancet，367：740-748)。因此，包含来自血清型3的荚膜多糖和能够引起对血清型3多糖的免疫原性应答的肺炎球菌缀合物疫苗提供了在本领域现状上的显著进步。

血清型6A和19A的包括

a.血清型6A和19A的流行病学

文献中的监视数据提示血清型6A和19A与血清型1、3、5、和7F组合相比，造成美国＜2岁的儿童中更多的侵入性肺炎球菌疾病(图1)[1，5]。此外，这些血清型通常与抗生素抗性有关(图2)并且在中耳炎中起重要作用[6，19，20]。当前的Prevnar疫苗保护6A和19A引起的疾病的能力还不清楚。下面讨论在13vPnC疫苗中包括6A和19A组分的原理。

b.6B和19F多糖诱导的对6A和19A的应答

所批准的未缀合的肺炎球菌多糖疫苗(用于至少2岁的人中)已经含有6A或6B荚膜多糖，但是不含有两者[21]。在配制23价肺炎球菌多糖疫苗时产生的免疫原性数据表明6B单价疫苗诱导针对6A和6B荚膜的抗体。使用游离多糖和使用肺炎球菌缀合物疫苗在多种群体中评估IgG和调理吞噬测定(OPA)应答的几个试验的数据表明针对6A的IgG应答通过6B抗原诱导，但是该应答通常较低，并且使用6A生物的OPA活性与使用6B生物的不同[22，23，24，25]。此外，以高6B抗体应答的受试者可以对6A有很小活性或无活性。

与6A和6B荚膜多糖的化学组成(其中存在高度相似性)相反，19A和19F荚膜由于在19A多糖中存在两条额外侧链而相当不同。不令人惊奇的是，在用19F多糖疫苗免疫的人类志愿者中测量的免疫应答表明在80％的受试者中诱导了对19F的应答，但是仅20％的受试者具有对19A的应答[26]。用19F多糖免疫后对血清型19A的低水平的交叉反应性IgG和OPA应答也已经在使用缀合物疫苗的试验中记载[24，26]。

已经从在美国婴儿中进行的7vPnC桥接试验(D118-P16)产生了关于对6A和19A的交叉反应性OPA应答的内部数据(图3)。这些研究与其他人的发现一致，并且表明用6B多糖免疫后诱导对6A多糖的交叉反应性功能抗体，尽管在较低水平，和用19F免疫后对19A的极低的功能抗体。

动物模型中6B和19F免疫对6A和19A的影响

已经用动物模型评估用多糖免疫的交叉保护的潜力。在Giebink等人开发的中耳炎模型中，用四价多糖外膜蛋白(OMP)缀合物疫苗(含有6B、14、19F、23F糖)或安慰剂免疫灰鼠[27]。在该试验中，显示对6A有一定的交叉保护；然而，这没有达到统计学显著性并且保护水平低于用6B对中耳炎的保护水平。在该相同模型中，存在对19F中耳炎的100％保护，但是对19A中耳炎仅有17％的保护。

Saeland等人在肺感染模型中，在用6A生物进行鼻内攻击之前，使用来自用8价肺炎球菌破伤风缀合物疫苗(含有6B和19F)免疫的婴儿血清被动免疫小鼠[28]。在59个血清样品中，53％的样品保护小鼠抵抗具有6B的菌血症，37％的样品保护抵抗6A。在相同模型中用来自4剂11价肺炎球菌缀合物疫苗(含有缀合到破伤风类毒素的19F)免疫的婴儿的血清被动免疫的小鼠被给予19A生物的鼻内攻击[29]。在100只被动免疫然后攻击的小鼠中，60只小鼠在肺组织中没有检测到19A生物，而在给予盐水安慰剂的所有小鼠中鉴定到生物。然而，在该模型中，被动免疫不能保护用19F生物的攻击；因此，该模型对于血清群19的相关性是可疑的。通常，这些模型提供证据证明6B免疫对6A生物的一定的生物学影响，尽管对异源血清型的影响没有用同源血清型观察到的大。从这些模型还没有很好地了解19F免疫对19A生物的影响。

在功效/有效性试验中6B和19F多糖缀合物免疫对6A和19A疾病的影响

表1中指出了在7vPnC和9vPnC(7vPnC加血清型1和5)功效试验中由于6B、6A、19F和19A血清型导致的疾病病例数[30，10，31]。侵入性疾病病例的数目太小而不能对血清型6A和19A得出任何结论。然而，Finnish中耳炎试验产生了大量肺炎球菌分离菌[32]。在根据方案分析(per protocolanalysis)中，7vPnC对由于血清型6B引起的中耳炎为84％(95％Cl 62％，93％)有效，对由于血清型6A引起的中耳炎为57％(95％Cl 24％，76％)有效(表1)。相反，对由于19F或者19A引起的中耳炎没有显示使用7vPnC的血清型特异的功效。

表1.在使用7vPnC和9vPnC疫苗的功效试验中，由于血清型6B、6A、19F和19A引起的肺炎球菌疾病的病例

^＊显示的统计学显著功效

来自参考文献30、10和33，和个人交流

Contr＝对照

ITT＝打算治疗分析

PP＝根据方案分析

还可以从疾病控制中心(Centers for Disease Control)进行的病例-对照试验得到上市后IPD监视数据以评估Prevnar的有效性[33]。在监视实验室中鉴定了3到23个月大的儿童中发生肺炎球菌侵入性疾病的病例并通过年龄和邮政编码与三个对照病例匹配。得到知情同意后，从病例和对照的父母和医学提供者得到医疗和免疫史(如果受试者接受了至少一剂Prevnar，那么认为他们是被免疫的)。初步结果在2003年ICAAC会议上给出并且在表2中给出对6B、19F、19A和6A疾病的发现总结。这些数据表明Prevnar能够预防由于6A引起的疾病，尽管其水平比血清型6B疾病低一些。这些数据还表明对由于19A引起的侵入性疾病的交叉保护是有限的。

表2.CDC进行的病例对照试验的初步结果(在2003年ICAAC上给出)

血清型	信息集，n	VE^＊(95％Cl)
血清型	信息集，n	VE^＊(95％Cl)	疫苗类型，所有	115	94(87，97)
疫苗相关的，所有	36	70(38，86)	疫苗类型，所有	115	94(87，97)
疫苗相关的，所有	36	70(38，86)	非疫苗类型，所有	43	-4(-106，48)
6B	27	94(72，99)	非疫苗类型，所有	43	-4(-106，48)
6B	27	94(72，99)	19F	19	73(16，92)
6A	15	87(53，97)	19F	19	73(16，92)
6A	15	87(53，97)	19A	16	40(-87，80)

^＊比较接种的(≥1剂)对比未接种的疫苗有效性，并对基础条件调节参照40和个人/机密交流

Prevnar使用的经公布的分析[3]也表明在2岁以下儿童中血清型6A和19A引起的IPD中，血清型6B和19F赋予适度减少([3]中的表1)。在未免疫的成年人中由血清型6A、9A、9L、9N、18A、18B、18F、19A、19B、19C、23A和23B(“都是疫苗相关的血清型”)引起疾病发生率有一定的降低([3]中的表2)。这些数据确定在2岁以下儿童中使用Prevnar的群体免疫力对于血清型6A和19A是中等的，并且提供了在本发明的13vPnC疫苗中包括血清型6A和19A的基础。

加入6A和19A的结论

在图1和表2中使用7vPnC疫苗的上市后监视数据和病例-对照研究表明，与上述关于动物中免疫应答和性能的其他信息相一致，可能存在对6A疾病的一定的交叉保护，但是比对6B疾病的交叉保护程度较低。此外，似乎对19A的保护是有限的。因此，含有血清型6A和19A的13vPnC疫苗提供了覆盖，其不依赖于血清型6B和19F对血清组交叉保护的限制。

因此，本发明提供了包含13种不同的多糖-蛋白质缀合物的多价免疫原性组合物，其中每种缀合物含有缀合到载体蛋白的不同的荚膜多糖缀合物，并且其中从肺炎链球菌的血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F制备荚膜多糖，以及生理学上可接受的载体。一种此类载体蛋白是称作CRM₁₉₇的白喉类毒素。免疫原性组合物可以还包含佐剂，如基于铝的佐剂，诸如磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝。

通过本领域技术人员已知的标准技术制备荚膜多糖。在本发明中，从肺炎链球菌的血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F制备荚膜多糖。通过单独的方法制备这些肺炎球菌缀合物并配制成单剂量制剂。例如，在一个实施方案中，在基于大豆的培养基中培养每种肺炎球菌多糖血清型。然后通过离心、沉淀、超滤和柱层析纯化各种多糖。将纯化的多糖化学活化以使得该糖能够与载体蛋白反应。

一旦活化，将每种荚膜多糖单独缀合到载体蛋白以形成复合糖。在一个实施方案中，每种荚膜多糖缀合到相同的载体蛋白。在该实施方案中，通过还原胺化实现缀合。

通过常规方法实现多糖的化学活化和随后缀合到载体蛋白。见，例如，美国专利号4,673,574和4,902,506[34，35]。

载体蛋白优选是无毒并且非反应原性并且可以以足够的量和纯度得到的蛋白质。载体蛋白应该服从标准的缀合步骤。在本发明的一个具体实施方案中，将CRM₁₉₇用作载体蛋白。

CRM₁₉₇(Wyeth，Sanford，NC)是从在基于酪蛋白氨基酸和酵母提取物的培养基中生长的白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheria)菌株C7(β197)的培养物分离的白喉毒素的非毒性变体(即，类毒素)。通过超滤、硫酸铵沉淀和离子交换层析纯化CRM₁₉₇。备选地，根据美国专利号5,614,382重组制备CRM₁₉₇，将该专利引入本文作为参考。其他白喉类毒素也适于用作载体蛋白。

其他合适的载体蛋白包括灭活的细菌毒素，诸如破伤风类毒素、百日咳类毒素、霍乱类毒素(例如，如国际专利申请WO2004/083251中所述[38])、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST、和来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的外毒素A。也可以使用细菌外膜蛋白，诸如外膜复合体c(OMPC)、孔蛋白、转铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌黏附素蛋白(PsaA)、来自A组或者B组链球菌的C5a肽酶、或者流感嗜血杆菌蛋白D。其他蛋白质，如卵白蛋白、匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或者结核菌素的纯化的蛋白质衍生物(PPD)也可以用作载体蛋白。

荚膜多糖缀合到载体蛋白后，通过多种技术纯化多糖-蛋白质缀合物(就多糖-蛋白质缀合物的量而言富集)。这些技术包括浓缩/渗滤操作、沉淀/洗脱、柱层析和深层过滤(depth filtration)。见下面的实施例。

纯化各糖缀合物后，将它们混合以配制本发明的免疫原性组合物，其可以用作疫苗。使用本领域公知的方法可以完成本发明的免疫原性组合物的配制。例如，可以用生理学上可接受的载体配制13种各自的肺炎球菌缀合物以制备组合物。此类载体的实例包括，但不限于，水、缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)和右旋糖(dextrose)溶液。

在一些实施方案中，免疫原性组合物将包含一种或多种佐剂。如本文定义的，“佐剂”是用于增强本发明的免疫原性组合物的免疫原性的物质。因此，通常给予佐剂以加强免疫应答并且佐剂是技术人员公知的。用于增强组合物的有效性的合适的佐剂包括，但不限于：

(1)铝盐(alum)，诸如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝，等等；

(2)水包油乳液制剂(有或者没有其他特定免疫刺激剂，诸如胞壁酰基肽(下文定义)或者细菌细胞壁组分)，如，

(a)MF59(PCT公布号WO 90/14837)，含有5％鲨烯，0.5％吐温80，和0.5％司盘85(任选含有不同量的MTP-PE(见下文，尽管不是所需的)，使用微流化床装置诸如110Y型微流化床装置(Microfluidics，Newton，MA)配制成亚微米颗粒，

(b)SAF，含有10％鲨烯，0.4％吐温80，5％Pluronic嵌段聚合物L121，和thr-MDP(见下文)，微流化成亚微米乳液或者经涡旋以产生较大颗粒大小的乳液，和

(c)Ribi^TM佐剂系统(RAS)，(Corixa，Hamilton，MT)，含有2％鲨烯，0.2％吐温80，和选自美国专利号4,912,094中描述的3-O-脱酰化的单磷酸脂A(MPL^TM)的一种或多种细菌细胞壁组分(Corixa)，海藻糖二霉菌酸酯(TDM)，和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(Detox^TM)；

(3)皂苷佐剂，可以使用如Quil A或STIMULON^TM QS-21(Antigenics，Framingham，MA)(美国专利号5,057,540)或者从其产生的颗粒，如ISCOMs(免疫刺激复合物)；

(4)细菌脂多糖，合成的脂类A类似物，如氨基烷基葡糖胺磷酸酯化合物(AGP)，或者其衍生物或类似物，其可以从Corixa得到，并且在美国专利号6,113,918中描述；一种此类AGP是2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰基氨基]乙基2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-十四酰氧基十四酰基]-2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰基氨基]-b-D-吡喃葡萄糖苷，其也称作529(以前称作RC529)，其配制为水性形式或者稳定的乳剂，合成的多核苷酸，诸如含有CpG基序的寡核苷酸(美国专利号6,207,646)；

(5)细胞因子，诸如白介素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18，等)，干扰素(例如，γ干扰素)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，肿瘤坏死因子(TNF)，共刺激分子B7-1和B7-2，等等；

(6)细菌ADP-核糖基化毒素的脱毒突变体，诸如野生型或者突变型的霍乱毒素(CT)，例如，其中氨基酸位置29的谷氨酸被另一氨基酸，优选被组氨酸替换(根据公布的国际专利申请号WO 00/18434(也见WO02/098368和WO 02/098369))，百日咳毒素(PT)，或者大肠杆菌不耐热毒素(LT)，尤其是LT-K63、LT-R72、CT-S109、PT-K9/G129(见例如WO 93/13302和WO 92/19265)；和

(7)作为免疫刺激剂以增强组合物的有效性的其他物质。

胞壁酰基肽包括，但不限于N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰基-L-丙氨酸-2-(1’-2’二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺(MTP-PE)等等。

本发明的疫苗组合物可以用于保护或者治疗对肺炎球菌感染易感的人，这可通过全身或者粘膜途径施用疫苗来完成。这些施用可以包括通过肌内、腹膜内、皮内或者皮下途径注射，或者通过粘膜施用于口/消化道、呼吸或者泌尿生殖道。在一个实施方案中，鼻内施用用于治疗肺炎或者中耳炎(因为肺炎球菌的鼻咽携带可以更有效预防，从而减轻在其最早阶段的感染)。

选择每个疫苗剂量中缀合物的量作为诱导免疫保护而无明显的不利作用的量。此类量可以取决于肺炎球菌血清型而变化。通常，每剂将包含0.1到100μg多糖，尤其0.1到10μg，更尤其1到5μg。

通过包括观察受试者中合适的免疫应答的标准研究确定具体疫苗的组分的最佳量。最初接种后，受试者可以接受足够间隔的一次或几次加强免疫。

在本发明的一个具体实施方案中，13vPnC疫苗是各自缀合到CRM₁₉₇的血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的肺炎球菌荚膜多糖的无菌液体制剂。每0.5mL剂量被配制成含有：除了4μg6B之外，2μg每种糖；约29μg CRM₁₉₇载体蛋白；0.125mg元素铝(0.5mg磷酸铝)佐剂；和作为赋形剂的氯化钠和琥珀酸钠缓冲剂。将液体填充到没有防腐剂的单剂量注射器中。摇动后，疫苗是可用于肌内施用的均匀、白色混悬液。

13vPnC疫苗的剂量水平的选择类似于上市的7vPnC疫苗(Prevnar)。为所有血清型选择2μg糖剂量水平，只是对于6B为每剂4μg。7vPnC疫苗对于血清型4、9V、14、18C、19F和23F在2μg糖剂量水平和对于6B在4μg剂量水平已经显示出对于IPD的所希望的安全性、免疫原性和功效。

免疫方案可以按照为7vPnC疫苗指定的方案。例如，针对肺炎链球菌由于13vPnC疫苗中包括的血清型引起的侵入性疾病，婴儿和刚学步的小孩的常规方案是2、4、6和12-15个月的年龄。本发明的组合物也适于更大的儿童、青少年和成人使用。

本发明的组合物可以还包括一种或多种额外的抗原，其用于抵抗其他细菌感染引起的中耳炎。此类细菌包括非典型流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenza)、粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)(以前称作粘膜炎布兰汉球菌(Branhamella catarrhalis))和Alloiococcus otitidis。

适于包括的非典型流感嗜血杆菌抗原的实例包括P4蛋白，也称作蛋白“e”(美国专利号5,601,831；国际专利申请WO03/078453)，P6蛋白，也称作PAL或者PBOMP-1蛋白(美国专利号5,110,908；国际专利申请WO0100790)，P5蛋白(美国再版专利号37,741)，嗜血杆菌粘附和穿透蛋白(美国专利号6,245,337和6,676,948)，LKP尖端黏附素蛋白(美国专利号5,643,725)和NucA蛋白(美国专利号6,221,365)。

适于包括的粘膜炎莫拉菌抗原的实例包括UspA2蛋白(美国专利号5,552,146，6,310,190)，CD蛋白(美国专利号5,725,862)，E蛋白(美国专利号5,948,412)和74千道尔顿外膜蛋白(美国专利号6,899,885)。

适于包括的Alloiococcus otitidis抗原的实例包括国际专利申请WO03/048304中鉴定的那些。

本发明的组合物还可以包括一种或多种来自肺炎链球菌的蛋白质。适于包括的肺炎链球菌蛋白质的实例包括国际专利申请WO02/083855中鉴定的那些以及国际专利申请WO02/053761中描述的那种。

本发明的组合物可以还包括一种或多种来自B型脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的蛋白质。适于包括的B型脑膜炎奈瑟氏球菌蛋白质的实例包括国际专利申请WO03/063766、WO2004/094596、WO01/85772、WO02/16612和WO01/87939中鉴定的那些。

用于缀合的肺炎球菌血清型3多糖的活化

已有效地应用多糖中碳水化合物的部分氧化来产生醛基，然后使所述醛基与载体蛋白的赖氨酸残基偶联以产生免疫原性缀合物(即，用于在脊椎动物中刺激或诱发特异免疫反应的组合物，诸如疫苗)。在许多应用中，通用氧化剂高碘酸钠提供了在与载体蛋白偶联之前的多糖中碳水化合物的有效氧化。然而，用高碘酸钠直接氧化Pn 3多糖可产生几乎不存在残余醛的降解的多糖。备选的氧化方案在二价阳离子(例如，Mg²⁺或Ca²⁺)的存在下混合高碘酸钠，并且提供了Pn 3多糖的有效氧化。

表3：应用高碘酸/MgCl₂的Pn 3的氧化数据

样品ID	高碘酸量(meq)^＊＊	氧化(小时)	温度(℃)	DO#^＊＊＊	Kd#(CL4B)
样品ID	高碘酸量(meq)^＊＊	氧化(小时)	温度(℃)	DO#^＊＊＊	Kd#(CL4B)	PP3^＊天然	0	--	4	0.0	0.048
PP3氧化的	0.2	16	25	5.8	0.24	PP3^＊天然	0	--	4	0.0	0.048
PP3氧化的	0.2	16	25	5.8	0.24	PP3氧化的	0.2	72	4	9.0	0.1
PP3氧化的	1	16	4	13.2	0.24	PP3氧化的	0.2	72	4	9.0	0.1
PP3氧化的	1	16	4	13.2	0.24	PP3氧化的	1	16	25	4.1	0.24
PP3氧化的	1	72	4	7.9	0.29	PP3氧化的	1	16	25	4.1	0.24

^＊PP3：天然的肺炎球菌多糖3型

^＊＊Meq：摩尔当量

^＊＊＊DO：氧化程度

为了降低粘稠度和相关过滤问题，首先应用温和的酸使Pn 3多糖进行水解/解聚，所述酸诸如是乙酸、柠檬酸或碳酸。在水解/解聚后，应用控制量的氧化剂进行部分氧化以产生“活化的”Pn3多糖。可以使用将末端羟基氧化为醛的任何选择性氧化剂，包括特异糖氧化酶(例如，高碘酸钠或钾，或高碘酸)。如上面所讨论的那样，优选的氧化剂是在二价阳离子存在下的高碘酸。然后任选地纯化活化的Pn 3多糖(例如通过相对缓冲盐水的渗滤)。

活化的Pn 3多糖可与载体蛋白混合。可以选择载体蛋白以增加结合的Pn3多糖的免疫原性和/或以诱发针对载体蛋白的抗体，其是诊断、分析和/或治疗有益的。将抗原分子(例如，多糖)与载体共价连接赋予增强的免疫原性和T-细胞依赖性(Pozsgay等人(1999)PNAS，96：5194-97；Lee等人(1976)J.Immunol.，116：1711-18；Dintzis等人(1976)PNAS，73：3671-75)。如本文讨论的那样，有用的载体蛋白包括灭活的细菌毒素，诸如破伤风类毒素、百日咳类毒素、霍乱类毒素(例如，如国际专利申请WO2004/083251中所述)、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST、和来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的外毒素A。也可以使用细菌外膜蛋白，诸如外膜复合体c、孔蛋白、转铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A、肺炎球菌黏附素蛋白、来自A组或者B组链球菌的C5a肽酶、或者流感嗜血杆菌蛋白D。其他蛋白质，诸如卵白蛋白、匙孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白或者结核菌素的纯化的蛋白质衍生物也可以用作载体蛋白。优选的载体蛋白是突变的白喉毒素CRM₁₉₇。在与载体蛋白混合后，任选地冷冻(例如，滚动冷冻(shell frozen))和共冻干活化的Pn 3多糖/载体蛋白混合物。

通过使活化的Pn 3多糖/载体蛋白混合物与还原剂如氰基硼氢化钠反应来进行缀合。然后通过硼氢化钠还原来封闭未反应的醛。纯化缀合物(例如，通过相对磷酸缓冲液渗滤，随后相对缓冲盐水渗滤)，得到在缓冲盐水中的终批次浓度的糖缀合物。

上面的公开一般性描述了本发明。通过下面的特定实施例可以更完全地理解本发明。这些实施例仅仅用于阐明的目的并且不意在限定本发明的范围。

实施例

实施例1

制备肺炎链球菌荚膜多糖血清型1

制备主细胞库和工作细胞库

从美国典型培养物保藏中心ATCC菌株6301得到肺炎链球菌血清型1。产生几代种子原种以便扩大菌株和除去动物来源的组分(F1、F3和F3代)。产生两个额外代的种子原种。从F3瓶得到第一额外的世代，从第一个额外世代瓶得到随后的世代。冷冻保存(＜-70℃)种子瓶，用合成的甘油作为冷藏剂。除了冷冻瓶外，为F4代制备冻干的瓶。为了制备细胞库，在基于大豆的培养基中培养所有培养物。冷冻前，通过离心浓缩细胞，除去用尽的培养基，将细胞沉淀物重悬浮在含有诸如合成甘油的冷藏剂的新鲜培养基中。

发酵和收获

来自工作细胞库的培养物用于接种含有基于大豆的培养基的种子瓶。将瓶子在36℃±2℃、不搅拌下温育直到满足生长要求。种子瓶用于接种含有基于大豆的培养基的种子发酵罐。用无菌碳酸钠溶液保持约7.0的pH。达到目标光密度后，用种子发酵罐接种含有基于大豆的培养基的生产发酵罐。用无菌碳酸钠溶液保持pH。生长停止后或者达到发酵罐的工作体积后终止发酵。向培养物加入合适量的无菌的12％脱氧胆酸钠以裂解细菌细胞和释放细胞相关的多糖。裂解后，冷却发酵罐内容物。用乙酸调节裂解的培养液的pH到约pH6.6。通过连续流动离心接着深层过滤和0.45μm微量过滤澄清裂解物。

在一个备选方法中，用3N NaOH保持约7.0的发酵pH。达到目的光密度后，用种子发酵罐接种含有基于大豆的培养基的生产发酵罐。用3NNaOH保持pH。生长停止后或者达到发酵罐的工作体积后终止发酵。向培养物加入合适量的无菌的12％脱氧胆酸钠在培养液中得到0.12％的浓度，以裂解细菌细胞和释放细胞相关的多糖。裂解后，在7℃到13℃的温度搅拌下，对发酵罐内容物保持8到24小时之间的时间间隔，以确保已经发生了完全的细胞裂解和多糖释放。该保持期间的搅拌防止裂解沉积物沉淀在发酵罐壁和pH探头上，从而允许保持pH探头完整性。接着，将裂解的细胞培养液的pH用50％乙酸调节到约pH5.0。无搅拌下，在15℃到25℃的温度下保持12到24小时之间的时间间隔后，显著部分的之前溶解的蛋白质作为固体沉淀物从溶液析出，多糖几乎没有损失或者降解，其保持在溶液中。然后通过连续流动离心，接着通过深层过滤和0.45μm微量过滤澄清具有沉淀物的溶液。

纯化

肺炎球菌多糖的纯化由几个浓缩/渗滤操作、沉淀/洗脱、柱层析和深层过滤步骤组成。除非另外指出，所有步骤都在室温下进行。

将来自肺炎链球菌血清型1的发酵罐培养物的澄清的培养液浓缩并用100kDa MWCO(千道尔顿分子量截止)滤器渗滤。使用磷酸钠缓冲液在中性pH下完成渗滤。渗滤从较高分子量的生物聚合物，诸如核酸、蛋白质和多糖除去了低分子量的培养基组分。

通过加入来自贮存液的十六烷基三甲基溴化铵(HB)以得到1％HB(w/v)的终浓度，从浓缩和渗滤的溶液沉淀多糖。在深层滤器上捕获多糖/HB沉淀物并丢弃滤液。再溶解多糖沉淀物并通过含有沉淀物的深层滤器再循环氯化钠溶液进行洗脱。然后用额外的氯化钠溶液漂洗滤器。

向多糖溶液中加入来自NaI贮存液的碘化钠(NaI)至终浓度0.5％以沉淀HB。通过深层过滤除去沉淀物。滤液含有目标多糖。用NaCI/NaI溶液漂洗沉淀容器和滤器并将漂洗液与部分纯化的多糖溶液合并。丢弃滤器。然后通过0.2μm滤器过滤多糖。

将多糖溶液在30kDa MWCO超滤器上浓缩并用氯化钠溶液渗滤。

通过浸渍活性炭的深层滤器过滤，进一步纯化部分纯化的多糖溶液。过滤后，用氯化钠溶液漂洗碳滤器。将漂洗液与多糖溶液合并，然后将其通过0.2μm滤器过滤。

将多糖溶液在30kDa MWCO超滤器上浓缩并用1M磷酸钠缓冲液调节以达到0.025M终浓度的磷酸钠。检查pH并调节到7.0±0.2。

用含有氯化钠的磷酸钠缓冲液平衡陶瓷羟基磷灰石(HA)柱，以得到合适的电导率(＜15μS)。然后将多糖溶液装载到柱子上。在这些条件下，杂质结合到树脂并且从柱子的穿过液回收多糖。多糖溶液通过位于柱子之前和之后的0.2μm线内滤器过滤。

使用30kDa MWCO滤器浓缩多糖溶液。然后用注射用水(WFI)渗滤浓缩液。

将渗滤的多糖溶液通过0.2μm滤膜过滤到聚丙烯瓶中。取出样品用于释放测试(release testing)并将纯化的多糖在-25°±5℃冷冻保藏。

描述特征

通过指定给多糖分子的质子的信号的分配，1H-NMR数据与化学结构相一致。1H-NMR谱显示一系列分辨率良好的信号(来自甲基的质子)，其用以定量多糖中的O-乙酰基官能团。

使用特异性抗血清，通过对流免疫电泳证实单价多糖的身份。

连接折射率和多角度激光散射(MALLS)检测器的高效凝胶过滤层析与样品浓度结合使用以计算分子量。

用大小排阻层析介质(CL-4B)描绘多糖的相对分子大小分布。

实施例2

制备血清型1肺炎球菌糖-CRM₁₉₇缀合物

活化和缀合

将纯化的多糖的容器解冻并在反应容器中合并。向容器中加入pH9.0的0.2M碳酸钠用于在50℃部分脱乙酰化(水解)3小时。将反应物冷却到20℃并通过0.2M乙酸进行中和。通过在2-8℃温育，在高碘酸钠存在下进行氧化，并搅拌混合物15-21小时。

浓缩活化反应混合物并使用30K MWCO膜用0.9％NaCl渗滤10次。将存留物用0.2μm滤器过滤。将活化的糖装入100mL玻璃冻干瓶中并在-75℃滚动冷冻并冻干。

“滚动冷冻”(Shell-freezing)是一种制备用于冻干(冷冻干燥)的样品的方法。在含有醇或任何其他合适的液体的冷冻浴中通过电机驱动的滚筒自动滚动烧瓶。在瓶的内部“壳”周围均匀冷冻产物的薄涂层，允许在每次冷冻干燥运行期间安全地处理更大体积的物质。这些自动化的冷冻的单位一次提供了简单和有效的预先冷冻许多烧瓶的方法，在内部产生所希望的涂层，并为有效的冷冻干燥提供了足够的表面积。

将冻干物质的瓶子恢复到室温并以2∶1的糖/蛋白质比重悬浮于CRM₁₉₇溶液中。向该糖/蛋白质混合物中加入1M磷酸钠缓冲液至最终0.2M离子强度和7.5的pH，然后加入氰基硼氢化钠。反应物在23℃温育18小时，接着在37℃再次温育72小时。氰基硼氢化物温育后，用冷的盐水稀释反应混合物，接着加入1M碳酸钠以调节反应混合物到pH9.0。通过加入硼氢化钠，在23℃温育3-6小时淬灭未反应的醛。

将反应混合物用盐水稀释2倍并通过0.45-5μm预过滤器转移到存留物容器中。用0.15M磷酸盐缓冲液(pH6)渗滤反应混合物30次，用盐水渗滤20次。通过0.2μm滤器过滤存留物。

将缀合物溶液用0.9％盐水稀释到0.5mg/mL的目标，然后在Class 100通风厨中无菌过滤到最终体相浓缩物(FBC)容器中。缀合物在2-8℃保存。

描述特征

用大小排阻层析介质(CL-4B)描绘缀合物的相对分子大小分布。

使用特异抗血清通过狭线印迹测定法证实缀合物的身份。

分别通过糖醛酸和Lowry测定法测定糖和蛋白质浓度。通过下面的计算得到共价结合的缀合物复合体中糖对蛋白质的比率：

通过Hestrin方法(Hestrin等人，J.Biol.Chem.1949，180，p.249)测量O-乙酰基含量。O-乙酰基浓度与总的糖浓度的比率得到微摩尔O-乙酰基/mg糖。

实施例3

制备肺炎链球菌荚膜多糖血清型3

制备主细胞库和工作细胞库

肺炎链球菌血清型3从Robert Austrian博士(University ofPennsylvania，Philadelphia，Pennsylvania)得到。细胞库系统的制备见实施例1。

发酵和收获

来自工作细胞库的培养物用于接种含有基于大豆的培养基的种子瓶。将瓶子在36℃±2℃无搅拌下温育，直到满足生长需要。用种子瓶接种含有基于大豆的培养基的种子发酵罐。用无菌碳酸钠溶液保持pH约7.0。达到目标光密度后，用种子发酵罐接种中间种子发酵罐。达到目标光密度后，用中间种子发酵罐接种生产发酵罐。用无菌碳酸钠溶液保持pH。达到发酵罐的工作体积后终止发酵。向培养物中加入合适量的无菌12％脱氧胆酸钠以裂解细菌细胞和释放细胞相关的多糖。裂解后，冷却发酵罐内容物。用乙酸调节裂解的培养液的pH到约pH6.6。通过连续流动离心接着深层过滤和0.45μm微量过滤澄清裂解物。

纯化

将来自肺炎链球菌血清型3的发酵罐培养物的澄清的培养液浓缩并用100kDa MWCO滤器渗滤。使用磷酸钠缓冲液在中性pH下完成渗滤。渗滤从较高分子量的生物聚合物，诸如核酸、蛋白质和多糖除去了低分子量的培养基组分。

加入十六烷基三甲基溴化铵(HB)前，向浓缩并渗滤的多糖溶液中加入计算体积的NaCl贮存液以得到0.25M NaCl的终浓度。然后通过加入来自贮存液的HB得到1％HB(w/v)的终浓度来沉淀多糖。在深层滤器上捕获多糖/HB沉淀物并丢弃滤液。再溶解多糖沉淀物并通过含有沉淀物的深层滤器再循环氯化钠溶液进行洗脱。然后用额外的氯化钠溶液漂洗滤器。

将多糖溶液在30kDa MWCO超滤器上浓缩并用氯化钠溶液渗滤。

将多糖溶液在30kDa MWCO超滤膜上浓缩并用1M磷酸钠缓冲液调节以实现0.025M终浓度的磷酸钠。检查pH并调节到7.0±0.2。

用含有氯化钠的磷酸钠缓冲液平衡陶瓷羟基磷灰石(HA)柱，以得到合适的电导率(15μS)。然后将多糖溶液装载到柱子上。在这些条件下，杂质结合到树脂并且从柱子的穿过液回收多糖。用缓冲液穿过柱子冲洗多糖并通过0.2μm滤器过滤。

使用30kDa MWCO滤器浓缩多糖溶液。然后用WFI渗滤浓缩液。

将渗滤的多糖溶液通过0.2μm滤膜过滤到不锈钢容器中。取出样品用于释放测试并将纯化的多糖在-25°±5℃冷冻保藏。

描述特征

通过指定给多糖分子的质子的信号的分配，1H-NMR数据与化学结构相一致。

用大小排阻层析介质(CL-4B)描绘多糖的相对分子大小分布。

实施例4

血清型3肺炎球菌糖-CRM₁₉₇缀合物的制备

活化和缀合

将纯化的血清型3糖的容器解冻并在反应容器中合并。向该容器中加入WFI和2M乙酸至终浓度0.2M和2mg/ml糖。将溶液的温度升高到85℃1小时以水解多糖。冷却反应物到≤25℃并加入1M氯化镁至终浓度0.1M。通过在23℃温育16-24小时，在高碘酸钠存在下进行氧化。

浓缩活化反应混合物，并使用100K MWCO膜，用WFI渗滤10次。通过0.2-μm滤器过滤存留物。

为了配制，向活化的糖中加入0.2M磷酸钠(pH7.0)至10mM终浓度和6.0-6.5的pH。将CRM₁₉₇载体蛋白与糖溶液混合至2g糖/1g CRM₁₉₇的比率。将合并的糖/蛋白质溶液装入100mL玻璃冻干瓶中，目标填充为50mL，在-75℃滚动冷冻，并冻干。

使共同冻干的糖/蛋白质物质瓶恢复室温，并重悬浮在0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.0)中至20mg/mL的最终糖浓度。调节pH到6.5，然后加入0.5摩尔当量的氰基硼氢化钠。在37℃温育反应物48小时。氰基硼氢化物温育后，用冷的5mM琥珀酸盐/0.9％盐水缓冲液稀释反应混合物。通过加入硼氢化钠并在23℃温育3-6小时淬灭未反应的醛。通过0.45-5μm预过滤器转移反应混合物到存留物容器中。

用0.1M磷酸盐缓冲液(pH9)渗滤反应混合物30次，用0.15M磷酸盐缓冲液(pH6)渗滤反应混合物20次，用5mM琥珀酸盐/0.9％盐水渗滤反应混合物20次。通过0.2-μm滤器过滤存留物。

将缀合物溶液稀释到0.5mg/mL的糖靶标，然后在Class 100通风厨中无菌过滤到FBC容器中。在2-8℃保存缀合物。

描述特征

用大小排阻层析介质(CL-4B)描绘缀合物的相对分子大小分布。

使用特异抗血清通过狭线印迹测定法证实缀合物的身份。

分别通过蒽酮测定法和Lowry测定法测定糖和蛋白质浓度。通过下面的计算得到共价结合的缀合物复合体中糖对蛋白质的比率：

实施例5

制备肺炎链球菌荚膜多糖血清型5

肺炎链球菌血清型5从Gerald Schiffman博士(State University ofNew York，Brooklyn，New York)得到。细胞库系统的制备见实施例1。发酵、收获、多糖的纯化和表征见实施例1。

备选的发酵方法

来自工作细胞库的培养物用于接种含有基于大豆的培养基和10mM无菌NaHCO₃溶液的种子瓶。将瓶子在36℃±2℃无搅拌下温育直到满足生长要求。用种子瓶接种含有基于大豆的培养基和10mM无菌NaHCO₃溶液的种子发酵罐。用3N NaOH保持pH约7.0。达到目标光密度后，用种子发酵罐接种含有10mM NaHCO₃浓度的基于大豆的培养基的生产发酵罐。用3N NaOH保持pH。生长停止后或者达到发酵罐的工作体积时停止发酵。向培养物中加入合适量的无菌12％脱氧胆酸钠得到培养液中0.12％的浓度，以裂解细菌细胞和释放细胞相关的多糖。裂解后，搅拌下，在7℃到13℃的温度之间保持发酵罐内容物8到24小时之间的时间间隔，以确保已经发生了完全细胞裂解和多糖释放。该保持期间的搅拌防止裂解沉积物沉淀在发酵罐壁和pH探头上，从而允许保持pH探头完整性。接着，将裂解的细胞培养液的pH用50％乙酸调节到约pH4.5。无搅拌下，在15℃到25℃的温度下保持12到24小时的时间间隔后，显著部分的以前溶解的蛋白质作为固体沉淀物从溶液析出，多糖几乎没有损失或者降解，其保持在溶液中。然后通过连续流动离心，接着通过深层过滤和0.45μm微量过滤澄清具有沉淀物的溶液。

实施例6

制备血清型5肺炎球菌糖-CRM₁₉₇缀合物

活化和缀合

将血清型5糖的容器解冻并在反应容器中合并。向该容器中加入0.1M乙酸钠(pH4.7)，接着在高碘酸钠存在下通过在23℃温育16-22小时进行氧化。

浓缩活化反应混合物，并使用100K MWCO膜，用WFI渗滤10次。通过0.2μm滤器过滤存留物。

将血清型5活化的糖与CRM₁₉₇以0.8∶1的比例合并。将合并的糖/蛋白质溶液装入100mL玻璃冻干瓶(50mL目标填充)中并在-75℃滚动冷冻，并共同冻干。

让共同冻干的物质的瓶子恢复到室温并重悬浮在0.1M磷酸钠(pH7.5)中，加入氰基硼氢化钠。反应物在30℃温育72小时，接着再次加入氰基硼氢化物并在30℃温育20-28小时。

氰基硼氢化钠温育后，用盐水稀释反应混合物2倍并通过0.45-5μm预过滤器转移到存留物容器中。将反应混合物用0.01M磷酸盐缓冲液(pH8)渗滤30次，用0.15M磷酸盐缓冲液(pH6)渗滤20次，并用盐水渗滤20次。通过0.2μm滤器过滤存留物。

缀合物的表征见实施例2。

实施例7

制备肺炎链球菌荚膜多糖血清型6A

从Gerald Schiffman博士(State University of New York，Brooklyn，New York)得到肺炎链球菌血清型6A。细胞库系统的制备见实施例1。发酵、收获和多糖的纯化见实施例1，只是在纯化期间，在层析步骤前的30kDa MWCO浓缩步骤被省略。

实施例8

制备血清型6A肺炎球菌糖-CRM₁₉₇缀合物

活化和缀合

血清型6A多糖是高分子量聚合物，其必须在氧化前减小大小。解冻血清型6A糖的容器并在反应容器中合并。向容器中加入2M乙酸至0.1M的终浓度，用于在60℃水解1.5小时。将反应物冷却到23℃并通过用1MNaOH调节反应混合物至pH6进行中和。在高碘酸钠存在下，通过在23℃温育14-22小时进行氧化。

浓缩活化反应混合物并使用100K MWCO膜用WFI渗滤10次。通过0.2μm滤器过滤存留物。

将血清型6A与蔗糖混合并填充到100mL玻璃冻干瓶(50mL目标填充)并在-75℃滚动冷冻并冻干。

将冻干物质的瓶子恢复到室温并以1∶1的糖/蛋白质比率重悬浮在二甲亚砜(DMSO)中。加入氰基硼氢化钠后，在23℃温育反应混合物18小时。氰基硼氢化物温育后，用冷盐水稀释反应混合物。通过加入硼氢化钠，通过在23℃温育3-20小时淬灭未反应的醛。

通过5μm预过滤器将稀释的反应混合物转移到存留物容器中。将反应混合物用0.9％NaCl渗滤10次，用琥珀酸盐缓冲的NaCl渗滤30次。通过0.2μm滤器过滤存留物。

将缀合物溶液稀释到0.5mg/mL的糖目标，然后在Class 100通风厨中无菌过滤到FBC容器中。在2-8℃保存缀合物。

缀合物的表征见实施例2。

实施例9

制备肺炎链球菌荚膜多糖血清型7F

肺炎链球菌血清型7F从Gerald Schiffman博士(State University ofNew York，Brooklyn，New York)得到。细胞库系统的制备和发酵和多糖的收获见实施例3。关于备选的发酵和收获方法，见实施例1中描述的备选方法。

纯化

将来自肺炎链球菌血清型7F的发酵罐培养物的澄清的培养液浓缩并用100kDa MWCO滤器渗滤。使用磷酸钠缓冲液在中性pH下完成渗滤。渗滤从较高分子量的生物聚合物，诸如核酸、蛋白质和多糖除去了低分子量的培养基组分。

血清型7F不与HB形成沉淀。而是，通过加入来自贮存液的HB至1％HB的终浓度从浓缩并渗滤的溶液沉淀杂质。在深层滤器上捕获沉淀物并丢弃滤器。多糖包含在滤液中。

将多糖溶液在30kDa MWCO超滤器上浓缩并用氯化钠溶液渗滤。

使用30kDa MWCO滤器浓缩多糖溶液。然后用WFI渗滤浓缩液。

将渗滤的多糖溶液通过0.2μm滤膜过滤到不锈钢容器中。取出样品用于释放测试并将纯化的多糖在2°-8℃冷冻保藏。

多糖的表征见实施例3。

实施例10

制备血清型7F肺炎球菌糖-CRM₁₉₇缀合物

活化和缀合

通过在23℃温育16-24小时，在高碘酸钠存在下进行氧化。

浓缩活化反应混合物并使用100K MWCO膜，用10mM NaOAc(pH4.5)渗滤10次。通过0.2μm滤器过滤存留物。

将血清型7F填充到100mL玻璃冻干瓶(50ml目标填充)，在-75℃滚动冷冻并冻干。

将冻干的血清型7F和CRM₁₉₇的瓶子恢复室温并以1.5∶1的糖/蛋白质比例重悬浮在DMSO中。加入氰基硼氢化钠后，在23℃温育反应物8-10小时。通过加入硼氢化钠，在23℃温育16小时淬灭未反应的醛。

将反应混合物用冷盐水稀释10倍，并通过5μm预过滤器转移到存留物容器中。将反应混合物用0.9％盐水渗滤10次并用琥珀酸缓冲的盐水渗滤30次。通过0.2μm滤器过滤存留物。

将缀合物溶液用0.9％盐水稀释到0.5mg/mL的糖目标，然后在Class100通风厨中无菌过滤到FBC容器中。在2-8℃保存缀合物。

缀合物的表征见实施例4。

实施例11

制备肺炎链球菌荚膜多糖血清型19A

从Gerald Schiffman博士(State University of New York，Brooklyn，New York)得到肺炎链球菌血清型19A。关于制备细胞库系统，见实施例1。多糖的发酵、收获和纯化见实施例7。表征见实施例3。

实施例12

血清型19A肺炎球菌糖-CRM₁₉₇缀合物的制备

活化和缀合

将血清型19A糖的容器解冻并在反应容器中合并。加入乙酸钠至10mM(pH5.0)并在高碘酸钠存在下通过在23℃温育16-24小时进行氧化。

浓缩活化反应混合物并使用100K MWCO膜，用10mM乙酸盐(pH5.0)渗滤10次。通过0.2μm滤器过滤存留物。

用蔗糖混合活化的糖接着加入CRM₁₉₇。将血清型19A活化的糖和CRM₁₉₇混合物(0.8∶1比例)填充到100ml玻璃冻干瓶(50mL目标填充)并在-75℃滚动冷冻并冻干。

将冻干物质的瓶子恢复到室温并重悬浮在DMSO中。向糖/蛋白质混合物中加入氰基硼氢化钠(100mg/ml)。将反应物在23℃温育15小时。氰基硼氢化物温育后，通过加入硼氢化钠，在23℃温育3-20小时淬灭未反应的醛。

将反应混合物用冷盐水稀释10倍并通过5μm预过滤器转移到存留物容器中。将反应混合物用0.9％NaCl渗滤10次，0.45μm过滤，并用5mM琥珀酸盐/0.9％NaCl缓冲液(pH6)渗滤30次。通过0.2μm滤器过滤存留物。

用5mM琥珀酸盐/0.9％盐水将缀合物溶液稀释到0.5mg/mL的靶标，然后在Class 100通风厨中无菌过滤到FBC容器中。在2-8℃保存缀合物。

缀合物的表征见实施例4。

实施例13

制备肺炎链球菌荚膜多糖血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F

制备肺炎链球菌种子培养物

从Gerald Schiffman博士(State University of New York，Brooklyn，New York)得到肺炎链球菌血清型4、6B、9V、18C、19F和23F。肺炎链球菌血清型14从ATCC菌株6314得到。

单独地将一瓶每种希望的血清型的肺炎链球菌用于开始发酵批次。用碳酸钠将含有基于大豆的培养基和酚红的两瓶调节到7.4±0.2的pH范围，然后向瓶中加入所需体积的50％右旋糖/1％硫酸镁溶液。将两个瓶子接种不同量的种子。瓶子在36℃±2℃培育直到培养基变成黄色。培育后，从每个瓶子移出样品，并测试光密度(OD)(0.3到0.9)和pH(4.6到5.5)。选择两个瓶子之一用于接种种子发酵罐。

将基于大豆的培养基转移到种子发酵罐并消毒。然后向发酵罐中加入一体积的50％右旋糖/1％硫酸镁溶液。监视并控制种子发酵罐的pH(pH6.7到7.4)和搅拌。温度保持在36℃±2℃。种子接种物(瓶)无菌连接到种子发酵罐并转移接种物。保持发酵罐处于pH控制下并定期取出样品并测试OD和pH。当在600nm达到所需的OD0.5时，用来自种子发酵罐的发酵液接种中间发酵罐。

将基于大豆的培养基转移到中间发酵罐并消毒。然后向发酵罐加入一体积的50％右旋糖/1％硫酸镁溶液。监视并控制中间发酵罐的pH(pH6.7到7.4)和搅拌。温度保持在36℃±2℃。将种子发酵罐的内含物转移到中间发酵罐中。保持发酵罐处于pH控制下并定期取出样品并测试OD和pH。当在600nm达到所需的OD0.5时，用来自中间发酵罐的发酵液接种生产发酵罐。

将基于大豆的培养基转移到生产发酵罐并消毒。然后向发酵罐加入一体积的50％右旋糖/1％硫酸镁溶液。监视并控制生产发酵罐的pH(pH6.7到7.4)和搅拌。温度保持在36℃±2℃。保持发酵罐处于pH控制下并定期取出样品并测试OD和pH，直到发酵完成。

向发酵罐中加入脱氧胆酸钠至约0.12％w/v的终浓度。将培养物混合最少30分钟并将温度设置点降低至10℃。过夜温育培养物并且证实失活后，根据需要，用50％乙酸调节培养物的pH到6.4至6.8。升高发酵罐的温度至20°±5℃并将内含物转移到澄清保持槽中。

通过以每小时25到600升的流速离心处理澄清保持槽的内含物(包括细胞残渣)(血清型4除外，其中丢弃细胞残渣并将流速固定到25到250升/小时)。取出上清液的样品并测试OD。在离心期间期望的OD为≤0.15。

最初，通过深层滤器装置再循环上清液，直到达到0.05±0.03的OD。然后，上清液穿过深层滤器装置并且通过0.45μm滤膜以过滤滤液保持槽。

随后，产物通过闭管转移到纯化区用于处理。

所有上面的操作(离心、过滤和转移)都在10℃到30℃之间进行。

关于血清型4和6B的备选发酵和收获方法，见实施例1中描述的备选方法。

纯化

每种肺炎球菌多糖的纯化由几个浓缩/渗滤操作、沉淀/洗脱、柱层析和深层过滤步骤组成。除非另外指出，所有步骤都在室温下进行。

将来自所希望的肺炎链球菌血清型的发酵罐培养物的澄清的培养液浓缩并用100kDa MWCO滤器渗滤。使用磷酸钠缓冲液在pH＜9.0下完成渗滤。渗滤从较高分子量的生物聚合物，诸如核酸、蛋白质和多糖除去了低分子量的培养基组分。

通过加入来自贮存液的HB得到1％HB(w/v)的终浓度(血清型23F除外，其具有2.5％的终浓度)，以从浓缩并渗滤的溶液沉淀多糖。在深层滤器上捕获多糖/HB沉淀物并丢弃滤液(注意：血清型14不沉淀；因此保留滤液)。再溶解多糖沉淀物并通过含有沉淀物的深层滤器再循环氯化钠溶液进行洗脱。然后用额外的氯化钠溶液漂洗滤器。

向多糖溶液中加入来自NaI贮存液的碘化钠(NaI)至终浓度0.5％以沉淀HB(血清型6B除外，其具有0.25％的终浓度)。通过深层过滤除去沉淀物。滤液含有目标多糖。丢弃滤器。然后通过0.2μm滤器过滤多糖。

将多糖溶液在30kDa MWCO超滤膜上浓缩并用氯化钠溶液渗滤。

将多糖溶液在30kDa MWCO超滤膜上浓缩并用氯化钠溶液漂洗滤器。检查pH并调节到7.0±0.3。

用含有氯化钠的磷酸钠缓冲液平衡陶瓷羟基磷灰石(HA)柱，直到pH为7.0±0.3并且电导率为26±4μS。然后将多糖溶液装载到柱子上。在这些条件下，杂质结合到树脂并且从柱子的穿过液回收多糖。多糖溶液通过0.2μm滤器过滤。

使用30kDa MWCO滤器浓缩多糖溶液。然后用WFI渗滤浓缩液直到电导率＜15μS。

将渗滤的多糖溶液通过0.2μm滤膜过滤到主体容器(bulk container)中并在2-8℃保存。

实施例14

制备用于血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的肺炎球菌糖-CRM₁₉₇缀合物

活化方法

不同的血清型糖按照不同的途径用于活化(活化前水解或者不水解)和缀合(水性或者DMSO反应)，如该实施例所述。

将多糖从主体容器转移到反应器容器中。然后用WFI和磷酸钠稀释多糖至1.6-2.4mg/mL的终浓度范围。

步骤1

对于血清型6B、9V、14、19F和23F，调节pH至pH6.0±0.3。

对于血清型4，加入盐酸(0.01M最终酸浓度)并在45°±2℃下温育25-35分钟。通过冷却到21-25℃并加入1M磷酸钠至目标pH6.7±0.2终止水解。进行过程中测试以证实合适水平的脱丙酮酸化(depyruvylation)。

对于血清型18C，加入冰乙酸(0.2M最终酸浓度)并在94°±2℃下温育溶液205-215分钟。然后降低温度至21-25℃并加入1-2M磷酸钠至目标pH6.8±0.2。

步骤2：高碘酸盐反应

使用总的糖含量(除了血清型4之外)确定肺炎球菌糖活化所需的高碘酸钠摩尔当量。对于血清型4，使用每摩尔糖0.8-1.2摩尔高碘酸钠的比例。通过充分混合，对于除了19F的所有血清型，让氧化反应在21-25℃下进行16到20小时，对于19F的氧化反应温度≤15℃。

步骤3：超滤

浓缩氧化的糖并在100kDa MWCO超滤器(对于18C使用5kDa超滤器)上用WFI(对于血清型19F使用0.01M磷酸钠缓冲液pH6.0)渗滤。丢弃渗透液并通过0.22μm滤器过滤存留物。

步骤4：冻干

对于血清型4、9V和14，将浓缩的糖与CRM₁₉₇载体蛋白混合，装入玻璃瓶中，滚动冷冻并在≤-65℃保存。冻干冷冻浓缩的糖-CRM₁₉₇并在-25°±5℃保存。

对于血清型6B、19F和23F，加入特定量的蔗糖，所述量经计算为在缀合反应混合物中达到5％±3％的蔗糖浓度。血清型18C不需要添加蔗糖。然后将浓缩的糖装入玻璃瓶中，滚动冷冻并在≤-65℃保存。冻干冷冻浓缩的糖并在-25°±5℃保存。

缀合方法

使用两种缀合方法：水性缀合用于血清型4、9V、14和18C，DMSO缀合用于血清型6B、19F和23F。

水性缀合

步骤1：溶解

对于血清型4、9V和14，解冻冻干的活化的糖-CRM₁₉₇混合物并在室温平衡。然后以特定比例用0.1M磷酸钠缓冲液重构冻干的活化的糖-CRM₁₉₇：

·对于血清型4和9V，每16-24g糖1L缓冲液

·对于血清型14，每6-10g糖1L缓冲液

对于血清型9V，在37°±2℃温育反应混合物直到完全溶解，对于血清型4和14，在23°±2℃温育反应混合物直到完全溶解。

对于血清型18C，在CRM₁₉₇于1M磷酸氢二钠的溶液中以每1LCRM₁₉₇溶液0.11L磷酸钠的典型比例重构冻干的糖。在23°±2℃温育反应混合物(8-12g/L糖浓度)直到完全溶解。

在该阶段检测pH作为过程中控制。

步骤2：缀合反应

对于血清型4和9V，通过加入氰基硼氢化钠溶液(100mg/mL)以达到每摩尔糖1.0-1.4摩尔氰基硼氢化钠，启动缀合反应。在37°±2℃温育反应混合物44-52小时。然后降低温度至23°±2℃并向反应器中加入0.9％氯化钠。加入硼氢化钠溶液(100mg/mL)以达到每摩尔糖1.8-2.2摩尔当量的硼氢化钠。在23°±2℃温育混合物3-6小时。用0.9％氯化钠稀释混合物并漂洗反应器。使用1.2μm预过滤器将稀释的缀合混合物过滤到储存容器中。

对于血清型14和18C，通过加入氰基硼氢化物溶液(100mg/mL)以达到每摩尔糖1.0-1.4摩尔氰基硼氢化钠，启动缀合反应。在23°±2℃温育反应混合物12-24小时。然后升高温度至37°±2℃并将反应物温育72-96小时。然后降低温度至23°±2℃并向反应器中加入0.9％氯化钠。加入硼氢化钠溶液(100mg/mL)以达到每摩尔糖1.8-2.2摩尔当量的硼氢化钠。在23°±2℃温育混合物3-6小时。用0.9％氯化钠稀释混合物并漂洗反应器。使用1.2μm预过滤器将稀释的缀合混合物过滤到储存容器中。

步骤3：超滤100kDa

浓缩稀释的缀合混合物并使用最小15体积(血清型4)或者40体积(血清型9V、14和18C)的0.9％氯化钠在100kDa MWCO超滤器上渗滤。

丢弃渗透液。

对于血清型4，通过0.45μm滤器过滤存留物。

在该步骤进行过程中控制(糖含量)。

步骤4：HA柱纯化

该步骤仅对于血清型4缀合物进行。

首先用0.5M磷酸钠缓冲液中和HA柱(pH7.0±0.3)，然后用0.9％氯化钠平衡。将过滤的存留物(血清型4)以1.0L/分钟的流速加到柱上。用0.9％氯化钠以≤2.0L/分钟流速洗涤柱子。然后用0.5M磷酸钠缓冲液以≤2.0L/分钟流速洗脱产物。

然后浓缩HA级分并用最小20体积的0.9％氯化钠在100kDa MWCO膜上渗滤。丢弃渗滤液。

步骤5：过滤除菌

100kDa MWCO渗滤后的存留物通过0.22μm滤器过滤。对过滤的产物进行过程中控制(糖含量，游离蛋白质，游离糖和氰化物)。对过滤的存留物进行过程中控制以确定是否需要额外的浓缩、渗滤和/或稀释以满足FBC靶标。用FBC样品重复这些和额外的测试。

如需要，用0.9％氯化钠稀释过滤的缀合物以便达到小于0.55g/L的终浓度。在该阶段进行糖含量、蛋白质含量和糖：蛋白质比例的释放测试。

最后，过滤缀合物(0.22μm)并以2.64g/罐的典型量装入10L不锈钢罐中。在该阶段，进行产率、糖含量、蛋白质含量、pH、糖：蛋白质比例和赖氨酸含量作为过程中控制。在该阶段进行释放测试(外观、游离蛋白质、游离糖、内毒素、分子大小测定、残留氰化物、糖鉴定、CRM₁₉₇鉴定)。

DMSO缀合

步骤I：溶解

将冻干活化的糖血清型6B、19F、23F和冻干的CRM₁₉₇载体蛋白在室温平衡并在DMSO中重构。稀释浓度通常为2-3g糖(2-2.5g蛋白质)/升DMSO。

步骤II：缀合反应

将活化的糖和CRM₁₉₇载体蛋白在23°±2℃以0.6g-1.0g糖/gCRM₁₉₇(对于血清型6B和19F)或者1.2到1.8g糖/gCRM₁₉₇(对于血清型23F)的比例范围混合60-75分钟。

通过以0.8-1.2摩尔当量的氰基硼氢化钠对1摩尔活化糖的比例加入氰基硼氢化钠溶液(100mg/ml)启动缀合反应。向反应混合物加入WIF至1％(v/v)的目标并在23°±2℃温育混合物40小时以上。

向反应物中加入硼氢化钠溶液100mg/mL(通常每摩尔活化糖1.8-2.2摩尔当量硼氢化钠)和WFI(目标5％v/v)并在23°±2℃温育混合物3-6小时。该步骤还原糖上存在的任何未反应的醛。然后在＜15℃将反应混合物转移到含有0.9％氯化钠的稀释罐中。

步骤III：100kDa超滤

将稀释的缀合物混合物通过1.2μm滤器过滤并浓缩，并在100kDaMWCO膜上用最少15体积的0.9％氯化钠渗滤(0.01M磷酸钠/0.05M NaCl缓冲液用于血清型23F)。丢弃渗透液。通过0.45μm滤器过滤存留物。在该阶段取过程中糖含量样品。

步骤IV：DEAE柱纯化

该步骤仅对血清型23F进行。

用0.01M磷酸钠/0.05M氯化钠缓冲液平衡DEAE柱。将过滤的存留物(血清型23F)装载到柱上并用0.01M磷酸钠/0.05M氯化钠缓冲液洗涤。用0.01M磷酸钠/0.9％NaCl缓冲液洗涤柱子。然后用0.01M磷酸钠/0.5M氯化钠缓冲液洗脱产物。

步骤V：100kDa超滤

浓缩来自6B和19F的存留物并用至少30体积的0.9％氯化钠渗滤。丢弃渗透液。

浓缩来自血清型23F的洗脱物并用最少20体积的0.9％氯化钠渗滤。丢弃渗透液。

步骤VI：过滤除菌

100kDa MWCO渗滤后的存留物通过0.22μm滤器过滤。对过滤的产物进行过程中控制(糖含量、游离蛋白质、游离糖、残留DMSO和残留的氰化物)。对过滤的存留物进行过程中控制以确定是否需要额外的浓缩、渗滤和/或稀释以满足FBC目标。用FBC样品重复这些和额外的测试。

最后，过滤缀合物(0.22μm)并以2.64g/罐的量装入10L不锈钢罐中。在该阶段，进行产率、糖含量、蛋白质含量、pH、糖：蛋白质比例和赖氨酸含量作为过程中控制。在该阶段进行释放测试(外观、游离蛋白质、游离糖、内毒素、分子大小测定、残留氰化物、残留DMSO、糖鉴定、和CRM₁₉₇鉴定)。

实施例15

多价肺炎球菌缀合物疫苗的配制

13种缀合物的最终本体(bulk)浓缩物含有0.85％氯化钠。3、6A、7F和19A型本体浓缩物也含有5mM pH5.8的琥珀酸钠缓冲剂。基于批体积和本体糖浓度计算本体浓缩物的所需体积。向贴标签前的制剂容器加入80％的0.85％氯化钠(生理盐水)和所需量的琥珀酸盐缓冲液后，加入本体浓缩物。然后使用Millipore Durapore膜滤器单元，将制备物通过0.22μm膜无菌过滤到第二个容器中。用剩余的20％的0.85％氯化钠洗涤第一个容器并将容器穿过相同的滤器并收集到所述第二个容器中。在加入本体磷酸铝期间和之后，温和混合配制的本体。检查pH并且如果需要，调节pH。将配制的本体产品在2-8℃保存。

将配制的本体产品装入从Becton Dickinson得到的1型硼硅酸盐玻璃注射器中。定期监测疫苗的混浊度以确保填充操作的均匀性。填充的疫苗(最终产品)在2-8℃保存。

实施例16

13价缀合物疫苗的免疫原性

迄今，已经在兔中对13vPnC疫苗进行了临床前研究。设计研究#HT01-0021和#HT01-0036以独立地检查来自肺炎链球菌的荚膜多糖(PS)与CRM₁₉₇的化学缀合和磷酸铝(AlPO₄)佐剂对兔中13vPnC疫苗的免疫应答的影响。这些效果通过抗原特异性ELISA测定血清IgG浓度和通过调理吞噬测定法(OPA)测定抗体功能来表征。

研究#HT01-0021

研究#HT01-0021检查具有AlPO₄佐剂的13vPnC疫苗引起疫苗血清型特异性免疫应答的能力。在13vPnC疫苗中代表的肺炎球菌血清型包括1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F型。第二个目标包括评估抗体应答的动力学和持续时间。在第0周和第2周用计划的人临床剂量的用或不用AlPO₄(100μg/剂)配制的每种多糖(2μg每种PS，只是4μg 6B)肌内免疫新西兰白兔(New Zealand White rabbits)。在不同时间点收集血清。通过ELISA测量血清特异性IgG并通过OPA评估功能活性。

表4显示了在两剂13vPnC疫苗后，在合并的血清样品中达到的几何平均效价(GMT)。用IgG GMT的比率比较来自第4周到第0周的应答。这些数据表明在13vPnC制剂中包括AlPO₄与没有佐剂的相同疫苗相比引起了更高水平的IgG抗体。尽管当在制剂中包括AlPO₄时抗体应答更大，但是这些增加不是统计学上显著的。

用这两种13vPnC制剂免疫后，还在兔中评估了功能抗体应答(表5)。当比较有或者没有佐剂的疫苗制剂时，在13vPnC+AlPO₄疫苗处理组中观察到更高的OPA GMT。在两个组中，在第4周合并血清中对所有疫苗血清型都检测到OPA效价。对于多数血清型，在第4周测量的OPA效价比第0周的OPA效价(基线)高至少4倍。

从来自两个处理组的合并血清评估了对每种13vPnC疫苗血清型的动力学反应。从第0周和第1、2、3、4、8、12、26和39周抽取的血液测量了对每种血清型的IgG效价，然后比较。除了血清型1之外，在接受加佐剂的疫苗的动物中的抗体应答好于接受无佐剂的疫苗并且在免疫方案的第二周达到峰值(数据未显示)。

总之，数据表明用磷酸铝配制的13vPnC疫苗在兔中是免疫原性的，引起针对疫苗中所含的肺炎球菌荚膜多糖的实质性抗体应答并且这些应答与功能活性有关。用13vPnC+AlPO₄免疫后对7种核心血清型观察到的应答与兔对7价制剂的历史应答相一致。

表4.用两剂13价肺炎球菌糖缀合物免疫后的兔IgG免疫应答(GMT)

a：来自组内每只兔的等体积的血清组成的合并血清的GMT

b：与没有AlPO₄的处理组统计学上不同(p＝0.022)

表5.用2剂13价肺炎球菌糖缀合物免疫后NZW兔合并血清的肺炎链球菌OPA GMT

a：由处理组(n＝12)内各只兔的等体积的血清组成的合并物

研究#HT01-0036

研究#HT01-0036比较用缀合或不缀合CRM₁₉₇蛋白质的13vPnC疫苗免疫后，兔对疫苗中所含的多糖(PS)的免疫应答。在第0周和第2周时，用一剂2.2μg每种PS(除6B是4.4μg外)肌内免疫新西兰白兔。动物接受三种疫苗制剂之一：(a)13vPnC(PS直接缀合到CRM₁₉₇)，(b)13vPnPS(游离PS)或者(c)13vPnPS+CRM₁₉₇(游离PS与CRM₁₉₇混合)。所有疫苗制剂都含有作为佐剂的125μg/剂量的AlPO₄。

在IgG ELISA和用补体介导的OPA测量功能性抗体中评估对所有疫苗制剂的血清型特异性免疫应答。比较处理组之间的免疫应答。

表6给出了用抗原特异性IgG ELISA分析的从第4周取血得到的GMT数据。额外的分析显示了在第4周和第0周GMT值的比率。数据表明缀合物疫苗制剂比游离的PS或者游离的PS+CRM₁₉₇疫苗引起了更高的血清IgG效价。除了14型肺炎链球菌之外，13vPnC疫苗能够在OPA中诱导针对肺炎链球菌的代表性菌株的功能性抗体(表7)。用13vPnPS或13vPnPS+CRM₁₉₇疫苗免疫两次后，两种疫苗都不能对于所测量的13种血清型中的10种在第4周时相对于第0周诱导≥8倍的OPA效价(表7)。

总之，这些结果表明13价肺炎球菌疫苗多糖的缀合比仅仅使用游离多糖或者与未缀合的CRM₁₉₇混合的多糖所看到的产生更高的血清IgG效价和总的更大的功能性抗体活性。

表6.用2剂13价肺炎球菌糖缀合物免疫后，通过ELISA测量的对PnPS的兔IgG应答(GMT)

表7.用2剂13价肺炎球菌疫苗免疫后，兔血清合并物的肺炎链球菌OPA效价

a：用作所有组的第0周值

实施例17

用于血清型3肺炎球菌糖-CRM₁₉₇缀合物的备选方法

解冻纯化的多糖的容器并在反应容器中合并，并加热至85℃的温度。当在温度上升期间混合物的温度达到约35℃时，加入2M乙酸以达到0.1M乙酸浓度。当混合物温度达到85℃时，在这一温度维持1小时以完成水解/解聚。将经水解/解聚的多糖冷却至23℃并加入1M MgCl₂以达到0.1MMgCl₂的浓度。应用1-1.25摩尔当量的高碘酸(作为在WFI中50mg/mL的溶液添加)进行氧化。将混合物在23℃温育16-24小时。

通过应用100K MWCO聚醚砜(PES)膜针对10倍体积的WFI渗滤纯化反应混合物。应用0.2M磷酸盐缓冲液(pH7.0)将经纯化的活化的多糖调节至6.0的pH，以2∶1的多糖/蛋白质比率与CRM₁₉₇混合，在-75℃滚动冷冻，并共同冻干71小时。共同冻干后，将多糖/CRM₁₉₇混合物储存于-25℃±5℃，直到缀合。为了缀合，将共同冻干的多糖/CRM₁₉₇混合物以20mg/mL多糖的浓度溶解于0.1M磷酸盐缓冲液中，并用0.2M磷酸盐缓冲液(pH 4.6)和1M NaOH的组合将pH调节至6.2，随后作为在0.15M磷酸盐缓冲液(pH7.5)中的100mg/mL溶液添加0.5摩尔当量的氰基硼氢化钠。搅拌反应混合物并在37℃温育44小时。在氰基硼氢化钠温育后，用冷(2-8℃)0.9％盐水稀释反应混合物1倍，随后作为在WFI中的100mg/mL溶液加入1摩尔当量的硼氢化钠，以在23℃封闭未反应的醛3-6小时。

将反应混合物通过0.45-5μm预过滤器转移到存留物容器中，并然后通过应用100K MWCO再生纤维素膜渗滤而纯化。然后针对0.1M磷酸盐缓冲液(pH9.0)渗滤30次，并针对0.15M磷酸盐缓冲液(pH6.0)渗滤20次。最后针对5mM琥珀酸盐/0.9％盐水(pH6.0)渗滤20次。通过0.2μm滤器过滤经渗滤的缀合物并测定糖含量。基于糖分析，用5mM琥珀酸盐/0.9％盐水(pH6.0)将缀合物溶液稀释至0.5mg/mL的目标，并再次无菌过滤(0.2μm)以得到终批浓度的缀合物。将缀合物储存在2-8℃。

对于缀合物的表征，见实施例4。

应该理解前面的讨论和实施例仅仅给出了一些实施方案的详细描述。因此本领域技术人员显而易见的是，可以做出多种修改和等同方案而不背离本发明的精神和范围。

本专利申请中指出的所有杂志文章、其他参考文献、专利和专利申请都完整引入本文作为参考。

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34.美国专利号4,673,574.

35.美国专利号4,902,506.

Claims

1.制备包含与载体蛋白共价连接的肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)血清型3多糖的免疫原性缀合物的方法，所述方法包括

(a)使纯化的血清型3多糖与温和的酸反应，得到水解的血清型3多糖；

(b)在二价阳离子的存在下使水解的血清型3多糖与氧化剂反应，得到活化的血清型3多糖；

(c)使活化的血清型3多糖与载体蛋白混合；

(d)使混合且活化的血清型3多糖和载体蛋白与还原剂反应，得到血清型3多糖：载体蛋白缀合物；和

(e)封闭血清型3多糖：载体蛋白缀合物中未反应的醛，得到包含与载体蛋白共价连接的肺炎链球菌血清型3多糖的免疫原性缀合物。

2.权利要求1的方法，还包括在与载体蛋白混合前纯化活化的血清型3多糖。

3.权利要求1的方法，还包括在与还原剂反应前，共同冻干所述混合且活化的血清型3多糖和载体蛋白。

4.权利要求1的方法，还包括纯化免疫原性缀合物。

5.权利要求1的方法，其中所述的温和的酸是乙酸。

6.权利要求1的方法，其中所述的氧化剂是高碘酸且二价阳离子是Mg²⁺。

7.权利要求1的方法，其中所述的载体蛋白是CRM₁₉₇。

8.权利要求1的方法，其中所述的还原剂是氰基硼氢化钠。

9.权利要求1的方法，其中封闭未反应的醛包括使血清型3多糖：载体蛋白缀合物与硼氢化钠反应。

10.制备包含与载体蛋白共价连接的肺炎链球菌血清型3多糖的免疫原性缀合物的方法，所述方法包括：

(a)使纯化的血清型3多糖与乙酸反应，得到水解的血清型3多糖；

(b)在MgCl₂的存在下使水解的血清型3多糖与高碘酸反应，得到活化的血清型3多糖；

(c)纯化活化的血清型3多糖；

(d)使活化的血清型3多糖与载体蛋白混合；

(e)共同冻干混合且活化的血清型3多糖和载体蛋白；

(f)使共同冻干且活化的血清型3多糖和载体蛋白与氰基硼氢化钠反应，得到血清型3多糖：载体蛋白缀合物；和

(g)用硼氢化钠封闭血清型3多糖：载体蛋白缀合物中未反应的醛，得到包含与载体蛋白共价连接的肺炎链球菌血清型3多糖的免疫原性缀合物。

11.权利要求10的方法，还包括纯化所述免疫原性缀合物。

12.权利要求10的方法，其中所述的载体蛋白是CRM₁₉₇。

13.制备活化的肺炎链球菌血清型3多糖的方法，所述方法包括：

(a)使纯化的血清型3多糖与温和的酸反应，得到水解的血清型3多糖；和

(b)在二价阳离子的存在下使水解的血清型3多糖与氧化剂反应，得到活化的血清型3多糖。

14.权利要求13的方法，还包括在氧化后纯化活化的血清型3多糖。

15.权利要求13的方法，其中所述的温和的酸是乙酸。

16.权利要求13的方法，其中所述的氧化剂是高碘酸且二价阳离子是Mg²⁺。