BR112020026899A2 - Melhorias em conjugados imunogênicos - Google Patents
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Abstract
melhorias em conjugados imunogênicos. o presente pedido divulga várias melhorias relativas a conjugados imunogênicos que compreendem um polipeptídeo transportador e um antígeno sacarídeo, em que o antígeno sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele.
Description
[0001] Este benefício de pedido de prioridade do pedido de patente provisório dos EUA número de série 62/693.981, depositado em 4 de julho de 2018, cujo conteúdo é incorporado por meio deste por referência em sua totalidade.
[0002] O conteúdo do arquivo de texto enviado eletronicamente com este documento é incorporado aqui por referência em sua totalidade: Uma cópia em formato legível por computador da Listagem de Sequências (nome de arquivo: STRO_005_01WO_SeqList_ST25.txt, data de registro: 1 de julho de 2019, tamanho de arquivo ~23 kilobytes).
[0003] A resposta imune a um antígeno de sacarídeo "fraco" pode ser amplificada por conjugação a um antígeno polipeptídico transportador "forte" conhecido, como toxóide diftérico, toxóide tetânico, proteína D de H.influenzae ou CRM197. WO 2018/126229 (SutroVax, Inc., Foster City, Califórnia) divulga métodos, composições e técnicas para a produção de antígenos de vacina conjugados usando polipeptídeos transportadores que incluem um aminoácido não natural (nnAA). A química de ligação ortogonal através do nnAA permite a conjugação de antígenos aos polipeptídeos transportadores para produzir conjugados imunogênicos que são úteis para imunização.
[0004] É um objetivo da invenção fornecer variantes e melhorias de tais métodos, composições e técnicas. As variantes e melhorias descritas abaixo podem ser aplicadas ou combinadas com qualquer um dos métodos, composições ou técnicas divulgadas em WO 2018/126229 ou nos pedidos de patente provisórios dos EUA com os números de série 62/693.978 e 62/693.981,
ambos depositados em 4 de julho de 2018. Os pedidos de patente acima mencionados são incorporados aqui por referência em sua totalidade.
[0005] Em uma modalidade, fornecemos um recipiente esterilizado (por exemplo, um frasco) contendo uma composição farmacêutica que compreende um conjugado imunogênico compreendendo um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo é covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador através de um resíduo de aminoácido não natural nele. O recipiente pode conter uma dose unitária da composição farmacêutica. Os recipientes de vidro esterilizados são preferidos.
[0006] Em outra modalidade, fornecemos um dispositivo de entrega (por exemplo, seringa, nebulizador, pulverizador, inalador, adesivo dérmico, etc.) contendo uma composição farmacêutica que compreende um conjugado imunogênico compreendendo um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo é ligado covalentemente ao polipeptídeo transportador através de um resíduo de aminoácido não natural nele. O dispositivo de entrega pode conter uma dose unitária da composição farmacêutica. O dispositivo de entrega pode ser usado para administrar a composição farmacêutica a um paciente mamífero.
[0007] Em outra modalidade, fornecemos um recipiente hermeticamente fechado contendo uma composição farmacêutica que compreende um conjugado imunogênico compreendendo um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo é covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador através de um resíduo de aminoácido não natural nele. Recipientes adequados para vedação hermética incluem, por exemplo, um frasco. O conteúdo é preferencialmente esterilizado no ponto de selagem hermética.
[0008] Em outra modalidade, fornecemos uma seringa contendo 0,25- 0,75mL (por exemplo, 0,3-0,75mL, de preferência 0,5mL) de uma composição farmacêutica que compreende dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes, cada um compreendendo um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo é covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele.
[0009] Em outra modalidade, fornecemos uma composição farmacêutica compreendendo dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes e um adjuvante de sal de alumínio, em que: (i) cada conjugado imunogênico compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; (ii) o adjuvante de sal de alumínio é um adjuvante de hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio; < (iii) a composição farmacêutica tem um volume de 0,25-0,75mL (por exemplo, de 0,3-0,75mL, de preferência 0,5mL).
[0010] Em outra modalidade, fornecemos uma composição farmacêutica compreendendo dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes e um adjuvante de fosfato de alumínio, em que: (i) cada conjugado imunogênico compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao transportador polipeptídeo por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; e (ii) a concentração de íons de alumínio na composição é <300 µg/mL (por exemplo, entre 100-300µg/mL). Idealmente, a concentração de íons de alumínio é <1,7mg/mL. Os conjugados dentro da composição podem ser adsorvidos ao adjuvante de fosfato de alumínio.
[0011] Em outra modalidade, fornecemos uma composição farmacêutica compreendendo dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes e um adjuvante de fosfato de alumínio, em que: (i) cada conjugado imunogênico compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao transportador polipeptídeo por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; (ii) o polipeptídeo transportador não compreende a SEQ ID NO: 3; e (iii) a concentração de íons de alumínio na composição é <2,5 mg/mL. Idealmente, a concentração de íons de alumínio é <1,7mg/mL. Os conjugados dentro da composição podem ser adsorvidos ao adjuvante de fosfato de alumínio.
[0012] Em outra modalidade, fornecemos uma composição farmacêutica compreendendo dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes, em que: (i) cada conjugado imunogênico compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo é covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; e (ii) o volume da composição farmacêutica é de 0,25-1,25mL (por exemplo, de 0,3-0,7mL, de preferência 0,5mL). Esta composição pode incluir um adjuvante de fosfato de alumínio e os conjugados dentro da composição podem ser adsorvidos ao adjuvante de fosfato de alumínio.
[0013] Em outra modalidade, fornecemos uma composição farmacêutica compreendendo dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes e um conservante, em que cada conjugado imunogênico compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele.
[0014] Em outra modalidade, fornecemos uma composição farmacêutica sem conservantes compreendendo dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes, em que cada conjugado imunogênico compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele.
[0015] Em outra modalidade, fornecemos uma composição farmacêutica compreendendo dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes, em que: (i) cada conjugado imunogênico compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo é covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; (ii) a composição tem uma osmolalidade de 200-400 mOsm/kg.
[0016] Em outra modalidade, fornecemos uma composição farmacêutica compreendendo dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes e pelo menos um excipiente em que: (i) cada conjugado imunogênico compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; e (ii) o pelo menos um excipiente é selecionado do grupo que consiste em cloreto de sódio, ácido succínico e polissorbato 80. Também pode incluir um adjuvante de sal de alumínio. Esta composição pode incluir cloreto de sódio e polissorbato 80 como excipientes.
[0017] Em outra modalidade, fornecemos uma composição farmacêutica compreendendo n diferentes conjugados imunogênicos em que: (i) cada um dos n conjugados imunogênicos compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo é covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; (ii) n é um número inteiro de 3 a 50; e (iii) a quantidade total de polipeptídeo transportador nos n conjugados imunogênicos é menor ou igual a 3n µg por dose da composição farmacêutica.
[0018] Em outra modalidade, fornecemos uma composição farmacêutica compreendendo n diferentes conjugados imunogênicos em que: (i) cada um dos n conjugados imunogênicos compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo é covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; (ii) n é um número inteiro de 3 a 50; e (iii) a concentração total do polipeptídeo transportador nos n conjugados imunogênicos é menor ou igual a 6n µg/mL na composição farmacêutica.
[0019] Em outra modalidade, fornecemos uma composição farmacêutica compreendendo n diferentes conjugados imunogênicos em que: (i) cada um dos n conjugados imunogênicos compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo é covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; (ii) n é um número inteiro de 3 a 50; e (iii) a quantidade total de antígeno de sacarídeo nos n conjugados imunogênicos é menor ou igual a 3n µg por dose da composição farmacêutica.
[0020] Em outra modalidade, fornecemos uma composição farmacêutica compreendendo n diferentes conjugados imunogênicos em que: (i) cada um dos n conjugados imunogênicos compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo é covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; (ii) n é um número inteiro de 3 a 50; e (iii) a concentração total de antígeno de sacarídeo nos n conjugados imunogênicos é menor ou igual a 6n µg / mL na composição farmacêutica.
[0021] Em outra modalidade, fornecemos uma composição farmacêutica que compreende dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes, em que: (i) cada conjugado imunogênico compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; e (ii) a quantidade média de polipeptídeo transportador por conjugado é de 1-4 µg por dose da composição farmacêutica.
[0022] Em outra modalidade, fornecemos uma composição farmacêutica que compreende dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes, em que: (i) cada conjugado imunogênico compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; e (ii) a concentração média de polipeptídeo transportador por conjugado é de 2-8 µg/mL na composição farmacêutica.
[0023] Em outra modalidade, fornecemos uma composição farmacêutica que compreende dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes, em que: (i) cada conjugado imunogênico compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; e (ii) a quantidade média de antígeno de sacarídeo por conjugado é de 1-4 µg por dose da composição farmacêutica.
[0024] Em outra modalidade, fornecemos uma composição farmacêutica que compreende dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes, em que: (i) cada conjugado imunogênico compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; e (ii) a concentração média de antígeno de sacarídeo por conjugado é de 2-8 µg/mL na composição farmacêutica.
[0025] Em outra modalidade, fornecemos uma composição farmacêutica compreendendo n diferentes conjugados imunogênicos em que: (i) cada um dos n conjugados imunogênicos compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo é covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; (ii) n é um número inteiro de 3-50; e (iii) a composição está livre do(s) polipeptídeo(s) transportador(es) na forma não conjugada ou (iv) a composição contém o(s) polipeptídeo(s) transportador(es) na forma não conjugada, em que a massa do(s) polipeptídeo(s) transportador(es) na forma não conjugada em a composição é <10% da massa desse polipeptídeo transportador nos n conjugados imunogênicos.
[0026] Em outra modalidade, fornecemos uma composição farmacêutica compreendendo n diferentes conjugados imunogênicos em que: (i) cada um dos n conjugados imunogênicos compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo é covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; (ii) n é um número inteiro de 3-50; e (iii) a composição está livre de antígenos de sacarídeo na forma não conjugada ou (iv) a composição contém pelo menos um dos antígenos de sacarídeo na forma não conjugada, em que a massa total dos antígenos de sacarídeo na forma não conjugada na composição é < 40% (por exemplo, <30%, <20% ou <10%) da massa total dos antígenos de sacarídeo nos n conjugados imunogênicos.
[0027] Em outra modalidade, fornecemos uma composição farmacêutica que compreende 14 ou mais conjugados imunogênicos diferentes, em que: (i) cada conjugado imunogênico compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; e (ii) a quantidade total de polipeptídeo transportador por dose é <40µg.
[0028] Em outra modalidade, fornecemos uma composição farmacêutica que compreende 14 ou mais conjugados imunogênicos diferentes, em que: (i) cada conjugado imunogênico compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; e (ii) a concentração do polipeptídeo transportador é < 80 µg/mL.
[0029] Em outra modalidade, fornecemos um processo para preparar uma pluralidade de doses unitárias de uma composição farmacêutica, em que (i) a composição farmacêutica compreende um conjugado imunogênico compreendendo um polipeptídeo transportador e um antígeno sacarídeo, em que o antígeno sacarídeo está covalentemente ligado ao transportador polipeptídeo por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele, e (ii) o processo compreende as etapas de preparação de uma composição a granel compreendendo o conjugado imunogênico e embalagem de doses unitárias individuais da composição a granel em uma pluralidade de recipientes individuais. Este processo é idealmente realizado assepticamente. Os recipientes individuais podem ser selados após as doses unitárias terem sido embaladas neles. Os recipientes individuais são idealmente seringas.
[0030] Em outra modalidade, fornecemos uma composição farmacêutica compreendendo dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes, em que: (i) cada conjugado imunogênico compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo é covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; (ii) a composição é liofilizada.
[0031] Em outra modalidade, fornecemos um processo para preparar uma composição farmacêutica, em que a composição farmacêutica compreende dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes e um adjuvante de sal de alumínio,
em que (i) cada um dos conjugados imunogênicos compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, e (ii) o antígeno sacarídeo é covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; e o processo compreende uma das etapas (A) de adsorver separadamente cada um dos conjugados imunogênicos a um adjuvante de sal de alumínio, em seguida, misturar conjugados adsorvidos individuais juntos (B) adsorver sequencialmente cada um dos conjugados imunogênicos ao adjuvante de sal de alumínio ou (C) preparar um mistura de dois ou mais dos conjugados imunogênicos (por exemplo, todos eles) e combinação desta mistura com um adjuvante de sal de alumínio. O adjuvante pode ser um adjuvante de fosfato de alumínio.
[0032] Em outra modalidade, fornecemos um polipeptídeo transportador CRM197 modificado compreendendo uma sequência de aminoácidos que (i) tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1; (ii) está livre de uma sequência dipeptídica Arg-Arg; e (iii) inclui pelo menos um resíduo nnAA. Assim, por exemplo, Arg-192 e/ou Arg-193 de SEQ ID NO: 1 podem ser deletados ou podem ser substituídos por um aminoácido diferente. O(s) resíduo(s) nnAA podem ser introduzidos por substituição de um resíduo de aminoácido na SEQ ID NO: 1 e/ou por inserção. O polipeptídeo transportador CRM197 modificado pode ser usado para preparar conjugados imunogênicos (por exemplo, de antígenos de sacarídeo) através do(s) resíduo(s) de nnAA nele.
[0033] Em outra modalidade, fornecemos um polipeptídeo transportador CRM197 modificado compreendendo uma sequência de aminoácidos que (i) tem pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1 e (ii) inclui uma substituição nnAA em um ou mais dos seguintes aminoácidos resíduos (numerados de acordo com SEQ ID NO: 1): Asp-211; Asp-295; Asp-352; Asp-392; Asp-465; Asp-467; Asp-507; Asp-519; Asn-296; Asn-359; Asn-399; Asn-481;
Asn-486; Asn-502; Asn-524; Glu-240; Glu-248; Glu-249; Glu-256; Glu-259; Glu-292; Glu-362; Gln-252; Gln-287; Lys-212; Lys-218; Lys-221; Lys-229; Lys-236; Lys-264; Lys-299; Lys-385; Lys-456; Lys-474; Lys-498; Lys-516; Lys-522; Lys-534; Arg-377; Arg-407; Arg-455; Arg-460; Arg-462; Arg-472; Arg-493; Ser-198; Ser-200; Ser-231; Ser-233; Ser-239; Ser-261; Ser-374; Ser-381; Ser-297; Ser-397; Ser-451; Ser-475; Ser-494; Ser-495; Ser-496; Ser-501; Ser-505; Thr-253; Thr-265; Thr-267; Thr-269; Thr-293; Thr-386; Thr-400; Thr-408; Thr-469; e/ou Thr-517. O polipeptídeo transportador CRM197 modificado pode ser usado para preparar conjugados imunogênicos (por exemplo, de antígenos de sacarídeo) através do(s) resíduo(s) de nnAA nele.
[0034] Em outra modalidade, fornecemos um polipeptídeo transportador CRM197 modificado compreendendo: uma sequência de aminoácidos que (i) tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1; (ii) está livre de uma sequência dipeptídica Arg-Arg; e (iii) inclui uma substituição nnAA em um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos (numerados de acordo com SEQ ID NO: 1): Asp-211; Asp-295; Asp-352; Asp-392; Asp-465; Asp-467; Asp-507; Asp-519; Asn-296; Asn-359; Asn-399; Asn-481; Asn-486; Asn-502; Asn-524; Glu-240; Glu-248; Glu-249; Glu-256; Glu-259; Glu-292; Glu-362; Gln-252; Gln-287; Lys-212; Lys-218; Lys-221; Lys-229; Lys-236; Lys-264; Lys-299; Lys-385; Lys-456; Lys-474; Lys-498; Lys-516; Lys-522; Lys-534; Arg-377; Arg-407; Arg-455; Arg-460; Arg-462; Arg-472; Arg-493; Ser-198; Ser-200; Ser-231; Ser-233; Ser-239; Ser-261; Ser-374; Ser-381; Ser-297; Ser-397; Ser-451; Ser-475; Ser-494; Ser-495; Ser-496; Ser-501; Ser-505; Thr-253; Thr-265; Thr-267; Thr-269; Thr-293; Thr-386; Thr-400; Thr-408; Thr-469; e/ou Thr-517. O polipeptídeo transportador CRM197 modificado pode ser usado para preparar conjugados imunogênicos (por exemplo, de antígenos de sacarídeo) através do(s) resíduo(s) de nnAA nele.
[0035] Em outra modalidade, fornecemos um conjugado imunogênico compreendendo um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que (i) o polipeptídeo transportador compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4; e (ii) o antígeno de sacarídeo é covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de pelo menos um resíduo nnAA dentro da SEQ ID NO: 4. Também fornecemos uma composição farmacêutica compreendendo dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes, cada um compreendendo um polipeptídeo transportador e um antígeno sacarídeo, em que (i) o polipeptídeo transportador em cada conjugado compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4; e (ii) o antígeno de sacarídeo em cada conjugado é covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de pelo menos um resíduo nnAA dentro da SEQ ID NO: 4.
[0036] Em outra modalidade, fornecemos uma seringa contendo uma composição farmacêutica que compreende dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes, cada um compreendendo um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo pneumocócico, em que a seringa é- uma seringa não siliconizada. A composição farmacêutica - na seringa não siliconizada idealmente tem 13 ou mais conjugados pneumocócicos diferentes, e os polipeptídeos transportadores opcionalmente incluem um nnAA, mas podem ser, por exemplo, CRM197. Mais detalhes de- seringas não siliconizadas são fornecidas abaixo.
[0037] A Figura 1 fornece o título médio geométrico para cada um dos 32 serotipos indicados em uma vacina 32-valente da presente invenção, em relação a uma formulação de polissacarídeo/alúmen e Prevnar-13™, conforme descrito nos exemplos.
[0038] Vários detalhes de métodos, composições e técnicas para a produção de antígenos conjugados são divulgados na Publicação de Patente Internacional Número WO2018/126229, cujo conteúdo completo é aqui incorporado por referência.
[0039] A invenção geralmente se refere a conjugados imunogênicos. Estes conjugados compreendem um polipeptídeo transportador que está covalentemente ligado a um antígeno. Esta ligação pode converter um imunógeno independente de células T (como um sacarídeo) em um imunógeno dependente de células T, aumentando assim a resposta imune que é desencadeada (particularmente em crianças). Os conjugados usados aqui incluem ligações covalentes que são formadas entre um antígeno e um resíduo de aminoácido não natural ('nnAA') dentro do polipeptídeo transportador. Esses resíduos de nnAA podem fornecer grupos funcionais que facilitam a reatividade com um antígeno de interesse.
[0040] Normalmente, um único polipeptídeo transportador será ligado a várias moléculas de antígeno. Os antígenos podem ter um único grupo de ligação por molécula (por exemplo, o terminal redutor de um sacarídeo) para se ligar a um polipeptídeo transportador, ou podem ter vários grupos de ligação (por exemplo, vários grupos aldeído ou éster de cianato). Quando uma molécula de antígeno tem vários grupos de ligação, isso geralmente leva à formação de conjugados reticulados ou de rede de alto peso molecular-, envolvendo ligações entre vários polipeptídeos transportadores através dos antígenos. -Conjugados reticulados são preferidos aqui (particularmente para pneumococos) e, portanto, antígenos com múltiplos grupos de ligação também são preferidos.
[0041] As ligações covalentes são formadas entre o antígeno e um resíduo nnAA dentro do polipeptídeo transportador. De preferência, o antígeno não é conjugado com um resíduo de lisina no polipeptídeo transportador; mais preferencialmente, o antígeno não é conjugado com um resíduo de aminoácido natural no polipeptídeo transportador.
[0042] Polipeptídeos transportadores úteis contêm um epítopo de células T. Vários desses polipeptídeos transportadores são conhecidos na técnica, e dentro das vacinas aprovadas é conhecido o uso de toxóide diftérico (toxina quimicamente tratada de Corynebacterium diphtheriae; 'Dt'), toxóide tetânico (toxina tetanospasmina quimicamente tratada de Clostridium tetani; 'Tt'), proteína D de Haemophilus influenzae ('PD' ou 'HiD'), o complexo de proteína da membrana externa do meningococo do serogrupo B ('OMPC') e a toxina C.diphtheriae mutante CRM197.
[0043] Um polipeptídeo transportador preferido no qual basear os transportadores da presente invenção é CRM197. CRM197 é bem conhecido na técnica (por exemplo, ver Bröker et al. 2011 Biologicals 39:195-204) e tem a seguinte sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 1), em que o resíduo sublinhado (Glu-52) difere da toxina diftérica natural, em que a substituição de Gly → Glu leva à perda da atividade enzimática tóxica na proteína:
[0044] A invenção não usa CRM197 nativo. Em vez de usar CRM197 compreendendo SEQ ID NO: 1, é usada uma sequência de aminoácidos modificada que contém pelo menos um nnAA. Estes polipeptídeos transportadores CRM197 modificados são descritos em mais detalhes abaixo.
[0045] Além do CRM197, outras formas mutantes desintoxicadas da toxina da difteria podem ser usadas. Por exemplo, um mutante duplo K51E/E148K não tóxico também foi usado como um polipeptídeo transportador em conjugados (Pecetta et al. 2016 Vaccine 34:1405-11) e resíduos nnAA podem ser incorporados na sequência deste mutante duplo no da mesma forma que no CRM197.
[0046] Outro polipeptídeo transportador de interesse é PD de H.influenzae, que naturalmente tem a seguinte sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 5):
[0047] Em vez de usar PD nativo, é usada uma sequência de aminoácidos modificada que contém pelo menos um nnAA. Por exemplo, um ou mais resíduos Lys dentro da SEQ ID NO: 5 podem ser substituídos por um nnAA. Existem 36 resíduos Lys dentro da SEQ ID NO: 5, portanto, vários podem ser substituídos por nnAA e então usados para a conjugação. A predição e o reconhecimento de epítopos de células T para PD foram relatados por Hua et al. (2016) Clin Vaccine Immunol 23:155-61.
[0048] Mais geralmente, qualquer polipeptídeo incluindo um epítopo de célula T pode ser usado como um polipeptídeo transportador. O epítopo da célula T pode se ligar ao MHC de classe II e interagir com os receptores das células T na superfície das células T CD4 +, aumentando assim as respostas do anticorpo contra antígenos ou haptenos conjugados a eles (por exemplo, ver Costantino et al. 2011, Expert Opin Drug Discov 6: 1045-66). . Micoli et al. (2018) Molecules 23, 1451 revisa vários polipeptídeos transportadores e critérios para sua seleção.
Tontini et al. (2016) Vaccine 34:4235-42 discute estudos pré-- clínicos de 28 polipeptídeos transportadores, incluindo testes de sua capacidade de induzir anticorpos contra antígenos sacarídeos.
Polipeptídeos transportadores de poliepitopos contendo múltiplos amplamente reativos (ou seja, imunogênicos no contexto da maioria das moléculas MHC de classe II humanas), epítopos de células T CD4+ humanas de vários antígenos derivados de patógenos foram projetados, por exemplo, o N19 e outros polipeptídeos, conforme divulgado por Falugi et al. (2001) Eur J Immunol 31:3816-24, Baraldo et al. (2004) Infect Immun 72:4884-7, e patentes dos EUA 6.855.321 e 7.867.498. A capacidade de conceber estes transportadores de polipepitopo demonstra a capacidade dos técnicos no assunto de identificar epítopos de células T adequados de diversas fontes e também de os usar para conceber transportadores de polipeptídeos eficazes.
Veja também o pedido de patente US2016-0101187. Podem ser usados epítopos de células T encontrados em transportadores conhecidos (por exemplo, Tt, PD, CRM197). Várias toxinas bacterianas desintoxicadas têm sido usadas com sucesso como transportadores, por exemplo, Tt, Dt, a exotoxina P.aeruginosa, as toxinas C.difficile A e B, etc.
Muitos polipeptídeos transportadores diferentes foram usados para sacarídeos pneumocócicos, por exemplo, CRM197 em Prevnar ™, PD, Tt e Dt em Synflorix™, e vários peptídeos em Velasco et al. (1995) Infect Immun 63:961-8. A invenção pode usar qualquer um destes numerosos polipeptídeos transportadores,
modificados para incluir pelo menos um nnAA, para aumentar a imunogenicidade de antígenos de interesse.
[0049] Os polipeptídeos transportadores a serem usados com a invenção, contendo nnAA, podem ser preparados em geral usando as técnicas divulgadas na seção 6 ('Métodos de Produção de Proteínas Transportadoras') de WO2018/126229. Os transportadores preferidos contêm nnAAs fora de pelo menos um epítopo de células T do transportador. Se as regiões de epítopos de células T para um transportador são desconhecidas, então é possível identificar os epítopos usando técnicas padrão, por exemplo, ver Reece et al. (1993) IJ Immunol 151:6175-84, Beissbarth et al. (2005) Bioinformatics 21 Suppl 1:i29-37, Maciel Jr et al. (2008) Virol 378:105-17, Fridman et al. (2012) Oncoimmunol 1:1258-70, etc. (incluindo abordagens empíricas e/ou preditivas). Também é possível confirmar que qualquer modificação particular da sequência de um polipeptídeo transportador não elimina a resposta de células T desejada a um antígeno conjugado, tal como os sacarídeos aqui descritos. Um grupo preferido de transportadores não contém qualquer modificação, incluindo a inserção ou substituição de um nnAA, dentro de um epítopo de célula T. Os transportadores particularmente preferidos contêm pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5 ou pelo menos 6 nnAAs. Os transportadores particularmente preferidos também podem ter um máximo de 10, 9, 8, 7 ou 6 nnAAs. Intervalos particularmente preferidos de nnAAs em um polipeptídeo transportador são 2- 10, 2-9, 2-8, 2-7, 2-6, 3-10, 3-9, 3-8, 3-7, 3-6, 4-10, 4-9, 4-8, 4-7 e 4-6 nnAAs.
[0050] Vários antígenos podem ser incluídos nos conjugados imunogênicos usados aqui. Normalmente, o antígeno é um sacarídeo. O termo "sacarídeo" inclui polissacarídeos com 50 ou mais unidades de repetição e oligossacarídeos com menos de 50 unidades de repetição. Normalmente, os polissacarídeos têm cerca de 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou 95 unidades de repetição a cerca de
2.000 (às vezes mais) unidades de repetição e, opcionalmente, de cerca de 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1000 unidades de repetição a cerca de 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800 ou 1900 unidades de repetição. Os oligossacarídeos têm tipicamente de cerca de 6, 7, 8, 9 ou 10 unidades de repetição a cerca de 15, 20, 25, 30 ou 35 a cerca de 40 ou 45 unidades de repetição.
[0051] Sacarídeos úteis para incorporação em conjugados imunogênicos incluem aqueles encontrados em bactérias. Estes podem ser sacarídeos não capsulares, (tais como um exopolissacarídeo, por exemplo, o exopolissacarídeo S.aureus), mas são de preferência sacarídeos capsulares bacterianos.
[0052] Os sacarídeos capsulares bacterianos são sacarídeos de alto peso molecular encontrados na cápsula de bactérias Gram-positivas ou Gram- negativas e podem ser usados como antígenos vacinais. Esses sacarídeos capsulares são geralmente preparados a partir de lisados de células inteiras ou sobrenadantes de cultura da bactéria correspondente por meio de processos que envolvem diafiltração, remoção de proteínas, precipitação com etanol, remoção de ácido nucleico e liofilização. Os sacarídeos bacterianos usados com a invenção podem estar intactos como encontrados nas bactérias, ou podem ser fragmentos obtidos a partir de sacarídeos intactos, por exemplo, obtidos por hidrólise de sacarídeos purificados das bactérias.
[0053] Antígenos de sacarídeo de interesse particular incluem, mas não estão limitados a: - Sacarídeos capsulares de S.pneumoniae. Outros detalhes de sacarídeos capsulares pneumocócicos úteis como antígenos para implementar a invenção são fornecidos abaixo. - Sacarídeos de Streptococcus pyogenes: O antígeno pode ser um sacarídeo de S.pyogenes. Em uma modalidade, o antígeno é o sacarídeo capsular de S. pyogenes, que é composto de ácido hialurônico, um polímero de alto peso molecular em que a unidade de repetição tem a estrutura: [→4)-β-D-GlcUAp-(1→3)-β-D-GlcpNAc-(→] que parece ser invariante entre os serotipos de S. pyogenes.
Em outra modalidade, o antígeno é um sacarídeo não capsular de S. pyogenes, tal como o sacarídeo da parede celular do strep do grupo A, que compreende uma estrutura de unidades poli-L-ramnopiranosil conectadas por α-L- alternado (1→3) e ligações α-L-(1→2), às quais os resíduos de N-acetil-β-D-glucosamina estão ligados na posição 3 da estrutura ramnose. - Sacarídeos capsulares de Streptococcus agalactiae: O antígeno pode ser um sacarídeo capsular de S.agalactiae (Streptococcus do Grupo B ou GBS). Existem pelo menos 10 serotipos de GBS com unidades de repetição de sacarídeo capsular distintas (Ia, Ib, II-IX), mas apenas alguns serotipos são comumente responsáveis pela doença.
Estes incluem os serotipos Ia, Ib, II, III e V e podem ser preparados conjugados de sacarídeos capsulares destes serotipos. - Sacarídeos capsulares de Haemophilus influenzae: O antígeno pode ser um sacarídeo capsular de H. influenzae.
Existem pelo menos 6 serotipos de H. influenzae com estruturas químicas de sacarídeo capsular distintas (tipos a-f). No entanto, apenas o tipo a e o tipo b são considerados cepas de “alta virulência”, e o tipo preferido de sacarídeo capsular de H.influenzae para uso com a invenção é o tipo b (Hib). - Sacarídeos capsulares de Neisseria meningitidis: O antígeno pode ser um sacarídeo capsular de N. meningitidis.
Existem pelo menos 13 serogrupos de N. meningitidis com estruturas químicas de sacarídeo capsular distintas (serogrupos A, B, C, E-29, H, I, K, L, W-135, X, Y, Z e Z') , mas apenas seis (A, B, C, W-135, X, Y) são considerados potencialmente fatais.
O antígeno de sacarídeo é derivado de forma útil de qualquer um dos serogrupos A, C, W135, X ou Y. - Sacarídeos capsulares de Porphyromonas gingivalis: O antígeno pode ser um sacarídeo capsular derivado de um dos seis serotipos K1, K2, K3, K4, K5 e K6 de P.gingivalis. - Sacarídeos capsulares de Salmonella typhi: O antígeno pode ser um sacarídeo Vi. Vi é o sacarídeo capsular de Salmonella typhi (o sorovar typhi de S.enterica). O sacarídeo Vi é um homopolímero linear de um ácido hexosaminurônico, Ácido 1,4-N-acetilgalactos-aminourônico, que é 60-90% acetilado na posição C-3. - Sacarídeos de Staphylococcus aureus: O antígeno pode ser um sacarídeo de S.aureus. O sacarídeo pode ser o exopolissacarídeo de S.aureus, que é uma poli-N-acetilglucosamina (PNAG), ou um sacarídeo capsular de S.aureus, que pode ser, por exemplo, serotipo 5, serotipo 8 ou serotipo 336. - Sacarídeos de superfície de Clostridium difficile: O antígeno pode ser um glicano de superfície de C.difficile, como PS-I ou PS-II. - Glucanos: O antígeno pode ser um glucano contendo ligações β-1,3 e/ou ligações β-1,6. Estes glucanos conjugados podem ser úteis para aumentar uma resposta imune antifúngica, por exemplo, contra Candida albicans.
[0054] Detalhes adicionais destes antígenos de sacarídeo podem ser encontrados em WO2018/126229.
[0055] Os antígenos frequentemente não contêm intrinsecamente grupos funcionais que sejam adequados ou ideais para conjugação. Assim, um antígeno pode precisar ser funcionalizado antes de sua conjugação com o nnAA. Mais detalhes de tal funcionalização são fornecidos abaixo.
[0056] Os antígenos preferidos para uso com a invenção são sacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae. S.pneumoniae é uma bactéria Gram-
positiva encapsulada que pode causar pneumonia, bacteremia e meningite. Existem pelo menos 90 serotipos distintos de S.pneumoniae documentados (ver, por exemplo, Kalin, M. Thorax 1998; 53:159-162) que carregam sacarídeos capsulares com estruturas de unidade de repetição específicas do serotipo. Como será entendido por aqueles na área, tem sido proposto que a S. pneumoniae do serotipo 20 é realmente formada por dois serotipos estreitamente relacionados, os polissacarídeos capsulares de que são em grande parte através do protector (Calix et al. 2012 J Biol Chem 287 : 27885-94). Assim, como seria ainda apreciado pelos técnicos no assunto, o serotipo 20 se refere a um sacarídeo que teria sido previamente classificado no campo como serotipo 20 e poderia, portanto, ser estruturalmente 20A ou 20B (de uma cepa que teria previamente classificado no campo como serotipo 20, mas poderia ser genotipicamente 20A ou 20B) conforme divulgado por Calix et al. Por exemplo, acredita-se agora que a cepa usada para produzir o polissacarídeo do serotipo 20 em Pneumovax™ (Merck) seja o serotipo 20A. Em alguns casos, 20A pode ser preferido. Em outros casos, 20B pode ser preferido. A prevalência em uma população-alvo pode ser uma base para a seleção entre esses serotipos. No entanto, como as cepas classificadas como 20, 20A e 20B são sorologicamente semelhantes, elas apresentam grande proteção cruzada em uma vacina e a escolha entre as cepas pode não ser crítica.
[0057] O antígeno utilizado com a invenção pode ser um sacarídeo capsular a partir de qualquer serotipos de S. pneumoniae 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 7A, 7B, 7C, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10F, 10A, 10B, 10C, 11F, 11A, 11B, 11C, 11D, 12F, 12A, 12B, 13, 14, 15F, 15A, 15B, 15C, 16F, 16A, 17F, 17A, 18F, 18A, 18B, 18C, 19F, 19A, 19B, 19C, 20, 21, 22F, 22A, 23F, 23A, 23B, 24F, 24A, 24B, 25F, 25A, 27, 28F, 28A, 29, 31, 32F, 32A, 33F, 33A, 33B, 33C, 33D, 34, 35F, 35A, 35B, 35C, 36, 37, 38, 39, 40, 41F, 41A, 42, 43, 44, 45, 46, 47F, 47A, ou 48 (Henrichsen J Clin Microbiol 1995;
33:2759–2762). No entanto, apenas um subconjunto destes serotipos é geralmente responsável pela infecção bacteriana de importância clínica, de modo que o antígeno pode ser um sacarídeo capsular a partir de qualquer de S. pneumoniae serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F. Os serotipos 6C, 7C, 15A, 15C, 16F, 20A, 20B, 23A, 23B, 24B, 31, 34, 35B, 35F, 37 e 38 também se tornaram uma preocupação clínica, então o antígeno pode ser um sacarídeo capsular de um dos esses serotipos de S.pneumoniae.
[0058] Quando a invenção usa conjugados de diferentes serotipos pneumocócicos, é preferível incluir sacarídeos de pelo menos 14 serotipos diferentes de S.pneumoniae ( por exemplo, de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, ou mais) Quando uma composição inclui 14 ou mais serotipos, estes incluem preferencialmente os 13 serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F. Além desses 13 serotipos de S.pneumoniae, uma composição inclui preferencialmente um ou mais dos serotipos 2, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20 (alternativamente, 20A ou 20B), 22F e/ou 33F.Alternativamente, além dos 13 serotipos acima, uma composição inclui preferencialmente um ou mais serotipos de S.pneumoniae 2, 6C, 8, 9N, 10A, 12F, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 20, 20A, 20B, 22F , 23A, 23B, 24F, 24B, 31, 33F, 34, 35B, 35F e 38. Uma combinação útil de 15 ou mais (por exemplo, 16 ou mais) serotipos inclui cada um dos serotipos de S.pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F, e também pode incluir o serotipo 8. Uma combinação útil de 20 ou mais (por exemplo, 21 ou mais) serotipos de S.pneumoniae inclui cada um dos serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C , 19A, 19F, 22F, 23F e 33F.Uma combinação útil de 24 ou mais serotipos inclui cada um dos serotipos de S. pneumoniae 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C , 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F.
[0059] As estruturas das unidades de repetição do sacarídeo capsular do serotipo pneumocócico comum são descritas em Jones et al. (Jones C et al.
An Acad Bras Ciênc.
Junho de 2005; 77 (2): 293-324): Tipo 1 [→3)-D-AAT-α-Galp-(1→4)-α-D-GalpA(2/3OAc)-(1→3)-α-D-GalpA-(1→] Tipo 2 [→4)-β-D-Glcp-(1→3)-[α-D-GlcpA-(1→6)-α-D-Glcp-(1→2)]-α-L-Rhap- (1→3)-α-L-Rhap-(1→3)β-L-Rhap-(1→] Tipo 3 [→3)-β-D-GlcA-(1→4)-β-D-Glcp-(1→] Tipo 4 [→3)-β-D-ManpNAc-(1→3)-α-L-FucpNAc-(1→3)-α-D-GalpNAc-(1→4) -α-D- Galp2,3(S)Py-(1→] Tipo 5 [→4)-β-D-Glcp-(1→4)-[α-L-PnepNAc-(1→2)-β-D-GlcpA-(1→3)] -α-L- FucpNAc-(1→3)-β-D-Sugp-(1→] Tipo 6B [→2)-α-D-Galp-(1→3)-α-D-Glcp-(1→3)-α-L-Rhap-(1→4)-D-Rib-ol-(5→P→] Tipo 9N [→4)-α-D-GlcpA-(1→3)-α-D-Glcp-(1→3)-β-D-ManpNAc-(1→4) -β-D-Glcp- (1→4)-α-D-GlcpNAc-(1→] Tipo 9V [→4)-α-D-GlcpA(2/3OAc)-(1→3)-α-D-Galp-(1→3)-β-D-ManpNAc(4/6OAc)- (1→4) -β-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→] Tipo 12F [→4)-[α-D-Galp-(1→3)]α-L-FucpNAc-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→4)-[α-D-Glc- (1→2) -α-D-Glc-(1→3)]-β-D-ManNAcA-(→]
Tipo 14 [→4)-β-D-Glcp-(1→6)-[β-D-Galp-(1→4)]-β-D-GlcpNAc-(1→3)-β-D-Galp- (1→] Tipo 18C [→4)-β-D-Glcp-(1→4)-[α-D-Glcp(6OAc) (1→2)][Gro-(1→P→3)]-β-D-Galp- (1→4) -α-D-Glcp-(1→3)-β-L-Rhap-(1→] Tipo 19F [→4)-β-D-ManpNAc-(1→4)-α-D-Glcp-(1→2)-α-L-Rhap-(1→P→] Tipo 23F [→4)-β-D-Glcp-(1→4)-[α-L-Rhap-(1→2)]-[Gro-(2→P→3)] -β-D-Galp-(1→4)- β-L-Rhap-(1→]
[0060] Uma discussão mais extensa sobre os sacarídeos é encontrada em Geno et al. (2015) Clin. Microbiol. Rev. 28:871-99, em que a Tabela 1 mostra as estruturas para 97 serotipos conhecidos. Esta tabela também descreve a proporção de resíduos de sacarídeo que são acetilados quando a acetilação não está completa.
[0061] O sacarídeo capsular pode ser O-acetilado. Em algumas modalidades, o sacarídeo capsular do serotipo 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A , 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F compreende um sacarídeo que tem um grau de O-acetilação entre 10-100%, entre 20-100%, entre 30-100%, entre 40-100% , entre 50-100%, entre 60-100%, entre 70-100%, entre 75-100%, 80-100%, 90-100%, 50-90%, 60-90%, 70-90% ou 80-90%. Em outras modalidades, o grau de O-acetilação é maior que 10%, maior que 20%, maior que 30%, maior que 40%, maior que 50%, maior que 60%, maior que 70%, maior que 80%, maior do que 90% ou cerca de 100%. O grau de O- acetilação do sacarídeo pode ser determinado por RMN de prótons (ver por exemplo Lemercinier & Jones (1996) Carbohydrate Research 296: 83-96; Jones et al. (2002) J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30: 1233-1247) Normalmente, o sacarídeo usado para preparar um conjugado reterá pelo menos 50% (por exemplo, 75% ou mesmo 100%) dos níveis de O-acetilação vistos no sacarídeo capsular inicial purificado de uma bactéria.
[0062] Os sacarídeos capsulares de S. pneumoniae podem ser obtidos diretamente a partir de bactérias utilizando procedimentos de isolamento conhecidos de um técnico no assunto comum (ver, por exemplo, métodos divulgados na Patente dos EUA App. Publicação Números. 2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340 e 2008/0102498 e WO 2008/118752). Como alternativa, eles podem ser obtidos de uma fonte comercial (por exemplo, ATCC).
[0063] Um antígeno de sacarídeo capsular pneumocócico usado com a invenção pode ter um peso molecular entre 10 kDa e 4.000 kDa, por exemplo, entre 50 kDa e 3.000 kDa, ou entre 100 kDa e 2.000 kDa. Por exemplo, o peso molecular pode estar entre 100 kDa e 2.000 kDa; entre 100 kDa e 1.750 kDa; entre 100 kDa e 1.500 kDa; entre 100 kDa e 1.250 kDa; entre 100 kDa e 1.000 kDa; entre 100 kDa e 750 kDa; entre 100 kDa e 500 kDa; entre 200 kDa e 4.000 kDa; entre 200 kDa e 3.500 kDa; entre 200 kDa e 3.000 kDa; entre 200 kDa e
2.500 kDa; entre 200 kDa e 2.000 kDa; entre 200 kDa e 2.000 kDa; entre 200 kDa e 1.750 kDa; entre 200 kDa e 1.500 kDa; entre 200 kDa e 1.250 kDa; entre 200 kDa e 1.000 kDa; entre 200 kDa e 750 kDa; ou entre 200 kDa e 500 kDa. Mais detalhes e orientações com relação aos pesos moleculares estão disponíveis em U.S. Serial No. 62/693.978, previamente incorporado por referência neste documento.
[0064] O sacarídeo capsular é opcionalmente modificado quimicamente em relação ao sacarídeo capsular encontrado na natureza. Por exemplo, o sacarídeo é opcionalmente des-O-acetilado (parcialmente ou totalmente), des-
N-acetilado (parcialmente ou totalmente), N-propionado (parcial ou totalmente), etc. De- a acetilação ocorre opcionalmente antes, durante ou após a ativação, derivatização ou conjugação, mas normalmente ocorre antes da conjugação.
[0065] Algumas modalidades da invenção envolvem o uso de dois ou mais conjugados diferentes. Em relação aos conjugados de sacarídeo capsular pneumocócico, isso significa (ao usar um único tipo de polipeptídeo transportador para cada conjugado) que cada conjugado "diferente" possui um sacarídeo de um serotipo pneumocócico diferente.
[0066] As composições preferidas da invenção envolvem o uso de dois ou mais conjugados diferentes, por exemplo, dentro de uma única composição farmacêutica. Essas modalidades também são chamadas de multivalentes. Quando quaisquer dois conjugados são descritos como 'diferentes', ou fornecem valências diferentes em uma composição 'multivalente', isso se refere a uma diferença entre a combinação de polipeptídeo transportador e antígeno nesses dois conjugados. Por exemplo, quando um único tipo de CRM197 modificado (por exemplo, SEQ ID NO: 4) é conjugado a um sacarídeo capsular de um único serotipo de pneumococo, o produto da reação conterá muitos tipos diferentes de molécula (diferentes pesos moleculares, diferentes padrões de ligações dentro de cada molécula, etc.), mas são considerados como um único conjugado aqui. Os técnicos no assunto estão familiarizados com esta heterogeneidade no nível molecular e da mesma forma definem conjugados individuais de uma vacina pela combinação antígeno-transportador do conjugado particular, com outras propriedades (como peso molecular) sendo uma média dentro da composição do conjugado. Dois conjugados 'diferentes' têm um polipeptídeo transportador diferente (ou seja, tendo uma sequência de aminoácidos diferente) e/ou um antígeno diferente (ou seja, tendo uma estrutura antigênica diferente).
[0067] Por exemplo, os antígenos de sacarídeo capsular podem ser purificados a partir de dois serotipos diferentes de pneumococo. Estes dois sacarídeos capsulares diferentes podem ser conjugados separadamente a um polipeptídeo transportador (que pode ser o mesmo ou diferente) para fornecer dois conjugados diferentes. Assim, em relação aos conjugados de sacarídeo capsular bacteriano, a diferença entre dois conjugados 'diferentes' será tipicamente que um contém sacarídeo capsular de um primeiro serotipo ou serogrupo de uma espécie bacteriana enquanto o outro contém sacarídeo capsular de um segundo serotipo ou serogrupo daquele espécies bacterianas, por exemplo, sacarídeos capsulares de diferentes serotipos de S.pneumoniae, ou sacarídeos capsulares de diferentes serogrupos de N. meningitidis. Dois conjugados também seriam 'diferentes' se incluíssem sacarídeos capsulares antigenicamente distintos de várias espécies bacterianas, por exemplo, um conjugado de sacarídeo Hib e um conjugado de sacarídeo meningocócico.
[0068] As composições multivalentes preferidas da invenção incluem n conjugados de sacarídeo imunogênicos diferentes, em que o antígeno de sacarídeo em cada um dos n conjugados imunogênicos é distinto do antígeno de sacarídeo dos outros n-1 conjugados imunogênicos. Por exemplo, se a composição inclui antígenos de uma única espécie bacteriana, pode haver sacarídeos capsulares de n diferentes serotipos ou n diferentes serogrupos dessa espécie.
[0069] Esta nomenclatura em relação a 'diferentes' conjugados é usada no campo da vacina conjugada. Por exemplo, Glesby et al. (2015) J Infect Dis 212:18- 27 menciona que a vacina Prevnar™ PCV13 contém '13 conjugados diferentes' porque inclui antígenos de sacarídeos de 13 serotipos pneumocócicos diferentes, conjugados separadamente com CRM197. De maneira semelhante, EP-A-2932979 refere-se a 'uma composição imunogênica compreendendo 13 diferentes conjugados de polissacarídeo-proteína'.
[0070] Assim, a vacina PCV7 Prevnar™ tem 7 conjugados diferentes, a vacina PCV13 Prevnar™ tem 13 conjugados diferentes, a vacina Menveo™ tem 4 conjugados diferentes, a vacina Menactra™ tem 4 conjugados diferentes, a vacina Nimenrix™ tem 4 conjugados diferentes, o Menitorix A vacina™ tem 2 conjugados diferentes, a vacina Menhibrix™ tem 3 conjugados diferentes, a vacina Synflorix™ tem 10 conjugados diferentes, etc.
[0071] As composições multivalentes de conjugados pneumocócicos incluem preferencialmente mais de 13 conjugados diferentes, por exemplo, 14, 15, 20, 21, 24, 25 ou mais. Escolhas adequadas de serotipos para estes >13- as composições valentes são discutidas acima.
[0072] No que diz respeito a vacinas de alta valência (por exemplo, com mais de 13 conjugados diferentes), pode às vezes ser preferido usar mais de um polipeptídeo transportador para reduzir a possibilidade de supressão de transportador (por exemplo, ver WO98/51339 e WO2011/110241). Por exemplo, em uma vacina multivalente compreendendo n diferentes conjugados, um primeiro polipeptídeo transportador é conjugado a ny antígenos diferentes (por exemplo, os saacarídeos capsulares de diferentes serotipos ou serogrupos bacterianos) e um segundo transportador polipeptídico é conjugado aos antígenos y restantes. De maneira semelhante, três, quatro ou mais portadores podem ser usados com os n antígenos divididos entre eles. Quando mais de um transportador é usado, pelo menos o primeiro transportador é um polipeptídeo transportador contendo nnAA de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade preferida, pelo menos o primeiro e o segundo transportadores são polipeptídeos transportadores contendo nnAA de acordo com a presente invenção
[0073] Como mencionado acima, os conjugados usados aqui incluem ligações covalentes entre um antígeno e um grupo funcional dentro de um resíduo de nnAA no polipeptídeo transportador. As cadeias laterais de resíduos de nnAA podem fornecer grupos funcionais reativos que são úteis para a conjugação de antígenos a sítios discretos no polipeptídeo transportador.
[0074] Em termos gerais, o nnAA pode ser qualquer aminoácido que pode ser incorporado em um polipeptídeo durante a tradução, mas não é um dos 20 aminoácidos comuns. Um nnAA pode ser convenientemente incorporado em um polipeptídeo convertendo uma molécula de tRNA de modo que seu códon incorpore o nnAA em vez do aminoácido cognato natural. Uma técnica para conseguir isso envolve o uso de um "códon de supressão", ou seja, um tripleto de nucleotídeos que é introduzido em uma sequência de codificação em uma posição desejada e é reconhecido por um tRNA específico que pode reconhecer um códon de parada natural (por exemplo, um âmbar, ocre ou opala códon de parada), mas permite que a tradução continue, com a incorporação do nnAA (suprimindo assim o códon de parada natural).
[0075] O resíduo nnAA pode ser qualquer um dos resíduos nnAA aqui descritos, ou qualquer outro que tenha sido identificado como compatível com a síntese de proteína baseada em células ou livre de células (ver, por exemplo, Schultz et al. Annu Rev Biochem. 2010;79:413-44 particularmente pp.418-420; e Chin et al. Annu Rev Biochem. 2014;83:5.1-5.30, que são incorporados neste documento por referência). Idealmente, o nnAA não surge naturalmente dentro de uma célula por modificação de um dos 20 aminoácidos comuns (por exemplo, pirolisina, selenocisteína, fosfotirosina, formil-metionina, etc.).
[0076] Os nnAA particularmente preferidos para uso neste documento são aqueles que podem ser incorporados durante a tradução (em um sistema celular ou sem células) com uma cadeia lateral que fornece um grupo funcional que não é encontrado na cadeia lateral de qualquer um dos 20 aminoácidos naturais ácidos. Várias técnicas para incorporar tais aminoácidos em polipeptídeos são conhecidas, por exemplo, ver Young & Schultz (2010) J Biol Chem 285:11039-44, Maza et al. (2015) Bioconjugate Chem. 26:1884-9 e Zimmerman et al. (2014) Bioconjugate Chem. 25:351-61. WO2018/126229 divulga em detalhes como os resíduos nnAA podem ser incorporados em polipeptídeos transportadores, por exemplo, usando misturas de expressão livres de células, pares de tRNA/aminoacil-tRNA sintetase ortogonais específicos para o nnAA, códons de supressão, etc. Veja também o pedido de patente US-2017/0267637.
[0077] O nnAA pode incluir um grupo químico adequado para reação química de "clique" com um grupo correspondente em um antígeno de interesse. Os grupos químicos adequados para a química de "clique" incluem, mas não estão limitados a azido (-N 3), alcino (-C≡C-), alquino (-C = C-) e 1,2,4,5-
N N tetrazina ( N N ), e grupos fosfina (por exemplo -P(Ph)2).
[0078] O nnAA pode ser qualquer um de ácido 2-amino-3-(4- azidofenil)propanóico (para-azido-L-fenilalanina ou pAF), ácido 2-amino-3-(4- (azidometil)fenil)propanóico (para-azidometil-L-fenilalanina ou pAMF), ácido 2- amino-3-(5-(azidometil)piridin-2-il)propanóico, ácido 2-amino-3-(4- (azidometil)piridin-2-il)propanóico, ácido 2-amino-3-(6-(azidometil)piridin-3- il)propanóico ou ácido 2-amino-5-azidopentanóico.
[0079] O nnAA mais preferido para uso aqui é pAMF:
pAMF fornece cinética de reação muito favorável para a produção de conjugados (por exemplo, muito mais rápido do que usar pAF ao reagir com um antígeno de carboidrato contendo alquino em um método SPAAC).
[0080] O nnAA pode ser um ácido propanóico 2,3-dissubstituído contendo: um substituinte amino na posição 2; e um substituinte contendo azido, um substituinte contendo 1,2,4,5-tetrazinil ou um substituinte contendo etinil na posição 3. De preferência, o substituinte na posição 3 é um substituinte contendo azido, particularmente um substituinte contendo azido compreendendo um grupo azido terminal ligado ao átomo de carbono na posição 3 através de um grupo de ligação. Por exemplo, o grupo de ligação pode compreender uma porção arileno que é opcionalmente substituída e opcionalmente contém heteroátomo. Por exemplo, o grupo de ligação pode compreender uma porção arileno de 5 ou 6 membros contendo 0 a 4 heteroátomos e 0 a 4 substituintes de anel não hidrogênio.
[0081] O nnAA pode ter a estrutura da fórmula XII: (XII) em que: Ar compreende um anel aromático de 5 ou 6 membros contendo opcionalmente pelo menos um heteroátomo; W5 é selecionado de alquileno C1- C10, -NH-, -O- e -S-; Q1 é zero ou 1; e W6 é selecionado a partir de azido, 1,2,4,5- tetrazinil opcionalmente C-substituído com um grupo alquil inferior e etinil. Em algumas modalidades, Ar não contém nenhum heteroátomo, caso em que o ligante preferido é um grupo fenileno não substituído (ou seja, Ar é- C6H4-) Em outras modalidades, Ar contém um heteroátomo de nitrogênio e pelo menos um heteroátomo adicional selecionado de N, O e S. Heterociclos de nitrogênio exemplares são descritos infra e Ar pode ser, por exemplo, uma piridina ou uma piridazina. Numa forma de realização particularmente preferida, Q1 é 1, W5 é alquileno inferior, e W6é azido.
[0082] O nnAA pode ser um nnAA contendo azido, como um nnAA da fórmula I:
O N3
HO D NH2 em que: D é —Ar—W3— ou —W1—Y1—C(O)—Y2—W2—; cada um de W1, W2 e W3 é independentemente uma ligação simples ou alquileno inferior; cada X1 é independentemente- NH-,- O-, ou- S-; cada Y1 é independentemente uma única ligação, -NH-, ou –O-; cada Y2 é independentemente uma ligação Z2 Z3 Z1 simples,- NH-,- O-, ou um pirrolidinileno ligado a N ou ligado a C; Ar é , X1 N HN HN N HN N Z1 X1 N N Z3 N N N , , , , , ou ; e um de Z 1, Z 2 eZ 3 é- N- e os outros de Z 1, Z 2 e Z 3 são independentemente- CH-.
[0083] Em outras modalidades, o nnAA tem a fórmula II:
em que W4 é alquileno C1-C10.
[0084] A preparação de aminoácidos contendo azido de acordo com as fórmulas I e II encontra-se, por exemplo, em Stafford et al. US2014-0066598A1, particularmente os parágrafos [0331] - [0333], que são incorporados por referência. O processo envolve a substituição de grupos hidroxila por cloreto em derivados dos arilaminoácidos correspondentes usando cloreto de tionila, seguido por deslocamento nucleofílico do cloreto com azida. Os aminoácidos adequados contendo cadeias laterais de arilo também são adquiridos comercialmente.
[0085] O nnAA pode ser um nnAA contendo 1,2,4,5-tetrazina. Por exemplo, fórmula III:
V N HO Ar N NH 2 N
N R Z2 X1 N HN HN N HN N Z3 Z1 Z1 X N N Z3 1 N N N em que: Ar é , , , , , , ou ; V é uma ligação simples, alquileno inferior ou -W1-W2-; um de W1 e W2 está ausente ou alquileno inferior, e o outro é -NH-, -O- ou -S-; cada um de Z 1, Z 2 e Z 3 independentemente -CH- ou -N-; e X1 independentemente -NH-, -O- ou -S-; e R é alquilo inferior.
[0086] A preparação de aminoácidos contendo 1,2,4,5-tetrazina de acordo com a fórmula III encontra-se, por exemplo, em Yang et al. US2016/0251336, particularmente os parágrafos [0341] - [0377], que são incorporados por referência. O processo envolve o acoplamento de Negishi de um derivado de amino/carboxil protegido de ácido (R)-2-amino-3-iodopropanóico com um brometo de aminopiridil para introduzir Ar, seguido por reação com um derivado de metiltio-1,2,4,5-tetrazina para introduzir a porção tetrazina no aminoácido.
[0087] O nnAA pode ser um nnAA contendo alquino. Em uma modalidade, este é um grupo propargil. Uma variedade de aminoácidos contendo propargil, incluindo sua síntese, são encontrados em Beatty et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 7364-7; Beatty et al. J. Am. Chem. Soc. 2005(127): 14150–1; Nguyen et al. JACS 2009 (131): 8720-1. Esses aminoácidos contendo propargil são adequados para incorporação em proteínas usando sistemas baseados em células. Em algumas modalidades, o nnAA contendo propargil é selecionado do grupo que consiste em homopropargilglicina, etinilfenilalanina e N6-[(2- propiniloxi)carbonil]-L-lisina.
[0088] Os nnAA usados aqui são geralmente aminoácidos α com um centro quiral no carbono α, e eles são preferencialmente L-estereoisômeros.
[0089] Um transportador polipeptídico usado com a invenção inclui pelo menos um resíduo nnAA. É preferível que um polipeptídeo transportador deva incluir múltiplos nnAA, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 resíduos de nnAA (ou às vezes mais). Polipeptídeos transportadores com menos de 10 resíduos nnAA são preferidos. Assim, o polipeptídeo pode incluir 2-9 resíduos nnAA e, de preferência, inclui 4-6 resíduos nnAA.
[0090] Quando um polipeptídeo transportador inclui múltiplos resíduos nnAA, é preferível incluir apenas uma única espécie de nnAA (por exemplo, o único nnAA no transportador é pAMF). Isso permite que a mesma química de conjugação seja usada simultaneamente em cada nnAA. Se for desejado anexar dois antígenos diferentes a uma única molécula transportadora, isso pode ser conseguido usando diferentes espécies de nnAA dentro de um único transportador e conjugando cada antígeno a um nnAA diferente, mas a conjugação a uma única espécie de nnAA em um transportador é preferida. Além disso, quando vários conjugados diferentes são usados (por exemplo, serotipos pneumocócicos diferentes), às vezes é preferível que cada conjugado inclua a mesma espécie única de nnAA. Além disso, quando uma composição inclui vários conjugados diferentes (por exemplo, diferentes serotipos pneumocócicos), às vezes é preferido que cada conjugado inclua o mesmo polipeptídeo transportador.
[0091] Um nnAA pode ser incorporado em um polipeptídeo transportador por substituição ou por inserção (ou por extensão C-terminal ou N-terminal). Em uma modalidade, o(s) resíduo(s) nnAA são incorporados por substituição. Convenientemente, o nnAA pode ser substituído por um resíduo de lisina no polipeptídeo nativo. Por exemplo, em CRM197 a substituição pode ocorrer em uma ou mais das posições K24, K33, K37, K39, K212, K214, K227, K244, K264, K385, K522 e K526 em SEQ ID NO: 1 ou 2. A substituição de um nnAA (por exemplo, pAMF) em cada um de K33, K212, K244, K264, K385 e K526 (e em uma modalidade em nenhuma outra posição) é preferida.
[0092] As substituições para incorporar nnAA não estão limitadas às posições de lisina, no entanto, e também é possível substituir outros aminoácidos por um nnAA, por exemplo, Phe, Asp, Asn, Glu, Gln, Arg, Ser e/ou Thr.
[0093] O(s) nnAA(s) dentro de um polipeptídeo transportador é/são resíduos idealmente acessíveis à superfície. Isso pode ser avaliado usando uma estrutura 3D do polipeptídeo ou realizando uma substituição abrangente de aminoácidos naturais por nnAAs seguido por testes de conjugação, para avaliar a utilidade de cada sítio.
[0094] Para preservar a função de um polipeptídeo transportador, preferiu- se não incorporar um nnAA dentro de um epítopo de ativação de células T do polipeptídeo transportador. O uso de nnAA permite a colocação seletiva de sítios para conjugação e, portanto, os epítopos de ativação de células T de um polipeptídeo transportador podem ser evitados como sítios para conjugação de antígeno. Como mencionado acima, esses epítopos podem ser facilmente identificados. Por exemplo, estudos de CRM197 por Raju et al., Bixler et al., Leonard et al. e Pillai et al. (por exemplo, Eur J Immunol. 1995 dez; 25 (12):3207- 14, WO89/06974) identificaram vários T- epítopos celulares, por exemplo, nos resíduos P271-D290, V321-G383 e Q411-I457. Assim, é preferido evitar a introdução de nnAA nestas regiões de SEQ ID NO: 1.
[0095] A conjugação envolve a formação de uma ligação covalente entre o resíduo nnAA e o antígeno. Isso requer um grupo funcional reativo tanto no nnAA quanto no antígeno. Um nnAA para o polipeptídeo transportador geralmente será escolhido porque já tem um grupo funcional adequado (por exemplo, o grupo azido de pAMF), mas os antígenos frequentemente não contêm grupos funcionais intrinsecamente que são adequados ou ideais para a conjugação. Assim, um antígeno pode precisar ser funcionalizado antes de sua conjugação com o nnAA.
[0096] Informações técnicas detalhadas sobre conjugação podem ser encontradas em Bioconjugate Techniques (Greg T Hermanson, 3ª edição, 2013). WO2018/126229 divulga em detalhes como os antígenos podem ser funcionalizados e, em seguida, conjugados com nnAA. Como observado acima, nnAA útil inclui um grupo funcional (por exemplo, um grupo azido) que é adequado para uma reação química de "clique" com um grupo funcional no antígeno. Assim, um antígeno funcionalizado inclui idealmente um grupo adequado para tais reações de “clique”.
[0097] Em termos gerais, a conjugação ocorre assim por um processo que compreende 3 etapas: (a) ativação do antígeno; (b) opcionalmente derivatizar o antígeno ativado (por exemplo, com um ligante ou grupo nucleofílico) para introduzir um grupo funcional reativo normalmente não presente no antígeno;
e (c) conjugar o antígeno com o polipeptídeo transportador por meio de um grupo introduzido na etapa (a) ou, se presente, na etapa (b). Em algumas modalidades, a etapa (a) inclui uma primeira etapa de remoção de um grupo de bloqueio no antígeno, de modo que certos grupos funcionais (por exemplo, hidroxilas, aminas, tióis) sejam mais acessíveis para ativação. Às vezes, as etapas (a)-(c) podem ocorrer essencialmente simultaneamente (por exemplo, quando uma fração reativa, como N- hidroxisuccinimida é adicionada ao antígeno), mas em outras modalidades duas ou mais das etapas (a)-(c) são discretas, com purificação opcional entre as etapas.
[0098] Como observado acima, conjugados reticulados são preferidos, por isso também é preferido introduzir vários grupos funcionais reativos por molécula de antígeno. Por exemplo, vários grupos de aldeído ou éster de cianato podem ser introduzidos ao ativar uma molécula de sacarídeo. Estes grupos podem então ser derivatizados, por exemplo, para introduzir um ciclo-octino reativo que pode então reagir com grupos azido no nnAA.
[0099] Um antígeno pode ser ativado usando vários produtos químicos, incluindo, mas não se limitando a: oxidação de periodato (por exemplo, para oxidar grupos hidroxila em átomos de carbono adjacentes para dar grupos aldeído reativos), por exemplo, como divulgado em WO2011/110531; cianilação, por exemplo, usando tetrafluoroborato de 1-ciano-4- dimetilaminopiridínio (CDAP); ativação de hidroxila com 1,1'- carbonildiimidazol (CDI) seguido por adição nucleofílica; ou desmascaramento de um aldeído intrínseco (por exemplo, uma terminação redutora de um sacarídeo).
[0100] A oxidação com periodato e a cianilação de CDAP são duas técnicas de ativação preferidas. A oxidação com periodato mostrou ser útil para ativar inter alia os serotipos pneumocócicos 1, 2, 3, 7F, 8, 9N e 11A. A cianilação de
CDAP mostrou ser útil para ativar inter alia os serotipos pneumocócicos 3, 7F e 10A.
[0101] O antígeno ativado pode ser conjugado a um nnAA diretamente, mas geralmente o grupo ativado é derivatizado para introduzir um grupo funcional que mostra melhor reatividade para o grupo funcional do nnAA. Por exemplo, pode ser introduzido um grupo alcinilo. Um reagente bifuncional com um grupo amino e um grupo alquino pode reagir com um grupo aldeído que foi introduzido em um antígeno (por exemplo, via aminação redutora), deixando assim um alquino pendente que pode reagir com um nnAA. Por exemplo, podem ser usados reagentes bifuncionais incluindo grupos funcionais amino e DBCO.
[0102] Em uma modalidade, o nnAA reage com um grupo alquinil no antígeno (por exemplo, um grupo propargil). Um grupo alquino em um antígeno é ideal para reagir com um grupo azido em um nnAA, por exemplo, usando as reações conhecidas na técnica como cicloadição azida-alquino catalisada por cobre (CuAAC), cicloadição azida-alquino catalisada por rutênio (RuAAC) ou Huisgen cicloadição 1,3-dipolar de azida-alquino. O grupo alquinil pode ter um contexto molecular que aumenta sua reatividade, por exemplo, pode estar dentro de um anel. Por exemplo, o alquileno pode estar dentro de um anel ciclo- octino (opcionalmente incluindo um heteroátomo), tal como um anel ciclo- octino tenso de diaril (por exemplo, DBCO). Esta reação pode ser uma cicloadição [3+2] referida na técnica como cicloadição azida-alquino promovida por cepa (SPAAC). Reagentes baseados em DIFO e DBCO estão prontamente disponíveis para essas reações.
[0103] Os anéis contendo alquino úteis em reações SPAAC incluem ciclooctilo difluorado (DIFO) e dibenzociclooctilos. Estes estão disponíveis com grupos funcionais pendentes para ligação a antígenos ativados (por exemplo,
com um amino pendente para ligação a um aldeído ou um éster de cianato), por exemplo, usando qualquer um dos seguintes reagentes: O NH 2
H N n
O DBCO-PEGn-NH2 DBCO-PEGn-NH2
O Ácidos carboxílicos DBCO
O DBCO-NH2 O Ácido carboxílico DIFO
[0104] O valor de 'n' em 'PEGn' representa o número de unidades de repetição de oxietileno. O valor de n está no intervalo 1-20, por exemplo, entre 2-18, 3-16 ou 4-14. Assim, n pode ser, por exemplo, qualquer um entre 4, 5, 11, 12 ou 13.
[0105] Outras reações químicas de clique que podem ser usadas para a conjugação de um antígeno e um nnAA incluem, mas não estão limitadas a, ligação de tetrazina-alceno e ligação de Staudinger entre uma fosfina e uma azida.
[0106] Um conjugado da invenção pode ter um peso molecular de pelo menos cerca de 750 kDa, pelo menos cerca de 1.000 kDa, ou pelo menos cerca de 1.500 kDa ou mais. Em algumas modalidades, o conjugado tem um peso molecular entre cerca de 750 kDa e cerca de 5.000 kDa. Em algumas modalidades, o conjugado tem um peso molecular entre cerca de 800 kDa e cerca de 2.800 kDa. Em algumas modalidades, o conjugado tem um peso molecular entre cerca de 850 kDa e cerca de 2.800 kDa. Em algumas modalidades, o conjugado tem um peso molecular entre cerca de 900 kDa e cerca de 2.800 kDa. Em algumas modalidades, o conjugado tem um peso molecular entre cerca de 950 kDa e cerca de 2.800 kDa. Em algumas modalidades, o conjugado tem um peso molecular entre cerca de 1.000 kDa e cerca de 2.800 kDa. O peso molecular de um conjugado é calculado por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) combinada com dispersão de luz laser multiangular (MALS).
[0107] Conjugados da invenção incluem antígeno (por exemplo, sacarídeo) e polipeptídeo transportador, e a proporção em peso desses dois componentes pode ser usada como um parâmetro para definir o conjugado. Antígeno mais alto: razões de peso de transportador para conjugados de transportador de sacarídeo permitem que mais antígeno de sacarídeo seja distribuído com uma quantidade menor de polipeptídeo transportador. Para vacinas pneumocócicas conjugadas, a proporção está normalmente na faixa de 0,3–3,0, mas isso pode variar com o serotipo e aspectos da química de conjugação (Anexo 2: Recomendações para a produção e controle de vacinas pneumocócicas conjugadas; Série de Relatórios Técnicos da OMS, Nº. 927, 2005). A proporção da vacina comercial Prevnar-13™ é de 0,9. Para composições que incluem conjugados de múltiplos serotipos pneumocócicos (por exemplo, mais de 13 serotipos), a proporção para a composição completa é idealmente acima de 1,0
(ou seja, um excesso de peso do antígeno de sacarídeo pneumocócico) e é preferencialmente 1,5 ou mais (por exemplo, dentro do intervalo 1,5-3,0 , ou de preferência 1,5-2,0). POLIPEPTÍDEOS TRANSPORTADORES DE CRM197 MODIFICADOS
[0108] Como mencionado acima, os polipeptídeos transportadores de principal interesse neste documento são formas modificadas de CRM197. Assim, os polipeptídeos transportadores preferidos para uso com a invenção compreendem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência (por exemplo, >85%, >90%, >95%, >96%, >97%, ou preferencialmente > 98%) para SEQ ID NO: 1. Por exemplo, o polipeptídeo transportador pode compreender a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1, exceto para a presença de até 10 nnAA, como discutido acima.
[0109] SEQ ID NO: 1 inclui uma sequência dipeptídica Arg-Arg nas posições 192-193. Esta sequência pode estar sujeita a clivagem proteolítica em algumas circunstâncias. Se desejado, este local pode ser modificado para evitar a clivagem e melhorar o rendimento. Assim, em algumas modalidades, um polipeptídeo transportador de CRM197 modificado usado aqui está livre de uma sequência de dipeptídeo Arg-Arg. Por exemplo, Arg-192 e/ou Arg-193 de SEQ ID NO: 1 podem ser deletados ou podem ser substituídos por um aminoácido diferente. Assim, um polipeptídeo transportador preferido compreende uma sequência de aminoácidos que (i) tem pelo menos 80% (por exemplo, >85%, >90%, >95%, >96%, >97%, ou preferencialmente >98%) identidade de sequência com SEQ ID NO: 1; (ii) está livre de uma sequência dipeptídica Arg-Arg; e (iii) inclui pelo menos um (por exemplo, pelo menos 2, e de preferência mais, como discutido acima) resíduo nnAA.
[0110] Uma dessas sequências de aminoácidos é a SEQ ID NO: 2, que difere da SEQ ID NO: 1 por ter uma substituição Arg→Asn na posição 193:
[0111] Qualquer modalidade aqui descrita, ou em WO2018/126229, por referência a SEQ ID NO: 1 pode ser colocada em vigor usando SEQ ID NO: 2 em vez disso.
[0112] Assim, fornecemos um polipeptídeo transportador compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2, em que SEQ ID NO: 2 foi modificada para incluir 1-10 (por exemplo, 3-9 ou 2-8, ou 2-6, ou de 3-6 ou de 4-6) resíduos de nnAA. Estas modificações de resíduos nnAA podem ser incorporadas na SEQ ID NO: 2 como inserções e/ou substituições (por exemplo, SEQ ID NO: 4, que inclui 6 substituições Lys→nnAA). O resíduo Asn-193 de SEQ ID NO: 2 é preferencialmente não substituído por um nnAA. Este polipeptídeo transportador pode ser usado para preparar conjugados imunogênicos (por exemplo, de antígenos de sacarídeo) através do(s) resíduo(s) nnAA nele.
[0113] Em algumas modalidades, esses polipeptídeos transportadores incluem sequências de aminoácidos a montante e/ou a jusante de SEQ ID NO: 1 ou 2. Assim, por exemplo, eles podem incluir um resíduo de metionina a montante do resíduo de aminoácido N-terminal de SEQ ID NO: 1 ou 2. Este resíduo de metionina pode ser formilado. Um resíduo de metionina não está presente nesta posição no CRM197 de tipo selvagem, mas pode ser incluído aqui para iniciar a tradução (por exemplo, em um sistema de síntese de polipeptídeo livre de células) sem exigir toda a sequência líder nativa. Em algumas modalidades, um polipeptídeo transportador inclui (i) nenhum aminoácido a montante do terminal N de SEQ ID NO: 1 ou 2, exceto para uma metionina opcional, e (ii) nenhum aminoácido a jusante do terminal C de SEQ ID NÃO: 1 ou
2.
[0114] De preferência, pelo menos um resíduo Lys em SEQ ID NO: 1 ou 2 é substituído por um resíduo nnAA. É preferido substituir mais do que um resíduo na SEQ ID NO: 1 ou 2 por um nnAA e, idealmente, apenas uma espécie de resíduo na SEQ ID NO: 1 é substituída por um nnAA, por exemplo, apenas os resíduos Lys são substituídos. Quando mais de um resíduo na SEQ ID NO: 1 é substituído por um nnAA, é preferível que o mesmo nnAA seja usado em cada posição, por exemplo, pAMF em cada posição de substituição. Como observado acima, em algumas modalidades, outros resíduos além de Lys são substituídos.
[0115] Polipeptídeos transportadores compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 ou 2 com de 2-9 substituições por resíduos nnAA (por exemplo, substituições Lys → nnAA, de preferência Lys → pAMF) são preferidas, e idealmente com 2-8, 2-6, 3-8, 3-6, 4-9, 4-8 ou 4 -6 substituições nnAA, por exemplo, 4, 5 ou 6 resíduos nnAA. Isso permite uma ligação mais extensa de antígenos ao transportador do que usar um único nnAA, aumentando assim o antígeno: a proporção de transportador, enquanto evita a interrupção excessiva da sequência nativa e da estrutura, que pode resultar em insolubilidade.
[0116] Os estudos estruturais do CRM197 revelam duas regiões 3D gerais dentro da SEQ ID NO: 1 ou 2: a primeira região vai do N- terminal para Asn-373; e a segunda região vai de Ser-374 para o terminal C. O primeiro deles corresponde aproximadamente aos domínios conhecidos como 'C' e 'T' (catalítico e transmembranar), e o segundo ao domínio 'R' (ligação ao receptor).
Idealmente, um polipeptídeo transportador inclui pelo menos um nnAA na primeira região e pelo menos um nnAA na segunda região, por exemplo, pelo menos 2 nnAA em cada região, ou pelo menos 3 nnAA em cada região. Isso permite que os antígenos conjugados sejam separados espacialmente quando ligados ao transportador. Um transportador com 3 nnAA na primeira região e 3 nnAA na segunda região é útil.
[0117] A primeira região contém 27 resíduos Lys e a segunda região contém 12 resíduos Lys. Assim, um ou mais (por exemplo, 3) resíduos de Lys dentro dos 374 aminoácidos do terminal N e um ou mais (por exemplo, 3) resíduos de Lys dentro dos 162 aminoácidos do terminal C de SEQ ID NO: 1 ou 2 podem ser substituídos por um nnAA por exemplo, dentro do pAMF.
[0118] As modalidades preferidas de transportadores contendo nnAA com base em CRM197 têm a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 em que um ou mais dos resíduos K24, K33, K37, K39, K212, K214, K227, K264, K385, K522 e K526 é/são substituídos por um nnAA (como pAMF). Uma dessas sequências é a SEQ ID NO: 3, em que cada X representa um nnAA (de preferência o mesmo nnAA, tal como pAMF):
DIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYV GNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSXLSLFFEIKS (SEQ ID NO: 3)
[0119] Outra dessas sequências é a SEQ ID NO: 4, em que cada X representa um nnAA (de preferência o mesmo nnAA, tal como pAMF):
DIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYV GNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSXLSLFFEIKS (SEQ ID NO: 4)
[0120] SEQ ID NOs: 3 e 4 podem ser muito bem expressas em um sistema de síntese de proteína livre de células, enquanto retém boa solubilidade e fornece boas respostas imunogênicas quando conjugadas com sacarídeos capsulares pneumocócicos. SEQ ID NO: 4 não tem o dipeptídeo Arg-Arg nativo.
[0121] Um polipeptídeo consistindo em SEQ ID NO: 4, em que cada X é pAMF, é outro polipeptídeo transportador preferido para uso com a invenção.
[0122] WO2018/126229 descreve vários resíduos de aminoácidos que são adequados para substituição nnAA (por exemplo, Lys-24, Lys-33, Lys-37, Lys-39, Lys-212, Lys-214, Lys-227, Lys-244, Lys- 264, Lys-385, Lys-522, Lys-526, Phe-12, Phe-53, Phe-123, Phe-127, Phe-140, Phe-167, Phe-250, Phe-389, Phe-530, ou Phe-531, numerado de acordo com SEQ ID NO: 1 neste documento). Outros resíduos que podem ser substituídos são:: Asp-211; Asp-295; Asp-352; Asp-392; Asp-465; Asp-467; Asp-507; Asp-519; Asn-296; Asn-359; Asn-399; Asn-481; Asn- 486; Asn-502; Asn-524; Glu-240; Glu-248; Glu-249; Glu-256; Glu-259; Glu-292; Glu-362; Gln-252; Gln-287; Lys-212; Lys-218; Lys-221; Lys-229; Lys-236; Lys-264;
Lys-299; Lys-385; Lys-456; Lys-474; Lys-498; Lys-516; Lys-522; Lys-534; Arg-377; Arg-407; Arg-455; Arg-460; Arg-462; Arg-472; Arg-493; Ser-198; Ser-200; Ser- 231; Ser-233; Ser-239; Ser-261; Ser-374; Ser-381; Ser-297; Ser-397; Ser-451; Ser- 475; Ser-494; Ser-495; Ser-496; Ser-501; Ser-505; Thr-253; Thr-265; Thr-267; Thr- 269; Thr-293; Thr-386; Thr-400; Thr-408; Thr-469; e/ou Thr-517.
[0123] Nós também fornecemos um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que (i) tem pelo menos 80% (por exemplo, >85%, >90%, >95%, >96%, >97%, ou preferencialmente >98%) identidade de sequência com SEQ ID NO: 1; (ii) está isento de uma sequência dipeptídica Arg-Arg; e (iii) inclui pelo menos um resíduo nnAA; e em que o polipeptídeo tem uma metionina N-terminal e/ou está na forma monomérica.
[0124] Estes polipeptídeos transportadores derivados de CRM197 podem ser usados da mesma maneira para a conjugação que CRM197 foi usado na técnica anterior (por exemplo, ver Bröker et al. 2011 supra, WO2015/117093, etc.), mas com a melhoria de permitir conjugação específica de sítio através do(s) resíduo(s) nnAA. Eles serão geralmente usados na forma monomérica monomérica, em vez de estarem associados a outras subunidades de CRM197 ou derivadas de CRM197 para formar multímeros polipeptídicos. De maneira semelhante, eles geralmente incluirão pelo menos uma ponte dissulfeto, - por exemplo, entre Cys 186 e Cys - 201 (numerado de acordo com SEQ ID NO: 1) e, opcionalmente, entre Cys-461 e Cys-471.
[0125] Também fornecemos um conjugado imunogênico compreendendo qualquer um desses vários polipeptídeos transportadores conjugados a um antígeno de sacarídeo por meio de pelo menos um de seus nnAA. Os polipeptídeos transportadores são particularmente úteis para a conjugação com sacarídeos capsulares pneumocócicos através do(s) resíduo(s) nnAA neles. Os conjugados imunogênicos preparados desta forma podem ser combinados para formar composições multivalentes como discutido em outro lugar neste documento.
[0126] Portanto, nós fornecemos um conjugado imunogênico compreendendo um polipeptídeo transportador e um antígeno sacarídeo, em que (i) o polipeptídeo transportador tem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4, por exemplo, onde cada X é pAMF; e (ii) o antígeno sacarídeo é covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de pelo menos um resíduo nnAA na SEQ ID NO: 4. Também fornecemos uma composição farmacêutica multivalente compreendendo dois ou muitos desses conjugados imunogênicos.
[0127] Assim, fornecemos uma composição farmacêutica incluindo vários conjugados diferentes (por exemplo, diferentes serotipos pneumocócicos) em que cada conjugado inclui um polipeptídeo transportador tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4.
[0128] Também fornecemos um conjugado imunogênico compreendendo um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que (i) o polipeptídeo transportador tem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4; (ii) o antígeno de sacarídeo é covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de pelo menos um resíduo nnAA na SEQ ID NO: 4; e (iii) o antígeno de sacarídeo é um sacarídeo capsular de qualquer um dos serotipos pneumocócicos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F. Estes conjugados individuais podem ser combinados para fazer composições farmacêuticas multivalentes da invenção.
[0129] Também fornecemos um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo transportador aqui descrito. Em outra modalidade, a divulgação fornece um vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo. Em outra modalidade, a divulgação fornece uma célula hospedeira que compreende o vetor de expressão.
[0130] As composições farmacêuticas da invenção podem incluir um adjuvante de sal de alumínio. O adjuvante pode aumentar a imunogenicidade dos conjugados na composição farmacêutica. Os conjugados dentro da composição podem ser adsorvidos ao adjuvante de sal de alumínio.
[0131] Adjuvantes de sal de alumínio úteis incluem, mas não estão limitados a, adjuvantes de hidróxido de alumínio e adjuvantes de fosfato de alumínio. Estes adjuvantes são descritos, por exemplo, nos capítulos 8 e 9 de Vaccine Design... (1995) eds. Powell & Newman. ISBN: 030644867X. Plenum.
[0132] Os adjuvantes comumente conhecidos como “hidróxido de alumínio” são tipicamente sais de oxihidróxido de alumínio, que são geralmente pelo menos parcialmente cristalinos. O oxihidróxido de alumínio, que pode ser representado pela fórmula AlO(OH), pode ser distinguido de outros compostos de alumínio, como Al(OH)3, por espectroscopia de infravermelho (IR), em particular pela presença de uma banda de adsorção a 1070cm - 1 e um ombro forte em 3090–3100cm–1 (capítulo 9 de Powell & Newman). O grau de cristalinidade de um adjuvante de hidróxido de alumínio é refletido pela largura da banda de difração a meia altura (WHH), com- partículas cristalinas apresentando maior alargamento de linha devido a tamanhos menores de cristalitos. A área de superfície aumenta com o aumento de WHH, e os adjuvantes com valores de WHH mais altos têm maior capacidade de adsorção de antígeno. Uma morfologia fibrosa (por exemplo, como observada em micrografias eletrônicas de transmissão) é típica para adjuvantes de hidróxido de alumínio, por exemplo, com partículas em forma de agulha com diâmetros de cerca de 2 nm. O pI dos adjuvantes de hidróxido de alumínio é tipicamente cerca de 11, isto é, o próprio adjuvante tem uma carga superficial positiva em pH fisiológico. Capacidades adsortivas entre 1,8-2,6 mg de proteína por mg de Al+++ em pH 7,4 foram relatadas para adjuvantes de hidróxido de alumínio.
[0133] Os adjuvantes comumente conhecidos como “fosfato de alumínio” são tipicamente hidroxifosfatos de alumínio, muitas vezes também contendo uma pequena quantidade de sulfato (isto é, sulfato de hidroxifosfato de alumínio). Eles podem ser obtidos por precipitação, e as condições de reação e concentrações durante a precipitação influenciam o grau de substituição de fosfato por hidroxila no sal. Os hidroxifosfatos geralmente têm uma razão molar PO4/ Al entre 0,3 e 1,2. Os hidroxifosfatos podem ser distinguidos do AlPO estrito 4 pela presença de grupos hidroxila. Por exemplo, uma banda de espectro de IR -1 em 3164cm (por exemplo, quando aquecido a 200ºC) indica a presença de hidroxilas estruturais (capítulo 9 de Powell & Newman).
[0134] A razão molar PO4/Al3+ de um adjuvante de fosfato de alumínio será geralmente entre 0,3 e 1,2, preferencialmente entre 0,8 e 1,2, e mais preferencialmente 0,95 + 0,1. O fosfato de alumínio será geralmente amorfo, particularmente para sais de hidroxifosfato. Um adjuvante típico é hidroxifosfato de alumio amorfo com PO4/Al razão molar entre 0,84 e 0,92, incluído a 0,6 mg de Al3 +/ml. O fosfato de alumínio geralmente será particulado (por exemplo, morfologia tipo placa observada em micrografias eletrônicas de transmissão, com partículas primárias na faixa de 50 nm). Os diâmetros típicos das partículas estão na faixa de 0,5-20μm (por exemplo, cerca de 5-10μm) após qualquer adsorção de antígeno. Capacidades adsortivas entre 0,7-1,5 mg de proteína por mg de Al+++ em pH 7,4 foram relatadas para adjuvantes de fosfato de alumínio.
[0135] O ponto de carga zero (PZC) do fosfato de alumínio está inversamente relacionado ao grau de substituição de fosfato por hidroxila, e este grau de substituição pode variar dependendo das condições de reação e concentração de reagentes usados para preparar o sal por precipitação. O PZC também é alterado pela alteração da concentração de íons fosfato livres em solução (mais fosfato = PZC mais ácido) ou pela adição de um tampão, como um tampão de histidina (torna o PZC mais básico). Os fosfatos de alumínio usados de acordo com a invenção geralmente terão um PZC entre 4,0 e 7,0, mais preferencialmente entre 5,0 e 6,5, por exemplo, cerca de 5,7.
[0136] A concentração de íons de alumínio em uma composição para administração a um paciente é de preferência inferior a 2.5mg/ml, por exemplo, <2 mg/ml, <1 mg/ml, etc. Uma concentração máxima preferida é <1,7 mg/mL. A faixa de Al+++ em uma composição da invenção pode ser de 0,3-1 mg/ml ou de 0,3-0,5 mg/ml. É preferido um máximo de 0,85 mg/dose.
[0137] Em solução, ambos os adjuvantes de fosfato de alumínio e hidróxido de alumínio tendem a formar agregados porosos estáveis 1-10μm de diâmetro. Uma composição pode incluir uma mistura de um adjuvante de hidróxido de alumínio e um adjuvante de fosfato de alumínio.
[0138] Quando uma composição inclui vários conjugados e cada um deles é adsorvido a um adjuvante de sal de alumínio, cada conjugado pode ser adsorvido a um sal de alumínio individualmente e depois misturado, ou cada um pode ser adicionado em sequência a um sal de alumínio, formando assim o conjugado misto composição. Uma mistura de ambas as abordagens também pode ser usada.
[0139] As composições farmacêuticas da invenção geralmente incluirão um ou mais excipiente(s) farmaceuticamente aceitável(is). Uma discussão abrangente de tais excipientes pode ser encontrada em Handbook of Pharmaceutical Excipients (ed. Rowe et al.), 6ª edição de 2009.
[0140] As composições farmacêuticas estão preferencialmente na forma aquosa, particularmente no ponto de administração, mas também podem ser apresentadas em formas secas (por exemplo, como liofilizados, etc.) que podem ser convertidas em formas aquosas para administração.
[0141] As composições farmacêuticas podem incluir um tampão ou agente de ajuste de pH. O tampão pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um tampão de fosfato, um tampão de acetato, um tampão de histidina, um tampão de citrato, um tampão de succinato, um tampão Tris, um tampão HEPES, etc. Os sais de tampão serão tipicamente incluídos na faixa de 5-20 mM.
[0142] As composições farmacêuticas podem incluir um sal fisiológico, como um sal de sódio, por exemplo, para controlar a tonicidade. O cloreto de sódio (NaCl) é típico, que pode estar presente a partir de 1- 20 mg/ml, por exemplo, 10+2 mg/ml ou 9 mg/ml. Outros sais que podem estar presentes incluem cloreto de potássio, di-hidrogenofosfato de potássio, fosfato dissódico desidratado, cloreto de magnésio, cloreto de cálcio, etc. Outros sais úteis podem ter catiões de sódio, potássio ou de amônio e aniões de cloreto, citrato, ascorbato, borato, fosfato, bicarbonato, sulfato, tiossulfato ou bissulfito.
[0143] As composições farmacêuticas podem incluir um ácido orgânico, como ácido acético ou ácido succínico. Isso pode ser parte de um sistema de buffer.
[0144] As composições farmacêuticas podem incluir um álcool de açúcar, como manitol ou sorbitol. As composições farmacêuticas podem incluir um açúcar, como sacarose ou glicose.
[0145] As composições farmacêuticas podem incluir um surfactante. Os surfactantes adequados incluem, mas não estão limitados a, polissorbato 20, polissorbato 80 e dodecil sulfato de sódio (SDS). Em algumas modalidades, o agente tensoativo está presente em uma concentração de 0,0003% e 0,3% (p/p), por exemplo, de 0,01-0,03%. O polissorbato 80 é um surfactante preferido.
[0146] As composições farmacêuticas podem incluir um conservante, como tiomersal ou 2-fenoxietanol. É preferido que uma composição seja substancialmente isenta de (por exemplo, <10 µg/ml) material mercurial, por exemplo, livre de tiomersal. As composições que não contêm mercúrio são mais preferidas. A inclusão de um conservante pode ser particularmente útil quando uma composição inclui um adjuvante de sal de alumínio porque sua insolubilidade significa que a composição é geralmente uma suspensão com uma aparência turva que pode mascarar o crescimento bacteriano contaminante. Um conservante também é particularmente útil se uma composição for usada mais de uma vez, por exemplo, em um frasco multidose. Frequentemente, entretanto, uma composição farmacêutica pode ser livre de conservantes.
[0147] As composições farmacêuticas podem ter uma osmolalidade de 200 mOsm/kg e 400 mOsm/kg, por exemplo, de 240-360 mOsm/kg, ou de 290-310 mOsm/kg.
[0148] As composições farmacêuticas têm tipicamente um pH de 5,0 a 9,5, por exemplo, de 5,0 a 8,0 ou de 6,0 a 8,0.
[0149] As composições farmacêuticas são preferencialmente não-pirogênico, por exemplo, contendo <1 EU (unidade de endotoxina, uma medida padrão) por dose, e de preferência <0,1 EU por dose.
[0150] As composições farmacêuticas podem ter uma osmolalidade de 200- 400 mOsm/kg, por exemplo, de 240-360 mOsm/kg ou de 280-320 mOsm/kg.
[0151] As composições farmacêuticas são preferencialmente sem glúten.
[0152] As composições farmacêuticas são adequadas para administração a pacientes animais (e, em particular, humanos) e, portanto, incluem usos humanos e veterinários.
[0153] As composições farmacêuticas podem ser preparadas na forma de dosagem unitária. Em algumas modalidades, uma dose unitária pode ter um volume de 0,1-1,0ml, por exemplo, cerca de 0,25mL ou de preferência cerca de 0,5ml. Esses volumes são ideais para injeção em humanos.
[0154] Uma composição farmacêutica pode incluir múltiplos conjugados imunogênicos. As vacinas conjugadas meningocócicas atualmente licenciadas incluem sacarídeos capsulares de 4 sorogrupos diferentes, e as vacinas conjugadas pneumocócicas licenciadas incluem sacarídeos capsulares de 7, 10 ou 13 serotipos diferentes. Assim, uma composição da invenção pode incluir, por exemplo, de 3 a 50 conjugados diferentes (por exemplo, 14, 15, 20, 21, 24, 25 ou mais). Por exemplo, cada um desses conjugados pode incluir um sacarídeo capsular de um serotipo ou serogrupo diferente da mesma espécie bacteriana (por exemplo, vários serogrupos meningocócicos ou vários serotipos pneumocócicos).
[0155] Quando uma composição farmacêutica inclui n diferentes conjugados imunogênicos, a quantidade total de polipeptídeo transportador nesses n conjugados pode ser menor ou igual a 3n µg por dose. Em outras palavras, a quantidade média de polipeptídeo transportador por conjugado é inferior a 3 µg. A quantidade total pode, por exemplo, ser de n-2,5 n µg por dose.
[0156] Quando uma composição farmacêutica inclui n diferentes conjugados imunogênicos, a quantidade total de antígeno de sacarídeo nesses n conjugados pode ser menor ou igual a 4,4 n µg por dose. Em outras palavras, a quantidade média de sacarídeo por conjugado é inferior a 4,4 µg. A quantidade total pode, por exemplo, ser de 0,4n-4,4n µg por dose, por exemplo, de 1,1n- 2,2n.
[0157] Quando uma composição farmacêutica inclui n diferentes conjugados imunogênicos, a concentração total do polipeptídeo transportador para esses n conjugados pode ser menor ou igual a 6nµg/mL. Em outras palavras, a concentração média de polipeptídeo transportador por conjugado é inferior a 6 µg/mL. A concentração total pode, por exemplo, ser de n-4n µg/mL.
[0158] Quando uma composição farmacêutica inclui n diferentes conjugados imunogênicos, a concentração total de antígeno de sacarídeo para esses n conjugados pode ser menor ou igual a 8,8 n µg/mL. Em outras palavras, a concentração média de sacarídeo por conjugado é inferior a 8,8 µg/mL. A concentração total pode, por exemplo, ser de 0,8n-8,8 n µg/mL, por exemplo, de 2,2n-4,4n µg/mL.
[0159] Em algumas modalidades, a quantidade total de polipeptídeo transportador conjugado em uma dose unitária de uma composição farmacêutica multivalente da invenção pode ser de 4-128 µg, por exemplo, de 8-64 µg, ou de 16-48 µg. A concentração do polipeptídeo transportador conjugado em uma composição farmacêutica multivalente da invenção pode ser de 8-256 µg/mL, por exemplo, de 16-128 µg/mL, ou de 32-96 µg/mL.
[0160] Em algumas modalidades, a quantidade total de antígeno de sacarídeo conjugado em uma dose unitária de uma composição farmacêutica multivalente da invenção pode ser de 10-120 µg, por exemplo, de 20-90 µg ou de 30-60 µg. A concentração de antígeno de sacarídeo conjugado em uma composição farmacêutica multivalente da invenção pode ser de 20-240 µg/mL, por exemplo, de 40- 180 µg/mL ou de 60-120 µg/mL.
[0161] Como observado acima, uma composição farmacêutica pode incluir múltiplos conjugados imunogênicos, por exemplo, de 3 a 50 conjugados diferentes (por exemplo, 14, 15, 20, 21, 24, 25 ou mais). Por exemplo, cada um desses conjugados pode incluir um sacarídeo capsular de um serotipo ou serogrupo diferente da mesma espécie bacteriana.
[0162] Em algumas modalidades, a composição está livre do(s) polipeptídeo(s) transportador(es) dos conjugados na forma não conjugada. Em outras modalidades, há um baixo nível de polipeptídeo(s) transportador(es) não conjugado(s), desde que a massa do(s) polipeptídeo(s) transportador(es) não conjugado(s) na composição seja <10% (por exemplo, <5% ou <2%) da massa do(s) polipeptídeo(s) transportador(es) nos n conjugados imunogênicos da composição como um todo.
[0163] Em algumas modalidades, a composição é livre de sacarídeos dos conjugados na forma não conjugada. Em outras modalidades, há um baixo nível de sacarídeo não conjugado, desde que a massa do sacarídeo não conjugado na composição seja <10% (por exemplo, <5% ou <2%) da massa total de sacarídeos nos n conjugados imunogênicos da composição. RECIPIENTES, DISPOSITIVOS DE ENTREGA, ETC.
[0164] As composições farmacêuticas, incluindo conjugados imunogênicos, podem ser embaladas em recipientes estéreis, dispositivos de entrega, etc. A esterilidade pode ser mantida selando hermeticamente um recipiente para torná-lo hermético. Recipientes adequados incluem, mas não estão limitados a, frascos, seringas, nebulizadores, pulverizadores, inaladores, adesivos dérmicos, etc. São preferidos frascos e seringas.
[0165] As composições imunogênicas estão frequentemente contidas em frascos. O frasco é de preferência feito de um material plástico ou, de preferência, de vidro. Um frasco é selado após ser enchido e o selo pode ser quebrado no momento do uso. O frasco é preferencialmente esterilizado antes de uma composição ser adicionada a ele e é então selado. Para evitar problemas com - pacientes sensíveis a látex, os frascos podem ser selados com uma tampa sem látex, e a ausência de látex em todos os materiais de embalagem é preferível. Idealmente, o frasco para injetáveis inclui uma única dose unitária de uma composição, mas pode por vezes incluir mais do que uma dose (um frasco “multidose”), por exemplo, 10 doses. Os frascos preferidos são feitos de vidro incolor.
[0166] Um frasco pode ter uma tampa (por exemplo, uma trava Luer) adaptada de modo que uma seringa possa ser inserida na tampa para facilitar a transferência de material entre o frasco e a seringa (em ambas as direções). Após a remoção da seringa do frasco, uma agulha pode então ser colocada e a composição pode ser administrada a um paciente. A tampa está preferencialmente localizada dentro de uma vedação ou cobertura, de modo que a vedação ou cobertura tenha que ser removida antes que a tampa possa ser acessada. Um frasco para injetáveis pode ter uma tampa que permite a remoção asséptica de seu conteúdo, especialmente para frascos multidose.
[0167] As composições podem estar contidas em dispositivos de entrega, prontos para administração a um paciente. A composição pode ser transferida para o dispositivo de entrega no ponto de uso (por exemplo, de um frasco), ou pode ser colocada no dispositivo de entrega na fase de fabricação (por exemplo, na forma de uma seringa pré-cheia).
[0168] Uma seringa usada com a invenção pode ser feita de vidro ou de plástico (por exemplo, feita de um polímero de ciclo-olefina ou de um co-polímero de ciclo-olefina). Uma seringa (particularmente uma seringa de vidro) pode ser uma seringa siliconizada. As seringas não siliconizadas também podem ser usadas, por exemplo, usando o sistema i-Coating™ da Terumo, que está disponível em suas seringas PLAJEX™, ou usando seringas Daikyo CZ™ com um copolímero de etileno-tetrafluoroetileno (ETFE), ou usando uma seringa TriboGlide™ tendo um perfluoropoliéter (PFPE). Filmes de carbono podem ser usados em vez de siliconização (por exemplo, ver JP2001190665). Seringas sem silicone também são divulgadas em JP2011212183. Uma seringa não-siliconizada incluindo uma rolha de êmbolo conforme divulgado em EP-A-0375778 pode ser usada, isto é, onde a rolha tem uma camada de elastômero termoplástico que é coberta pelo menos em parte por uma camada de resina termoplástica de baixo coeficiente de atrito dinâmico.
[0169] Quando uma composição está contida em uma seringa, a seringa pode ter uma agulha acoplada a ela, para injeção do conteúdo da seringa em um paciente ou em um recipiente. A seringa pode ser fornecida com uma agulha já colocada. Se uma agulha não for colocada, uma agulha separada pode ser fornecida com a seringa para montagem e uso, ou uma agulha pode ser fornecida separadamente. Essa agulha deve ser esterilizada no momento do uso e pode ser embainhada. Agulhas de segurança podem ser usadas. Agulhas de calibre 23 de 1 polegada, calibre 25 de 1 polegada e calibre 25 de 5/8 de polegada são típicas. Podem ser usadas agulhas de ½ a 1½ polegada, calibre 22-
25. Se a seringa e a agulha forem embaladas separadamente, a agulha é preferencialmente equipada com uma proteção de borracha butílica.
[0170] As seringas podem ser fornecidas com etiquetas destacáveis nas quais o número do lote e a data de validade do conteúdo podem ser impressos, para facilitar a manutenção de registros. O êmbolo de uma seringa pode ter uma rolha para evitar que o êmbolo seja removido acidentalmente durante a aspiração. As seringas podem ter uma tampa de borracha de látex e/ou êmbolo, mas borrachas sem látex podem ser usadas, por exemplo, borracha de clorobutila sem látex ou borracha de bromobutila de isopreno sem látex. A seringa terá geralmente uma tampa de ponta para selar a ponta antes da fixação de uma agulha, e a tampa de ponta é preferencialmente feita de uma borracha de butila, por exemplo, borracha de bromobutila isopreno sem látex. Seringas úteis são, por exemplo, aquelas comercializadas sob o nome comercial “Tip- Lok”™.
[0171] Os recipientes podem ser marcados para mostrar um volume de metade da dose, por exemplo, para facilitar a entrega a crianças. Por exemplo, uma seringa contendo uma dose de 0,5ml pode ter uma marca mostrando um volume de 0,25ml. A própria seringa pode ter um volume maior do que a dose, por exemplo, uma seringa de 1 ml pode ser usada para conter uma dose de 0,5 ml de uma composição farmacêutica. As seringas descartáveis ou pré-cheias geralmente contêm uma dose única de vacina.
[0172] Quando um recipiente de vidro (por exemplo, uma seringa ou um frasco) é usado, ele é preferencialmente feito de um vidro de borosilicato em vez de um vidro de cal sodada.
[0173] Um recipiente pode ser embalado (por exemplo, na mesma caixa) com um folheto incluindo detalhes da vacina, por exemplo, instruções para administração, detalhes dos antígenos dentro da vacina, etc. As instruções também podem conter avisos, por exemplo, para manter uma solução de adrenalina prontamente disponível em caso de reação anafilática após a vacinação, etc. Vários recipientes podem ser embalados juntos, por exemplo, na mesma caixa.
[0174] As composições farmacêuticas podem ser apresentadas na forma de dose unitária, com uma dose única por recipiente (por exemplo, por seringa ou por frasco). Em vez de fabricar cada dose unitária individualmente, uma composição a granel é preparada e as doses unitárias são extraídas e embaladas individualmente em seus recipientes. Assim, por exemplo, uma pluralidade de doses unitárias é extraída do volume e cada dose unitária é colocada em um recipiente separado, por exemplo, em uma seringa ou frasco.
[0175] Um conjugado imunogênico pode ser administrado a um paciente mamífero para induzir uma resposta imune protetora contra o antígeno nesse conjugado. Eles serão administrados na forma de uma composição farmacêutica. A composição pode incluir múltiplos conjugados imunogênicos, conforme descrito em outro lugar neste documento, de modo que as respostas imunes protetoras podem ser induzidas contra muitos antígenos simultaneamente.
[0176] Assim, fornecemos um método para desencadear uma resposta de anticorpo protetor a um ou mais antígeno(s) em um paciente mamífero pela administração ao paciente de um conjugado do(s) antígeno(s).
[0177] Também fornecemos um conjugado conforme divulgado neste documento, para uso na elicitação de uma resposta de anticorpo protetora.
[0178] Também fornecemos o uso de um conjugado, conforme divulgado neste documento, na fabricação de um medicamento para induzir uma resposta de anticorpo protetora.
[0179] Nós também fornecemos (i) um método para induzir uma resposta de anticorpo protetor a múltiplos antígenos em um paciente mamífero pela administração de uma composição multivalente da invenção ao paciente, (ii) uma composição multivalente da invenção para uso na elicitação de um resposta protetora do anticorpo, e (iii) o uso de múltiplos conjugado,s conforme divulgado neste documento, na fabricação de uma composição farmacêutica multivalente para induzir uma resposta protetora do anticorpo contra múltiplos antígenos.
[0180] A capacidade de induzir uma resposta imune protetora significa que os conjugados podem ser usados, por exemplo, para fornecer imunização ativa para a prevenção de doenças invasivas causadas por S.pneumoniae, para a prevenção de otite média causada por S.pneumoniae, para a prevenção de pneumonia causada por S.pneumoniae, para imunização ativa de indivíduos em risco de exposição a N. meningitidis para prevenir doenças invasivas, etc.
[0181] As composições farmacêuticas podem ser preparadas em várias formas. Por exemplo, as composições podem ser preparadas como injetáveis, por exemplo, como soluções ou suspensões líquidas. Os injetáveis para administração intramuscular são típicos. Um volume de injeção de cerca de 0,5ml é preferido para humanos. Assim, um volume de dose unitária preferido é de cerca de 0,5ml. A administração por injeção intramuscular é típica, por exemplo, no aspecto anterolateral da coxa em bebês, ou no músculo deltóide do braço em bebês, crianças e adultos.
[0182] Os conjugados serão tipicamente administrados de acordo com um esquema de doses múltiplas. Doses múltiplas podem ser usadas em um esquema de imunização primária e/ou em um esquema de imunização de reforço. A administração de mais de uma dose (normalmente duas doses) é particularmente útil em pacientes imunologicamente virgens. Múltiplas doses serão tipicamente administradas com pelo menos 1 semana de intervalo (por exemplo, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 4 semanas, cerca de 6 semanas, cerca de 8 semanas, cerca de 10 semanas, cerca de 12 semanas, etc.).
[0183] O termo "compreendendo" abrange "incluindo", bem como "consistindo", por exemplo, uma composição "compreendendo" X pode consistir exclusivamente em X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X + Y.
[0184] O termo “cerca de” em relação a um valor numérico x é opcional e significa, por exemplo, x+ 10%.
[0185] A palavra "substancialmente" não exclui "completamente", por exemplo, uma composição que é "substancialmente livre" de Y pode ser completamente livre de Y. Quando necessário, a palavra "substancialmente" pode ser omitida da definição da invenção.
[0186] O termo "identidade de sequência" no contexto de duas sequências de aminoácidos se refere a duas sequências que são iguais ou têm uma porcentagem especificada de resíduos de aminoácidos que são iguais, quando comparados e alinhados para correspondência máxima em uma janela de comparação, conforme medido usando um algoritmo de comparação de sequência (por exemplo, BLASTP). A porcentagem de identidade é determinada sobre a sequência de referência de comprimento total divulgada neste documento, como a sequência de referência apresentada em SEQ ID NO: 1 ou 2. O método para calcular a identidade de sequência, conforme fornecido neste documento, é o programa BLASTP tendo seus padrões definidos em um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10 e a matriz de pontuação BLOSUM62 (ver, por exemplo, Henikoff & Henikoff, 1989, Proc Natl Acad Sci USA 89:10915). Consulte, por exemplo, a ferramenta de alinhamento BLAST disponível na WWW em blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ou em outro lugar.
[0187] O termo “alquilo inferior”, tal como utilizado neste documento, exceto se especificado de outra forma, refere-se a um hidrocarboneto saturado linear ou ramificado possuindo de um a seis átomos de carbono, ou seja, alquilo C1 a C6. Em certas modalidades, o grupo alquilo inferior é um hidrocarboneto primário, secundário ou terciário. O termo inclui porções substituídas e não substituídas. Consulte também US-2014/0066598. O termo "alquileno inferior" refere-se a um radical alquileno de um alquilo inferior.
[0188] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o significado comumente compreendido. Os profissionais são particularmente direcionados a Green & Sambrook (eds.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2012), e Ausubel, FM, et al.,
Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 99), John Wiley & Sons, New York (2012), e Plotkin, SA, Orenstein, WA, & Offit, PA, Vaccines, 6ª ed, Elsevier, Londres (2013).
[0189] Os métodos para a síntese livre de células estão descritos em Spirin & Swartz (2008) Cell-free Protein Synthesis, Wiley-VCH, Weinheim, Germany. Métodos para incorporação de aminoácidos não naturais em proteínas usando síntese livre de células são descritos em Shimizu et al. (2006) FEBS Journal, 273, 4133-4140 e também em Chong (2014) Curr Protoc Mol Biol. 108:16.30.1-11.
[0190] Em algumas modalidades, a invenção não abrange uma composição na qual SEQ ID NO: 3 é usada como o polipeptídeo transportador para conjugados de cada um dos 24 serotipos pneumocócicos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F (conforme exemplificado em WO2018/126229). Mais geralmente, em algumas modalidades, a invenção não abrange uma composição na qual SEQ ID NO: 3 é usada como o polipeptídeo transportador para cada conjugado em uma composição multivalente.
[0191] Modalidade I-1. Recipiente esterilizado, contendo uma composição farmacêutica que compreende um conjugado imunogênico compreendendo polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele.
[0192] Modalidade I-2. Recipiente hermeticamente selado, contendo uma composição farmacêutica que compreende um conjugado imunogênico compreendendo um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele.
Recipientes adequados para vedação hermética incluem, por exemplo, um frasco. O conteúdo é preferencialmente esterilizado no ponto de selagem hermética.
[0193] Modalidade I-3. O recipiente da modalidade I-1 ou I-2, que é um recipiente de vidro estéril, como um frasco.
[0194] Modalidade I-4. Dispositivo de entrega, contendo uma composição farmacêutica que compreende um conjugado imunogênico compreendendo um polipeptídeo transportador e um antígeno sacarídeo, em que o antígeno sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele.
[0195] Modalidade I-5. O recipiente da modalidade I-1 ou I-2, ou o dispositivo de entrega da modalidade I-4, que é uma seringa.
[0196] Modalidade I-6. Composição farmacêutica, compreendendo dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes e um adjuvante de sal de alumínio, em que: (i) cada conjugado imunogênico compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; e (ii) o adjuvante de sal de alumínio é um adjuvante de hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio.
[0197] Modalidade I-7. Composição farmacêutica, compreendendo dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes e um adjuvante de fosfato de alumínio, em que: (i) cada conjugado imunogênico compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; e (ii) a concentração de íons de alumínio na composição é <2,5 mg/mL.
[0198] Modalidade I-8. Composição farmacêutica, compreendendo dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes, em que: (i) cada conjugado imunogênico compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; e (ii) o volume da composição farmacêutica é de 0,25 a 1,25mL.
[0199] Modalidade I-9. Composição farmacêutica, compreendendo dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes e um conservante, em que cada conjugado imunogênico compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele.
[0200] Modalidade I-10. Composição farmacêutica sem conservante, compreendendo dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes, em que cada conjugado imunogênico compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele.
[0201] Modalidade I-11. Uma composição farmacêutica que compreende dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes, em que: (i) cada conjugado imunogênico compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; (ii) a composição tem uma osmolalidade de 200-400 mOsm/kg.
[0202] Modalidade I-12. Composição farmacêutica, compreendendo dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes e pelo menos um excipiente em que: (i) cada conjugado imunogênico compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; e (ii) o pelo menos um excipiente é selecionado do grupo que consiste em cloreto de sódio, ácido succínico e polissorbato 80.
[0203] Modalidade I-13. Composição farmacêutica, compreendendo n diferentes conjugados imunogênicos, em que: (i) cada um dos n conjugados imunogênicos compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo é covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; (ii) n é um número inteiro de 3 a 50; e (iii) a quantidade total de polipeptídeo transportador nos n conjugados imunogênicos é menor ou igual a 3n µg por dose; (iv) a concentração total de polipeptídeo transportador nos n conjugados imunogênicos é menor ou igual a 6n µg/ml; (v) a quantidade total de antígeno de sacarídeo nos n conjugados imunogênicos é menor ou igual a 3n µg por dose; (vi) a concentração total de antígeno de sacarídeo nos n conjugados imunogênicos é menor ou igual a 6n µg/mL; (vii) a quantidade média de polipeptídeo transportador por conjugado é de 1 a 4 µg por dose; (viii) a concentração média de polipeptídeo transportador por conjugado é de 2 a 8 µg/mL; (ix) a quantidade média de antígeno de sacarídeo por conjugado é de 1 a 4 µg por dose; (x) a concentração média de antígeno de sacarídeo por conjugado é de 2 a 8 µg/mL;
(xi) a composição é isenta do(s) polipeptídeo(s) transportador(es) na forma não conjugada; (xii) a composição contém o(s) polipeptídeo(s) transportador(es) na forma não conjugada, em que a massa do(s) polipeptídeo(s) transportador(es) na forma não conjugada na composição é <10% da massa desse polipeptídeo transportador nos n conjugados imunogênicos; (xiii) a composição é isenta de antígenos de sacarídeo na forma não conjugada; e/ou (xiv) a composição contém pelo menos um dos antígenos de sacarídeo na forma não conjugada, em que a massa total dos antígenos de sacarídeo na forma não conjugada na composição é <10% da massa total dos antígenos de sacarídeo nos n conjugados imunogênicos.
[0204] Modalidade I-14. Processo para a preparação de uma pluralidade de doses unitárias de uma composição farmacêutica, em que (i) a composição farmacêutica compreende um conjugado imunogênico compreendendo um polipeptídeo transportador e um antígeno sacarídeo, em que o antígeno sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele, e (ii) o processo compreender etapas de preparação de uma composição a granel compreendendo o conjugado imunogênico e embalagens de doses unitárias individuais da composição a granel em uma pluralidade de recipientes individuais.
[0205] Modalidade I-15. Processo para preparar uma composição farmacêutica, em que a composição farmacêutica compreende dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes e um adjuvante de sal de alumínio, em que (i) cada um dos conjugados imunogênicos compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, e (ii) o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; e o processo compreender (A) etapas de adsorção separada de cada um dos conjugados imunogênicos a um adjuvante de sal de alumínio, em seguida, mistura de conjugados adsorvidos individuais juntos ou (B) adsorção sequencial de cada um dos conjugados imunogênicos ao adjuvante de sal de alumínio.
[0206] Modalidade I-16. Polipeptídeo transportador, compreendendo uma sequência de aminoácidos que (i) tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1; (ii) está isento de uma sequência dipeptídica Arg- Arg; e (iii) inclui pelo menos um resíduo nnAA.
[0207] Modalidade I-17. Polipeptídeo transportador, compreendendo uma sequência de aminoácidos que (i) tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 e (ii) inclui uma substituição nnAA em um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos (numerados de acordo com SEQ ID NO : 1): Asp-211; Asp-295; Asp-352; Asp-392; Asp-465; Asp-467; Asp 507; Asp 519; Asn 296; Asn 359; Asn 399; Asn 481; Asn 486; Asn 502; Asn 524; Glu 240; Glu 248; Glu 249; Glu 256; Glu 259; Glu 292; Glu 362; Gln 252; Gln 287; Lys 212; Lys 218; Lys 221; Lys 229; Lys 236; Lys 264; Lys 299; Lys 385; Lys 456; Lys 474; Lys 498; Lys 516; Lys 522; Lys 534; Arg 377; Arg 407; Arg 455; Arg 460; Arg 462; Arg 472; Arg 493; Ser 198; Ser 200; Ser 231; Ser 233; Ser 239; Ser 261; Ser 374; Ser 381; Ser 297; Ser 397; Ser 451; Ser 475; Ser 494; Ser 495; Ser 496; Ser 501; Ser 505; Thr 253; Thr 265; Thr 267; Thr 269; Thr 293; Thr 386; Thr 400; Thr 408; Thr- 469; e/ou Thr 517.
[0208] Modalidade I-18. Polipeptídeo transportador da modalidade I-16 ou I-17, em que Arg-193 da SEQ ID NO: 1 é substituído por um aminoácido diferente, tal como Asn.
[0209] Modalidade I-19. Conjugado imunogênico compreendendo o polipeptídeo transportador da modalidade I-16 ou I-17 ou I-18, conjugado por meio de um resíduo nnAA nele a um antígeno.
[0210] Modalidade I-20. Conjugado imunogênico compreendendo um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que (i) o polipeptídeo transportador compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4; e (ii) o antígeno de sacarídeo é covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de pelo menos um resíduo nnAA dentro da SEQ ID NO:.
[0211] Modalidade I-21. Composição farmacêutica que compreende dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes de acordo com a modalidade I-20.
[0212] Modalidade I-22. O recipiente, dispositivo, composição, processo, polipeptídeo ou conjugado de qualquer modalidade anterior, em que o polipeptídeo transportador compreende 4 a 9 resíduos nnAA.
[0213] Modalidade I-23. O recipiente, dispositivo, composição, processo, polipeptídeo ou conjugado de qualquer modalidade anterior, em que pelo menos um nnAA é substituído por uma lisina na sequência nativa do polipeptídeo transportador.
[0214] Modalidade I-24. O recipiente, dispositivo, composição, processo, polipeptídeo ou conjugado de qualquer modalidade anterior, em que o polipeptídeo transportador tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1.
[0215] Modalidade I-25. O recipiente, dispositivo, composição, processo, polipeptídeo ou conjugado da modalidade I-24, em que pelo menos um nnAA é substituído por K24, K33, K37, K39, K212, K214, K227, K244, K264, K385, K522 e/ou K526 em SEQ ID NO:1 ou 2.
[0216] Modalidade I-26. O recipiente, dispositivo, composição, processo, polipeptídeo ou conjugado de qualquer modalidade anterior, em que o polipeptídeo transportador compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:14.
[0217] Modalidade I-27. O recipiente, dispositivo, composição, processo, polipeptídeo ou conjugado de qualquer modalidade anterior, em que o nnAA é ácido 2-amino-3-(4-(azidometil)fenil)propanóico.
[0218] Modalidade I-28. O recipiente, dispositivo, composição, processo, polipeptídeo ou conjugado de qualquer modalidade anterior, em que o antígeno tem um grupo alquino que é conjugado ao nnAA por meio de um grupo azido.
[0219] Modalidade I-29. O recipiente, dispositivo, composição, processo, polipeptídeo ou conjugado de qualquer modalidade anterior, em que o antígeno é um sacarídeo capsular bacteriano; por exemplo, um sacarídeo capsular de uma bactéria selecionada do grupo que consiste em Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae e Porphyromonas gingivalis.
[0220] Modalidade I-30. O recipiente, dispositivo, composição, processo, polipeptídeo ou conjugado de qualquer modalidade anterior, em que o antígeno é um sacarídeo capsular de um serotipo S.pneumoniae selecionado do grupo que consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B , 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F.
[0221] Modalidade I-31. O recipiente, dispositivo, composição, processo, polipeptídeo ou conjugado de qualquer modalidade anterior, em que a razão de sacarídeo para polipeptídeo transportador (p/p) no(s) conjugado(s) é maior que
1.
[0222] Modalidade I-32. O recipiente, dispositivo, composição, processo, polipeptídeo ou conjugado de qualquer modalidade anterior, em que o polipeptídeo transportador inclui 3 ou mais resíduos nnAA e o conjugado tem um peso molecular de pelo menos 500 kDa.
[0223] Modalidade I-33. O recipiente, dispositivo, composição, processo, polipeptídeo ou conjugado de qualquer modalidade anterior, em que o conjugado tem um peso molecular entre 900kDa e 5MDa.
[0224] Modalidade I-34. O recipiente, dispositivo, composição ou processo, de qualquer uma das modalidades de I-1 a I-15 ou modalidades de I-21 a I-33, em que a composição farmacêutica compreende: conjugados de sacarídeos capsulares de 2 ou mais serotipos pneumocócicos diferentes selecionados do grupo que consiste nos serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F; conjugados de sacarídeos capsulares de 14 ou mais serotipos pneumocócicos diferentes selecionados do grupo que consiste nos serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F; conjugados de sacarídeos capsulares de 15 ou mais serotipos pneumocócicos diferentes selecionados do grupo que consiste nos serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F; conjugados de sacarídeos capsulares de 20 ou mais serotipos pneumocócicos diferentes selecionados do grupo que consiste nos serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F; conjugados de sacarídeos capsulares de 21 ou mais serotipos pneumocócicos diferentes selecionados do grupo que consiste nos serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F; conjugados de sacarídeos capsulares de 24 ou mais serotipos pneumocócicos diferentes selecionados do grupo que consiste nos serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F; conjugados de sacarídeos capsulares de 25 ou mais serotipos pneumocócicos diferentes selecionados do grupo que consiste nos serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F; conjugados de sacarídeos capsulares de 4 ou mais serogrupos meningocócicos diferentes selecionados do grupo que consiste nos serogrupos A, C, W135, X e Y; ou conjugados de sacarídeos capsulares de 2 ou mais serotipos P.gengivals diferentes selecionados do grupo que consiste nos serotipos K1, K2, K3, K4, K5 e K6.
[0225] Modalidade I-35. Método para desencadear uma resposta de anticorpo imunoprotetor a um antígeno em um paciente, compreendendo a administração ao paciente de uma composição farmacêutica de qualquer uma das modalidades de I-6 a I-13 ou modalidades de I-21 a I-34, ou um conjugado de imunogênio de acordo com a qualquer uma das modalidades de I-19 a I-33, em um excipiente adequado para administração parenteral.
[0226] A invenção é ilustrada nos seguintes exemplos. Os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitantes. Numerosas variações, mudanças e substituições ocorrerão aos técnicos no assunto sem se afastar da invenção. Os exemplos são realizados usando técnicas bem conhecidas e de rotina para os técnicos no assunto, exceto onde descrito em detalhes de outra forma. EXEMPLOS DE WO2018/126229
[0227] Os exemplos de WO2018/126229 descrevem em detalhes completos a síntese de porções eCRM de um único sítio (por exemplo, K11TAG). Estes foram expressos em um extrato de síntese de proteína livre de células (CFPS), e pAMF foi incorporado no lugar de Lys natural.
[0228] Variantes de CRM contendo múltiplos nnAA por polipeptídeo também foram expressas, com vários números diferentes de substituições Lys → pAMF por proteína. Em geral, verificou-se que um maior número de substituições deu transportadores que levaram a conjugados de MW mais altos, mas os transportadores tinham menor solubilidade. Os transportadores com seis resíduos de pAMF geralmente fornecem boa solubilidade (>> 50 mg/mL) e imunogenicidade. A alta solubilidade foi surpreendente porque a substituição de resíduos Lys carregados na sequência nativa por resíduos pAMF hidrofóbicos aumentou a hidrofobicidade de CRM197, que é uma proteína cuja hidrofobicidade já foi relatada como afetando sua solubilidade. Assim, foi demonstrado que é possível manter os mesmos sítios de ligação que foram usados em conjugados CRM197 conhecidos (nomeadamente resíduos de Lys) sem causar insolubilidade quando os resíduos carregados são perdidos.
[0229] Um conjunto particularmente útil de 6 substituições Lys → pAMF foi visto usando K34, K213, K245, K265, K386 e K527 (numerados de acordo com SEQ ID NO: 3). Esta combinação de sítios para substituição de pAMF é surpreendentemente eficaz, em particular porque as substituições individuais nas posições K245 e K527 conduziram a níveis de expressão relativamente baixos.
[0230] Este conjunto de seis substituições pode ser combinado com a interrupção do dipeptídeo Arg-Arg nos resíduos 192-193 de SEQ ID NO: 1 (RR → RN) para fornecer SEQ ID NO: 4, em que cada X é pAMF.
[0231] Os exemplos de WO2018/126229 descrevem ainda protocolos gerais para ativação de sacarídeo com meta-periodato de sódio, para derivatização de polissacarídeo oxidado por periodato com DBCO, para ativação de sacarídeo com CDAP e para conjugação de sacarídeo-DBCO com eCRM. Ver também US Serial No. 62/693.978, previamente incorporado por referência
[0232] Uma combinação de conjugados para cada um dos 24 serotipos pneumocócicos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F foi preparado usando derivado CRM197 SEQ ID NO: 4 (com X=pAMF) como o polipeptídeo transportador em cada conjugado. A imunogenicidade desta composição multivalente foi confirmada usando um 3- esquema de dosagem em grupos de 7 coelhos, por injeção intramuscular de 0,25mL de vacina. Cada dose incluiu 24 µg de sacarídeo (1 µg por serotipo), dando uma concentração de 96 µg/mL.
[0233] Uma combinação de conjugados para cada um dos 32 serotipos pneumocócicos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23A, 23B, 23F, 31, 33F e 35B foi então preparada e a imunogenicidade confirmada de maneira semelhante.
[0234] Para fins de comparação, a vacina conjugada Prevnar™ 13-valente também foi testada, juntamente com uma vacina não conjugada 24-valente feita da vacina Pneumovax™ 23-valente suplementada por polissacarídeo serotipo 6A não conjugado. Essas três composições tinham doses de polissacarídeo equivalentes por serotipo (exceto para 6B, onde Prevnar™ inclui uma dosagem dupla), que envolvia a diluição de Prevnar™ e Pneumovax™. Todas as três composições incluíram adjuvante de fosfato de alumínio (60 µg Al +++ por dose), que envolveu a adição do adjuvante a Pneumovax™. As composições não continham conservantes.
[0235] A composição do conjugado 24-valente incluiu uma quantidade menor de polipeptídeo transportador do que na vacina aprocada Prevnar-13™, embora também inclua sacarídeos capsulares de 11 serotipos adicionais. A razão de peso total de sacarídeo capsular para polipeptídeo transportador na composição do conjugado 24-valente era cerca do dobro da observada em Prevnar™.
[0236] As respostas de IgG e OPA foram medidas nos coelhos. Após a terceira dose, ambas as respostas foram muito maiores em coelhos que receberam as duas vacinas conjugadas do que naqueles que receberam a vacina não conjugada. Além disso, as respostas de IgG e OPA usando a composição 24-valente foi comparável àquelas alcançadas usando Prevnar™ nos 13 serotipos contemplados pela vacina aprovada, mas foram, além disso, superiores contra os 11 serotipos que não estão incluídos em Prevnar™. Surpreendentemente, não houve evidência de supressão epitópica induzida por transportador usando a composição 24-valente.
[0237] A Figura 1 fornece o título médio geométrico para cada um dos 32 serotipos na composição do conjugado 32-valente em relação à formulação de polissacarídeo/alúmen e Prevnar-13 ™.
[0238] A composição de conjugado multivalente pode ser utilmente embalada em uma seringa esterilizada pré-cheia para que possa ser facilmente distribuída na forma de dose unitária e possa então ser administrada no ponto de uso sem a necessidade de transferir o conteúdo de um frasco para uma seringa para injeção, etc. POSIÇÕES SUBSTITUÍVEIS NO CRM197
[0239] Com base no trabalho divulgado em WO2018/126229, uma variedade de resíduos Asp, Asn, Glu, Gln, Lys, Arg, Ser e Thr dentro da sequência CRM197 nativa (SEQ ID NO: 1) foram substituídos individualmente por pAMF por mutação de seus códons a TAG e expressando a proteína a 25°C em um sistema livre de células em que este códon é reconhecido por um tRNA que incorpora o nnAA. Os polipeptídeos mutantes foram expressos com um N-terminus metionina e com uma etiqueta de hexahistidina jusante anexada por meio de um ligante tripeptídeo Gly-Ser-Gly. Resíduos dentro de Asn270-Ile289, Ala320- Glu349 e Phe410-His-449 foram evitados por causa do reconhecido epítopos de células T nessas regiões (ver acima).
[0240] A eficiência de expressão foi avaliada verificando a incorporação de 14 C-Leu nas proteínas mutantes, observando a proteína total e a proteína solúvel. Em geral, as mutações no domínio catalítico de CRM197 levaram a níveis de expressão reduzidos em relação à sequência de CRM197 não modificada, e os mutantes com os melhores níveis de expressão geralmente envolveram substituições a jusante de Arg-193, que pode ser usado para delinear o fim do domínio catalítico.
[0241] Os melhores 72 mutantes mostraram níveis de expressão aumentados de proteínas totais e solúveis e tiveram substituições nos seguintes resíduos, numerados de acordo com SEQ ID NO: 1: Ser-198, Ser-200, Asp-211, Lys-212, Lys-218 , Lys-221, Lys-229, Ser-231, Ser-233, Lys-236, Ser-239, Glu-240, Glu-248, Glu-249, Gln-252, Thr-253, Glu-256, Glu -259, Ser-261, Lys-264, Thr- 265, Thr-267, Thr-269, Gln-287, Glu-292, Thr-293, Asp-295, Asn-296, Ser-297, Lys-299, Asp-352, Asn-359, Glu-362, Ser-374, Arg-377, Ser-381, Lys-385, Thr-386, Asp-392, Ser-397, Asn-399, Thr-400, Arg -407, Thr-408, Ser-451, Arg-455, Lys- 456, Arg-460, Arg-462, Asp-465, Asp-467, Thr-469, Arg-472, Lys-474, Ser-475 , Asn-481, Asn-486, Arg-493, Ser-494, Ser-495, Ser-496, Lys-498, Ser-501, Asn- 502, Ser-505, Asp-507, Lys-516, Thr-517, Asp-519, Lys-522, Asn-524 e Lys-534.
[0242] As modalidades descritas neste documento são fornecidas apenas a título de exemplo, e várias alternativas às modalidades não são excluídas na prática das modalidades descritas neste documento.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1 (CRM197 nativo)
NGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS SEQ ID NO: 2 (CRM197 com substituição Arg-Asn)
NGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS SEQ ID NO: 3 (CRM197 com 6 sítios nnAA preferenciais e Met N-terminal)
GNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSXLSLFFEIKS SEQ ID NO: 4 (CRM197 COM SUBSTN ARG-ASN, 6 SÍTIOS NNAA PREFERENCIAIS E MET N-TERMINAL)
GNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSXLSLFFEIKS SEQ ID NO: 5 (proteína D de H.influenzae)
Claims (37)
1. Recipiente esterilizado, caracterizado pelo fato de que contém uma composição farmacêutica que compreende um conjugado imunogênico compreendendo um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele.
2. Recipiente hermeticamente selado, caracterizado pelo fato de que contém uma composição farmacêutica que compreende um conjugado imunogênico compreendendo um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele e em que recipientes adequados para vedação hermética incluem, por exemplo, um frasco, em que os conteúdos são preferencialmente esterilizados no ponto de selagem hermética.
3. Recipiente de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de ser um recipiente de vidro estéril, como um frasco.
4. Dispositivo de entrega, caracterizado pelo fato de que contém uma composição farmacêutica que compreende um conjugado imunogênico compreendendo um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele.
5. Recipiente de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ou dispositivo de entrega de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de ser uma seringa.
6. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes e um adjuvante de sal de alumínio, em que: (i) cada conjugado imunogênico compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; e (ii) o adjuvante de sal de alumínio é um adjuvante de hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio.
7. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes e um adjuvante de fosfato de alumínio, em que: (i) cada conjugado imunogênico compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; e (ii) a concentração de íons de alumínio na composição é < 2,5 mg/mL.
8. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes, em que: (i) cada conjugado imunogênico compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; e (ii) o volume da composição farmacêutica é de 0,25 a 1,25mL.
9. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes e um conservante, em que cada conjugado imunogênico compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele.
10. Composição farmacêutica sem conservante, caracterizada pelo fato de que compreende dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes, em que cada conjugado imunogênico compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele.
11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes, em que: (i) cada conjugado imunogênico compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; (ii) a composição tem uma osmolalidade de 200 a 400 mOsm/kg.
12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes e pelo menos um excipiente em que: (i) cada conjugado imunogênico compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; e (ii) o pelo menos um excipiente é selecionado do grupo que consiste em cloreto de sódio, ácido succínico e polissorbato 80.
13. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende n diferentes conjugados imunogênicos, em que: (i) cada um dos n conjugados imunogênicos compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que o antígeno de sacarídeo é covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; (ii) n é um número inteiro de 3 a 50; e (iii) a quantidade total de polipeptídeo transportador nos n conjugados imunogênicos é menor ou igual a 3n µg por dose; (iv) a concentração total de polipeptídeo transportador nos n conjugados imunogênicos é menor ou igual a 6n µg/ml; (v) a quantidade total de antígeno de sacarídeo nos n conjugados imunogênicos é menor ou igual a 3n µg por dose; (vi) a concentração total de antígeno de sacarídeo nos n conjugados imunogênicos é menor ou igual a 6n µg/mL; (vii) a quantidade média de polipeptídeo transportador por conjugado é de 1 a 4 µg por dose; (viii) a concentração média de polipeptídeo transportador por conjugado é de 2 a 8 µg/mL; (ix) a quantidade média de antígeno de sacarídeo por conjugado é de 1 a 4 µg por dose; (x) a concentração média de antígeno de sacarídeo por conjugado é de 2 a 8 µg/mL; (xi) a composição é isenta do(s) polipeptídeo(s) transportador(es) na forma não conjugada; (xii) a composição contém o(s) polipeptídeo(s) transportador(es) na forma não conjugada, em que a massa do(s) polipeptídeo(s) transportador(es) na forma não conjugada na composição é <10% da massa desse polipeptídeo transportador nos n conjugados imunogênicos; (xiii) a composição é isenta de antígenos de sacarídeo na forma não conjugada; e/ou (xiv) a composição contém pelo menos um dos antígenos de sacarídeo na forma não conjugada, em que a massa total dos antígenos de sacarídeo na forma não conjugada na composição é <10% da massa total dos antígenos de sacarídeo nos n conjugados imunogênicos.
14. Processo para a preparação de uma pluralidade de doses unitárias de uma composição farmacêutica, caracterizado pelo fato de que (i) a composição farmacêutica compreende um conjugado imunogênico compreendendo um polipeptídeo transportador e um antígeno sacarídeo, em que o antígeno sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele, e (ii) o processo compreende etapas de preparação de uma composição a granel compreendendo o conjugado imunogênico e embalagens de doses unitárias individuais da composição a granel em uma pluralidade de recipientes individuais.
15. Processo para preparar uma composição farmacêutica, em que a composição farmacêutica compreende dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes e um adjuvante de sal de alumínio, em que (i) cada um dos conjugados imunogênicos compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, e (ii) o antígeno de sacarídeo está covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de um resíduo de aminoácido não natural nele; caracterizado pelo fato de que o processo compreende (A) etapas de adsorção separada de cada um dos conjugados imunogênicos a um adjuvante de sal de alumínio, em seguida, mistura de conjugados adsorvidos individuais juntos ou (B) adsorção sequencial de cada um dos conjugados imunogênicos ao adjuvante de sal de alumínio.
16. Polipeptídeo transportador, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos que (i) tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1; (ii) está isento de uma sequência dipeptídica Arg-Arg; e (iii) inclui pelo menos um resíduo nnAA.
17. Polipeptídeo transportador, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos que (i) tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 e (ii) inclui uma substituição nnAA em um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos (numerados de acordo com SEQ ID NO : 1): Asp-211; Asp-295; Asp-352; Asp-392; Asp-465; Asp-467; Asp 507; Asp 519; Asn 296; Asn 359; Asn 399; Asn 481; Asn 486; Asn 502; Asn 524; Glu 240; Glu 248; Glu 249; Glu 256; Glu 259; Glu 292; Glu 362; Gln 252; Gln 287;
Lys 212; Lys 218; Lys 221; Lys 229; Lys 236; Lys 264; Lys 299; Lys 385; Lys 456; Lys 474; Lys 498; Lys 516; Lys 522; Lys 534; Arg 377; Arg 407; Arg 455; Arg 460; Arg 462; Arg 472; Arg 493; Ser 198; Ser 200; Ser 231; Ser 233; Ser 239; Ser 261; Ser 374; Ser 381; Ser 297; Ser 397; Ser 451; Ser 475; Ser 494; Ser 495; Ser 496; Ser 501; Ser 505; Thr 253; Thr 265; Thr 267; Thr 269; Thr 293; Thr 386; Thr 400; Thr 408; Thr-469; e/ou Thr 517.
18. Polipeptídeo transportador de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que Arg-193 da SEQ ID NO: 1 é substituído por um aminoácido diferente, tal como Asn.
19. Conjugado imunogênico, caracterizado pelo fato de que compreende o polipeptídeo transportador definido em qualquer uma das reivindicações 16 a 18, conjugado por meio de um resíduo nnAA nele a um antígeno.
20. Conjugado imunogênico, caracterizado pelo fato de que compreende um polipeptídeo transportador e um antígeno de sacarídeo, em que (i) o polipeptídeo transportador compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4; e (ii) o antígeno sacarídeo é covalentemente ligado ao polipeptídeo transportador por meio de pelo menos um resíduo nnAA na SEQ ID NO: 4.
21. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende dois ou mais conjugados imunogênicos diferentes definidos na reivindicação 20.
22. Recipiente, dispositivo, composição, processo, polipeptídeo ou conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo transportador compreende de 4 a 9 resíduos nnAA.
23. Recipiente, dispositivo, composição, processo, polipeptídeo ou conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que pelo menos um nnAA é substituído por uma lisina na sequência nativa do polipeptídeo transportador.
24. Recipiente, dispositivo, composição, processo, polipeptídeo ou conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo transportador tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1.
25. Recipiente, dispositivo, composição, processo, polipeptídeo ou conjugado de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que pelo menos um nnAA é substituído por K24, K33, K37, K39, K212, K214, K227, K244, K264, K385, K522 e/ou K526 na SEQ ID NO: 1 ou 2.
26. Recipiente, dispositivo, composição, processo, polipeptídeo ou conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo transportador compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4.
27. Recipiente, dispositivo, composição, processo, polipeptídeo ou conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que o nnAA é ácido 2-amino-3-(4-(azidometil)fenil)propanóico.
28. Recipiente, dispositivo, composição, processo, polipeptídeo ou conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que o antígeno tem um grupo alquino que é conjugado ao nnAA por meio de um grupo azido.
29. Recipiente, dispositivo, composição, processo, polipeptídeo ou conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que o antígeno é um sacarídeo capsular bacteriano; por exemplo, um sacarídeo capsular de uma bactéria selecionada do grupo que consiste em Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae e Porphyromonas gingivalis.
30. Recipiente, dispositivo, composição, processo, polipeptídeo ou conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que o antígeno é um sacarídeo capsular de um serotipo de S.pneumoniae selecionado do grupo que consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31, e 33F.
31. Recipiente, dispositivo, composição, processo, polipeptídeo ou conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que a razão de sacarídeo para polipeptídeo transportador (p/p) no(s) conjugado(s) é maior que 1.
32. Recipiente, dispositivo, composição, processo, polipeptídeo ou conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo transportador inclui 3 ou mais resíduos nnAA e o conjugado tem um peso molecular de pelo menos 500 kDa.
33. Recipiente, dispositivo, composição, processo, polipeptídeo ou conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que o conjugado tem um peso molecular entre 900kDa e 5MDa.
34. Recipiente, dispositivo, composição ou processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15 ou 21 a 33, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica compreende: conjugados de sacarídeos capsulares de 2 ou mais serotipos pneumocócicos diferentes selecionados do grupo que consiste nos serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F; conjugados de sacarídeos capsulares de 14 ou mais serotipos pneumocócicos diferentes selecionados do grupo que consiste nos serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F; conjugados de sacarídeos capsulares de 15 ou mais serotipos pneumocócicos diferentes selecionados do grupo que consiste nos serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F; conjugados de sacarídeos capsulares de 20 ou mais serotipos pneumocócicos diferentes selecionados do grupo que consiste nos serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F; conjugados de sacarídeos capsulares de 21 ou mais serotipos pneumocócicos diferentes selecionados do grupo que consiste nos serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F; conjugados de sacarídeos capsulares de 24 ou mais serotipos pneumocócicos diferentes selecionados do grupo que consiste nos serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F; conjugados de sacarídeos capsulares de 25 ou mais serotipos pneumocócicos diferentes selecionados do grupo que consiste nos serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F; conjugados de sacarídeos capsulares de 4 ou mais serogrupos meningocócicos diferentes selecionados do grupo que consiste nos serogrupos A, C, W135, X e Y; ou conjugados de sacarídeos capsulares de 2 ou mais serotipos P.gengivals diferentes selecionados do grupo que consiste nos serotipos K1, K2, K3, K4, K5 e K6.
35. Recipiente, dispositivo, composição, processo, polipeptídeo ou conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 34,
caracterizado pelo fato de que o serotipo 20 é o serotipo 20B.
36. Recipiente, dispositivo, composição, processo, polipeptídeo ou conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 34, caracterizado pelo fato de que o serotipo 20 é o serotipo 20A.
37. Método para induzir uma resposta de anticorpo imunoprotetor a um antígeno em um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao paciente uma composição farmacêutica definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 13 ou 21 a 34, ou um conjugado de imunogênio, definido em qualquer uma das reivindicações 19 a 33, em um excipiente adequado para administração parentérica.
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