KR20130098362A - 면역원성 조성물 - Google Patents

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구이도 그란디
도메니코 마이오네
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Abstract

본 발명은 a) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ia의 캡슐형 당류인 접합체; b) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ib의 캡슐형 당류인 접합체; 및 c) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 III의 캡슐형 당류인 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 환자에게 디프테리아 변성 독소 또는 이들의 유도체에 접합된 GBS의 캡슐형 당류인 접합체를 투여하는 단계를 포함하는, GBS에 의한 감염에 대하여 환자를 면역화하는 방법을 제공하며, 환자는 디프테리아 변성 독소 또는 이들의 유도체로 사전-면역화되었다.

Description

면역원성 조성물{IMMUNOGENIC COMPOSITIONS}
본 출원은 2010년 9월 16일 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/383,668; 및 2011년 1월 31일 출원된 영국 특허 출원 번호 1101665.6의 이익을 주장하며, 이것들 둘 다는 전문이 본원에 참고로 포함된다.
기술분야
본 발명은 스트렙토코쿠스 아갈락티애 (Streptococcus agalactiae) 캡슐형 당류 및 담체 단백질의 접합체를 포함하는 면역원성 조성물의 분야에 있다. 조성물은 면역에 유용하다.
박테리아의 캡슐형 당류는 캡슐화된 박테리아에 대한 백신으로 수년 동안 사용되었다. 하지만, 당류가 T-독립적인 항원이기 때문에, 그것들은 불량한 면역원성이다. 담체에 접합은 T-독립적인 항원을 T-의존적인 항원으로 전환함으로써, 기억 반응을 향상시키고 보호 면역이 발달하는 것을 허용할 수 있다. 그러므로 가장 효과적인 당류 백신은 당접합체에 기초하고, 원형 접합체 백신은 헤모필루스 인플루엔재 (Haemophilus influenzae) 타입 b ('Hib')에 대한 것이다 [예를 들어, 참고문헌 84의 14장 참고].
접합체 백신이 설명된 또 다른 박테리아는 '그룹 비 스트렙토코쿠스', 또는 간단하게 'GBS'로도 알려진 스트렙토코쿠스 아갈락티애이다. 이 일의 대부분은 Dennis Kasper 및 동료들에 의해 수행되었고, 참고문헌 1 내지 9와 같은 문서에서 설명된다. 각각의 GBS 혈청형 Ia, Ib, III 또는 V에 대한 접합체 백신은 사람에 안전하고 면역원성인 것으로 나타났다 [10]. 하지만, 추가의 및 개선된 GBS 접합체 백신에 대한 필요는 남아있다.
첫 번째 양태에서, 본 발명은 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ia, Ib, III 또는 V의 캡슐형 당류인 하나 이상의 접합체를 이용한다. 특히, 본 발명은 이들 접합체들 중 하나 이상을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 조성물은 이들 GBS 혈청형(들)에 의한 감염을 방지하기 위해 백신으로서 사용될 수도 있다.
두 번째 양태에서, 본 발명은 환자에게 디프테리아 변성 독소 또는 이들의 유도체에 접합된 GBS의 캡슐형 당류인 접합체를 투여하는 단계를 포함하는, GBS에 의한 감염에 대하여 환자를 면역화하는 방법을 제공하며, 환자는 디프테리아 변성 독소 또는 이들의 유도체로 사전-면역화된다. 전형적으로, 접합체는 본 발명의 첫 번째 양태의 면역원성 조성물에서 GBS 접합체 중 하나이다.
면역원성 조성물
한 구체예에서, 본 발명은 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ia의 캡슐형 당류인 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 두 번째 구체예에서, 본 발명은 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ib의 캡슐형 당류인 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 세 번째 구체예에서, 본 발명은 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 III의 캡슐형 당류인 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 네 번째 구체예에서, 본 발명은 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 V의 캡슐형 당류인 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
면역원성 조성물은 하나 이상의 접합체를 포함할 수도 있다. 두 개, 세 개 또는 네 개의 접합체를 포함하는 본 발명의 구체예는 하기 설명된다. 이들 조성물들 중에, 발명자는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ib의 캡슐형 당류인 접합체를 포함하는 조성물이 GBS 혈청형 Ib에 더하여 GBS 혈청형 Ia에 대해 보호를 제공할 수도 있다는 것을 발견하였다. 이 관찰은 참고문헌 11의 교시 내용에 대한 것이며, 이것은 타입 Ib 접합체가 타입 Ia 박테리아를 죽일 수 있는 항체를 포함할 수 없다는 것을 제안한다. 따라서, 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ib의 캡슐형 당류인 접합체를 포함하는, 하기 설명된 구체예는 그것들이 혈청형 Ia에 대하여 향상된 보호를 제공하고 (조성물이 또한 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ia의 캡슐형 당류인 접합체를 포함할 때), 조성물이 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ia의 캡슐형 당류인 접합체를 포함하지 않을 때도 보호를 제공할 수 있다는 점에서 유리할 수도 있다.
상기 설명된 바와 같이, 면역원성 조성물은 두 개의 접합체를 포함할 수도 있다. 한 구체예에서, 첫 번째 접합체는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ia의 캡슐형 당류인 한편, 두 번째 접합체는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ib의 캡슐형 당류이다. 두 번째 구체예에서, 첫 번째 접합체는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ia의 캡슐형 당류인 한편, 두 번째 접합체는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 III의 캡슐형 당류이다. 세 번째 구체예에서, 첫 번째 접합체는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ia의 캡슐형 당류인 한편, 두 번째 접합체는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 V의 캡슐형 당류이다. 네 번째 구체예에서, 첫 번째 접합체는 첫 번째 접합체는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ib의 캡슐형 당류인 한편, 두 번째 접합체는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 III의 캡슐형 당류이다. 다섯 번째 구체예에서, 첫 번째 접합체는 첫 번째 접합체는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ib의 캡슐형 당류인 한편, 두 번째 접합체는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 V의 캡슐형 당류이다. 여섯 번째 구체예에서, 첫 번째 접합체는 첫 번째 접합체는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 III의 캡슐형 당류인 한편, 두 번째 접합체는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 V의 캡슐형 당류이다.
유사하게, 면역원성 조성물은 세 개의 접합체를 포함할 수도 있다. 한 구체예에서, 첫 번째 접합체는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ia의 캡슐형 당류인 한편, 두 번째 접합체는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ib의 캡슐형 당류이고 세 번째 접합체는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 III의 캡슐형 당류이다. 발명자는 이러한 조성물 (예를 들어, 하기 예시된 바와 같이)이 특히 GBS에 의한 감염을 방지하는 백신으로서 사용에 적합하다는 것을 발견하였다. 그러므로 이 구체예는 본 발명의 바람직한 구체예이다. 두 번째 구체예에서, 첫 번째 접합체는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ia의 캡슐형 당류인 한편, 두 번째 접합체는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ib의 캡슐형 당류이고 세 번째 접합체는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 V의 캡슐형 당류이다. 세 번째 구체예에서, 첫 번째 접합체는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ia의 캡슐형 당류인 한편, 두 번째 접합체는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 III의 캡슐형 당류이고 세 번째 접합체는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 V의 캡슐형 당류이다. 네 번째 구체예에서, 첫 번째 접합체는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ib의 캡슐형 당류인 한편, 두 번째 접합체는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 III의 캡슐형 당류이고 세 번째 접합체는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 V의 캡슐형 당류이다.
같은 방법으로, 면역원성 조성물은 네 개의 접합체를 포함할 수도 있다. 한 구체예에서, 첫 번째 접합체는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ib의 캡슐형 당류인 한편, 두 번째 접합체는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ib의 캡슐형 당류이고, 세 번째 접합체는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 III의 캡슐형 당류이고 네 번째 접합체는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 V의 캡슐형 당류이다.
전형적으로, 상기 설명된 면역원성 조성물은 특이적으로 언급된 것들 이외의 어떤 접합체, 특히 특이적으로 언급된 것들 이외의 GBS 혈청형의 캡슐형 당류를 포함하는 접합체도 포함하지 않을 것이다. 하지만, 일부 구체예에서, 조성물은 다른 GBS 혈청형의 캡슐형 당류를 포함하는 접합체를 포함하는, 다른 접합체를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 조성물은 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 II의 캡슐당류인 접합체를 포함할 수도 있다. 유사하게, 조성물은 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 VI의 캡슐형 당류인 접합체를 포함할 수도 있다. 또 다른 가능성으로, 조성물은 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 VIII의 캡슐형 당류인 접합체를 포함할 수도 있다.
상기 설명된 면역원성 조성물은 단위 용량 당 캡슐형 당류(들)의 어느 적합한 양을 포함할 수도 있다. 캡슐형 당류(들)의 적합한 양은 단위 용량 당 0.1 내지 50 μg일 수도 있다. 전형적으로, 각각의 GBS 캡슐형 당류는 1 내지 30 μg, 예를 들어, 2 내지 25 μg, 특히 5 내지 20 μg의 양으로 존재한다. 적합한 양의 캡슐형 당류(들)는 단위 용량 당 5, 10 및 20 μg을 포함할 수도 있다. 발명자는 특히 면역원성 조성물이 GBS 혈청형 Ia, Ib 및/또는 III의 캡슐형 당류를 포함할 때, 이들 양들이 적합하다는 것을 발견하였다. 그러므로 상기 설명된 구체예에서 각각의 캡슐형 당류의 단위 용량 당 적합한 양은 다음 표에서 번호가 매겨진 옵션으로부터 선택될 수도 있으며, 적절한 구체예는 조성물의 캡슐형 당류(들)가 유도되는 혈청형(들)을 언급하여 표시한다.
표 A - 하나의 접합체를 포함하는 면역원성 조성물
Figure pct00001
표 B - 두 개의 접합체를 포함하는 면역원성 조성물
Figure pct00002
표 C - 세 개의 접합체를 포함하는 면역원성 조성물
Figure pct00003
Figure pct00004
표 C에 설명된 투여 옵션 중에, 발명자는 특히 면역원성 조성물이 a) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ia의 캡슐 당인 접합체; b) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ib의 캡슐형 당류인 접합체; 및 c) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 III의 캡슐형 당류인 접합체를 포함할 때, 옵션 1, 14 및 27이 유효하다는 것을 발견하였다. 그러므로 이들 투여 옵션들은 본 발명에서 사용에, 특히 이 구체예에 적합하다. 잠재적인 독성을 감소시키기 위해 단위 용량 당 캡슐형 당류(들)의 총량을 최소화하는 것이 유리할 수도 있다. 따라서, 투여 옵션 1은 특히 바람직하다.
단위 용량 당 캡슐형 당류(들)의 양을 더 최소화하는 것이 가능할 수도 있다. 특히, 적합한 양의 캡슐형 당류(들)는 단위 용량 당 0.1 내지 5 μg일 수도 있다. 그러므로, 전형적으로, 각각의 GBS 캡슐형 당류는 단위 용량 당 0.1 내지 5 μg, 예를 들어, 0.5, 2.5 또는 5 μg의 양으로 존재할 수도 있다. 예를 들어, 각각의 GBS 캡슐형 당류는 단위 용량 당 0.5 내지 5 μg, 1 내지 4 μg, 2 내지 3 μg, 또는 약 2.5 μg의 양으로 존재할 수도 있다. 발명자는 특히 면역원성 조성물이 a) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ia의 캡슐형 당류인 접합체; b) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ib의 캡슐형 당류인 접합체; 및 c) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 III의 캡슐형 당류인 접합체를 포함할 때, 이들 양이 적합할 것으로 예상한다. 그러므로, 이 구체예에서 각각의 단위 용량 당 캡슐형 당류의 적합한 양은 하기 표의 번호가 매겨진 옵션으로부터 선택될 수도 있다:
표 C' - GBS 혈청형 Ia, Ib 및 III의 캡슐형 당류를 포함하는 면역원성 조성물
Figure pct00005
표 C에 설명된 투여 옵션 중에, 발명자는 특히 옵션 1, 14 및 27을 예상한다. 이 옵션들에서, 각각의 GBS 캡슐의 양은 같다 (예를 들어, 하기 예시된 더 높은 용량의 조성물과 같은).
표 D - 네 개의 접합체를 포함하는 면역원성 조성물
Figure pct00006
Figure pct00007
면역원성 조성물이 하나 이상의 접합체를 포함하는, 상기 설명된 구체예에서, 특정 캡슐형 당류의 다른 캡슐형 당류(들)에 대한 질량비는 달라질 수도 있다. 그러므로 상기 설명된 구체예에서 각각의 캡슐형 당류에 대하여 적합한 비율 (w/w)은 다음 표에서 번호가 붙여진 옵션으로부터 선택될 수도 있으며, 여기에서 관련 구체예는 조성물에서 캡슐형 당류(들)가 유도되는 혈청형(들)을 언급하여 표시한다:
표 E - 두 개의 접합체를 포함하는 면역원성 조성물
Figure pct00008
표 F - 세 개의 접합체를 포함하는 면역원성 조성물
Figure pct00009
표 F에 설명된 비율 옵션 중에, 발명자는 특히 면역원성 조성물이 a) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ia의 캡슐형 당류인 접합체; b) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ib의 캡슐형 당류인 접합체; 및 c) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 III의 캡슐형 당류인 접합체를 포함할 때, 옵션 1이 유효하다는 것을 발견하였다. 그러므로 이 비율 옵션은 본 발명에서 사용에서, 특히 이 구체예에서 바람직하다.
표 G - 네 개의 접합체를 포함하는 면역원성 조성물
Figure pct00010
상기 논의된 바와 같이, 본 발명은 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 V의 캡슐형 당류인 접합체를 포함하는 면역원성 조성물에 일부 관련된다. 발명자는 면역원성 조성물이 하나 이상의 추가의 항원(들)을 포함하면 이들 조성물들에서 GBS 혈청형 V의 캡슐형 당류에 대한 면역 반응이 감소될 수도 있다는 것을 발견하였다. 어떤 이론에도 결부되지 않고, 추가의 항원(들)의 존재는, 감소된 GBS 혈청형 V의 캡슐형 당류에 대한 반응과 함께, "면역 간섭 (immune interference)"을 발생시킨다.
발명자는 조성물이 보조제를 포함하면 이들 면역원성 조성물들에서 GBS 혈청형 V의 캡슐형 당류에 대한 반응이 개선될 수도 있다는 것을 발견하였다. 이 관찰은 참고문헌 12의 교시 내용에 관한 것이며, 이것은 보조제가 GBS 접합체에 대한 면역 반응을 개선하지 않을 수도 있다는 것을 제안한다. 따라서, 또 다른 구체예에서 본 발명은 a) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 V의 캡슐형 당류인 접합체; b) GBS 혈청형 V의 캡슐형 당류를 포함하지 않는 하나 이상의 항원; 및 c) 보조제를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 성분 b)의 항원(들)은 다른 GBS 혈청형(들)의 캡슐형 당류(들)를 포함하는 접합체(들)일 수도 있다. 예를 들어, 이들 접합체들은 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형(들) Ia, Ib 및/또는 III의 캡슐형 당류(들)일 수도 있다. 따라서, 본 발명의 이 구체예는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 V의 캡슐형 당류인 접합체를 포함하고, 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ia, Ib 및/또는 III의 캡슐형 당류인 하나 이상의 접합체를 더 포함하는, 여기에 설명된 면역원성 조성물 중 어느 것도 포함하며, 조성물은 보조제를 더 포함한다. 대안으로, 성분 b)의 항원(들)은 다른 종류(들)의 항원, 예를 들어, 하기 제목 "접합체 및 다른 항체의 조합" 및 "GBS 단백질 항원" 하에 설명된 항원일 수도 있다. 따라서, 본 발명의 이 구체예는 또한 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 V의 캡슐형 당류인 접합체 및 다른 GBS 혈청형(들)의 캡슐형 당류(들)를 포함하는 접합체를 포함하지 않는 하나 이상의 항원을 포함하는, 여기에 설명된 면역원성 조성물 중 어느 것도 포함하며, 조성물은 보조제를 더 포함한다. 하기 설명된 바와 같이, 발명자는 본 발명의 이 구체예에서 보조제는 예를 들어, 알루미늄 염일 수도 있다는 것을 발견하였다. 당업자들은 이들 조성물들에서 사용될 수도 있는 다른 보조제를 확인할 수 있을 것이다.
발명자는 또한 GBS 혈청형 V의 캡슐형 당류에 대한 반응은 이 캡슐형 당류의 용량이 증가하는 경우 개선될 수도 있다는 것을 발견하였다. 특히, 면역원성 조성물이 담체 단백질에 접합된 타입 V 이외의 GBS 혈청형의 캡슐형 당류인 접합체를 포함하면, 타입 V 캡슐형 당류에 대한 반응은 타입 V 캡슐형 당류의 용량이 다른 GBS 혈청형의 캡슐형 당류의 용량보다 더 많은 경우 개선될 수도 있다. 따라서, 또 다른 구체예에서 본 발명은 a) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 V의 캡슐형 당류인 접합체; b) 각각 담체 단백질에 접합된 타입 V 이외의 GBS 혈청형의 캡슐형 당류인, 하나 이상의 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공하며; 타입 V 캡슐형 당류의 용량은 다른 GBS 혈청형(들)의 캡슐형 당류(들)의 총 용량(들)보다 많거나, 다른 GBS 혈청형의 캡슐형 당류의 용량 중 적어도 하나 또는 평균 용량보다 더 많다. 타입 V 캡슐형 당류의 용량이 1.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10배 더 많을 수도 있다. 성분 b)가 하나 이상의 접합체를 포함할 때, 타입 V 캡슐형 당류의 용량이 다른 GBS 혈청형의 캡슐형 당류의 평균 용량보다 더 많은 것이 일반적이다. 성분 b)의 접합체(들)는 타입 V 이외의 어떤 GBS 혈청형의 캡슐형 당류를 포함하는 접합체일 수도 있다. 예를 들어, 이들 접합체(들)는 담체 단백질(들)에 접합된 GBS 혈청형 Ia, Ib 및/또는 III의 캡슐형 당류(들)일 수도 있다. 따라서, 본 발명의 이 구체예는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 V의 캡슐형 당류인 접합체를 포함하고 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ia, Ib 및/또는 III의 캡슐형 당류인 하나 이상의 접합체를 더 포함하는, 여기에 설명된 면역원성 조성물 중 어느 것도 포함한다; 여기에서 타입 V 캡슐형 당류의 용량은 다른 GBS 혈청형(들)의 캡슐형 당류(들)의 총 용량(들)보다 더 많거나, 다른 GBS 혈청형의 캡슐형 당류의 적어도 하나의 용량 또는 평균 용량보다 더 많다. 발명자는 또한 이들 조성물들에서 다른 GBS 혈청형(들)의 캡슐형 당류에 대한 면역 반응이 더 많은 용량의 타입 V 캡슐형 당류에 의해 감소될 수도 있다는 것을 발견하였다. 이 결과는 상기 설명된 바와 같이, 조성물이 보조제를 포함하면 감소될 수도 있다. 즉, 이 관찰은 참고문헌 12의 교시 내용에 관한 것이며, 이것은 보조제가 GBS 접합체에 대한 면역 반응을 증가시키지 않을 수도 있다는 것을 제안한다.
본 발명의 면역원성 조성물을 투여하는 방법은 하기 논의된다. 간단히 말하면, 본 발명의 면역원성 조성물은 일회 또는 다회수 용량으로 투여될 수도 있다. 발명자는 특히 면역원성 조성물이 GBS 혈청형 Ia, Ib 및/또는 III의 캡슐형 당류를 포함할 때; 및 더 특히 면역원성 조성물이 a) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ia의 캡슐형 당류인 접합체; b) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ib의 캡슐형 당류인 접합체; 및 c) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 III의 캡슐형 당류인 접합체를 포함할 때, 본 발명의 면역원성 조성물의 일회 용량의 투여가 효과적이라는 것을 발견하였다. 그러므로 일회 용량의 투여는 본 발명에서, 특히 이들 구체예들에 대하여 바람직하다.
대안으로는, 한 단위 용량에 이어서 두 번째 단위 용량이 효과적일 수도 있다. 전형적으로, 두 번째 (또는 세 번째, 네 번째, 다섯 번째 등) 단위 용량은 첫 번째 단위 용량과 동일하다. 두 번째 단위 용량은 첫 번째 단위 용량의 어느 적합한 시간 후, 특히 1, 2 또는 3 개월 후 투여될 수도 있다. 예를 들어, 면역원성 조성물이 GBS 혈청형 Ia, Ib 및/또는 III의 캡슐형 당류를 포함하면, 그때 두 번째 단위 용량은 첫 번째 단위 용량의 3 개월 후에 투여될 수도 있다. 또 다른 예에서, 면역원성 조성물이 GBS 혈청형 V의 캡슐형 당류를 포함하면, 그때 두 번째 단위 용량은 첫 번째 단위 용량의 1 개월 후에 투여될 수도 있다. 전형적으로, 본 발명의 면역원성 조성물은 근육 내, 예를 들어, 하기 설명된 바와 같이 허벅지 또는 상부 팔에 근육 내 투여에 의해 투여될 것이다.
하기 설명된 바와 같이, 본 발명의 면역원성 조성물은 하나 이상의 보조제를 포함할 수도 있다. 하지만, 발명자는 면역원성 조성물이 GBS 혈청형 Ia, Ib 및/또는 III의 캡슐형 당류를 포함할 때; 및 더 특히 면역원성 조성물이 a) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ia의 캡슐형 당류인 접합체; b) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ib의 캡슐형 당류인 접합체; 및 c) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 III의 캡슐형 당류인 접합체를 포함할 때, 보조제가 없는 조성물의 사용이 효과적이라는 것을 발견하였다. 잠재적인 독성을 감소시키기 위해 보조제를 제외하는 것이 유리할 수도 있다. 따라서, 어떤 보조제도 함유하지 않는 면역원성 조성물 (특히 어떤 알루미늄 염 보조제도 함유하지 않음)은 본 발명에서 사용에, 특히 이들 구체예들에 바람직하다.
캡슐형 당류
본 발명은 스트렙토코쿠스 아갈락티애의 캡슐형 당류에 기초한다. 캡슐형 당류는 GBS의 펩티도글리칸 백본에 공유 결합되고, 그룹 B 항원과 다르며, 이것은 펩티도글리칸 백본에 부착된 또 다른 당류이다.
GBS 캡슐형 당류는 화학적으로 관련되지만, 항원에 관하여 매우 다르다. 모든 GBS 당류는 다음 삼당류 코어를 공유한다:
β-D-GlcpNAc(1→3)β-D-Galp(1→4)β-D-Glcp
다양한 GBS 혈청형은 이 코어가 변형되는 방법에 따라 다르다. 예를 들어, 혈청형 Ia 및 III 사이의 차이는 연속적인 삼당류 코어와 결합하기 위해 이 코어의 GlcNAc (Ia) 또는 Gal (III)의 사용에서 발생한다 (도 1). 혈청형 Ia 및 Ib 둘 다는 코어에서 GlcNAc에 결합된 [α-D-NeupNAc(2→3)β-D-Galp-(l→] 이당류를 갖지만, 결합은 1→4 (Ia) 또는 1→3 (Ib)이다.
GBS-관련된 질환은 주로 혈청형 Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, 및 VIII에서 발생하며, 85% 이상이 다섯 개의 혈청형 Ia, Ib, III & V에 의해 유발된다. 본 발명은 바람직하게 이들 네 개의 혈청형 중 하나 이상, 특히 혈청형 Ia, Ib & III 중 하나 이상의 당류를 사용한다. 도 2에 나타난 바와 같이, 이들 네 개의 혈청형의 각각의 캡슐형 당류는 (a) 말단 N-아세틸-뉴라민산 (NeuNAc) 잔기 (보통 시알산으로 나타낸다)를 포함하며, 이것은 모든 경우에, 2→3으로 갈락토스 잔기에 결합되고; (b) 삼당류 코어 내에 N-아세틸-글루코사민 잔기 (GlcNAc)를 포함한다.
네 개의 당류 모두는 삼당류 코어 내에 갈락토스 잔기를 포함하지만, 혈청형 Ia, Ib, II & III는 또한 각각의 반복 단위에 추가적인 갈락토스 잔기를 함유한다.
본 발명에 따라 사용된 당류는 그것들의 원래 형태로 있을 수도 있거나, 변형되었을 수도 있다. 예를 들어, 당류는 원래 캡슐형 당류보다 더 짧을 수도 있거나, 화학적으로 변형될 수도 있다. 특히, 본 발명에 사용된 혈청형 V 캡슐형 당류는 참고문헌 13 및 14에 설명된 바와 같이 변형될 수도 있다. 예를 들어, 참고문헌 13 및 14에 설명된 바와 같이 실질적으로 탈시알릴화된 혈청형 V 캡슐형 당류 (도 3)는 특이적으로 본 발명에서 사용이 예상된다. 참고문헌 13에 설명된 바와 같이, 탈시알릴화된 GBS 혈청형 V 캡슐형 당류는 약산성 조건 하에 정제된 GBS 혈청형 V 캡슐형 당류를 처리함으로써 (예를 들어, 80℃에서 60분 동안 0.1 M 황산) 또는 뉴라미니다제의 처리에 의해 제조될 수도 있다. 탈시알릴화된 GBS 혈청형 V 캡슐형 당류의 바람직한 제조 방법은 정제된 당류에 81℃ ± -3℃에서 2시간 동안 1 M 아세트산의 처리에 의한 것이다. 따라서 본 발명에 따라 사용된 당류는 자연에서 발견된 것과 같은, 실질적으로 전체 길이 캡슐 다당류일 수도 있거나, 그것은 자연적인 길이보다 짧을 수도 있다. 전체 길이 다당류는 본 발명에 사용되는 더 짧은 단편을 제공하기 위해, 예를 들어, 가수분해, 가열, 사이징 크로마토그래피 (sizing chromatography)등에 의해 탈폴리머화될 수도 있다. 토끼에서 사슬 길이는 GBS 당류의 면역원성에 영향을 미치는 것으로 보고되었다 [4]. 특히, 본 발명에 사용된 혈청형 II 및/또는 III 캡슐형 당류는 참고문헌 15 및 16에 설명된 바와 같이 탈폴리머화될 수도 있다. 이들 문서들은 적당한 탈아미노 분할에 의해 말단 2, 5-무수-D-만노스 잔기를 감소시키는 항원성 단편으로 타입 II 및 타입 III 캡슐형 당류의 부분적인 탈폴리머화를 설명한다. 간단히 말하면, 캡슐형 당류는 0.5 N NaOH에 용해되고 70℃에서 약 1-4시간 동안 가열된다. 이 배양의 길이는 탈폴리머화의 정도를 조절하며, 이것은 표준 방법에 의해 (예를 들어, 참고문헌 15에 설명된 바와 같이 HPLC에 의해) 결정될 수도 있다. 샘플은 pH를 4로 가져오기 위해 빙초산이 추가되기 전 얼음물에서 냉각된다. 부분적으로 N-탈아실화된 생성물은 5℃에서 2시간 동안 교반하면서 5% (질량/부피) NaNO2의 추가에 의해 탈아민화된다. 하기 설명된 바와 같이, 새롭게 형성된 2,5-무수-D-만노스 잔기의 자유 알데히드는 담체 단백질에 접합에 사용될 수도 있다.
테타누스 변성 독소 담체를 가진 접합체를 형성하기 위해 탈폴리머화된 물질을 사용는 것을 포함하는, 엔도-β-갈락토시다제에 의한 혈청형 III 캡슐형 당류의 탈폴리머화가 보고된다 [참고문헌 1 & 4-6]. GBS 혈청형 III 및 VIII의 캡슐 다당류의 오존 분해 (ozonolysis)는 또한 탈폴리머화에 사용되었다 [17]. MW가 30 kDa 보다 큰 당류를 사용하는 것이 바람직하고, 실질적으로 전체 길이 캡슐 다당류가 사용될 수 있다. 혈청형 Ia에 대하여, 150-300 kDa, 특히 175-275 kD의 범위의 MW를 갖는 다당류를 사용하는 것이 바람직하다. 전형적으로, 약 200 kDa 또는 약 260 kDa의 MW를 갖는 혈청형 Ia 당류가 사용된다. 혈청형 Ib에 대하여, 150-300 kDa, 특히 175-250 kDa의 범위의 MW를 갖는 다당류를 사용하는 것이 바람직하다. 전형적으로, 약 200 kDa 또는 약 230 kDa의 MW를 갖는 혈청형 Ib 당류가 사용된다. 혈청형 III에 대하여, 50-200 kDa, 특히 80-150 kDa의 범위의 MW를 갖는 다당류를 사용하는 것이 바람직하다. 전형적으로, 약 100 kDa 또는 약 140 kDa의 MW를 갖는 혈청형 III 당류가 사용된다. 혈청형 V에 대하여, 또한 최대 50 kDa의 MW를 갖는 다당류를 사용하는 것이 바람직하다. 전형적으로, 약 100 kDa의 MW를 갖는 혈청형 V 당류가 사용된다. 이들 분자 질량은 Polymer Standard Service에서 이용 가능한 것들과 같이, 덱스트란 표준에 관하여 겔 여과에 의해 측정될 수 있다 [18].
당류는 자연에서 발견된 바와 같은 캡슐형 당류에 비해 화학적으로 변형될 수도 있다. 예를 들어, 당류는 탈-O-아세틸화 (부분적으로 또는 전체적으로), 탈-N-아세틸화 (부분적으로 또는 전체적으로), N-프로피온화 (부분적으로 또는 전체적으로) 등이 될 수도 있다. 탈-아세틸화는 접합 전에, 도중에 또는 후에 발생할 수도 있지만, 바람직하게 접합 전에 발생한다. 특정 당류에 의존하여, 탈-아세틸화는 면역원성에 영향을 미치거나 아닐 수도 있다. 다양한 혈청형의 GBS 당류에 대하여 O-아세틸화의 적합성은 참고문헌 19에서 논의되고, 일부 구체예에서 위치 7, 8 및/또는 9에서 시알산 잔기의 O-아세틸화는, 예를 들어, 보호/탈-보호, 재-아세틸화 등에 의해 접합 전에, 도중에 및 후에 유지된다. 하지만, 전형적으로 본 발명에 사용된 당류는 실질적으로 위치 7, 8 및/또는 9에서 시알산 잔기의 O-아시틸화를 갖지 않는다. 특히, 하기 설명된 바와 같이 GBS 당류가 염기 추출에 의해 정제되었을 때, 그때 O-아세틸화는 전형적으로 손실된다 (참고문헌 19). 탈-아세틸화 등의 효과는 통상적인 검정에 의해 평가될 수 있다.
여기에서 참고문헌 2 및 20과 같은, 참고문헌에 설명된 바와 같이, 캡슐형 당류는 알려진 기술에 의해 정제될 수 있다. 전형적인 공정은 염기 추출, 원심분리, 여과, RNasd/DNase 처리, 프로테아제 처리, 농축, 크기 배제 크로마토그래피, 초원심분리, 음이온 교환 크로마토그래피, 및 추가의 원심분리를 수반한다. GBS 세포에 세포벽 성분을 자유롭게 하기 위해 박테리아 세포벽을 분할하는, 효소 뮤타올리신의 처리가 또한 유용하다.
대안으로는, 참고문헌 21에 설명된 정제 공정이 사용될 수 있다. 이것은 염기 추출, 에탄올/CaCl2 처리, CTAB 침전, 및 재-가용화를 수반한다. 추가의 대안의 공정은 참고문헌 22에서 설명된다.
본 발명은 자연적 근원에서 정제된 당류에 제한되지 않고, 당류는 전체적 또는 부분적 합성과 같은, 다른 방법에 의해 얻을 수도 있다.
접합
본 발명은 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ia, Ib, III 또는 V의 캡슐형 당류인 접합체를 수반한다. 일반적으로, 당류와 담체의 공유 접합은 그것들을 T-독립 항원에서 T-의존 항원으로 전환시키기 때문에 당류의 면역원성을 향상시키고, 따라서 면역학적 메모리를 위한 프라이밍을 허용한다. 접합은 특히 소아 백신에 유용하고 [예를 들어, 참고문헌 23] 잘 알려진 기술이다 [예를 들어, 참고문헌 24 내지 32에서 재검토됨]. 따라서 본 발명의 공정은 정제된 당류를 담체 분자에 접합하는 추가의 단계를 포함할 수도 있다.
GBS 당류의 접합은 널리 보고되었고, 예를 들어, 참고문헌 1 내지 9 참조. GBS 당류 접합에 대한 전형적인 선행 업계 공정은 전형적으로 정제된 당류의 테타누스 변성 독소 (TT) 또는 CRM 197과 같은 담체 단백질로 환원성 아민화를 수반한다 [2]. 환원성 아민화는 담체에서 아미노산의 측쇄 상에 아민기 및 당류에서 알데히드기를 수반한다. GBS 캡슐형 당류는 그것들의 원래 형태에서는 알데히드기를 포함하지 않기 때문에 이것은 전형적으로 당류의 시알산 잔기의 일부 (예를 들어, 5 내지 40%, 특히 10 내지 30%, 바람직하게 약 20%)의 산화 (예를 들어, 과옥소산염 산화)에 의한 접합 전에 발생한다 [2, 33]. 이 방식으로 제조된 접합체 백신은 각각의 GBS 혈청형 Ia, Ib, II, III, 및 V에 대하여 사람에서 안전하고 면역원성인 것으로 나타났다 [10]. 전형적으로, 본 발명의 면역원성 조성물의 모든 접합체는 이 방식으로 제조된다. 하지만, 본 발명이 탈시알릴화된 혈청형 V 캡슐형 당류를 사용할 때, 알데히드기는 당류의 갈락토스 잔기의 일부 (예를 들어, 5 내지 40%, 특히 10 내지 30%, 바람직하게 약 20%)의 산화 (예를 들어, 과옥소산염 산화)에 의한 접합 전에 이 당류에서 발생할 수도 있다 [14]. 참고문헌 34에 설명된 바와 같이, 대체 접합 공정은 이기능성 연결자와 결합하여 당류에서 (탈-N-아세틸화로부터, 또는 아민의 도입 후에) -NH2 기의 사용을 수반한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물에서 하나 이상의 접합체는 이 방식으로 제조되었다. 추가의 대체 공정은 참고문헌 15 및 16에 설명된다. 이 공정에서, 적당한 탈아민화 분할에 의한 타입 II 또는 타입 III 캡슐형 당류의 탈폴리머화의 말단 2,5-무수-D-만노스의 자유 알데히드기는 환원성 아민화에 의한 접합을 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물에서 하나 이상의 접합체는 이 방식으로 제조되었다.
본 발명은 담체 분자의 사용을 수반하며, 이것은 전형적으로 단백질이다. 유용한 담체 단백질은 박테리아 독소 또는 디프테리아 변성 독소 또는 테타누스 변성 독소와 같은, 변성 독소를 포함한다. 독소 또는 변성 독소의 단편, 예를 들어, 테타누스 변성 독소의 단편 C가 또한 사용될 수 있다 [35]. 디프테리아 독소의 CRM 197 돌연변이 [36-38]는 본 발명에 특히 유용하다. 다른 적합한 담체 단백질은 엔.메닝기티디스 (N.meningitidis) 외막 단백질 [39], 합성 펩티드 [40, 41], 열충격 단백질 [42, 43], 페르투시스 단백질 [44, 45], 시토킨 [46], 림포킨 [46], 호르몬 [46], 성장 인자 [46], 사람 혈청 알부민 (바람직하게 재조합), N19 [48]와 같은 다양한 병원체-유도 항원 [47]의 다수의 사람 CD4+ T 세포 에피토프를 포함하는 인공 단백질, 에이치.인플루엔재 (H. influenzae)의 단백질 D [49, 50], 폐렴 구균의 표면 단백질 PspA [51], 폐렴구균용혈소 [52], 철-흡수 단백질 [53], 씨.디피실레 (C.difficile)의 독소 A 또는 B [54], 재조합 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 외부 단백질 A (rEPA) [55], GBS 단백질 (하기 참조; 특히 GBS67) [206], 등을 포함한다.
담체에 부착은 바람직하게, 예를 들어, 담체 단백질의 리신 잔기의, 또는 아르기닌 잔기의 측쇄에서, 또는 N 말단에서, -NH2 기를 통해서 부착된다. 부착은 또한, 예를 들어, 시스테인 잔기의 측쇄에서, -SH 기를 통해서 부착될 수도 있다.
예를 들어, 담체 억제의 위험을 감소시키기 위해, 하나 이상의 담체 단백질을 사용하는 것이 가능하다. 따라서 다른 담체 단백질은 다른 GBS 혈청형에 사용될 수 있으며, 예를 들어, 혈청형 Ia 당류는 CRM 197에 접합될 수도 있는 한편, 혈청형 Ib 당류는 테타누스 변성 독소에 접합될 수도 있다. 특정 당류 항원을 위해 하나 이상의 담체를 사용하는 것이 가능하며, 예를 들어, 혈청형 III 당류는 CRM 197에 접합된 일부 및 테타누스 변성 독소에 접합된 다른 것들을 갖는, 두 개의 그룹에 있을 수도 있다. 하지만, 일반적으로 모든 당류에 대하여 같은 담체 단백질을 사용하는 것이 바람직하다.
단일 담체 단백질은 하나 이상의 당류 항원을 운반할 수도 있다 [56, 57]. 예를 들어, 단일 담체 단백질은 혈청형 Ia 및 Ib의 당류를 그것에 접합시킬 수도 있다. 이 목표를 달성하기 위해, 다른 당류는 접합 반응 이전에 혼합될 수 있다. 하지만, 일반적으로, 각각의 혈청군에 대한 별도의 접합체를 갖는 것이 바람직하며, 다른 당류는 접합 후에 혼합된다. 별도의 접합체는 같은 담체에 기초할 수도 있다.
1:5 (즉, 과도한 단백질) 내지 5:1 (즉, 과도한 당류), 특히 1:5 내지 2:1의 당류:단백질 중량비를 갖는 접합체가 전형적으로 사용된다. 본 발명이 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ia의 캡슐형 당류인 접합체를 사용할 때, 당류:단백질 중량비는 전형적으로 약 1:1 내지 1:2, 특히 약 1:1.3이다. 유사하게, 본 발명이 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 III의 캡슐형 당류인 접합체를 사용할 때, 당류:단백질 중량비는 전형적으로 약 3:1 내지 1:1, 특히 약 2:1이다. 하지만, 약 1:1 내지 1:5, 특히 약 1:3.3의 당류:단백질 중량비를 갖는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 III가 또한 사용될 수도 있다. 최종적으로, 본 발명은 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 V의 캡슐형 당류인 접합체를 사용할 때, 비율은 전형적으로 약 2:1 내지 1:1, 특히 약 1.1:1이다. 따라서 당류의 중량 초과는 전형적이며, 특히 더 긴 당류 사슬을 갖는다.
조성물은 소량의 자유 담체를 포함할 수도 있다 [58]. 특정 담체 단백질이 본 발명의 조성물에서 자유로운 및 접합된 형태로 존재할 때, 전체적으로 비접합된 형태는 바람직하게 조성물의 담체 단백질의 총량의 5% 이하이고, 더 바람직하게는 2 중량% 미만으로 존재한다.
접합 후에, 자유 및 접합된 당류는 분류될 수 있다. 소수성 크로마토그래피, 접선 초여과, 투석여과 등을 포함하는, 많은 적합한 방법들이 있다 [참고문헌 59 & 60, 등 또한 참조]. 바람직한 방법은 참고문헌 61에 설명된다.
본 발명의 조성물이 탈폴리머화된 올리고당을 포함하는 경우, 탈폴리머화가 접합에 선행하는 것이 바람직하다.
접합체 및 다른 항원의 조합
본 발명의 면역원성 조성물은 하나 이상의 추가의 항원을 포함할 수도 있다.
추가의 항원(들)은 추가의 GBS 접합체를 포함할 수도 있다. 다른 GBS 접합체는 같은 GBS 혈청형의 접합체 및/또는 다른 GBS 혈청형의 접합체의 다른 타입을 포함할 수도 있다. 조성물은 전형적으로 별도의 접합체 (예를 들어, 각각의 혈청형에 대한 다른 접합체)를 제조하고 그때 접합체를 결합시킴으로써 생성될 것이다.
하기 설명된 바와 같이, 추가의 항원(들)은 GBS 아미노산 서열을 포함할 수도 있다.
추가의 항원(들)은 비-GBS 병원체의 항원을 포함할 수도 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 추가의 박테리아, 바이러스 또는 기생충 항원을 포함하는, 하나 이상의 비-GBS 항원을 더 포함할 수도 있다. 이것들은 다음으로부터 선택될 수도 있다:
- 참고문헌 62 내지 68의 것들과 같은, 엔.메닝기티디스 혈청군 B의 단백질 항원으로서, 단백질 '287' (하기 참조) 및 유도체 (예를 들어, 'AG287')가 특히 바람직한 단백질 항원.
- 참고문헌 69, 70, 71, 72 등에 개시된 것들과 같은, 엔.메닝기티디스 혈청군 B의 외막 소낭 (OMV) 조제물.
- 혈청군 C의 참고문헌 72에 개시된 올리고당 또는 참고문헌 72의 올리고당과 같은, 메닝기티디스 혈청군 A, C, W135 및/또는 Y의 당류 항원.
- 스트렙토코쿠스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)의 당류 항원 [예를 들어, 참고문헌 75-77; 참고문헌 84의 22 & 23장].
- 불활성화된 바이러스 [예를 들어, 78, 79; 참고문헌 84의 15장]와 같은, A형 간염 바이러스의 항원.
- 표면 및/또는 코어 항원 [예를 들어, 79, 80; 참고문헌 84의 16장]과 같은, B형 간염 바이러스의 항원.
- C형 간염 바이러스의 항원 [예를 들어, 81].
- 임의로 또한 퍼탁틴 및/또는 응집원 2 및 3과 조합된, 비.페르투시스의 페르투시스 완전독소 (PT) 및 사상 헤마글루티닌 (FHA)과 같은, 보르데텔라 페르투시스 (Bordetella pertussis)의 항원 [예를 들어, 참고문헌 82 & 83; 참고문헌 84의 21장].
- 디프테리아 변성 독소 [예를 들어, 참고문헌 84의 13장]와 같은, 디프테리아 항원.
- 테타누스 변성 독소 [예를 들어, 참고문헌 84의 27장]와 같은, 테타누스 항원.
- 헤모필루스 인플루엔재 B의 당류 항원 [예를 들어, 참고문헌 84의 14장].
- 엔.고노로애 (N. gonorrhoeae)의 항원 [예를 들어, 62, 63, 64].
- 클라미디아 뉴모니애 (Chlamydia pneumoniae)의 항원 [예를 들어, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91].
- 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis)의 항원 [예를 들어, 92].
- 포르피로모나스 진지발리스 (Porphyromonas gingivalis)의 항원 [예를 들어, 93].
- IPV와 같은 폴리오 항원(들) [예를 들어, 94, 95; 참고문헌 84의 24장].
- 동결건조 불활성화 바이러스 [예를 들어, 97, RabAvert™]와 같은, 라비 항원(들) [예를 들어, 96].
- 홍역, 볼거리 및/또는 풍진 항원 [예를 들어, 참고문헌 84의 19, 20 및 26장].
- 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 표면 단백질과 같은, 인플루엔자 항원(들) [예를 들어, 참고문헌 84의 17 & 18장].
- 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis)의 항원 [예를 들어, 98].
- 스트렙토코쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) (그룹 A 스트렙토코쿠스)의 항원 [예를 들어, 99, 100, 101].
- 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)의 항원 [예를 들어, 102].
당류 또는 탄수화물 항원이 사용된 경우, 그것은 바람직하게 면역원성을 향상시키기 위해 담체에 접합된다. 에이치.인플루엔재 B, 수막염균 및 폐렴구균 당류 항원이 잘 알려져 있다.
독성 단백질 항원은 필요한 경우 해독될 수도 있다 (예를 들어, 화학적 및/또는 유전적 방법에 의한 페르투시스 독소의 해독 [83]).
디프테리아 항원이 조성물에 포함된 경우, 또한 테타누스 항원 및 페르투시스 항원을 포함하는 것이 바람직하다. 유사하게, 테타누스 항원이 포함된 경우, 또한 디프테리아 및 페르투시스 항원을 포함하는 것이 바람직하다. 유사하게, 페르투시스 항원이 포함된 경우, 또한 디프테리아 및 테타누스 항원을 포함하는 것이 바람직하다.
항원은 알루미늄 염에 흡착될 수도 있다. 조성물에 하나 이상의 접합체가 있는 경우, 모든 접합체가 흡착될 필요는 없다.
바람직한 조성물의 한 타입은 헤르페스 바이러스; 엔.고노로애; 씨.트라코마티스; 등과 같은, 성감염성 병원체의 추가의 항원을 포함한다. 바람직한 조성물의 또 다른 타입은 고령자 및/또는 면역 저하된 대상에 영향을 미치는 추가의 항원을 포함하고, 그래서 본 발명의 GBS 항원은 다음 비-GBS 병원체의 하나 이상의 항원과 결합될 수 있다: 인플루엔자 바이러스, 엔테로코쿠스 파에칼리스 (Enterococcus faecalis), 스타필로코쿠스 아우레우스, 스타필로코쿠스 에피더미스 (Staphylococcus epidermis), 슈도모나스 애루기노사, 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 리스테리아 모노시토게네스 (Listeria monocytogenes), 네이세리아 메닝기티디스 (Neisseria meningitidis), 및 파라인플루엔자 바이러스.
조성물에서 항원은 전형적으로 각각 적어도 1μg/ml의 농도로 존재할 것이다. 일반적으로, 어느 특정 항원의 농도는 항원에 대한 면역 반응을 이끌어내기에 충분할 것이다.
본 발명의 조성물에서 단백질 항원의 사용에 대한 대안으로서, 항원을 암호화하는 핵산이 사용될 수도 있다 [예를 들어, 참고문헌 103 내지 111]. 따라서 본 발명의 조성물의 단백질 성분은 단백질을 암호화하는 핵산 (바람직하게, 예를 들어, 플라스미드의 형태인 DNA)에 의해 대체될 수도 있다.
실행 기간에, 본 발명의 조성물에 포함된 항원의 수에 대한 상한이 있을 수도 있다. 본 발명의 조성물에서 항원 (GBS 항원을 포함)의 수는 20 미만, 19 미만, 18 미만, 17 미만, 16 미만, 15 미만, 14 미만, 13 미만, 12 미만, 11 미만, 10 미만, 9 미만, 8 미만, 7 미만, 6 미만, 5 미만, 4 미만, 3, 또는 2 미만일 수도 있다. 본 발명의 조성물에서 GBS 항원의 수는 6 미만, 5 미만, 4 미만, 3, 또는 2 미만일 수도 있다.
약학적 방법 및 이용
본 발명의 면역원성 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수도 있다. 전형적인 '약학적으로 허용 가능한 담체'는 자체로 조성물을 받는 개인에게 해로운 항체의 생산을 유도하지 않는 어떤 담체도 포함한다. 적합한 담체는 단백질, 다당류, 폴리락틱산, 폴리글리콜산, 폴리머 아미노산, 아미노산 코폴리머, 수크로스 [112], 트레할로스 [113], 락토스, 및 지질 응집체와 같은 (오일 방울 또는 리포솜과 같은), 전형적으로 크고, 천천히 대사되는 거대분자이다. 이러한 담체는 당업자에게 잘 알려져 있다. 백신은 또한 물, 식염수, 글리세롤, 등과 같은, 희석액을 함유할 수도 있다. 추가로, 습윤제 또는 에멀젼화제, pH 완충 물질, 등과 같은, 보조 물질이 존재할 수도 있다. 멸균 발열물질이 없고, 포스페이트-완충된 생리 식염수는 전형적인 담체이다. 약학적으로 허용 가능한 첨가제의 완벽한 논의는 참고문헌 114에서 이용 가능하다.
본 발명의 조성물은 수성 형태 (즉, 용액 또는 현탁액) 또는 건조된 형태 (예를 들어, 동결건조)로 있을 수도 있다. 건조된 백신이 사용되면, 그때 그것은 주사 전에 액체 배지로 재구성될 것이다. 접합체 백신의 동결건조는 업계에 알려져 있고, 예를 들어, Menjugate™ 제품이 동결건조된 형태로 나타난다. 본 발명의 면역원성 조성물은 하나 이상의 GBS 혈청형의 캡슐형 당류를 포함하는 접합체를 포함할 때, 접합체가 별도로 제작되고, 혼합되고 이후 동결건조되는 것이 일반적이다. 이 방법으로, 두 개, 세 개 또는 네 개 등의 접합체를 포함하는 동결건조된 조성물이 여기에 설명된 바와 같이 제조될 수도 있다. 동결건조 중에 접합체를 안정화하기 위해, 조성물에, 예를 들어, 1 mg/ml 내지 30 mg/ml (예를 들어, 약 25 mg/ml)로 당 알콜 (예를 들어, 만니톨) 및/또는 이당류 (예를 들어, 수크로스 또는 트레할로스)를 포함하는 것이 바람직할 수도 있다. GBS 접합체 백신의 안정화제로서 수크로스의 사용이 추천되었다 (참고문헌 115). 하지만, 본 발명의 안정화제가 만니톨인 것이 일반적이다. 건조 백신이 주사 이전에 액체 배지로 재구성될 때, 잔류 만니톨의 농도는 전형적으로 약 2-20mg/ml, 예를 들어, 3.75mg/ml, 7.5mg/ml 또는 15mg/ml일 것이다. 만니톨이 GBS 캡슐형 당류의 단당류 서브유닛과는 화학적으로 다르기 때문에 만니톨의 사용이 유리하다. 이것은, 예를 들어, 품질 관리 분석을 위한 캡슐형 당류의 검출이 만니톨의 간섭 없이 당류의 서브유닛의 존재에 기초할 수 있다는 것을 의미한다. 반대로, 수크로스 같은 안정화제는 글루코스를 함유하며, 이것은 당류에서 글루코스 서브유닛의 검출을 방해할 수도 있다.
조성물은 바이알에 존재할 수도 있거나, 그것들은 미리 채워진 주사기에 존재할 수도 있다. 주사기는 바늘과 함께 또는 없이 제공될 수도 있다. 주사기는 조성물의 일회 용량을 포함하는 반면에, 바이알은 일회 용량 또는 다회수 용량을 포함할 수도 있다.
본 발명의 수성 조성물은 또한 동결건조 형태에서 다른 백신을 재구성하는데 적합하다. 본 발명의 조성물은 이러한 즉석의 재구성에 사용될 것인 경우, 본 발명은 키트를 제공하며, 이것은 두 개의 바이알을 포함할 수도 있거나, 하나의 미리 채워진 주사기 및 하나의 바이알을 포함할 수도 있고, 주사기의 내용물은 주사 이전에 바이알의 내용물을 재활성화하는데 사용된다.
본 발명의 조성물은 단위 용량 형태로 또는 다회수 용량 형태로 포장될 수도 있다. 다회수 투여 형태를 위해, 바이알은 미리 채워진 주사기가 바람직하다. 유효한 용량은 통상적으로 확립될 수 있지만, 조성물의 전형적인 사람 용량은, 예를 들어, 근육 내 주사를 위해 0.5 ml의 부피를 갖는다.
조성물의 pH는 바람직하게 6 내지 8, 바람직하게 약 7이다. 안정한 pH는 완충액의 사용에 의해 유지될 수도 있다. 본 발명의 면역원성 조성물은 전형적으로 칼륨 이수소 포스페이트 완충액을 포함한다. 칼륨 이수소 포스페이트 완충액은 약 1-10 mM, 예를 들어, 1.25 mM, 2.5 mM 또는 5.0 mM 칼륨 이수소 포스페이트를 포함할 수도 있다. 조성물이 알루미늄 히드록시드를 포함하면, 히스티딘 완충액을 사용하는 것이 바람직하다 [116]. 조성물은 멸균되고 및/또는 발열물질이 없을 수도 있다. 본 발명의 조성물은 사람에 관하여 등장성일 수도 있다.
본 발명의 조성물은 면역원성이고, 더 바람직하게는 백신 조성물이다. 본 발명에 따르는 백신은 예방적 (즉, 감염을 방지하기 위해) 또는 치료적 (즉, 감염을 치료하기 위해)이지만, 전형적으로 예방적이다. 백신으로 사용된 면역원성 조성물은, 필요한 만큼, 면역학적으로 유효량의 항원(들), 뿐만 아니라 어떤 다른 성분들도 포함한다. '면역학적으로 유효량'에 의해, 개개에, 일회 용량으로 또는 연속 용량의 일부로서, 그 양의 투여는 치료 또는 방지에 효과적이다. 이 양은 치료되는 개개의 건강 및 육체적 조건, 나이, 치료되는 개개의 분류학적 그룹 (예를 들어, 비-사람 영장류, 영장류, 등), 개개의 면역계의 항체를 합성하는 능력, 원하는 보호의 정도, 백신의 제형, 치료하는 의사의 의학적 상황의 평가, 및 다른 적절한 인자에 의존하여 달라진다. 그 양은 통상적인 실험을 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 빠질 것이 예상된다.
각각의 용량 내에, 개개의 당류 항원의 양은 일반적으로 0.1-50 μg (당류의 질량으로서 측정됨), 특히 1-50 μg 또는 0.5-25 μg, 더 특히 2.5-7.5 μg, 예를 들어, 약 1 μg, 약 2.5 μg, 약 5 μg, 약 10 μg, 약 15 μg, 약 20 μg 또는 약 25 μg일 것이다. 각각의 용량 내에, GBS 캡슐형 당류의 총량은 일반적으로 70 μg 이하 (당류의 질량으로서 측정됨), 예를 들어, 60 μg 이하일 것이다. 특히, 총량은 40 μg 이하 (예를 들어, 30 μg 이하) 또는 20 μg 이하 (예를 들어, 15 μg 이하)일 수도 있다. 발명자는, 특히 면역원성 조성물이 a) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ia의 캡슐형 당류인 접합체; b) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ib의 캡슐형 당류인 접합체; 및 c) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 III의 캡슐형 당류인 접합체를 포함할 때, 이들 총량들이 유효하다는 것을 발견하였다. 그러므로 이들 총량은 본 발명에서 사용에서, 특히 이 구체예에 바람직하다. 잠재적인 독성을 감소시키기 위해 단위 용량 당 캡슐형 당류(들)의 총량을 최소화하는 것이 유리할 수도 있다. 따라서, 20 μg 이하, 예를 들어, 15 μg 이하, 7.5 μg 이하 또는 1.5 μg 이하의 총량이 바람직하다.
GBS는 신체의 다양한 영역에 영향을 미치고 그래서 본 발명의 조성물은 다양한 형태로 제조될 수도 있다. 예를 들어, 조성물은 주사 가능한, 액체 용액 또는 현탁액으로 제조될 수도 있다. 조성물은 미세 분말 또는 스프레이를 사용하여, 폐 투여를 위해, 예를 들어, 흡입기로 제조될 수도 있다. 조성물은 좌약 또는 질좌약으로 제조될 수도 있다. 조성물은 비강, 귀 또는 안구 투여를 위해, 예를 들어, 스프레이, 방울, 겔 또는 분말로 제조될 수도 있다 [예를 들어, 참고문헌 117 & 118]. 폐렴 구균 당류 [119, 120], Hib 당류 [121], MenC 당류 [122], 및 Hib 및 MenC 당류 접합체의 혼합물 [123]의 비강 투여로의 성공이 보고되었다.
본 발명의 조성물은, 특히 다회수 용량 포맷으로 포장될 때, 항미생물제를 포함할 수도 있다.
본 발명의 조성물은 세제, 예를 들어, Tween 80과 같은, Tween (폴리소르베이트)을 포함할 수도 있다. 세제는 일반적으로 낮은 수준, 예를 들어, 0.01% 이하로 존재한다.
본 발명의 조성물은 장력 (tonicity)을 제공하기 위해 나트륨 염 (예를 들어, 염화나트륨)을 포함할 수도 있다. 10 ± 2 mg/ml NaCl의 농도가 일반적이다. 일부 구체예에서, 4-10 mg/ml NaCl의 농도, 예를 들어, 9.0, 7.0, 6.75 또는 4.5 mg/ml이 사용될 수도 있다.
본 발명의 조성물은 일반적으로 완충액을 포함할 것이다. 포스페이트 완충액이 일반적이다.
본 발명의 조성물은 다른 면역 조절 시약과 함께 투여될 수도 있다. 특히, 조성물은 하나 이상의 보조제를 포함할 수도 있다. 이러한 보조제는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다:
A.미네랄 함유 조성물
본 발명에서 보조제로서 사용에 적합한 미네랄 함유 조성물은 알루미늄 염 및 칼슘 염 (또는 이들의 혼합물)과 같은, 미네랄 염을 포함한다. 칼슘 염은 칼슘 포스페이트 (예를 들어, 참고문헌 124에 개시된 "CAP" 입자)를 포함한다. 알루미늄 염은 히드록시드, 포스페이트, 술페이트, 등을 포함하며, 염들은 어떤 적합한 형태 (예를 들어, 겔, 결정, 무정형, 등)를 취한다. 이들 염에 흡착이 바람직하다. 미네랄 함유 조성물은 또한 금속염의 입자로서 조제될 수도 있다 [125].
알루미늄 히드록시드 및 알루미늄 포스페이트로 알려진 보조제가 사용될 수도 있다. 이들 이름들은 둘 다가 존재하는 실제 화학적 화합물의 명확한 설명이 아니기 때문에, 관습적이지만, 편의를 위해서만 사용된다 (예를 들어, 참고문헌 126의 9장 참조). 본 발명은 일반적으로 보조제로서 사용되는 "히드록시드" 또는 "포스페이트" 보조제 중 어느 것도 이용할 수 있다. "알루미늄 히드록시드"로 알려진 보조제는 전형적으로 알루미늄 옥시히드록시드이며, 이것은 보통 적어도 부분적으로 결정이다. "알루미늄 포스페이트"로 알려진 보조제는 전형적으로 알루미늄 히드록시드포스페이트이며, 또한 소량의 술페이트 (즉, 알루미늄 히드록시드포스페이트 술페이트)를 종종 함유한다. 그것들은 침전에 의해 얻을 수도 있고, 침전 중에 반응 조건 및 농도는 염에서 히드록실에 대한 포스페이트의 치환의 정도에 영향을 미친다.
섬유 형태 (예를 들어, 투과 전자 미크로그래프에서 보이는 바와 같음)는 알루미늄 히드록시드 보조제가 전형적이다. 알루미늄 히드록시드 보조제의 pi는 전형적으로 약 11이다, 즉, 보조제 자체는 생리학적 pH에서 표면 양전하를 갖는다. 알루미늄 히드록시드 보조제에 대하여 pH 7.4에서 mg Al+++ 당 1.8-2.6 mg 단백질의 흡착력이 보고되었다.
알루미늄 포스페이트 보조제는 일반적으로 0.3 내지 1.2, 바람직하게 0.8 내지 1.2, 및 더 바람직하게는 0.95 ± 0.1의 PO4/Al 분자비를 갖는다. 알루미늄 포스페이트는 일반적으로, 특히 히드록시드포스페이트에 대해 무정형일 것이다. 전형적인 보조제는 0.6 mg Al3 +/ml에서 포함되는 0.84 내지 0.92의 PO4/Al 분자비를 갖는 무정형 알루미늄 히드록시드포스페이트이다. 알루미늄 포스페이트는 일반적으로 입자성 (예를 들어, 투과 전자 미크로그래프에서 보이는 바와 같이 판 모양)일 것이다. 어떤 항원 흡착 후에 입자의 전형적인 직경은 0.5-20 μm (예를 들어, 약 5-10 μm)의 범위에 있다. 알루미늄 포스페이트 보조제에 대하여 mg Al+++ 당 0.7-1.5 mg 단백질의 흡착력이보고되었다.
알루미늄 포스페이트의 영전하점 (PZC)은 히드록실에 대한 포스페이트의 치환의 정도에 반비례하고, 이 치환의 정도는 반응 조건 및 침전에 의해 염을 제조하기 위해 사용된 반응물의 농도에 의존하여 달라질 수 있다. PZC는 또한 용액에서 자유 인산 이온의 농도를 변화시킴으로써 (더 많은 포스페이트 = 더 산성인 PZC) 또는 히스티딘 완충액과 같은 완충액을 추가함으로써 (PZC를 더 염기성으로 만든다) 달라진다. 본 발명에 따라 사용된 알루미늄 포스페이트는 일반적으로 4.0 내지 7.0, 더 바람직하게는 5.0 및 6.5, 예를 들어, 5.7의 PZC를 가질 것이다.
본 발명의 조성물을 제조하는데 사용된 알루미늄 염의 현탁액은 완충액 (예를 들어, 포스페이트 또는 히스티딘 또는 트리스 완충액)을 함유할 수도 있지만, 이것은 항상 필요하지 않다. 현탁액은 바람직하게 멸균상태이고 발열물질이 없다. 현탁액은, 예를 들어, 1.0 및 20 mM, 바람직하게 5 내지 15 mM, 및 더 바람직하게는 약 10 mM의 농도로 존재하는 자유 수성 인산 이온을 포함할 수도 있다. 현탁액은 또한 염화 나트륨을 포함할 수도 있다.
본 발명은 알루미늄 히드록시드 및 알루미늄 포스페이트 둘 다의 혼합물을 사용할 수 있다. 이 경우에서 히드록시드보다 더 많은 알루미늄 포스페이트, 적어도 2:1, 예를 들어, 5:1 이상, 6:1 이상, 7:1 이상, 8:1 이상, 9:1 이상, 등의 중량비가 있을 수도 있다.
환자에게 투여용 조성물에서 Al+++의 농도는 바람직하게 10 mg/ml 미만, 예를 들어, 5 mg/ml 이하, 4 mg/ml 이하, 3 mg/ml 이하, 2 mg/ml 이하, 1 mg/ml 이하, 등이다. 바람직한 범위는 0.3 내지 1 mg/ml이다. 최대의 0.85 mg/투여가 바람직하다.
전형적인 보조제 알루미늄 포스페이트 보조제는 0.6 mg Al3 +/ml에서 포함되는, 0.84 내지 0.92의 PO4/Al 분자비를 갖는 무정형 알루미늄 히드록시드포스페이트이다. 낮은 용량, 예를 들어, 용량 당 접합체 당 50 내지 100 μg Al3 +의 알루미늄 포스페이트로 흡착이 사용될 수도 있다.
B.오일 에멀젼
본 발명에서 보조제로서 사용에 적합한 오일 에멀젼 조성물은 MF59 (5% 스쿠알렌, 0.5% Tween 80, 및 0.5% Span 85, 미크로유동화기를 사용하여 서브미크론 입자로 조제됨)와 같은, 스쿠알렌-물 에멀젼을 포함한다 [참고문헌 126의 10장; 또한 참고문헌 127-129 참조]. MF59는 FLU AD™ 인플루엔자 바이러스 3가 서브유닛 백신에서 보조제로서 사용된다.
조성물에 사용되는 특히 바람직한 보조제는 서브미크론 수중유 에멀젼이다. 여기에서 사용되는 바람직한 서브미크론 수중유 에멀젼은 4-5 중량% 스쿠알렌, 0.25-1.0 중량% Tween 80 (폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올리에이트), 및/또는 0.25-1.0% Span 85 (소르비탄 트리올리에이트), 및, 임의로, 엔-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포포릴옥시)-에틸아민 (MTP-PE)을 함유하는 서브미크론 수중유 에멀젼과 같은, 임의로 다른 양의 MTP-PE를 함유하는 스쿠알렌/물 에멀젼이다.
조성물에 사용되는 서브미크론 수중유 에멀젼, 같은 것을 만드는 방법 및, 무라밀 펩티드와 같은, 면역자극제는 참고문헌 127 & 130-131에서 상세히 설명된다.
완전 프로인트 보조제 (Complete Freund's 보조제; CFA) 및 불완전 프로인트 보조제 (IFA)는 또한 본 발명에서 보조제로서 사용될 수도 있다.
C.사포닌 조제물 [참고문헌 126의 22장]
사포닌 조제물은 또한 본 발명에서 보조제로서 사용될 수도 있다. 사포닌은 다양한 식물 종의 나무 껍질, 잎, 줄기, 뿌리 및 꽃에서도 발견된 스테롤 글리코시드 및 트리터페노이드 글리코시드의 이종 기원의 그룹이다. 퀼라야 사포나리아 몰리나 (Quillaia saponaria Molina) 나무의 껍질에서 분리된 사포닌은 보조제로서 널리 연구되었다. 사포닌은 또한 상업적으로 스밀락스 오르나타 (Smilax ornata) (사르사파릴라 (sarsaprilla)), 집소필라 파니쿨라타 (Gypsophilla paniculata) (브라이드 베일 (brides veil)), 및 사포나리아 오피시아날리스 (Saponaria officianalis) (소프루트 (soap root))에서 얻을 수 있다. 사포닌 보조제 조제물은 QS21과 같은, 정제된 조제물, 뿐만 아니라 ISCOM과 같은, 지질 조제물을 포함한다.
사포닌 조성물은 HPLC 및 RP-HPLC를 사용하여 정제되었다. QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B 및 QH-C를 포함하는, 이들 기술들을 사용하여 특이적 정제된 일부가 확인되었다. 바람직하게는, 사포닌은 QS21이다. QS21의 생산 방법은 참고문헌 132에 개시된다. 사포닌 조제물은 또한 콜레스테롤과 같은, 스테롤을 포함할 수도 있다 [133].
사포닌 및 콜레스테롤의 조합은 면역자극 복합체 (ISCOM)로 불리는 독특한 입자를 형성하는데 사용될 수 있다 [참고문헌 126의 23장]. ISCOM은 전형적으로 또한 포스파티딜에탄올아민 또는 포스파티딜콜린과 같은 인지질을 포함한다. 어떤 알려진 사포닌도 ISCOM에 사용될 수 있다. 바람직하게도, ISCOM은 하나 이상의 Quila, QHA 및 QHC를 포함한다. ISCOM은 참고문헌 133-135에 더 설명된다. 임의로, ISCOM은 추가적인 세제(들)이 없을 수도 있다 [136].
보조제 기반의 사포닌의 개발의 재검토는 참고문헌 137 & 138에서 발견될 수 있다.
D. 비로솜 및 바이러스-유사 입자
비로솜 및 바이러스-유사 입자 (VLP)는 또한 본 발명에서 보조제로서 사용될 수 있다. 이들 구조체는 일반적으로 임의로 인지질과 결합되거나 그것으로 조제된 바이러스의 하나 이상의 단백질을 함유한다. 그것들은 일반적으로 비-병원성, 비-복제성이고 일반적으로 원래의 바이러스 게놈의 어느 것도 함유하지 않는다. 바이러스 단백질은 재조합에 의해 생성되거나 전체 바이러스로부터 분리될 수도 있다. 비로솜 또는 VLP에서 사용에 적합한 이들 바이러스 단백질들은 인플루엔자 바이러스 (예를 들어, HA 또는 NA), B형 간염 바이러스 (코어 또는 캡시드 단백질), E형 간염 바이러스, 홍역 바이러스, 신드비스 바이러스 (Sindbis virus), 로타바이러스 (Rotavirus), 구제역 바이러스 (Foot-and-Mouth Disease virus), 레트로바이러스 (Retrovirus), 노르워크 바이러스 (Norwalk virus), 인유두종 바이러스 (human Papilloma virus), HIV, RNA-파지, QB-파지 (예를 들어, 코트 단백질), GA-파지, fr-파지, AP205 파지, 및 Ty (예를 들어, 레트로트랜스포손 Ty 단백질 pi)로부터 유도되는 단백질을 포함한다. VLP는 참고문헌 139-144에서 더 논의된다. 비로솜은, 예를 들어, 참고문헌 1455에서 더 논의된다.
E.박테리아 또는 미생물 유도체
본 발명에서 사용에 적합한 보조제는 장내 세균 지질 다당류 (LPS)의 비-독성 유도체, 지질 A 유도체, 면역 자극 올리고뉴클레오티드 및 ADP-리보실화 독소 및 이들의 해독된 유도체와 같은 박테리아 또는 미생물 유도체를 포함한다.
LPS의 비-독성 유도체는 모노포스포릴 지질 A (MPL) 및 3-O-탈아실화된 MPL (3dMPL)을 포함한다. 3dMPL은 탈-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A와 4, 5 또는 6개의 아실화된 사슬의 혼합물이다. 탈-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A의 바람직한 "작은 입자" 형태는 참고문헌 146에서 개시된다. 3dMPL의 이러한 "작은 입자"는 0.22 μm 막을 통해 멸균 여과될 정도로 충분히 작다 [146]. 다른 비-독성 LPS 유도체는 아미노알킬 글루코사미니드 포스페이트 유도체, 예를 들어, RC-529와 같은, 모노포스포릴 지질 A 미믹을 포함한다 [147, 148].
지질 A 유도체는 OM-174과 같은 대장균의 지질 A의 유도체를 포함한다. OM-174는, 예를 들어, 참고문헌 149 & 150에서 설명된다.
본 발명에서 보조제로서 사용에 적합한 면역 자극 올리고뉴클레오티드는 CpG 모티프를 함유하는 뉴클레오티드 서열 (구아노신에 포스페이트 결합에 의해 결합된 메틸화되지 않은 시토신을 함유하는 디뉴클레오티드 서열)을 포함한다. 이중-가닥 RNA 및 재발성 또는 폴리 (dG) 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드는 또한 면역 자극성인 것으로 나타났다.
CpG's는 포스포로티오에이트 변형과 같은 뉴클레오티드 변형/유사체를 포함할 수 있고 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다. 참고문헌 151, 152 및 153은 가능한 유사체 치환, 예를 들어, 구아노신을 2'-데옥시-7-데아자구아노신으로 대체를 개시한다. CpG 올리고뉴클레오티드의 보조 효과는 참고문헌 154-159에서 더 논의된다.
CpG 서열은 모티프 GTCGTT 또는 TTCGTT와 같은, TLR9에 관련될 수도 있다 [160]. CpG 서열은 CpG-A ODN과 같은, Th1 면역 반응을 유발하는데 특이적일 수도 있거나, 그것은 CpG-B ODN과 같은 B 세포 반응을 유발하는데 더 특이적일 수도 있다. CpG-A 및 CpG-B ODN은 참고문헌 161-163에 논의된다. 바람직하게도, CpG는 CpG-A ODN이다.
바람직하게도, CpG 올리고뉴클레오티드는 5' 말단이 수용체 인식을 위해 접근 가능하도록 구성된다. 임의로, 두 개의 CpG 올리고뉴클레오티드 서열은 "이뮤노머"를 형성하기 위해 그것들의 3' 말단에 부착될 수도 있다. 예를 들어, 참고문헌 160 & 164-166 참조.
박테리아 ADP-리보실화 독소 및 이들의 해독된 유도체는 본 발명에서 보조제로서 사용될 수도 있다. 바람직하게도, 단백질은 대장균 (대장균 열 불안정한 장내 독소 "LT"), 콜레라 (CT), 또는 페르투시스 ("PT")로부터 유도된다. 점막 보조제로서 해독된 ADP-리보실화 독소의 사용은 참고문헌 167에서 설명되고 비경구 보조제로서는 참고문헌 168에서 설명된다. 독소 또는 변성 독소는 바람직하게 완전독소의 형태로 있고 A 및 B 서브유닛 둘 다를 포함한다. 바람직하게도, A 서브유닛은 해독 돌연변이를 함유한다; 바람직하게 서브유닛은 돌연변이되지 않는다. 바람직하게도, 보조제는 LT-K63, LT-R72, 및 LT-G192와 같은 해독된 LT 돌연변이이다. 보조제로서 ADP-리보실화 독소 및 해독된 이들의 유도체, 특히 LT-K63 및 LT-R72의 사용은 참고문헌 169-176에서 발견될 수 있다. 아미노산 치환에 대한 숫자 참조는 바람직하게도 참고문헌 177에서 설명된 ADP-리보실화 독소의 A 및 B 서브유닛의 배열에 기초하며, 특이적으로 전문이 본원에 참고로 포함된다.
F.사람 면역조절기
본 발명에서 보조제로서 사용에 적합한 사람 면역조절기는 인터루킨 (예를 들어, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [178], 등) [179], 인터페론 (예를 들어, 인터페론-γ), 매크로파지 콜로니 자극 인자, 및 종양 괴사 인자와 같은, 시토킨을 포함한다
G.생체 접착제 및 점막 접착제
생체 접착제 및 점막 접착제는 또한 본 발명에서 보조제로서 사용될 수도 있다. 적합한 생체 접착제는 에스테르화된 히알루론산 미소구체 [180] 또는 폴리 (아크릴산), 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 다당류 및 카르복시메틸셀룰로스의 교차-결합된 유도체와 같은 점막 접착제를 포함한다. 키토산 및 이들의 유도체는 또한 본 발명에서 보조제로서 사용될 수도 있다 [181].
H.미세입자
미세입자는 또한 본 발명에서 보조제로서 사용될 수도 있다.
미세입자 (즉, 직경이 ~100 nm 내지 ~150 μm, 더 바람직하게는 직경이 ~200 nm 내지 ~30 μm, 및 가장 바람직하게는 직경이 ~500 nm 내지 ~10 μm인 입자)는 생분해성 및 비-독성인 물질 (예를 들어, 폴리 (α-히드록시산), 폴리히드록시부티르산, 폴리오르토에스테르, 폴리무수물, 폴리카프로락톤, 등)로부터 형성되며, 폴리 (락티드-코-글리콜리드)가 바람직하고, 음전하를 띈 표면 (예를 들어, SDS로) 또는 양전하를 띈 표면 (예를 들어, CTAB와 같은, 양이온성 세제로)을 갖도록 임의로 처리된다.
I.리포솜 (참고문헌 126의 13 & 14장)
보조제로서 사용에 적합한 리포솜 조제물의 예는 참고문헌 182-184에서 설명된다.
J. 폴리옥시에틸렌 에테르 및 폴리옥시에틸렌 에스테르 조제물
본 발명에서 사용에 적합한 보조제는 폴리옥시에틸렌 에테르 및 폴리옥시에틸렌 에스테르를 포함한다 [185]. 이러한 조제물들은 옥톡시놀과 결합된 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제 [186] 뿐만 아니라 옥톡시놀과 같은 적어도 하나의 추가적 비-이온성 계면활성제와 결합된 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 또는 에스테르 계면활성제 [187]를 더 포함한다. 바람직한 폴리옥시에틸렌 에테르는 다음 그룹으로부터 선택된다: 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르 (라우레쓰 9), 폴리옥시에틸렌-9-스테오릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-8-스테오릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-4-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-35-라우릴 에테르, 및 폴리옥시에틸렌-23-라우릴 에테르.
K. 폴리포스파젠 ( PCPP )
PCPP 조제물은, 예를 들어, 참고문헌 188 및 189에서 설명된다.
L. 무라밀 펩티드
본 발명에서 보조제로서 사용에 적합한 무라밀 펩티드의 예시는 N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP), N-아세틸-노르무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민 (nor-MDP), 및 N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2- (1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민 (MTP-PE)을 포함한다.
M. 이미다조퀴놀론 화합물
본 발명에서 보조제로서 사용에 적합한 이미다조퀴놀론 화합물의 예시는 Imiquamod 및 그것의 상동체 (예를 들어, "레시퀴모드 3M")을 포함하며, 참고문헌 190 및 191에서 더 설명된다.
N. 티오세미카르바존 화합물
티오세미카르바존 화합물의 예시, 뿐만 아니라 본 발명에서 보조제로서 사용에 모두 적합한 화합물을 조제, 제조, 및 선별하는 방법은 참고문헌 192에서 설명된 것들을 포함한다. 티오세미카르바존은 특히 TNF-α와 같은, 시토킨의 생산을 위해 사람 말초 혈액 단핵 세포의 자극에 효과적이다.
O. 트립탄트린 화합물
트립탄트린 화합물의 예시, 뿐만 아니라 본 발명에서 보조제로서 사용에 모두 적합한 화합물을 조제, 제조, 및 선별하는 방법은 참고문헌 193에서 설명된 것들을 포함한다. 트립탄트린은 특히 TNF-α와 같은, 시토킨의 생산을 위해 사람 말초 혈액 단핵 세포의 자극에 효과적이다.
본 발명은 또한 상기 확인된 보조제 중 하나 이상의 양태의 조합을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 다음 조합은 본 발명에서 보조제 조성물로서 사용될 수도 있다: (1) 사포닌 및 수중유 에멀젼 [194]; (2) 사포닌 (예를 들어, QS21) + 비-독성 LPS 유도체 (예를 들어, 3dMPL) [195]; (3) 사포닌 (예를 들어, QS21) + 비-독성 LPS 유도체 (예를 들어, 3dMPL) + 콜레스테롤; (4) 사포닌 (예를 들어, QS21) + 3dMPL + IL-12 (임의로 + 스테롤) [196]; (5) 3dMPL와, 예를 들어, QS21 및/또는 수중유 에멀젼의 조합 [197]; (6) 10% 스쿠알렌, 0.4% Tween 80™, 5% 플루로닉-블록 폴리머 L121, 및 thr-MDP를 함유하고, 서브미크론 에멀젼으로 미크로유동화되거나 더 큰 입자 크기 에멀젼을 발생시키기 위해 보텍스되는, SAF. (7) 모노포스포리지질 A (MPL), 트레할로스 디미콜레이트 (TDM), 및 세포벽 골격 (CWS), 바람직하게 MPL + CWS (Detox™)로 구성된 그룹으로부터 2% 스쿠알렌, 0.2% Tween 80, 및 하나 이상의 박테리아 세포벽 성분을 함유하는, Ribi™ 보조 시스템 (RAS), (Ribi Immunochem); 및 (8) 하나 이상의 미네랄 염 (예를 들어, 알루미늄 염) + LPS의 비-독성 유도체 (예를 들어, 3dMPL).
면역자극제로서 작용하는 다른 물질은 참고문헌 126의 7장에서 개시된다.
알루미늄 염 보조제의 사용은 특히 바람직하고, 항원은 일반적으로 이러한 염에 흡착된다. 본 발명의 조성물에서 일부 항원이 알루미늄 히드록시드에 흡착되지만 알루미늄 포스페이트와 연관된 다른 항원을 갖는 것이 가능하다. 하지만, 일반적으로, 단일 염, 예를 들어, 히드록시드 또는 포스페이트만을 사용하는 것이 바람직하지만 둘 다를 사용하는 것은 아니다. 모든 접합체가 흡착될 필요는 없다, 즉, 일부 또는 모든 것이 용액에서 자유로울 수 있다.
치료 방법
본 발명은 또한 본 발명의 약학적 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 증가시키는 방법을 제공한다. 면역 반응은 바람직하게 보호되고 바람직하게 항체를 수반한다. 방법은 촉진 반응을 증가시킬 수도 있다.
포유동물은 바람직하게 사람이다. 백신이 예방적 용도인 경우, 사람은 바람직하게 어린이 (예를 들어, 유아 또는 영유아) 또는 청소년이고; 백신이 치료적 용도인 경우, 사람은 바람직하게 어른이다. 어린이를 위한 백신은 또한, 예를 들어, 안전성, 용량, 면역원성 등을 평가하기 위해 어른에게 투여될 수도 있다. 치료를 위해 바람직한 사람의 클래스는 임신 가능한 나이 (예를 들어, 청소년 이상)의 여성이다. 또 다른 바람직한 클래스는 임신한 여성이다. 나이가 많은 환자들 (예를 들어, 50, 60, 70, 80 또는 90살 이상, 특히 65살 이상인 사람들), 특히, GBS 감염의 위험이 증가될 수 있는 요양원에 사는 사람들은 치료를 위해 바람직한 사람의 또 다른 클래스이다. 일부 구체예에서, 사람은 약학적 조성물의 투여 이전에 GBS 혈청형 Ia의 캡슐형 당류에 대한 검출 불가능한 수준의 항체를 갖는다. 다른 구체예에서, 사람은 약학적 조성물의 투여 이전에 GBS 혈청형 Ib의 캡슐형 당류에 대한 검출 불가능한 수준의 항체를 갖는다. 다른 구체예에서, 사람은 약학적 조성물의 투여 이전에 GBS 혈청형 III의 캡슐형 당류에 대한 검출 불가능한 수준의 항체를 갖는다. 특히, 사람은 약학적 조성물의 투여 이전에 GBS 혈청형 Ia의 캡슐형 당류에 대한 검출 불가능한 수준의 항체 및 GBS 혈청형 Ib의 캡슐형 당류에 대한 검출 불가능한 수준의 항체를 가질 수도 있다. 대안으로 또는 추가로, 사람은 약학적 조성물의 투여 이전에 GBS 혈청형 III의 캡슐형 당류에 대한 검출 불가능한 수준의 항체를 가질 수도 있다. 캡슐형 당류(들)에 대한 항체의 수준(들)은 하기 사람 연구 (1)에 설명된 ELISA를 사용하여 결정될 수도 있다. 항체의 수준(들)은 투여 이전에 한 개월 중에, 특히 투여 이전에 한 개월 내에 (예를 들어, 투여의 2주 내에, 1주 내에 또는 당일에) 있을 수도 있다. 캡슐형 당류(들)에 대한 이들 검출 불가능한 수준의 항체를 갖는 여성들은 그들의 신생아 시절에 더 높은 수준의 GBS 감염을 가질 수도 있다. 이것은 GBS 캡슐형 당류에 대한 더 높은 수준의 모체 항체가 신생아 시절에 감소된 위험의 질환과 연관되기 때문이다 [참고문헌 199 및 200]. 따라서, 본 발명에서 이들 여성들에게 투여는 특이적으로 예상된다.
일부 구체예에서, 환자는, 예를 들어, 섹션 사전-면역화된 환자에서 본 발명의 두 번째 양태에 관하여 하기 설명된 바와 같이, 디프테리아 변성 독소 또는 이들의 유도체로 사전-면역화되었다. 이들 구체예에서, 면역원성 조성물에서 적어도 하나의 접합체가 디프테리아 변성 독소 또는 이들의 유도체에 접합된 GBS의 캡슐형 당류인 것은 바람직하다. 발명자는 캡슐형 당류에 대한 면역 반응이 환자가 디프테리아 변성 독소 또는 이들의 유도체로 사전-면역화되었을 때, 디프테리아 변성 독소 또는 이들의 유도체에 당류를 제공함으로써 개선될 수도 있다는 것을 발견하였다. 조성물에서 디프테리아 변성 독소 또는 이들의 유도체에 접합된 캡슐형 당류는, 예를 들어, GBS 혈청형 Ia, Ib 또는 III의 것일 수도 있다. 특히, 캡슐형 당류는 GBS 혈청형 III의 것일 수도 있다 (하기 예시된 바와 같이). 이들 구체예에서, 조성물에서 GBS의 모든 캡슐형 당류가 디프테리아 변성 독소 또는 이들의 유도체에 접합되는 것이 일반적이다. 담체 또는 사전-면역화 항원이 디프테리아 변성 독소의 유도체인 경우, 그 유도체는 바람직하게 면역학적으로 Dt와 교차 반응을 유지하고, 바람직하게 CRM 197이다.
다른 구체예에서, 환자는, 예를 들어, 섹션 사전-면역화된 환자 및 테타누스 변성 독소 담체에서 본 발명의 두 번째 양태에 관하여 하기 설명된 바와 같이, 테타누스 변성 독소 또는 이들의 유도체로 사전-면역화되었다. 이들 구체예에서, 면역원성 조성물에서 적어도 하나의 접합체가 테타누스 변성 독소 또는 이들의 유도체에 접합된 GBS의 캡슐형 당류인 것은 바람직하다. 캡슐형 당류에 대한 면역 반응은 환자가 테타누스 변성 독소 또는 이들의 유도체로 사전-면역화되었을 때, 테타누스 변성 독소 또는 이들의 유도체에 당류를 제공함으로써 개선될 수도 있다. 조성물에서 테타누스 변성 독소 또는 이들의 유도체에 접합된 캡슐형 당류는, 예를 들어, GBS 혈청형 Ia, Ib 또는 III의 것일 수도 있다. 특히, 캡슐형 당류는 GBS 혈청형 III의 것일 수도 있다. 이들 구체예에서, 조성물에서 GBS의 모든 캡슐형 당류가 테타누스 변성 독소 또는 이들의 유도체에 접합되는 것이 일반적이다.
본 발명은 또한 약제로서 사용되는 본 발명의 조성물을 제공한다. 약제는 바람직하게 포유동물에서 면역반응을 증가시킬 수 있고 (즉, 그것은 면역원성 조성물이다) 더 바람직하게 백신이다.
본 발명은 또한 포유동물에서 면역 반응을 증가시키는 약제의 제조시 본 발명의 조성물의 사용을 제공한다.
이들 사용 및 방법은 바람직하게 에스.아갈락티애에 의해 유발된 질환, 예를 들어, 신생아 패혈증 (neonatal sepsis) 또는 균혈증 (bacteremia), 신생아 폐렴 (neonatal pneumonia), 신생아 수막염 (neonatal meningitis), 자궁내막염 (endometritis), 골수염 (osteomyelitis), 화농성 관절염 (septic arthritis), 등의 방지 및/또는 치료에 대한 것이다.
이 질환이 방지되는 대상체는 본 발명의 접합체를 수용하는 대상체와 같지 않을 수도 있다. 예를 들면, 접합체는 자손을 보호하기 위해 여성 (임신 전에 또는 중에)에게 투여될 수도 있다 (소위 '모체 면역화' [201-203]).
치료적 처치의 효능을 체크하는 한 방법은 본 발명의 조성물의 투여 후에 GBS 감염을 관찰하는 단계를 수반한다. 예방적 처치의 효능을 체크하는 한 방법은 조성물의 투여 후에 GBS 항원에 대한 면역 반응을 관찰하는 단계를 수반한다.
바람직한 본 발명의 조성물은 사람 대상체의 허용 가능한 퍼센트로 각각의 항원 성분에 대한 혈청 보호를 위해 기준보다 뛰어난 환자에서 항체 적정 농도를 수여할 수 있다. 숙주가 항원에 대하여 혈청 전환되는 것으로 생각되는 것 이상으로, 관련 항체 적정 농도를 갖는 항원이 잘 알려져 있고, 이러한 적정 농도는 WHO와 같은 기관에 의해 발표된다. 바람직하게 80% 이상, 더 바람직하게 90% 이상, 더 바람직하게는 93% 이상 및 가장 바람직하게는 96-100%의 통계적으로 유의한 대상체의 샘플은 혈청 전환된다. 본 발명의 조성물은 일반적으로 환자에게 직접 투여될 것이다. 직접 전달은 비경구 주사 (예를 들어, 피하로, 복강 내로, 정맥 내로, 근육 내로, 또는 조직 사이 공간으로), 또는 직장, 구강, 질, 국부적, 경피성, 비강 내, 안구, 귀, 폐 또는 다른 점막 투여에 의해 이루어질 수도 있다. 허벅지 또는 상부 팔에 근육 내 투여가 바람직하다. 주사는 바늘 (예를 들어, 피하 주사 바늘)을 통할 수도 있지만, 바늘-없는 주사가 대안으로 사용될 수도 있다. 전형적인 근육 내 용량은 0.5 ml이다.
본 발명은 전신 및/또는 점막 면역력을 이끌어내기 위해 사용될 수도 있다.
투약 치료는 일회 투여 계획 또는 다회수 투여 계획일 수도 있다. 다회수 투여는 1차 면역화 계획 및/또는 촉진 면역화 계획에 사용될 수도 있다. 1차 투여 계획은 촉진 투여 계획으로 이어질 수도 있다. 적합한 초기 투여 사이 (예를 들어, 4-16주), 및 초기 및 촉진 사이의 적합한 기간은 통상적으로 결정될 수 있다.
GBS 단백질 항원
상기 언급된 바와 같이, GBS 단백질은 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다. 이것들은 본 발명의 접합체에 대한 담체 단백질, 다른 접합체에 대한 담체 단백질, 또는 비접합 단백질 항원으로서 사용될 수도 있다.
본 발명에 사용되는 GBS 단백질 항원은 참고문헌 99 및 204-206에 개시된 것들을 포함한다. 본 발명에 사용되는 두 개의 바람직한 GBS 단백질 항원은 GBS67 및 GBS80로서 알려져 있다 [참고문헌 99 참조]. 본 발명에 사용되는 추가의 바람직한 GBS 단백질 항원은 Spb1으로 알려져 있다 [참고문헌 207 참조]. 이들 세 개의 항원의 더 상세한 설명은 하기 제공된다.
이들 세 개의 GBS 단백질에 대한 전체 길이 서열은 여기에서 SEQ ID NO: 1 내지 3이다. 따라서 본 발명의 조성물은 (a) SEQ ID NO: 1 내지 3으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및/또는 (b) (i) SEQ ID NO: 1 내지 3 중 하나 이상과 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및/또는 (ii) SEQ ID NO: 1 내지 3의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 조성물은 또한 이들 GBS 단백질 항원의 혼합물을 포함할 수도 있다.
특히, 본 발명의 조성물은 다음을 포함할 수도 있다:
(a1) SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및/또는 (b1) (i) SEQ ID NO: 1과 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및/또는 (ii) SEQ ID NO: 1의 단편을 포함하는 폴리펩티드; 및
(a2) SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및/또는 (b2) (i) SEQ ID NO: 2와 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및/또는 (ii) SEQ ID NO: 2의 단편을 포함하는 폴리펩티드.
유사하게, 본 발명의 조성물은 다음을 포함할 수도 있다:
(a1) SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및/또는 (b1) (i) SEQ ID NO: 1과 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및/또는 (ii) SEQ ID NO: 1의 단편을 포함하는 폴리펩티드; 및
(a2) SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및/또는 (b2) (i) SEQ ID NO: 3과 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및/또는 (ii) SEQ ID NO: 2의 단편을 포함하는 폴리펩티드.
같은 방법으로, 본 발명의 조성물은 다음을 포함할 수도 있다:
(a1) SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및/또는 (b1) (i) SEQ ID NO: 2와 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및/또는 (ii) SEQ ID NO: 1의 단편을 포함하는 폴리펩티드; 및
(a2) SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및/또는 (b2) (i) SEQ ID NO: 3과 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및/또는 (ii) SEQ ID NO: 2의 단편을 포함하는 폴리펩티드.
본 발명의 조성물은 다음을 포함할 수도 있다:
(a1) SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및/또는 (b1) (i) SEQ ID NO: 1과 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및/또는 (ii) SEQ ID NO: 1의 단편을 포함하는 폴리펩티드; 및
(a2) SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및/또는 (b2) (i) SEQ ID NO: 2와 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및/또는 (ii) SEQ ID NO: 2의 단편을 포함하는 폴리펩티드; 및
(a3) SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및/또는 (b3) (i) SEQ ID NO: 3과 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및/또는 (ii) SEQ ID NO: 2의 단편을 포함하는 폴리펩티드.
본 발명에 사용되는 세 개의 다른 바람직한 GBS 단백질 항원은 GBS104; GBS276; 및 GBS322로서 알려져 있다 [참고문헌 99 참조]. 혈청형 V 분리된 균주 2603 V/R의 야생형 GBS104 아미노산 서열은 참고문헌 21에서 SEQ ID NO: 3으로서 그 안에 제공된다. 본 발명의 구체예가 여기에서 SEQ ID NO: 1에 대한 참고로 한정된 경우, SEQ ID NO: 1에 대한 참고문헌은 참고문헌 21의 SEQ ID NO: 3에 대한 참고로 대체될 수도 있다. 혈청형 V 분리된 균주 2603 V/R의 야생형 GBS276 아미노산 서열은 참고문헌 21에서 SEQ ID NO: 4로서 그 안에 제공된다. 본 발명의 구체예가 여기에서 SEQ ID NO: 2에 대한 참고로 한정된 경우, SEQ ID NO: 2에 대한 참고문헌은 참고문헌 21의 SEQ ID NO: 4에 대한 참고로 대체될 수도 있다. 혈청형 V 분리된 균주 2603 V/R의 야생형 GBS322 아미노산 서열은 참고문헌 21에서 SEQ ID NO: 5로서 그 안에 제공된다. 본 발명의 구체예가 여기에서 SEQ ID NO: 3에 대한 참고로 한정된 경우, SEQ ID NO: 3에 대한 참고문헌은 참고문헌 21의 SEQ ID NO: 5에 대한 참고로 대체될 수도 있다.
특정 SEQ ID NO에 의존하여, (i)에서 서열 동일성의 정도는 바람직하게 50% 이상 (예를 들어, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)이다. 이들 폴리펩티드들은 상동체, 오솔로그, 대립 유전자 변이체 및 기능적 돌연변이를 포함한다. 전형적으로, 두 개의 폴리펩티드 서열 사이에서 50% 이상의 동일성은 기능적 등량을 나타내는 것으로 생각된다. 폴리펩티드 사이의 동일성은 바람직하게 파라미터 갭 오픈 패널티=12 및 갭 연장 패널티=1인 아핀 갭 (affine gap) 검색을 사용하여, MPSRCH 프로그램 (Oxford Molecular)에 주입된 바와 같이 Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘에 의해 결정된다.
특정 SEQ ID NO에 의존하여, (ii)의 단편은 서열로부터 적어도 n개의 연속된 아미노산을 포함해야 하고, 특정 서열에 의존하여, n은 7 이상 (예를 들어, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100이상)이다. 단편은 적어도 하나의 T-세포 또는, 바람직하게, 서열의 B-세포 에피토프를 포함할 수도 있다. T- 및 B-세포 에피토프는 경험적으로 (예를 들어, PEPSCAN [208, 209] 또는 유사한 방법을 사용하여) 확인될 수 있거나, 그것들은 예상될 수 있다 (Jameson-Wolf 항원 지수 [210], 매트릭스-기반 접근법 [211], TEPITOPE [212], 신경 네트워크 [213], OptiMer & EpiMer [214, 215], ADEPT [216], Tsites [217], 친수성 [218], 항원 지수 [219] 또는 참고문헌 220에 개시된 방법, 등을 사용하여). 다른 바람직한 단편은 그것들의 N-말단 아미노산 잔기가 없거나 그것들의 N-말단 신호 펩티드가 없는 SEQ ID NO: 1 내지 3이다. 선도 또는 신호 서열 영역, 막관통 영역, 세포질 영역 또는 세포벽 앵커링 모티프 (anchoring motif)와 같은, 하나 이상의 도메인의 제거가 사용될 수 있다. 특정 단백질의 바람직한 단편은 전체 길이 특정 단백질에 결합될 수 있는 항체에 결합될 수 있고, 예를 들어, SEQ ID NO: 1, 2 또는 3에 결합될 수 있는 항체에 결합될 수 있다. 일부 유용한 단편이 하기 제공된다 (SEQ ID NO: 4 내지 13).
세 개의 폴리펩티드는, SEQ ID NO: 1 내지 3에 비해, 하나 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 등) 연속적인 아미노산 대체, 즉, 하나의 아미노산의 관련된 측쇄를 갖는 또 다른 것으로의 대체를 포함한다. 유전적으로 암호화된 아미노산은 일반적으로 네 개의 과: (1) 산성, 즉, 아스파르테이트, 글루타메이트; (2) 염기성, 즉, 리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비-극성, 즉, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비전하 극성, 즉, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스틴, 세린, 트레오닌, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판으로 나누어지고, 티로신은 가끔 방향족 아미노산으로 공동으로 분류된다. 일반적으로, 이들 과에서 단일 아미노산의 치환은 생물학적 활성에 대하여 큰 영향을 갖지 않는다. 폴리펩티드는 또한 SEQ ID NO: 1 내지 3에 관하여 하나 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 등) 단일 아미노산 삭제를 포함할 수도 있다. 폴리펩티드는 또한 SEQ ID NO: 1 내지 3에 관하여 하나 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 등) 삽입 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 각각)을 포함할 수도 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 많은 방법으로, 예를 들어, 화학적 합성 (전체적으로 또는 부분적으로)에 의해, 프로테아제를 사용하여 더 긴 폴리펩티드를 합성함으로써, RNA로부터 번역에 의해, 세포 배양으로부터 (예를 들어, 재조합 발현으로부터) 정제에 의해, 유기체 그 자체로부터 (예를 들어, 박테리아 배양 후, 또는 환자로부터 직접), 등으로 제조될 수 있다. 40개의 아미노산 길이의 펩티드의 바람직한 생산 방법은 시험관 내 화학적 합성을 수반한다 [221, 222]. tBoc 또는 Fmoc [223] 화학법에 기초한 방법과 같은, 고체-단계 펩티드 합성이 특히 바람직하다. 효소 합성 [224]은 또한 부분적으로 또는 전체적으로 이용될 수도 있다. 화학적 합성에 대한 대안으로서, 생물학적 합성이 사용될 수도 있는데, 예를 들어, 폴리펩티드는 번역에 의해 생산될 수도 있다. 이것은 시험관 내 또는 생체 내에서 수행될 수도 있다. 생물학적인 방법은 일반적으로 L-아미노산에 기초한 폴리펩티드의 생산으로 제한되지만, 번역 기관 (예를 들어, 아미노아실 tRNA 분자 중에)의 조작은 D-아미노산 (또는 이오도티로신 또는 메틸페닐알라닌, 아지도호모알라닌, 등과 같은, 다른 비천연 아미노산)의 도입을 허용하기 위해 사용될 수 있다 [225]. 하지만, D-아미노산이 포함되는 경우, 화학적 합성을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 폴리펩티드는 C-말단 및/또는 N-말단에서 공유 변형을 가질 수도 있다.
이들 GBS 단백질들이 본 발명의 조성물에 포함되면, 그것들은 다양한 형태 (예를 들어, 원래, 융합, 글리코실화, 비-글릴코실화, 지질화, 비-지질화, 인산화, 비-인산화, 미리스토일레이트화, 비-미리스토일레이트화, 모노머, 멀티머, 입자성, 변성, 등)를 취할 수 있다. 그것들은 바람직하게 정제된 또는 실질적으로 정제된 형태, 즉, 다른 폴리펩티드로부터, 특히 다른 GBS 또는 숙주 세포 폴리펩티드로부터 실질적으로 자유로운 (예를 들어, 저절로 발생한 폴리펩티드로부터 자유로운) 형태로 사용된다.
GBS67
혈청형 V 균주 2603 V/R로부터 서열화된 GBS67의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 참고문헌 99에서 SEQ ID NO: 3745 & 3746으로서 설명된다. 아미노산 서열은 여기에서 SEQ ID NO: 1이다:
Figure pct00011
GBS67은 상기 SEQ ID NO: 1의 C-말단에 가장 가까운, 밑줄 친 영역에 의해 표시된 C-말단 막통과 영역을 함유한다. 막통과 영역에서 하나 이상의 아미노산이 제거될 수도 있거나, 아미노산은 막통과 영역 전에 절단될 수도 있다. 이러한 GBS67 단편의 예는 하기 SEQ ID NO: 4로서 설명된다.
Figure pct00012
GBS67은 세포벽 앵커를 나타내는 아미노산 모티프를 함유하며, 상기 SEQ ID NO: 1에서 이탤릭체로 나타낸다. 일부 재조합 숙주 세포 시스템에서, 숙주 세포에서 재조합 GBS67 단백질의 분비를 용이하게 하기 위해 이 모티프를 제거하는 것이 바람직할 수도 있다. 따라서, 본 발명에서 사용된 GBS67의 한 바람직한 단편에서, 막통과 및 세포벽 앵커 모티프는 GBS67로부터 제거된다. 이러한 GBS67 단편의 예는 하기 SEQ ID NO: 5로서 설명된다.
Figure pct00013
대안으로, 일부 재조합 숙주 세포 시스템에서, 재조합으로 발현된 단백질을 세포벽에 고정하기 위해 세포벽 앵커 모티프를 사용하는 것이 바람직할 수도 있다. 발현된 단백질의 세포 외 도메인은 정제 중에 분할될 수도 있거나 재조합 단백질은 최종 조성물에서 불활성화된 숙주 세포 또는 세포막에 부착된 채로 남아있을 수도 있다.
전환된 리신 잔기를 함유하는, 세 개의 필린 모티프는 GBS67에서 확인되었다. 전환된 리신 잔기는 아미노산 잔기 478 및 488에, 아미노산 잔기 340 및 342에, 및 아미노산 잔기 703 및 717에 있다. 필린 서열, 특히 전환된 리신 잔기는 GBS67의 올리고머, 섬모 (pilus)-유사 구조의 형성에 중요한 것으로 생각된다. GBS67의 바람직한 단편은 적어도 하나의 전환된 리신 잔기를 포함한다. 전환된 글루타민 잔기를 함유하는 두 개의 E 박스가 또한 GBS67에서 확인되었다. GBS67의 바람직한 단편은 적어도 하나의 전환된 글루탐산 잔기를 포함한다. GBS67은 알파 나선 구조를 형성하는 것으로 예측된 여러 영역을 함유한다. 이러한 알파 나선 영역은 또 꼬인 나선 (coiled-coil) 구조를 형성할 가능성이 있고 GBS67의 올리고머화에 수반될 수도 있다. GBS67은 또한 에스.아우레우스 콜라겐-결합 표면 단백질 (pfam05738)의 Cna_B 도메인에 상동인 영역을 함유한다. 이것은 베타 샌드위치 구조를 형성할 수도 있다. GBS67은 폰 빌레브란트 인자 (von Willebrand factor; vWF) 타입 A 도메인에 상동인 영역을 함유한다.
혈청형 Ib 균주 H36B로부터 서열화된 GBS67의 아미노산 서열은 참고문헌 226에서 SEQ ID NO: 20906으로서 설명된다. 아미노산 서열은 여기에서 SEQ ID NO: 24이다:
Figure pct00014
일부 구체예에서, GBS67의 이 변이가 사용될 수도 있다. 따라서, 본 발명의 구체예가 여기에서 SEQ ID NO: 1에 대한 참고로 한정된 경우, SEQ ID NO: 1에 대한 참고문헌은 SEQ ID NO: 24에 대한 참고로 대체될 수도 있다.
혈청형 V 균주 2603 V/R로부터 서열화된 GBS67과 같이, GBS67은 상기 SEQ ID NO: 24의 C-말단에 가장 가까운, 밑줄 친 영역에 의해 표시된 C-말단 막통과 영역을 함유한다. 막통과 영역에서 하나 이상의 아미노산이 제거될 수도 있거나, 아미노산은 막통과 영역 전에 절단될 수도 있다. 이러한 GBS67 단편의 예는 하기 SEQ ID NO: 25로서 설명된다.
Figure pct00015
혈청형 V 균주 2603 V/R로부터 서열화된 GBS67과 같이, 혈청형 Ib 균주 H36B로부터 서열화된 GBS67은 세포벽 앵커를 나타내는 아미노산 모티프를 함유하며, 상기 SEQ ID NO: 24에서 이탤릭체로 나타낸다. 따라서, 본 발명에서 사용된 GBS67의 한 바람직한 단편에서, 막통과 및 세포벽 앵커 모티프는 GBS67로부터 제거된다. 이러한 GBS67 단편의 예는 하기 SEQ ID NO: 26으로서 설명된다.
Figure pct00016
GBS80
GBS80은 추정상 세포벽 표면 앵커 과 단백질을 나타낸다. 혈청형 V 분리된 균주 2603 V/R로부터 서열화된 GBS80의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 참고문헌 99에서 SEQ ID NO: 8779 & 8780으로서 설명된다. 아미노산 서열은 하기 SEQ ID NO: 2로서 설명된다:
Figure pct00017
GBS80은 상기 밑줄 친 서열에 의해 표시된 N-말단 선도 또는 신호 서열 영역을 함유한다. GBS80의 선도 또는 신호 서열 영역의 하나 이상의 아미노산이 제거될 수 있다. 이러한 GBS80 단편의 예는 하기 SEQ ID NO: 6으로서 설명된다:
Figure pct00018
GBS80은 상기 SEQ ID NO: 2의 말단 근처에서 밑줄 친 서열에 의해 표시된 C-말단 막통과 영역을 함유한다. 막통과 영역 및/또는 세포질 영역의 하나 이상의 아미노산은 제거될 수도 있다. 이러한 단편의 예는 하기 SEQ ID NO: 7로서 설명된다:
Figure pct00019
GBS80은 상기 SEQ ID NO: 2에서 이탤릭체로 나타난 세포벽 앵커를 나타내는 아미노산 모티프를 함유한다. 일부 재조합 숙주 세포 시스템에서, 숙주 세포로부터 재조합 GBS80 단백질의 분비를 용이하게 하기 위해 이 모티프를 제거하는 것이 바람직할 수도 있다. 따라서 막통과 및/또는 세포질 영역 및 세포벽 앵커 모티프는 GBS80으로부터 제거될 수도 있다. 이러한 단편의 예는 하기 SEQ ID NO: 8로서 설명된다.
Figure pct00020
대안으로, 일부 재조합 숙주 세포 시스템에서, 재조합으로 발현된 단백질을 세포벽에 고정하기 위해 세포벽 앵커 모티프를 사용하는 것이 바람직할 수도 있다. 발현된 단백질의 세포 외 도메인은 정제 중에 분할될 수도 있거나 재조합 단백질은 최종 조성물에서 불활성화된 숙주 세포 또는 세포막에 부착된 채로 남아있을 수도 있다.
한 구체예에서, 선도 또는 신호 서열 영역, 막통과 및 세포질 영역 및 세포벽 앵커 모티프는 GBS80 서열로부터 제거된다. 이러한 GBS80 단편의 예는 하기 SEQ ID NO: 9로서 설명된다:
Figure pct00021
특히 GBS80의 면역원성 단편은 단백질의 N-말단에 위치되고, 여기에서 SEQ ID NO: 10으로서 제공된다:
Figure pct00022
Spb1
혈청형 III 균주 COH1의 야생형 Spb1 서열은 여기에서 SEQ ID NO: 3이다:
Figure pct00023
야생형 Spb1은 상기 밑줄 친 서열 (aa 1-29)에 의해 표시된 N-말단 선도 또는 신호 서열 영역을 함유한다. Spb1의 선도 또는 신호 서열 영역의 하나 이상의 아미노산은 제거될 수 있다. 이러한 Spb1 단편의 예는 하기 SEQ ID NO: 11로서 설명된다:
Figure pct00024
야생형 Spb1 서열은 세포벽 앵커를 나타내는 아미노산 모티프 (LPSTG)를 함유한다. 일부 재조합 숙주 세포 시스템에서, 숙주 세포로부터 재조합 Spb1 단백질의 분비를 용이하게 하기 위해 모티프를 제거하는 것이 바람직할 수도 있다. 따라서 세포벽 앵커 모티프 및 이 모티프에 대한 서열 C-말단은 Spb1로부터 제거될 수도 있다. 이러한 단편의 예는 하기 SEQ ID NO: 12로서 설명된다:
Figure pct00025
대안으로, 일부 재조합 숙주 세포 시스템에서, 재조합으로 발현된 단백질을 세포벽에 고정하기 위해 세포벽 앵커 모티프를 사용하는 것이 바람직할 수도 있다. 발현된 단백질의 세포 외 도메인은 정제 중에 분할될 수도 있거나, 재조합 단백질은 최종 조성물에서 불활성화된 숙주 세포 또는 세포막에 부착된 채로 남아있을 수도 있다.
한 구체예에서, 선도 또는 신호 서열 영역, 세포벽 앵커 모티프 및 이 모티프에 대한 서열 C-말단은 Spb1로부터 제거된다. 이러한 Spb1 단편의 예는 하기 SEQ ID NO: 13으로서 설명된다:
Figure pct00026
전환된 글루타민 잔기를 함유하는 E 박스는 또한 잔기 423에서 전환된 글루탐산 (볼드)과 함께, Spb1에서 (밑줄) 확인되었다. E 박스 모티프는 올리고머, 섬모 (pilus)-유사 구조의 형성에 중요할 수도 있고, 그래서 Spb1의 유용한 단편은 전환된 글루탐산 잔기를 포함할 수도 있다.
야생형 Spb1 서열은 Shine-Dalgarno 서열의 코어 서열 (밑줄)을 포함하는 업스트림 12-머 TAATGGAGCTGT 서열 (SEQ ID NO: 14)을 갖는 내부 메티오닌 코돈 (Met-162)을 포함한다. 이 Shine-Dalgarno 서열은 절단된 Spb1 서열의 번역을 개시하는 것으로 발견되었다. 이 부위에서 번역의 개시를 방지하기 위해 Shine-Dalgarno 서열은 발현에 사용된 Spb1-암호화 서열에서 방해될 수 있다. 리보솜 결합을 방지하기 위해 어떤 적합한 뉴클레오티드도 돌연변이될 수 있지만, 서열은 Shine-Dalgarno 코어 및 내부 메티오닌 코돈을 갖는 인-프레임의 두 부분인 GGA 글리신 코돈을 포함한다. 이 코돈에서 세 번째 염기는 암호화된 글리신을 변화시키지 않고 C, G 또는 T로 돌연변이 될 수 있으므로, Spb1 서열에서 어떤 변화도 방지한다.
본 발명의 조성물은 또한 참고문헌 [227]에서 아미노산 서열 NH2-W-X-L-Y-Z-CO2H에 의해 한정된 폴리펩티드를 포함할 수도 있으며, 여기에서 X는 Spb1 서열이고; L은 임의의 연결자이고; 및 Y는 GBS80 서열이고; W는 임의의 N-말단 서열이고; Z는 임의의 C-말단 서열이다. 이 폴리펩티드의 더 상세한 설명은 하기 제공된다.
이들 조성물은 또한 상기 설명된 GBS 단백질 항원 중 하나 이상을 포함할 수도 있다. 특히, 본 발명의 조성물은 (a) 아미노산 서열 NH2-W-X-L-Y-Z-CO2H의 폴리펩티드; 및 (b1) 상기 설명된 바와 같이 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및/또는 (b2) (i) 상기 설명된 바와 같이 SEQ ID NO: 1과 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및/또는 (ii) 상기 설명된 바와 같이 SEQ ID NO: 1의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수도 있다.
폴리펩티드 NH 2 -W-X-L-Y-Z- CO 2 H
전형적으로, 폴리펩티드는 아미노산 서열 X-L-Y를 포함하며, X는 Spb1 서열이고; L은 임의의 연결자이고; 및 Y는 GBS80 서열이다.
X: Spb1 서열
X 모이어티는 Spb1 서열이다. 이 Spb1 서열은, 대상체에 투여될 때, 야생형 Spb1 단백질, 예를 들어, 아미노산 서열 SEQ ID NO: 3 (COH1의 전체 길이 야생형 서열)을 갖는 에스.아갈락티애 단백질에 결합하는 항체를 포함하는 항체 반응을 이끌어낼 것이다.
Spb1 서열은 SEQ ID NO: 13과 적어도 a% 동일성을 갖는 아미노산을 포함할 수도 있다. a의 값은 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 이상으로부터 선택될 수도 있다. Spb1 서열은 SEQ ID NO: 13을 포함할 수도 있다.
Spb1 서열은 SEQ ID NO: 3 및/또는 SEQ ID NO: 13의 단편을 포함할 수도 있다. 단편은 보통 SEQ ID NO: 3/13의 적어도 b개의 아미노산을 포함할 것이며, b는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 175, 200 이상으로부터 선택된다. 단편은 보통 SEQ ID NO: 3/13의 적어도 하나의 T-세포 또는, 바람직하게, B-세포 에피토프를 포함할 것이다. T- 및 B-세포 에피토프는 상기 설명된 방법에 의해 설명될 수 있다. 상기 설명된 바와 같이, SEQ ID NO: 13은 자체로 SEQ ID NO: 3의 단편이다.
상기 한정된 바와 같이, Spb1 서열은 SEQ ID NO: 13과 적어도 a% 동일성을 갖고 SEQ ID NO: 13의 단편을 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수도 있다.
X 모이어티는 보통 적어도 c 아미노산 길이일 것이며, c는 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400 이상으로부터 선택된다.
X 모이어티는 보통 d 아미노산 길이보다 길지 않을 것이며, d는 500, 480, 460, 440, 420, 400, 380, 360, 340, 320, 300, 280, 260, 240, 220, 200 이하로부터 선택된다.
X 모이어티는 보통 300-500 아미노산 길이, 예를 들어, 350-480, 400-460, 430-450일 것이다.
혈청형 III 균주 COH1의 야생형 Spb1 서열은 상기 SEQ ID NO: 3이다. 상기 섹션 "Spb1"에 설명된 이들의 특이적 유도체는 본 발명의 이 구체예의 Spb1 서열에 적용 가능하다.
Y: GBS80 서열
Y 모이어티는 GBS80 서열이다. 이 GBS80 서열은, 대상체에 투여될 때, 야생형 GBS80 단백질, 예를 들어, 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2 (균주 2603V/R의 전체 길이 야생형 서열)를 갖는 에스.아갈락티애 단백질에 결합하는 항체를 포함하는 항체 반응을 이끌어낼 것이다.
GBS80 서열은 SEQ ID NO: 9와 적어도 e% 동일성을 갖는 아미노산을 포함할 수도 있다. a의 값은 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 이상으로부터 선택될 수도 있다. GBS80 서열은 SEQ ID NO: 9를 포함할 수도 있다.
GBS80 서열은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 9의 단편을 포함할 수도 있다. 단편은 보통 SEQ ID NO: 2/9의 적어도 f개의 아미노산을 포함할 것이며, f는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 175, 200 이상으로부터 선택된다. 단편은 보통 SEQ ID NO: 2/9의 적어도 하나의 T-세포 또는, 바람직하게, B-세포 에피토프를 포함할 것이다. 상기 설명된 바와 같이, SEQ ID NO: 9는 자체로 SEQ ID NO: 2의 단편이다.
상기 한정된 바와 같이, GBS80 서열은 SEQ ID NO: 9와 적어도 e% 동일성을 갖고 SEQ ID NO: 9의 단편을 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수도 있다.
Y 모이어티는 보통 적어도 g 아미노산 길이일 것이며, c는 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580, 600 이상으로부터 선택된다.
Y 모이어티는 보통 h 아미노산 길이보다 길지 않을 것이며, d는 600, 580, 560, 540, 520, 500, 480, 460, 440, 420, 400, 380, 360, 340, 320, 300, 280, 260, 240, 220, 200 이하로부터 선택된다.
Y 모이어티는 보통 350-550 아미노산 길이, 예를 들어, 400-520, 450-500, 470-490일 것이다.
혈청형 V 분리된 균주 2603 V/R의 야생형 GBS80 서열은 상기 SEQ ID NO: 2이다. 상기 섹션 "GBS80"에 설명된 이들의 특이적 유도체는 본 발명의 이 구체예의 GBS80 서열에 적용 가능하다.
L: 연결 자
폴리펩티드는 X 및 Y 모이어티를 연결하기 위해 임의로 L 모이어티를 포함한다. L 모이어티는 전형적으로, 예를 들어, 2-40개의 아미노산의 범위에서, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개의 아미노산으로 구성된, 짧은 아미노산 서열이다.
연결자는 보통 적어도 하나의 글리신 잔기를 함유할 것이며, 이로 인해 구조적 가요성을 용이하게 한다. 연결자는, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 글리신 잔기를 함유할 수도 있다. 글리신은 Gly-Gly 디펩티드 서열, 또는 더 긴 올리고-Gly 서열, 즉 Glyn에서 적어도 두 개의 연속적인 글리신을 포함하도록 배열될 수도 있으며, n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상, 예를 들어, SEQ ID NO: 15이다:
Figure pct00027
연결자는 제한 효소의 인식 서열에서 발견된 코돈에 의해 암호화될 수도 있다. 예를 들어, 특정 제한 효소의 표적인 6-머 서열은 디펩티드를 암호화할 수 있다. 따라서 BamH1 (GGATCC)에 대한 인식 서열은 Gly-Ser을 암호화하고, 그래서 연결자는 Gly-Ser 디펩티드 서열을 포함할 수도 있다. 이러한 서열은 클로닝 및 조작을 용이하게 한다.
유용한 연결자 서열은 상기 SEQ ID NO: 15 및 하기 SEQ ID NO: 16, 17 및 18을 포함한다:
Figure pct00028
하지만, 바람직한 연결자는 사람 폴리펩티드 서열과 공동으로 10개 이상의 인접한 아미노산을 공유하는 서열을 포함하지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 사용될 수 있는 한 글리신-풍부 연결자 서열은 14머 SEQ ID NO: 16이다. 하지만, 이 14머는 또한 사람 RNA 결합 단백질 (gi: 8051631)에서 발견되고 그래서 그것은 바람직하게 L 모이어티 내에서 방지된다.
W: N-말단 서열
X 모이어티는 폴리펩티드의 N-말단에 있을 수도 있지만, X의 아미노산 업스트림을 갖는 것이 또한 가능하다. 이들 임의의 아미노산은 W 모이어티를 형성한다.
W 모이어티는 전형적으로, 예를 들어, 2-40개의 아미노산의 범위의, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개의 아미노산으로 구성된, 짧은 아미노산 서열이다.
W 모이어티의 예는 직접적인 단백질 트래피킹 (trafficking)에 대한 선도 서열, 또는 클로닝 또는 정제를 용이하게 하는 짧은 펩티드 서열을 포함한다 (예를 들어, n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상인 경우, 히스티딘 태그, 즉, Hisn). 다른 적합한 N-말단 아미노산 서열은 당업자에게 명백할 것이다.
초기의 폴리펩티드에서, W 모이어티는 폴리펩티드의 N-말단 메티오닌 (박테리아의 포르밀-메티오닌, fMet)을 제공할 수 있다. 하지만, 하나 이상의 아미노산은 초기의 W 모이어티의 N-말단으로부터 분할될 수도 있으므로, 본 발명의 폴리펩티드의 W 모이어티는 반드시 N-말단 메티오닌을 포함하지는 않는다.
유용한 W 모이어티는 SEQ ID NO: 19를 포함한다:
Figure pct00029
Z: C-말단 서열
Y 모이어티는 폴리펩티드의 C-말단에 있을 수도 있지만, Y의 아미노산 다운스트림을 갖는 것이 또한 가능하다. 이들 임의의 아미노산은 Z 모이어티를 형성한다.
Z 모이어티는 전형적으로, 예를 들어, 2-40개의 아미노산의 범위에서, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개의 아미노산으로 구성된, 짧은 아미노산 서열이다.
Z 모이어티의 예는 직접적인 단백질 트래피킹에 대한 선도 서열, 클로닝 또는 정제를 용이하게 하는 짧은 펩티드 서열 (예를 들어, n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상인 경우, 히스티딘 태그, 즉, Hisn을 포함), 또는 단백질 안정성을 향상시키는 서열을 포함한다. 글루타티온-S-트랜스퍼라제, 티오레독신, 14kD 에스.아우레우스 단백질 A의 단편, 비오티닐화된 펩티드, 말토스-결합 단백질, 엔테로키나제 플래그, 등과 같은, 다른 적합한 C-말단 아미노산 서열은 당업자에게 명백할 것이다. 한 유용한 Z 모이어티는 SEQ ID NO: 20을 포함한다:
Figure pct00030
유용한 조합
다양한 X, Y 및 L 모이어티 중에, 유용한 조합은 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다:
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
폴리펩티드는 SEQ ID NO: 21과 적어도 i% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수도 있다. i의 값은 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 이상으로부터 선택될 수도 있다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 21을 포함할 수도 있다.
폴리펩티드는 SEQ ID NO: 23과 적어도 i% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수도 있다. i의 값은 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 이상으로부터 선택될 수도 있다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 23을 포함할 수도 있다.
본 발명에 사용된 폴리펩티드는 다음 아미노산 서열을 포함할 수도 있다:
(a) SEQ ID NO: 21 또는 23과 동일한 (즉, 100% 동일한) 아미노산 서열;
(b) SEQ ID NO: 21 또는 23과 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열;
(c) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 (또는 이상)의 단일 아미노산 변화 (삭제, 삽입, 치환)을 가지며, 이것은 별도의 위치에서 일어날 수도 있거나, (a) 또는 (b)의 서열과 비교하여, 인접할 수도 있는 아미노산 서열; 및
(d) 서열 짝 정렬 알고리즘 (pairwise alignment algorithm)을 사용하여 SEQ ID 21 또는 23이 배열될 때, N-말단에서 C-말단으로의 x 아미노산의 이동 윈도우 (그러므로 p 아미노산으로 연장되는 배열에 대하여, p > x인 경우, p-x+1 이러한 윈도우가 있다)는 적어도 x·y 동일하게 배열된 아미노산을 가지며, x는 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200으로부터 선택되고; y는 0.50, 0.60, 0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0.90, 0.91, 0.92, 0.93, 0.94, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98, 0.99로부터 선택되고; x·y가 정수가 아니면, 가장 가까운 정수로 반올림된다. 바람직한 서열 짝 정렬 알고리즘은 디폴트 파라미터를 사용하는 (예를 들어, 갭 오프닝 패널티 = 10.0, 및 갭 연장 패널티 = 0.5로, EBLOSUM62 스코링 매트릭스를 사용), Needleman-Wunsch 글로벌 배열 알고리즘이다 [228]. 이 알고리즘은 EMBOSS 패키지의 니들 도구로 편리하게 시행되는 [229] 아미노산 서열.
그룹 (c) 내에, 삭제 또는 치환은 N-말단 및/또는 C-말단에 있을 수도 있거나, 두 개의 말단 사이에 있을 수도 있다. 따라서, 절단은 삭제의 예이다. 절단은 N-말단 및/또는 C-말단에서 최대 40개 (또는 이상) 아미노산의 삭제를 수반할 수 있다.
폴리펩티드의 Spb1 및 GBS80 서열은 하나 이상의 GBS 균주로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, SEQ ID NO: 21 및 23은 균주 COH1의 Spb1 서열 및 균주 2603V/R의 GBS80 서열을 포함한다.
폴리펩티드
폴리펩티드, 또는 개개의 모이어티는, SEQ ID NO: 2, 3, 9, 10, 13, 21 또는 23과 비교하여, 하나 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 등) 연속적인 아미노산 대체, 즉, 하나의 아미노산의 관련된 측쇄를 갖는 또 다른 것들로의 대체를 포함한다. 유전적으로 암호화된 아미노산은 일반적으로 네 개의 과: (1) 산성, 즉, 아스파르테이트, 글루타메이트; (2) 염기성, 즉, 리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비-극성, 즉, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비전하 극성, 즉, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판으로 나누어지고, 티로신은 가끔 방향족 아미노산으로 공동으로 분류된다. 일반적으로, 이들 과에서 단일 아미노산의 치환은 생물학적 활성에 대하여 큰 영향을 갖지 않는다. 폴리펩티드는 참고 서열에 관하여 하나 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 등) 단일 아미노산 삭제를 가질 수도 있다. 폴리펩티드는 또한 참고 서열에 관하여 하나 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 등) 삽입 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 각각)을 포함할 수도 있다.
상기 설명된 바와 같이, 폴리펩티드는 많은 방법으로 제조될 수 있다. 상기 설명된 바와 같이, 폴리펩티드는 또한 다양한 형태 (예를 들어, 원래, 융합, 글리코실화, 비-글릴코실화, 지질화, 비-지질화, 인산화, 비-인산화, 미리스토일레이트화, 비-미리스토일레이트화, 모노머, 멀티머, 입자성, 변성, 등)를 취할 수 있다. 상기 설명된 바와 같이, 폴리펩티드는 바람직하게 정제된 또는 실질적으로 정제된 형태로 제공된다.
용어 "폴리펩티드"는 어느 길이의 아미노산 폴리머도 나타낸다. 폴리머는 선형 또는 분지형일 수도 있고, 그것은 변형된 아미노산을 포함할 수도 있고, 그것은 비-아미노산에 의해 방해될 수도 있다. 용어는 또한 자연적으로 또는 간섭에 의해 변형된 아미노산 폴리머, 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지 성분을 갖는 접합체와 같은, 어떤 다른 조작 또는 변형을 포함한다. 또한, 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체 (예를 들어, 비자연적 아미노산, 등 포함), 뿐만 아니라 업계에 알려진 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드도 정의 내에 포함된다. 폴리펩티드는 단일 사슬 또는 연관 사슬로서 발생할 수 있다. 폴리펩티드는 자연적으로 또는 비-자연적으로 글리코실화될 수 있다 (즉, 폴리펩티드는 해당하는 자연적으로 발생한 폴리펩티드에서 발견된 글리코실화 패턴과 다른 글리코실화 패턴을 갖는다).
폴리펩티드는 적어도 40개의 아미노산 길이 (예를 들어, 적어도 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 350, 400, 450, 500개 이상)일 수도 있다. 폴리펩티드는 1100개 아미노산보다 더 짧을 수도 있다.
사전-면역화
두 번째 양태에서, 본 발명은 환자에게 디프테리아 변성 독소 또는 이들의 유도체에 접합된 GBS의 캡슐형 당류인 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 GBS에 의한 감염에 대하여 환자를 면역화하는 방법을 제공하며, 환자는 디프테리아 변성 독소 또는 이들의 유도체로 사전-면역화되었다. 상기 설명된 바와 같이, 전형적으로, 접합체는 본 발명의 첫 번째 양태의 면역원성 조성물에서 GBS 접합체 중 하나이다. 즉, 적어도 하나의 접합체가 디프테리아 변성 독소 또는 이들의 유도체에 접합된 GBS의 캡슐형 당류인, 본 발명의 첫 번째 양태의 면역원성 조성물은 본 발명의 두 번째 양태에서 사용될 수도 있다. 조성물에서 디프테리아 변성 독소 또는 이들의 유도체에 접합된 캡슐형 당류는, 예를 들어, GBS 혈청형 Ia, Ib 또는 III의 것일 수도 있다. 특히, 캡슐형 당류는 GBS 혈청형 III의 것일 수도 있다 (하기 예시된 바와 같음). 이 양태에서, 조성물에서 GBS의 모든 캡슐형 당류가 디프테리아 변성 독소 또는 이들의 유도체에 접합된 것이 전형적이다.
담체 또는 사전-면역화 항원이 디프테리아 변성 독소의 유도체인 경우, 그 유도체는 바람직하게 면역학적으로 Dt와 교차 반응을 유지하고, 바람직하게 CRM 197이다. 발명자는 디프테리아 변성 독소 또는 이들의 유도체에 접합된 GBS의 캡슐형 당류인 접합체가 담체-유발 에피토프 억제로부터 고통받지 않는 것으로 보이며 (또는 그것이 일반적으로 알려진 바와 같이, "담체 억제"), 특히 억제는 담체 프라이밍으로부터 발생한다는 것을 발견하였다. 하기 논의된 바와 같이, "담체 억제"는 담체 단백질을 가진 동물의 사전-면역화가 그것을 담체 상에 존재하는 새로운 항원 에피토프에 대한 면역 반응을 이끌어내는 것으로부터 방지하는 현상이다 [230]. 이 알려진 현상과 반대로, 발명자는 GBS 캡슐형 당류-디프테리아 변성 독소 또는 이들의 유도체 접합체에 대한 면역 반응이 사실은 디프테리아 변성 독소 또는 이들의 유도체로 사전-면역화에 의해 향상될 수도 있다는 것을 발견하였다.
참고문헌 231에 보고된 바와 같이, 여러 백신 항원이 같은 단백질 성분 (접합체에서 면역원으로서 및/또는 담체 단백질로서 사용됨)을 함유하는 경우, 그들 항원 사이의 간섭에 대한 가능성이 있다. 참고문헌 231에서, 테타누스 변성 독소 (Tt) 담체에 접합된 항원에 대한 면역 반응은 Tt에 대하여 미리 존재하는 면역력에 의해 억제되었다.
참고문헌 232는 Hib 접합체에 대한 담체가 D-T-P 백신의 테타누스 항원과 같은 것일 경우 어떻게 D-T-P 백신과 Hib 접합체 백신의 조합이 부정적으로 영향을 받는 방법을 보고한다. 저자는 다수의 접합체를 포함하는 백신을 도입할 때, 일반적인 단백질 담체에 의한 간섭으로부터 발생하는 이 "담체 억제" 현상이 고려되어야 한다고 결론 짓는다.
참고문헌 231 및 232와 반대로, 참고문헌 233은 테타누스 변성 독소로 프라이밍이 이어서 투여된 Hib-Tt 접합체에 대한 면역 반응에 대하여 부정적인 영향을 갖지 않지만, 억제는 모계 획득 항-Tt 항체를 가진 환자에서 나타난다는 것을 보고하였다. 하지만, 참고문헌 234에서, "에피토프 억제" 효과는 테타누스 백신 접종으로부터 발생하는 기존 항-Tt 항체를 가진 환자에서 Tt-기반 펩티드 접합체에 대하여 보고되었다.
참고문헌 235에서, 담체로서 CRM 197 (디프테리아 독소의 해독된 돌연변이)를 갖는 접합체는 백신의 일부로서 (예를 들어, D-T-P 또는 D-T 백신의 일부로서) 이전에 디프테리아 독소를 받은 적이 없는 아이에서 효과가 없을 수도 있다는 것이 제안되었다. D-T 면역화에 의한 담체 프라이밍 효과가 Hib 접합체로 이후 면역화에 대하여 지속하는 것으로 보이는 경우, 이 일은 참고문헌 236에서 더 개발되었다.
참고문헌 237에서, 저자는 디프테리아 또는 테타누스 변성 독소 담체 단백질로 사전-면역화는 이후 그들 담체에 접합된 Hib 캡슐형 당류로 면역화 후에 항-Hib 항체 수준의 증가를 감소시키며, IgG1 및 IgG2는 동일하게 영향을 받는다는 것을 발견하였다. 접합체의 담체 부분에 대한 반응은 또한 억제되었다. 게다가, 하나의 접합체로 사전-면역화가 4주 후에 투여되는 두 번째 접합체의 담체 및 당류 부분 둘 다에 대한 면역 반응에 영향을 미치는 것으로 나타나는 것처럼, 더 일반적인 비-에피토프-특이적 억제가 나타났다.
단일 다가 폐렴 구균 접합체 백신에서 다른 담체 단백질의 사용은 참고문헌 238에서 보고되며, 다수의 담체가 담체 억제를 방지하기 위해 사용된다. 저자는 부정적인 간섭을 일으키지 않고 다가 접합체 백신에서 용인될 수 있는 담체 단백질의 최대 로드가 있다는 것을 예상한다. 참고문헌 239에서 혼합된 담체 단백질을 포함하는 폐렴 구균 접합체 백신이, 항-폐렴 구균 반응과 동시에, 담체에 대한 비의도성 촉진 반응을 이끌어낸다는 것이 보고되었다.
참고문헌 240, 디프테리아 및 테타누스 촉진제가 일가 수막염균 혈청군 C 접합체와 함께 투여될 수 있는지의 조사에서, 담체가 테타누스 변성 독소 담체이고 환자가 이전에 테타누스-함유 백신으로 면역화를 받은 경우 수막염균 접합체에 대한 적정 농도가 감소되었다는 것을 발견하였다.
당류 접합체에 대한 면역 반응에 부정적인 영향을 갖는 담체로 프라이밍의 문제에 더하여, 반대가 또한 발생할 수 있다, 즉, 접합체로의 면역화가 담체에 대한 면역 반응에 부정적인 영향을 가질 수 있다 [241].
그러므로 본 발명의 이 두 번째 양태는 환자에게 디프테리아 변성 독소 또는 이들의 유도체에 접합된 GBS의 캡슐형 당류인 접합체를 투여하는 단계를 포함하는, GBS에 의한 감염에 대하여 환자를 면역화하는 방법을 제공하며, 환자는 디프테리아 변성 독소 또는 이들의 유도체로 사전-면역화되었다. 이 양태는 또한 GBS에 의한 감염에 대하여 환자를 면역화하는데 사용되는 디프테리아 변성 독소 또는 이들의 유도체에 접합된 GBS의 캡슐형 당류인 접합체를 제공하며, 환자는 디프테리아 변성 독소 또는 이들의 유도체로 사전-면역화되었다. 이 양태는 GBS에 의한 감염에 대하여 환자를 면역화하기 위해 약제의 제조시 디프테리아 변성 독소 또는 이들의 유도체에 접합된 GBS의 캡슐형 당류인 접합체의 사용을 더 제공하며, 환자는 디프테리아 변성 독소 또는 이들의 유도체로 사전-면역화되었다.
사전-면역화된 환자
면역화되는 이 환자는 디프테리아 변성 독소 또는 이들의 유도체로 사전-면역화되었다. 디프테리아 변성 독소 또는 이들의 유도체는 GBS 및 디프테리아 변성 독소 또는 이들의 유도체 외에 유기체의 캡슐형 당류의 접합체의 담체로서 투여될 수도 있다. 전형적인 사전-면역화는 디프테리아 변성 독소 항원; 디프테리아 변성 독소 또는 CRM 197 담체를 사용하는 Hib 캡슐형 당류 접합체; 및/또는 디프테리아 변성 독소 또는 CRM 197 담체를 사용하는 폐렴 구균 캡슐형 당류 접합체를 포함할 수도 있다. 환자는 사전-면역화 항원(들)의 적어도 하나의 (예를 들어, 1, 2, 3 이상) 용량을 수용할 것이고, 그 용량 (또는 다회수 투여 중 최초)은 환자에게 본 발명의 이 양태에 따라 GBS 접합체로 면역화의 적어도 6 (예를 들어, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 36, 48, 60, 120, 180, 240, 300 이상) 개월 전에 투여될 것이다. 한자의 바람직한 그룹에서 사전-면역화는 출생 3년 내에, 예를 들어, 출생 2년 내에, 출생 1년 내에, 출생 6 개월 내에, 또는 출생 3 개월, 2 개월 또는 1 개월 내에 일어났다. 본 발명의 이 양태에 따라 면역화되기에 적합한 환자는 상기 섹션 치료 방법에서 설명된다.
사전-면역화 항원이 디프테리아 변성 독소인 경우 환자는 전형적으로 D-T-P 또는 D-T 사전-면역화의 'D' 항원으로서 변성 독소를 받을 것이다. 이러한 면역화는 전형적으로 2, 3, 및 4 개월된 신생아에게 제공된다. 면역화가 페르투시스 백신을 포함하는 경우, 그 백신은 전체 세포 또는 세포의 페르투시스 백신 ('Pw')일 수도 있지만, 바람직하게 무세포성 페르투시스 백신 ('Pa')이다. 사전-면역화 Pa 백신은 일반적으로 다음 잘 알려진 및 잘 특성화된 비.페르투시스 항원 중 하나, 둘 또는 셋을 포함할 것이다: (1) 화학적 수단에 의해 또는 부위-유도되는 돌연변이원, 예를 들어, '9K/129G' 돌연변이에 의해 해독된, 페르투시스 변성 독소 ('PT') [242]; (2) 사상 헤마글루티닌 ('FHA'); (3) 페르탁틴 (또한 '69 킬로달톤 외막 단백질'로 알려짐). 무세포성 페르투시스 백신은 또한 응집원 2 및/또는 응집원 3을 포함할 수도 있다. D-T-P 사전-면역화에서 'T' 항원은 전형적으로 테타누스 변성 독소이다.
사전-면역화 항원이 디프테리아 변성 독소인 경우 환자는 또한 또는 대안으로 단백질-당류 접합체의 담체 단백질로서 변성 독소를 받을 수도 있다. 이러한 접합체는 'PRP-D' Hib 접합체 [참고문헌 243의 표 14-7 참조], 예를 들어, ProHIBIT™ 제품을 포함한다.
사전-면역화 항원이 CRM 197인 경우 환자는 전형적으로 Hib 접합체 및/또는 다가 폐렴 구균 접합체로 사전-면역화될 것이다. 이러한 면역화는 전형적으로 2, 3, 및 4 개월된 신생아에게 제공된다. CRM 197 담체를 사용하는 Hib 접합체는 'HbOC' 접합체 [참고문헌 243의 표 14-7], 예를 들어, HibTITER™ 제품을 포함한다. CRM 197 담체를 사용하는 폐렴 구균 접합체는 7가 PCV7 혼합물, 예를 들어, PrevNar™ 백신을 포함한다 [244]. 환자는 또한 혈청군 C 수막염균 ('MenC') 접합체로 사전-면역화될 수도 있다. CRM 197 담체를 사용하는 MenC 접합체는 Meninvact™/Menjugate™ [245] 및 Meningitec™을 사용할 수도 있다.
사전-면역화가 접합된 항원으로 된 경우, 환자는 대부분 필연적으로 또한 접합체의 낮은-수준 오염의 결과로서 소량의 자유 디프테리아 변성 독소 (또는 유도체)를 받지만, 소량은 전형적으로 큰 면역 반응을 제공하는데 충분하지 않을 것이다.
디프테리아 변성 독소는 포르말린 또는 포름알데히드와 같은, 불활성화 화학물질로 코리네박테리움 디프테리애 (Corynebacterium diphtheriae)의 ADP-리보실화 외독소를 치료함으로써 얻을 수 있는 잘 알려진 및 잘 특성화된 단백질이다 [예를 들어, 참고문헌 243의 13장 참조]. CRM 197은 또한 잘 알려진 및 잘 특성화되고 [246-249], 접합된 당류 백신에서 담체로서 널리 사용되었다. CRM 197 및 Dt는 많은 담체 에피토프를 공유한다.
사전-면역화의 결과는 환자의 면역계가 사전 면역화 항원에 노출되었다는 것이다. 디프테리아 변성 독소 (Dt)로 사전 면역화에 대하여, 이것은 일반적으로 환자가 항-Dt 항체 반응을 증가시키고 (전형적으로 0.01 IU/ml 이상인 항-Dt 적정 농도를 제공하기 위해) Dt에 특이적인 기억 B 및/또는 T 림프구를 소유할 것이다, 즉, Dt로 사전-면역화는 전형적으로 환자의 병력 항-Dt 면역 반응을 끌어내는데 충분하다는 것을 의미한다. 사전 면역화에 대하여, Dt (또는 유도체)가 접합체 내에 당류에 대한 담체인 경우 사전 면역화는 항-당류 반응을 증가시키고 환자는 당류에 특이적인 기억 B 및/또는 T 림프구를 소유할 것이다, 즉, 사전 면역화는 전형적으로 환자의 병력 항-당류 면역 반응을 끌어내는데 충분하다. 사전 면역화는 바람직하게, 예를 들어, 디프테리아 질환에 대한 환자의 보호 면역력을 끌어내는데 충분하였다.
따라서 본 발명의 이 양태에 따라 면역화되는 환자는 일반적인 환자와는 다른데, 그들이 면역계가 이미 사전-면역화 항원에 대한 면역 반응을 장착한 일반적인 집단의 부분 집합의 멤버이므로, 이 양태에 따르는, 디프테리아 변성 독소 (또는 이들의 유도체) 담체를 포함하는 GBS 접합체로 면역화는 이전에 사전 면역화 항원에 대한 면역 반응을 장착하지 않은 환자에서 보다 서브세트에서 다른 면역 반응을 이끌어내기 때문이다. 접합체 (특히 Hib 접합체)의 담체로서 Dt (또는 유도체)로 사전 면역화된 환자들은 바람직하다. 특히 바람직한 환자들은 접합체의 담체로서 Dt (또는 유도체)로 및 비접합된 면역원으로서 Dt로 사전 면역화되었다.
디프테리아 변성 독소 (또는 유도체)로 사전 면역화되는 것뿐만 아니라, 접합된 또는 비-접합된 형태로, 환자는 다른 항원으로 사전-면역화될 수도 있다. 이러한 항원들은 페르투시스 항원(들) - 상기 참조; 테타누스 변성 독소 - 상기 참조; 헤모필루스 인플루엔재 타입 B - 상기 참조; B형 간염 표면 항원 (HBsAg); 불활성화된 폴리오바이러스 백신 (IPV)과 같은, 폴리오바이러스; 스트렙토코쿠스 뉴모니애 - 상기 참조; 인플루엔자 바이러스; BCG; A형 간염 바이러스 항원; 홍역 바이러스; 볼거리 바이러스; 풍진 바이러스; 수두 바이러스; 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
환자는 하나 이상의 GBS 접합체(들)로 사전-면역화될 수도 있고 아닐 수도 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 환자가 처음 GBS 접합체를 받을 때, 그들은 이미 Dt (또는 유도체)로 사전 면역화되었다. 다른 구체예에서, GBS 접합체는 이미 (i) Dt 또는 유도체 및 (ii) GBS 접합체 둘 다로 사전-면역화된 환자들에게 투여된다.
테타누스 변성 독소 담체
본 발명의 이 두 번째 양태가 디프테리아 변성 독소 담체 (및 그것들의 유도체)에 관하여 상기 설명되었으며, 테타누스 변성 독소는 바람직하게 사용되지 않았지만, 이 양태의 대안의 구체예는 테타누스 변성 독소 (또는 유도체) 담체를 사용하며, 디프테리아 변성 독소는 바람직하게 사용되지 않는다. 이들 대안의 구체예에서 상기 정의는 그에 따라 변형될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 두 번째 양태는 환자에게 테타누스 변성 독소 또는 이들의 유도체에 접합된 GBS의 캡슐형 당류인 접합체를 투여하는 단계를 포함하는, GBS에 의한 감염에 대하여 환자를 면역화하는 방법을 제공하며, 환자들은 테타누스 변성 독소 또는 이들의 유도체로 사전 면역화되었다. 이 양태는 또한 GBS에 의한 감염에 대하여 환자를 면역화하는데 사용되는 테타누스 변성 독소 또는 이들의 유도체에 접합된 GBS의 캡슐형 당류인 접합체를 제공하며, 환자는 테타누스 변성 독소 또는 이들의 유도체로 사전-면역화되었다. 이 양태는 GBS에 의한 감염에 대하여 환자를 면역화하기 위해 약제의 제조시 테타누스 변성 독소 또는 이들의 유도체에 접합된 GBS의 캡슐형 당류인 접합체의 사용을 더 제공하며, 환자는 테타누스 변성 독소 또는 이들의 유도체로 사전-면역화되었다. 테타누스 변성 독소 또는 이들의 유도체에 접합된 GBS의 캡슐형 당류인 접합체는 담체 억제, 특히 담체 프라이밍으로부터 발생하는 억제로부터 고통받지 않을 수도 있다. GBS 캡슐형 당류-테타누스 변성 독소 또는 이들의 유도체 접합체에 대한 면역 반응이 사실은 테타누스 변성 독소 또는 이들의 유도체로 사전-면역화에 의해 개선될 수도 있다.
상기 설명된 바와 같이, 전형적으로, 접합체는 본 발명의 첫 번재 양태의 면역원성 조성물에서 GBS 접합체 중 하나이다. 즉, 적어도 하나의 접합체가 테타누스 변성 독소 또는 이들의 유도체에 접합된 GBS의 캡슐형 당류인, 본 발명의 첫 번째 양태의 면역원성 조성물은 본 발명의 두 번째 양태에서 사용될 수도 있다. 조성물에서 테타누스 변성 독소 또는 이들의 유도체에 접합된 캡슐형 당류는, 예를 들어, GBS 혈청형 Ia, Ib 또는 III의 것일 수도 있다. 특히, 캡슐형 당류는 GBS 혈청형 III의 것일 수도 있다. 이 양태에서, 조성물에서 GBS의 모든 캡슐형 당류가 테타누스 변성 독소 또는 이들의 유도체에 접합되는 것이 전형적이다.
테타누스 변성 독소는 잘 알려진 단백질이고 [예를 들어, 참고문헌 243의 27장 참조] 클로스트리듐 테타니 (Clostridium tetani)의 ADP-리보실화 외독소를 불활성화함으로써 얻을 수 있다. 환자들은 전형적으로 D-T-P 또는 D-T 사전-면역화의 'T' 항원으로서, 또는 접합체의 담체 단백질로서 테타누스 변성 독소를 받을 것이다. 이러한 접합체는 'PRP-T' Hib 접합체 [참고문헌 243의 표 14-7], 예를 들어, ActHIB™, OmniHIB™ 및 HIBEPJX™ 제품을 포함한다
일반
용어 "포함하는"은 "포함하는" 뿐만 아니라 "구성되는"을 포함하는데, 예를 들어, X를 "포함하는 조성물은 단지 X만으로 구성될 수도 있거나 추가적인 것, 예를 들어, X+Y를 포함할 수도 있다.
숫자 값 x에 관하여 용어 "약"은, 예를 들어, x+10%를 의미한다.
단어 "실질적으로"는 "완벽히"를 제외하지 않는데, 예를 들어, Y로부터 "실질적으로 자유로운" 조성물은 Y로부터 완벽히 자유로울 수도 있다. 필요한 경우, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의로부터 제외될 수도 있다.
당 고리 (sugar ring)는 개방형 및 폐쇄형으로 존재할 수 있고, 폐쇄형은 여기에 구조식으로 나타나는 한편, 개방형은 또한 본 발명에 포함된다는 것이 인정될 것이다.
유사하게, 당은 피라노스형 및 푸라노스형으로 존재할 수 있고, 피라노스형이 여기에 구조식으로 나타나는 한편, 푸리노스형은 또한 포함된다. 당의 다른 아노머형이 또한 포함된다.
특이적으로 진술되지 않으면, 둘 이상의 성분을 혼합하는 단계를 포함하는 공정은 어떤 특정 순서의 혼합을 필요로 하지 않는다. 따라서 성분은 어떤 순서로 혼합될 수 있다. 세 개의 성분이 있는 경우, 두 개의 성분이 서로 결합될 수 있고, 그때 조합은 제 3 성분, 등과 결합될 수도 있다.
항체는 일반적으로 그것들의 표적에 특이적일 것이다. 따라서 그것들은 소 혈청 알부민과 같은, 부적절한 대조군 단백질보다 표적에 대하여 더 높은 친화도를 가질 것이다.
달리 진술되지 않으면, 폴리펩티드 서열 사이의 동일성은 바람직하게 파라미터 갭 오픈 패널티=12 및 갭 연장 패널티=1인 아핀 갭 검색을 사용하여, MPSRCH 프로그램 (Oxford Molecular)에 주입된 바와 같이 Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘에 의해 한정된다.
도 1은 GBS 혈청 Ia 및 III의 반복 구조 사이의 차이를 나타낸다.
도 2는 GBS 혈청형 Ia, Ib, II, III & V의 캡슐형 당류의 반복 구조를 나타낸다.
도 3은 GBS 혈청형 V의 캡슐형 당류의 탈시알릴화된 형태의 반복 구조를 나타낸다.
도 4는 보조제와 함께 및 보조제 없이, GBS 혈청형 III 캡슐형 당류 및 CRM 197의 접합체의 투여 이전에 CRM 197으로 프라이밍의 효과를 나타낸다.
접합체 생산
스트렙토코쿠스 아갈락티애 혈청형 Ia, Ib 및 III 의 정제된 캡슐형 당류는 과옥소산염 산화에 의해 담체 단백질에 접합된 후 이어서 환원성 아민화되었다 (참고문헌 2). 스트렙토코쿠스 아갈락티애 혈청형 V의 정제된, 탈시알릴화된 캡슐형 당류는 과옥소산염 산화에 의해 담체 단백질에 접합된 후 이어서 환원성 아민화되었다 (참고문헌 14). 대부분의 경우에서 담체 단백질은 CRM 197이었다. 테타누스 변성 독소는 특이적으로 표시된 경우 담체 단백질로서 사용되었다.
마우스 연구 (1)
이 연구에서, 일가 또는 조합 백신으로서, GBS 혈청형 Ia, Ib 및 III 접합체의 효능 및 면역원성에 대한 보조제의 효과는 활성 모자 챌린지 마우스 모델 (active maternal-neonatal challenge mouse model)로 평가되었다.
모자 챌린지 마우스 모델은, 참고문헌 250에서 적용되며, 신생아에서 활성 백신 접종된 댐의 태반에서 얻은 특이적 항체의 효능을 평가하기 위해 사용된다. 특이적으로, Charles River Laboratories (Calco, Italy)의 5-6주차인 암컷 CD-1 마우스는 보조제와 함께 또는 보조제 없이, 제 1일, 제 21일 및 결국 제 35일에 두 번 또는 세 번의 면역화와 함께 복강내 주사에 의해 백신 접종된다. 최종 면역화 후에, 마우스는 사육되고 전달까지 유지된다. 비-면역화된 새끼 (100-1000 배 LD50)의 90%에 대하여 치명적인 GBS 균주의 접종물 (0.05 mL의 Todd-Hewitt broth)는 신생아 마우스에 시도하기 위해 사용된다. 시도는 생후 48시간 이내에 복강내 경로에 의한 것이다. 72시간에 살아남은 새끼의 수가 기록되고 생존율은 Fisher의 정확 테스트 (Fisher's exact test)을 사용하여 처치된 모든 그룹에서 비교된다. 대조군 그룹에서, 댐은 같은 경로에 의해 및 같은 투여 계획을 사용하여 PBS를 받는다. 최종 면역화 2주 후, 혈액 샘플은 두 번의 시험관 내 검정 (ELISA 및 하기 설명된 옵소노 식균 작용 검정 (Opsonophagocytosis assay))을 사용하여 면역원성 평가를 위해 수거된다.
ELISA 검정은 면역화에 따라 생산된 GBS-특이적 항체의 적정 농도를 한정하기 위해 수행된다. ELISA는 또한 각각의 캡슐형 당류 항원에 대한 총 IgG를 정량하기 위해 사용된다. 개개의 마우스 각각의 혈청은 분석되었고 기하학적 평균 적정 농도 (Geometric Mean Titer; GMT)는 각각의 그룹에 대하여 계산된다. 캡슐형 당류 타입 Ia, Ib 및 III에 대한 항체 적정 농도는 마우스 ELISA 유닛 (Mouse ELISA Unit; MEU)으로서 표현되고 참고 라인 검정법 (Reference Line Assay Method)에 기초하여 계산된다.
옵소노 식균 작용 검정 (OPA)은 보체-조절 GBS 살해 가능한 백신-유발 항체의 적정 노도를 평가하기 위해 수행된다 (참고문헌 251에서 설명된 접근법을 사용하여). 검정은 다음 성분을 결합함으로써 수행된다: 박테리아, 식세포 (사람 혈액에서 추출된 PMN 또는 분화된 HL-60 세포주), 보체 및 면역 혈청.반응 혼합물의 앨리쿼트는 남은 콜로니 형성 유닛 (CFU)을 결정하기 위해 37℃에서 1 시간 배양 전 및 후 플레이팅된다. 옵소노 식균성 세포 살해의 양 (로그 살해)은 초기 시점에 존재한 CFU 수의 로그로부터 살아남은 콜로니 수의 로그를 뺌으로써 한정된다. 사전-면역 혈청, 및 PMN 없이 열-불활성화된 보체는 음성 대조군으로서 사용된다. 살균 적정 농도는 박테리아의 50%의 감소로 이어지는 상호간 혈청 희석으로서 표현된다.
이 연구에서, 암컷 CD1 마우스는 제 0일 및 제 21일에 보조제 (알루미늄 히드록시드 또는 MF59)의 존재시 세 개의 다른 접합체의 두 번의 투여 (각각 1 μg)로 면역화되었다. 신생아는 하기 표 1에서 나타난 바와 같이 타입 특이적 균주로 시도되었다.
표 1: 활성 모자 챌린지 마우스 모델에서 알루미늄 히드록시드 또는 MF59 의 존재시 GBS 혈청형 Ia , Ib 및 III / CRM 197 접합체와 함께 얻은 보호 수준 및 항체 적정 농도의 결정.
Figure pct00035
- 적용할 수 없음
높은 수준의 보호는 알루미늄 히드록시드 및 MF59를 갖는 세 개의 혈청형 모두에 대하여 일가 백신으로 달성되었다. 하지만, 약간 낮은 생존율은 더 높은 항체 적정 농도의 존재시에도 보조제 MF59와 함께 얻었다.
추가 실험에서, 마우스는 제 0일, 제 21일 및 제 35일에 보조제의 존재시 각각의 접합체 1 μg으로 조합의 세 번의 투여로 면역화되었다. 신생아는 하기 표 2에 나타난 바와 같이 타입 특이적 균주로 시도되었다.
표 2: 활성 모자 챌린지 마우스 모델에서 알루미늄 히드록시드 또는 MF59 의 존재시 또는 부재시 GBS 혈청형 Ia , Ib 및 III / CRM 197 접합체의 조합과 함께 얻은 보호 수준 및 항체 적정 농도의 결정.
Figure pct00036
Combo = CRM 197-Ia + CRM 197-Ib + CRM 197-III; -: 적용할 수 없음
높은 수준의 보호는 보조제의 존재시 또는 부재시 세 개의 조제물 모두의 조합 백신으로 달성되었지만, 더 낮은 항체 적정 농도는 보조제의 부재시 달성되었다.
마우스 연구 (2)
이 연구에서, 활성 모자 챌린지 마우스 모델에서 혈청형 Ia, Ib 및 III/CRM 197 접합체의 효능 및 면역원성에 대한 동결건조의 효과가 평가되었다. 제 0일 및 제 21일에 보조제의 존재시 또는 부재시, 마우스는 세 개의 다른 접합체의 두 번의 투여 (각각 1 μg)로 면역화되었다. 신생아는 하기 표 3에 나타난 바와 같이 타입 특이적 균주로 시도되었다.
표 3: 활성 모자 챌린지 마우스 모델에서 알루미늄 히드록시드 의 존재시 또는 부재시 액체 또는 동결건조된 항원으로서 마우스에 투여될 때, 혈청형 Ia, Ib 및 III /CRM 197 접합체에 의해 달성된 보호 수준, 항체 적정 농도 및 살균 적정 농도의 결정.
Figure pct00037
- 적용할 수 없음; ND: 미결정
동결건조 공정은 GBS 접합체의 면역원성에 영향을 미치지 않았다. 항체 적정 농도 및 살균 적정 농도는 액체 및 동결건조된 조제물 둘 다를 받은 마우스에서 비슷하였다.
마우스 연구 (3)
이 연구에서, 활성 모자 챌린지 마우스 모델에서 혈청형 V/CRM 197 접합체의 효능에 대한 동결건조의 효과가 평가되었다. 제 0일 및 제 21일에 보조제의 존재시 또는 부재시, 마우스는 접합체의 두 번의 투여 (각각 1, 5 또는 10 μg)로 면역화되었다. 신생아는 타입 V 균주로 시도되었다. 결과는 하기 표 4에서 나타난다.
표 4: 활성 모자 챌린지 마우스 모델에서 알루미늄 히드록시드 의 존재시 또는 부재시 액체 또는 동결건조된 항원으로서 마우스에 투여될 때, 혈청형 Ia, Ib 및 V/CRM 197 접합체에 의해 달성된 보호 수준, 항체 적정 농도 및 살균 적정 농도의 결정.
Figure pct00038
동결건조 공정은 GBS 접합체의 면역원성에 영향을 미치지 않았다. 생존율은 액체 및 동결건조된 조제물 둘 다를 받은 마우스에서 비슷하였다.
마우스 연구 (4)
이 연구에서, 활성 모자 챌린지 마우스 모델에서 GBS 혈청형 Ia, Ib, III 및 V 접합체의 혼합물의 효능에 대한 다른 용량의 효과가 평가되었다. 제 0일 및 제 21일에 보조제의 부재시, 마우스는 각각의 GBS 혈청형 Ia, Ib, III 및 V 접합체의 0.2, 1 또는 5 μg으로 조합의 두 번의 투여로 면역화되었다. 신생아는 하기 표 5에 나타난 바와 같이 타입 특이적 균주로 시도되었다.
표 5: 활성 모자 챌린지 마우스 모델에서 알루미늄 GBS 혈청형 Ia, Ib, III 및 V/CRM 197 접합체의 조합과 함께 얻은 보호 수준의 결정.
Figure pct00039
Combo = CRM 197-Ia + CRM 197-Ib + CRM 197-III + CRM 197-V
GBS 혈청형 V 접합체의 더 많은 투약은 보호의 수준을 증가시킨다.
마우스 연구 (5)
이 연구에서, 활성 모자 챌린지 마우스 모델에서 GBS 혈청형 Ia, Ib, III 및 V 접합체의 혼합물의 효능에 대한 다른 수의 투여의 효과가 평가되었다. 마우스는 적절하게 제 0일, 제 21일 및 제 35일에 Alum 보조제의 존재시 조합의 한 번, 두 번 또는 세 번의 투여 (각각의 접합체 1 μg)로 면역화되었다. 신생아는 하기 표 6에 나타난 바와 같이 타입 특이적 균주로 시도되었다.
표 6: 활성 모자 챌린지 마우스 모델에서 보조제의 존재시 GBS 혈청형 Ia, Ib, III 및 V/CRM 197 접합체의 조합과 함께 얻은 보호 수준의 결정.
Figure pct00040
Combo = CRM 197-Ia + CRM 197-Ib + CRM 197-III + CRM 197-V
이 연구에서 살균 적정 농도는 혈청형 Ia, Ib, III 및 V 접합체의 혼합물의 투여에 따라 측정되었다. OPA 적정 농도는 하기 나타난다:
Figure pct00041
면역화의 수는 GBS 혈청형 V 접합체에 대한 면역 반응에 강하게 영향을 미친다.
마우스 연구 (6)
이 연구에서, 활성 모자 챌린지 마우스 모델에서 GBS 혈청형 V 접합체 단독과 비교하여 GBS 혈청형 Ia, Ib, III 및 V 접합체 혼합물의 효능이 평가되었다. 마우스는 세 번의 투여로 면역화되었다. 제 0일, 제 21일 및 제 35일에 Alum 보조제의 존재시 각각의 접합체 1 μg으로 조합 또는 GBS 혈청형 V 접합체 1 μg의 세 번의 투여로 면역화되었다. 신생아는 CJB111 및 2603 V/R 타입 V 균주로 시도되었다. 결과는 하기 표 7에서 나타난다.
표 7: 활성 모자 챌린지 마우스 모델에서 보조제의 존재시 GBS 혈청형 Ia, Ib, III 및 V/CRM 197 접합체의 조합 또는 GBS 혈청형 V 접합체 단독과 함께 얻은 보호 수준의 결정.
Figure pct00042
Combo = CRM 197-Ia + CRM 197-Ib + CRM 197-III + CRM 197-V
GBS 혈청형 Ia, Ib 및 III 접합체가 또한 조성물에 존재할 때 GBS 혈청형 V의 캡슐형 당류에 대한 면역 반응은 감소되었다.
마우스 연구 (7)
이 연구에서, 활성 모자 챌린지 마우스 모델에서 GBS 혈청형 V 접합체와 비교하여 GBS 혈청형 Ia, Ib, III 및 V 접합체의 혼합물의 면역원성 및 효능에 대한 보조제의 효과가 평가되었다. 마우스는 제 0일, 제 21일 및 제 35일에 보조제의 존재시 또는 부재시 각각의 접합체 1 μg으로 조합 또는 GBS 혈청형 V 접합체 1 μg의 세 번의 투여로 면역화되었다. 신생아는 CJB111 타입 V 균주로 시도되었다. 결과는 하기 표 8에서 나타난다.
표 8: 활성 모자 챌린지 마우스 모델에서 보조제의 존재시 또는 부재시 GBS 혈청형 Ia, Ib, III 및 V/CRM 197 접합체의 조합 또는 GBS 혈청형 V 접합체 단독과 함께 얻은 보호 수준, 항체 적정 농도 및 살균 적정 농도의 결정.
Figure pct00043
Combo = CRM 197-Ia + CRM 197-Ib + CRM 197-III + CRM 197-V; - 적용할 수 없음
한 번 더, GBS 혈청형 Ia, Ib 및 III 접합체가 또한 조성물에 존재할 때 GBS 혈청형 V의 캡슐형 당류에 대한 면역 반응은 감소되었다. 생존은 보조제의 추가에 의해 개선되었지만, 이 실험에서 GBS 혈청형 V 접합체 단독에 보조제의 추가는 이 효과를 갖지 않았다.
마우스 연구 (8)
이 연구에서, 활성 모자 챌린지 마우스 모델에서 GBS 혈청형 Ia, Ib, III 및 V 접합체의 혼합물의 효능에 대한 GBS 혈청형 V 접합체의 용량의 증가의 효과가 평가되었다. 마우스는
마우스는 제 0일 및 제 21일에 보조제의 존재시 또는 부재시 각각의 접합체 1 μg으로 조합의 두 번의 투여 또는 GBS 혈청형 Ia, Ib, III 접합체 1 μg으로 조합 또는 GBS 혈청형 V 접합체 5 μg의 두 번의 투여로 면역화되었다. 신생아는 하기 표 9에서 나타난 바와 같이 타입 특이적 균주로 시도되었다.
표 9: 활성 모자 챌린지 마우스 모델에서 다른 용량의 GBS 혈청형 V 접합체와 함께 보조제의 존재시 GBS 혈청형 Ia, Ib, III 및 V/CRM 197 접합체의 조합과 함께 얻은 보호 수준의 결정.
Figure pct00044
Combo = CRM 197-Ia + CRM 197-Ib + CRM 197-III + CRM 197-V (모두 1 μg으로)
Combo plus = CRM 197-Ia + CRM 197-Ib + CRM 197-III + CRM 197-V (5 μg의 CRM 197-V를 제외한 모두 1 μg으로)
이 실험에서, 혼합물에서 GBS 혈청형 V의 캡슐형 당류에 대한 면역 반응은 보조제의 추가에 의해 한 번 더 개선되었다. 반응은 또한 조성물에서 이 캡슐형 당류의 용량이 증가함으로써 개선되었다. 하지만, 높은 용량의 GBS 혈청형 V의 캡슐형 당류의 존재는 GBS 혈청형 Ia, Ib 및 III의 캡슐형 당류에 대한 반응을 감소시키는 것으로 나타났다. 이 결과는 보조제의 추가에 의해 감소되었다.
마우스 연구 (9)
이 연구에서, 활성 모자 챌린지 마우스 모델에서GBS 혈청형 Ia, Ib 및 III 접합체와 GBS67 및 GBS80 단백질의 혼합물의 효능이 평가되었다. 마우스는 다양한 다른 보조제의 존재시 또는 부재시 조합으로 면역화되었다. 신생아는 하기 표 10에 나타난 바와 같이 타입 특이적 균주로 시도되었다.
표 10: 활성 모자 챌린지 마우스 모델에서 GBS 혈청형 Ia, Ib 및 III /CRM 197 접합체 및 GBS67 및 GBS80 단백질의 조합과 함께 얻은 보소 수준의 결정.
Figure pct00045
Combo = CRM 197-Ia + CRM 197-Ib + CRM 197-III + GBS67 + GBS80
이 연구에서, 항체 적정 농도는 혈청형 Ia, Ib, III 및 V 접합체 및 GBS67 및 GBS80 단백질의 혼합물의 투여에 따라 측정되었다. 다섯 개의 별도의 실험의 결과는 하기 나타난다:
Figure pct00046
마우스 연구 (10)
이 연구에서, 활성 모자 챌린지 마우스 모델에서 GBS 혈청형 Ia, Ib 및 III 접합체와 GBS67 및 GBS80 단백질의 혼합물의 효능이 평가되었다. 마우스는 제 0일, 제 21일 및 제 35일에 다양한 다른 보조제의 존재시 또는 부재시 조합의 세 번의 투여로 면역화되었다. 신생아는 하기 표 11에 나타난 바와 같이 타입 특이적 균주로 시도되었다.
표 11: 활성 모자 챌린지 마우스 모델에서 GBS 혈청형 Ia, Ib 및 III /CRM 197 접합체 및 GBS67 및 GBS80 단백질의 조합과 함께 얻은 보소 수준의 결정.
Figure pct00047
Combo = CRM 197-Ia + CRM 197-Ib + CRM 197-III + GBS67 + GBS80
마우스 연구 (11)
이 연구에서, 활성 모자 챌린지 마우스 모델에서 GBS 혈청형 Ia, Ib, III 및 V 접합체와 GBS67 단백질 및 Spb1-GBS80 융합 단백질의 혼합물의 효능이 평가되었다. 마우스는 보조제의 존재시 조합으로 면역화되었다. 신생아는 하기 표 12에 나타난 바와 같이 타입 특이적 균주로 시도되었다.
표 12: 활성 모자 챌린지 마우스 모델에서 GBS 혈청형 Ia, Ib, III 및 V/CRM 197 접합체, GBS67 단백질 및 Spb1 - GBS80 융합 단백질의 조합과 함께 얻은 보소 수준의 결정.
Figure pct00048
Combo = CRM 197-Ia + CRM 197-Ib + CRM 197-III + GBS67 + GBS67 단백질 + Spb1-GB80 융합 단백질
마우스 연구 (12)
이 연구에서, 활성 모자 챌린지 마우스 모델에서 GBS 혈청형 Ia, Ib, III 및 V 접합체의 효능이 평가되었다. 마우스는 각각의 접합체 1 μg으로 면역화되었다. 신생아는 하기 표 13에 나타난 바와 같이 타입 특이적 균주로 시도되었다. 실험은 두 번 반복되었다.
표 13: 접합체 활성 모자 챌린지 마우스 모델에서 GBS 혈청형 Ia, Ib, III 및 V/CRM 197 접합체와 함께 얻은 보호 수준의 결정.
Figure pct00049
GBS 혈청형 Ib의 캡슐형 당류를 포함하는 접합체는 GBS 혈청형 Ib에 더하여 GBS 혈청형 Ia에 대한 보호를 제공하였다.
마우스 연구 (13)
이 연구에서, 테타누스 변성 독소 (TT) 담체 단백질 또는 CRM 197 담체 단백질에 접합된 캡슐형 당류를 테스트하였고 그것들의 면역원성에 대하여 비교하였다. 암컷 CD1 마우스는 제 0일 및 제 21일에 알루미늄 히드록시드 보조제를 갖는 각각 1 μg의 GBS 혈청형 Ia, Ib 및 III 접합체의 두 번 투여로 면역화되었다. 신생아는 하기 표 14에 나타난 바와 같이 타입 특이적 균주로 시도되었다.
표 14: 활성 모자 챌린지 마우스 모델에서 TT 또는 CRM 에 접합된 GBS 혈청형 Ia, Ib 및 III 캡슐형 당류에 의해 달성된 보호의 결정.
Figure pct00050
*% 생존 (살아있는 것들/처치된 것들)
세 개의 혈청형 모두의 CRM 197 접합체로 면역화된 그룹에서 생존율은 TT 접합체로 면역화된 그룹에서 관찰된 생존율과 비슷하였다. 이들 결과들에 기초하여, CRM 197은 추가의 개발을 위한 담체 단백질로서 선택되었다.
마우스 연구 (14)
이 연구에서, 면역원성 상에 공유 접합 공정 중에 캡슐형 당류 산화의 수준의 영향이 평가되었다. 여러 배치의 GBS 혈청형 Ia, Ib 및 III 접합체는 TT 및/또는 CRM 197에 접합된 다른 퍼센트의 산화로 제조된 당류와 함께 얻었고 그것들의 면역원성에 대하여 암컷 CD1 마우스에서 테스트되었다.
마우스는 제 0일 및 제 21일에 알루미늄 히드록시드 보조제의 존재시 세 개의 다른 접합체의 두 번의 투여 (각각 1 μg)로 면역화되었다.
표 15: 활성 모자 챌린지 마우스 모델을 사용하여 TT 또는 CRM 197 및 다른 퍼센트의 산화에 접합된 GBS 혈청형 Ia 및 III 캡슐형 당류의 보호 수준, 항체 적정 농도 및 살균 적정 농도의 결정.
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
- 적용할 수 없음
댐이 산화된 당류로부터 제조된 접합체로 면역화될 때 생존율은 15-20%에 도달하였다. 항체 적정 농도는 기능에 어떤 영향도 없이 산화의 수준의 증가와 함께 증가하였다. 살균 적정 농도는 더 높은 항체 적정 농도로 증가하지 않았다. 이들 결과 및 추가적인 실험 (데이터 미도시)에 기초하여, 세 개의 혈청형 모두에 대한 CPS 산화의 최적의 퍼센트는 10 내지 30%인 것으로 한정되었다.
토끼 및 래트에서 생식 및 발달 독성학 연구
두 종의 결과는 배아 또는 태아 발달에 대한 혈청형 Ia, Ib 및 III/CRM 197 접합체의 효과가 없다는 것을 나타냈다.
토끼에서, 세 개의 접합체와 알루미늄 히드록시드 보조제의 조합은 제 0일에 교배 (전-교배 기간) 및 임신 제 7일 및 제 20일 또는 단지 임신 제 7일 또는 제 20일에 관하여 제 -35일, 제 -21일 및 제 -7일에 20/20/20 μg (각각의 당류의 질량에 기초)의 임상 용량으로 근육 내 주사에 의해 투여되었다. 모체 독성에서 일어난 치료는 어느 용량 수준에서도 배아 치사율, 태아 독성 또는 최기성의 교배 또는 증거에 효과를 미치지 않았다.
래트에서, 조합이 투여될 때 유사하게 모체 독성 또는 생식 기능에 대한 효과 및 배아-태아 발달의 증거가 없었다, 3번의 (임신 중에만) 또는 6번의 (임신 전에 및 임신 중에) 주사로 식염수에서 조합 대 알루미늄 히드록시드 보조제에서 조합이 투여된 그룹 사이에서 차이가 나타나지 않았다. 주사는 제 0일 뿐만 아니라 임신 제 6일, 제 12일 및 제 17일 또는 단지 임신의 제 6일, 제 12일 및 제 17일에 교배에 관하여 제 -35일, 제 -21일 및 제 -7일에 제공되었다. 전-이유기 중에 F1 세대 새끼 생존, 임상 조건 또는 체중에 대한 효과가 없다.
사람 연구 (1)
이 연구는 일가 GBS 혈청형 Ia 캡슐형 당류-CRMl 97 접합체 백신을 조사하였다. 테스트 그룹의 10명의 대상체는 5, 10 또는 20 μg (당류의 질량으로서 측정됨) 용량으로 1번 또는 2번 주사가 투여되었다. 3명 및 2명의 대상체의 플라세보 그룹은 각각 1번 또는 2번의 식염수의 주사가 투여되었다. 혈액은 ELISA에 의한 분석을 위해 선별 및 첫 번째 주사의 1개월 후에 각각의 대상에서 뽑았다. 추가적으로, 3 개월의 연구에서 2-주사 그룹은 그들이 두 번째 주사를 받은 시간에 채혈하였고, 또 다른 채혈을 위해 1 개월 후 반환하였다. 추가의 채혈은 대상체가 받은 최종 주사의 6, 12 및 24 개월 후에 수행되었다.
ELISA는 GBS Ia (또는 하기 설명된 연구에서 Ib 및 III)에 대한 특이적 항체의 농도를 측정한다. 미세 적정 플레이트를 1 μg/ml의 적절한 GBS 당류 (HSA에 접합됨)로 코팅하였고 37℃에서 1시간 동안 연구 대상체의 혈청과 함께 배양하였다. 3번 세척 후, 플레이트는 37℃에서 90분 동안 알칼린 포스파타제 (AP) 표지된 항-사람 IgG 2차 항체와 함께 배양 후 이어서 추가적으로 3번 세척하였다. 기질 (pNPP)을 플레이트에 추가하였고 상온에서 30분 동안 배양하였다. AP는 기질의 405 nm에서 ELISA 리더로 정량될 수 있는 비색 반응 (colorimetric reaction)을 발생시키는 가수분해를 촉진한다. 표준 곡선을 이용하여 항체 농도의 평가를 수행하였다. 각각의 그룹에 대한 항-Ia 항체의 기하학적 평균 농도 (μg/ml)의 요약은 하기 표 16에 제공된다:
표 16: 일가 GBS 혈청형 Ia 캡슐형 당류- CRMl 97 접합체 백신 연구에 대한 기하학적 평균 농도 (및 기하학적 평균 비율).
Figure pct00054
+ 두 번의 주사
전체적으로 GMS 데이터는 베이스라인 및 이후의 시점 사이에서 큰 증가를 나타내고 (예를 들어, GMC는 최종 백신 접종의 1 개월 후에 6 내지 43 μg/ml의 범위에 있다), 24 개월의 연구에서, 시간이 흐름에 따라 감소하지만, 그룹 GMC는 베이스라인에서보다 수배 높았다 (GMR은 24 개월에 7 내지 14의 범위에 있다). GMC 포인트 평가에 의해 판단하면, 단일 백신 접종으로서 5 μg의 용량을 받는 그룹이 최종 백신 접종의 1 개월 후에 가장 높은 전체 반응을 가졌다.
최종 백신 접종의 1 개월 후에, 3 μg/mL 이상의 항체 수준을 갖는 대상체의 수는 다른 용량을 통해 유사한 수의 "응답자" (5, 10 및 20 용량에 대하여 20 외에 각각 11, 13 및 12), 및 다른 백신 접종 계획 (둘 다에 대하여 20 중에 18)을 나타냈다 (데이터 미도시). 5 μg/mL 이상의 항체 수준을 갖는 대상체의 퍼센트는 같은 관찰을 확인하였다 (데이터 미도시). 이들 컷오프는 반응이 보호의 잠재적인 혈청학적 관계에 관하여 평가되는 것을 허용하도록 하였다 (참고문헌 252에 기초). 이들 데이터는 두 번째 백신 접종 또는 더 높은 백신 용량에 의해 관찰 가능한 기여가 없다는 것을 제안한다. 용량-반응이 관찰되지 않았기 때문에, 5 μg 이하의 용량이 어른 집단에서 최적의 용량인 것이 가능할 수도 있다. 5 및 20 μg을 받은 그룹에 대하여 제 1의 주사에 비해 제 2의 주사의 투여로부터 지속적인 이점이 관찰되지 않았다. 10 μg 용량을 받은 그룹은 제 1의 주사 주사에 대하여 제 2의 주사 후에 더 높은 피크 반응을 나타냈지만 (백신 접종의 1 개월 후에), 이 경향은 다음 (평형 상태) 시점에서 반대가 되었다.
많은 다른 기준을 기반으로 안전성 분석을 평가하였다. 안전성 문제는 눈에 띄지 않았고, 용량 의존적 반응은 뚜렷하지 않았다.
사람 연구 (2)
이 연구는 일가 GBS 혈청형 Ib 및 III 캡슐형 당류-CRM 197 접합체 백신을 조사하였다. 테스트 그룹의 10명의 대상체는 5, 10 또는 20 μg (당류의 질량으로서 측정됨) 용량으로 1 또는 2번의 주사가 투여된다. 3 및 2명의 대상체의 플라세보 그룹은 각각 식염수의 1 및 2번의 투여를 받았다. ELISA에 의한 분석을 위해 혈액을 각각의 대상체로부터 스크리닝시 및 첫 번째 주사의 1 개월 후에 채취하였다. 추가적으로, 3 개월의 연구에서, 2-주사 그룹을 그들이 두 번째 주사를 받은 시점에 채혈하였고, 또 다른 채혈을 위해 1 개월 후에 돌아왔다. 추가의 채혈을 대상체가 받은 최종 주사의 6, 12 및 24 개월 후에 수행하였다.
표 17: 일가 GBS 혈청형 III 및 lb 캡슐형 당류- CRMl 97 접합체 백신 연구에 대한 기하학적 평균 농도 (및 기하학적 평균 비율).
Figure pct00055
Figure pct00056
다시 한 번, 한 번에 비해 두 번의 주사의 투여의 유의한 농도-반응 또는 이점이 이 작은 연구에서 관찰되지 않았다.
많은 다른 기준에 기초하여 안정성 분석을 평가하였다. 안전 문제가 두드러지지 않았고, 용량 의존 반응은 뚜렷하지 않다. 반응원성 지표 중에, 주사 부위의 고통 (혈청형 Ib에 대하여 98번 주사 중에 15번 발생, 및 혈청형 III에 대하여 96번의 주사 중에 14번 발생)은 혈청형 둘 다에 대한 반응형 국소 반응에서 가장 일반적인 불평이었고, 두통은 반응형 전신 반응의 하나였지만, 플라세보 및 백신 접종된 개개 사이에서 명백한 차이는 관찰되지 않았다.
사람 연구 (3)
이 연구는 건강한, 비-임신 여성에서 삼가 GBS 혈청형 Ia, Ib 및 III 캡슐형 당류-CRM 197 접합체 백신을 조사하였다. 두 개의 다른 백신 조제물을 연구하였고, 각각은 같은 비율로 세 개의 당류와 결합하였다. Alum 보조제와 함께 및 알루미늄 보조제 없이 두 개의 다른 용량 (0.5 ml에 5 μg 및 20 μg, 각각의 당류의 질량으로서 측정됨)을 테스트하였다. 연구는 또한 각각의 조제물에 대한 근육 내 1- 및 2-주사 (30일 간격) 계획을 평가하였다. 백신은 또한 4.5 mg 염화 나트륨, 0.34 mg 칼륨 이수소 포스페이트 및 7.5 mg 만니톨을 포함하였다. 연구 그룹은 하기 표 18에서 요약된다. 20명의 대상체로 플라세보 그룹 (두 번의 0.9% 식염수 주사, 30일 간격)을 또한 테스트하였다.
표 18: 삼가 GBS 혈청형 Ia, Ib 및 III 캡슐형 당류- CRM 197 접합체 백신 연구를 위한 연구 그룹
Figure pct00057
ELISA에 의한 면역원성의 분석을 위해 혈액을 각각의 대상체로부터 스크리닝시 및 첫 번째 주사의 1 개월 후에 채취하였다. 2-주사 그룹은 1 개월 시점에 혈액 채취 후에 두 번째 주사를 받았다. 3 개월의 연구에서 모든 그룹으로부터 혈액을 또한 채취하였다. 각각의 그룹에 대하여 항-Ia, Ib 및 III 항체의 기하학적 평균 농도의 요약 (베이스라인 항체 농도를 위해 조정되고 플라세보 그룹은 제외함)은 하기 표 19에 제공된다.
표 19: 삼가 GBS 혈청형 Ia , Ib 및 III 캡슐형 당류- CRM 197 접합체 백신 연구에 대한 기하학적 평균 농도 (및 기하학적 평균 비율)
Figure pct00058
Figure pct00059
백신은 면역원성이고, 대상체의 80% 내지 100%에서 다른 혈청형을 통해 GBS 특이적 항체의 적어도 2배 증가를 유발한다. 8개의 그룹의 GMC의 비교는 단일 주사와 비교하여 두 번째 주사의 기여 없음; 보조제 없음과 비교하여 Alum 보조제의 포함으로부터 기여 없음; 및 5/5/5 μg에 대하여 20/20/20 μg의 더 높은 용량으로부터 기여 없음을 나타냈다.
더 특이적으로, GBS 혈청형 (Ia, Ib 또는 III) 중 어느 것에 대하여 단지 한 번의 백신 주사를 받는 사람들과 비교하여 두 번의 백신 주사를 받는 대상체 중에 항체 반응의 일관된 증가는 없었다. 용량 (5/5/5 또는 20/20/20 μg) 또는 조제물 (Alum 없음 또는 Alum 보조제)와 상관없이 두 번째 백신 주사의 기여의 부족이 관찰되었다. GBS Ia에 대하여, 8개의 그룹 각각에 대한 GMC 측정값은 제 61일의 연구에서 7 내지 20 μg/ml의 범위에 있었다. 이들 결과로부터, 한 번의 주사 (GMC 범위 [9-20 μg/ml] (95%) CI 모두 중복)와 비교하여 두 번의 주사 (GMC 범위 [7-16 μg/ml])의 기여가 없음이 관찰되었다. 게다가, 한 번 대 두 번의 주사의 비율은 1.2였다 [95% 이하의 CI (0.7, 2.0)]. 이 결과는 한 번 대 두 번의 주사의 실제적인 등량을 표시한다 (p-값 = 0.5). GBS Ib에 대하여, 8개의 그룹의 각각에 대한 GMC 측정값은 제 61일의 연구에서 2-7 μg/ml의 범위에 있었다. 한 번의 주사 (GMC 범위 [4-7 μg/ml] (95%) CI 모두 중첩))와 비교하여 두 번의 주사 (GMC 범위 [2-5 μg/ml])의 기여 없음이 관찰되었다. 이 때, 한 번 대 두 번의 주사의 비율은 1.2였다 [95% 이하의 CI (0.7, 2.0)]. 다시 한 번, 이 결과는 실제적인 등량을 표시한다 (p-값 = 0.5). GBS III에 대하여, 8개의 그룹의 각각에 대한 측정값은 제 61일의 연구에서 5-13 μg/ml의 범위에 있었다. 한 번의 주사 (GMC 범위 [5-13 μg/ml] (95% CI 모두 중첩))와 비교하여 두 번의 주사 (GMC 범위 [5-11 μg/ml])의 기여 없음이 관찰되었다. 한 번 대 두 번의주사의 비율은 0.94였으며 [95% CI (0.55, 1.66], 등량을 표시한다 (p-값 = 0.8).
유사하게, Alum 없음과 비교하여 Alum의 포함에서 GMC의 추가된 기여가 없었다. 용량 (5/5/5 또는 20/20/20 μg) 또는 주사 횟수에 상관없이 Alum 보조제의 기여의 이 부족이 관찰되었고 세 개의 혈청형 모두 (Ia, Ib 및 III)에 걸쳐 나타났다. GBS Ia에 대하여, 8개의 그룹에 걸쳐 GMC는 제 61일의 연구에서 7-20 μg/ml의 범위에 있었고 Alum 없음 (GMC 범위 [13-16 μg/ml] (95%) CI 모두 중첩))과 비교하여 Alum (GMC 범위 [7-15 μg/ml])의 기여가 없음을 나타냈다. Alum 그룹과 비교하여 Alum 없음 그룹에 대한 그룹 GMC의 비율은 1.6 [95% 이하의 CI (0.9, 2.6)]이었으며, 이것은 Alum을 갖는 백신 조제물에 비해 Alum이 없는 반응이 잠재적으로 더 크다 (p-값 = 0.11)는 것을 제안한다. GBS Ib에 대하여, GMC는 제 61일의 연구에서 2-7 μg/ml의 범위에 있었고 Alum 없음 (GMC 범위 [4-7 μg/ml] (95% CI 모두 중첩))과 비교하여 Alum (GMC 범위 [2-4 μg/ml])의 기여가 없음을 나타냈다. Alum 그룹과 비교하여 Alum 없음에 대하여 그룹 GMC의 비율은 GMC 값의 거의 등량을 나타내는 (p-값 = 0.2) 1.4 [95% 이하의 CI (0.8, 2.4)]였다. GBS III에 대하여, 제 61일의 연구에서 GMC는 5-13 μg/ml의 범위에 있었고 Alum 없음 (GMC 범위 [5-13 μg/ml] (95% CI 모두 중첩))과 비교하여 Alum (GMC 범위 [5-11 μg/ml])의 기여가 없음을 나타냈다. Alum 그룹과 비교하여 Alum 없음 그룹에 대한 그룹 GMC의 비율은 거의 등량을 나타내는 (p-값 = 0.7) 1.09 (95% 이하의 CI (0.6, 1.9))였다.
결국, 데이터는 두 번의 용량 (접합체에서 세 개의 당류의 각각의 5 대 20 μg)의 평가를 허용한다. 결과는 더 높은 용량 (20 μg)이 더 높은 항체 반응을 유발하지 않는다는 것을 제안한다. 특히, 5 μg을 받는 대상체 (모든 그룹에 걸쳐) 및 20 μg을 받는 대상체 (모든 그룹에 걸쳐)에 대한 GMC의 비율은 GBS Ia에 대하여 1.2 [95% CI (0.7, 2.1)]; GBS Ib에 대하여 0.7 [95% CI (0.4, 1.2)] 및 GBS III에 대하여 1.4 [95% CI (0.9, 2.5)]이다. 이들 비율들은 1에 근접하고 1과 동일함에 대한 통계적 테스트의 p-값은 세 개의 혈청형 모두에 대하여 0.15 이상이며, 두 개의 용량 용법 사이에서 유발된 항체의 수준의 인식 가능한 차이가 없음을 제안한다.
안전성은 국소 및 전신 반응원성의 발생률, 이상반응 및 심각한 이상반응, 뿐만 아니라 임상적 실험 결과에 의해 측정되었다. 삼가 GBS 백신은 플라세보와 비교할 때 8개의 백신 연구 그룹 모두에서 안전하고 효과적이었다. 안전성을 반응의 심각성과 함께 각각의 백신 접종의 7일 후에 발생하는 반응형 국소 (즉, 주사 부위 통증, 출혈, 홍반, 경화 및 부기) 및 반응형 전신 (즉, 오한, 구역질, 불쾌감, 근육통, 두통, 피로, 관절통, 발진, 발열 [38℃ 이상의 액성 온도로서 한정됨], 등) 반응; 각각의 백신 접종의 1일 내지 23일 후에 보고된 다른 모든 이상 반응; 최대 61일 동안 백신 그룹 당, 연구의 중단을 일으키는, 보고된 심각한 이상 반응 및/또는 이상 반응을 갖는 대상체의 퍼센트에 의해 평가하였다.
사람 연구 (4)
연구 항목에서 검출 이하의 항체 (Ab) 수준 (혈청형 Ia, Ib 및 III, 각각에 대하여 0.4, 0.084 및 0.068 μg/ml)을 갖는 대상체의 반응은 특히 흥미로웠다. 이 서브세트 분석을 상기 사람 연구 (3)의 데이터에서 수행하였다. 각각의 혈청형에 대하여, 데이터를 다음으로서 평가하였다:
(a) 각각의 주사/조제물/용량 그룹에 대한 GMC, 및 해당하는 95% CI
(b) 그룹 배치에 상관없이 1번의 주사를 받는 모든 대상체를 통한 GMC, 이것을 2번의 주사를 받는 모든 대상체의 GMC와 비교하였다. 유사하게, 알루미늄을 받는 대상체의 GMC와 비교되는 보조제를 받지 않는 대상체의 GMC, 뿐만 아니라 20/20/20 μg을 받는 모든 대상체의 GMC와 비교되는 5/5/5 μg 용량을 받는 GMC.평가는 계산된 비율 주위에서 양면 95%의 CI와 함께, GMC의 비율에 기초하였다.
(c) 가장 낮은 검출의 절반으로 평가되는 (lld), 베이스라인으로부터 적어도 4배의 변화를 갖는 대상체의 비율.
일반적으로, 대략 25% 및 50%의 여성들이 혈청형 III 및 Ia/Ib 각각에 대하여 검출 한계 이하의 Ab 수준을 나타냈다. 베이스라인과 비교하여 (베이스라인 값이 절반 lld가 할당된 경우) 제 61일에서 Ab 수준의 4배 이상의 증가를 달성하는 이 서브세트에서 대상체의 퍼센트는 64-95% (혈청형 Ia), 80-100% (혈청형 III) 및 81-100% (혈청형 Ib)의 범위에 있다.
전체 연구 코호트로부터 결과와 유사하게, 연구 항목에서 검출 불가능한 Ab 수준을 갖는 대상체는 또한 2번의 주사 (1번의 주사에 대하여), 더 높은 용량 (더 낮은 용량에 대하여) 또는 Alum의 포함 (보조제 없음에 대하여)의 추가적인 이익을 나타내는데 실패한다. GMC의 비율 (제 61일에)은 모든 1번의 주사 대 모든 2번의 주사 대상체에 대하여 1.1 (0.6-1.8; 혈청형 Ia), 0.7 (0.3-1.5; 혈청형 III) 및 0.9 (0.5-1.4; 혈청형 Ib)였고; 모든 5 μg 대 모든 20 μg 용량 대상체에 대하여 1.3 (0.8-2.1; 혈청형 Ia), 1.4 (0.7-2.8; 혈청형 III) 및 1.4 (0.9-2.3; 혈청형 Ib)였고; 모든 보조제 없음 대상체 대 모든 Alum 대상체에 대하여 1.4 (0.8-2.4; 혈청형 Ia), 1 (0.5-2.0; 혈청형 III) 및 1.7 (1.1-2.7; 혈청형 Ib)이었다.
마우스 연구 (15)
마우스를 제 0일에 CRM 197 및 알루미늄 히드록시드 보조제 또는 알루미늄 히드록시드 보조제 단독으로 프라이밍하였고 제 21일 및 제 35일에 보조제 알루미늄 히드록시드 보조제와 함께 또는 없이 GBS 혈청형 III/CRM 197 접합체로 면역화하였다. 혈액을 제 0일에 및 제 21일 및 제 35일에 백신 접종 전에 채취하였다. GBS 혈청형 III 다당류 및 CRM 197 담체 단백질에 대한 IgG/IgM 혈청 적정 농도를 혈액 샘플로부터 측정하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, CRM 197 담체로 프라이밍은 비프라이밍 마우스 (P≤ 0.0002)와 비교하여 한 번 및 두 번의 백신 투여 (보조제와 함께 또는 없이) 후 담체에 대하여 크게 더 높은 IgG 항체 반응을 일으켰다. 프라이밍은 또한 두 번의 백신 투여 (보조제와 함께 또는 없이) 후 GBS 혈청형 III 다당류에 대한 양호한 항체 반응을 일으켰다. 비프라이밍 마우스는 프라이밍 마우스에서 관찰된 것과 비슷한 항-다당류 항체 적정 농도에 도달하기 위해 보조제를 필요로 하였다. 비프라이밍 마우스에서, 당접합체 백신을 보조제 없이 투여하였을 때, 항체 적정 농도는 다른 그룹에서보다 크게 더 낮다 (P ≤ 0.03).
그러므로 보조제 없이 투여될 때, CRM 197로 프라이밍은 접합체의 GBS 캡슐형 당류에 대한 다음 항체 반응에 대하여 긍정적 영향을 갖는 것으로 보인다.
래트 및 토끼 연구
삼가 GBS 혈청형 Ia, Ib 및 III 캡슐형 당류-CRM 197 접합체 백신의 잠재적인 생식 및 발달 독성을 평가하기 위한 연구를 래트 및 토끼에서 수행하였다.
래트 연구를 하기 표 20에 따라 수행하였다:
표 20: 래트 연구
Figure pct00060
† 혈청형 Ia/Ib/III에 대하여
* 알루미늄 히드록시드, 2 mg/mL
연구 제 1일, 제 15일, 제 29일에 (사전 교배 기간) 및/또는 임신 제 6일, 제 12일 및 제 17일에 알루미늄 히드록시드와 함께 또는 없이 20 μg의 용량으로 암컷 래트에게 삼가 백신의 피하 투여는 생식 기능 또는 배아 태아 발달에 대하여 모체 독성 또는 효과를 일으키지 않았다. 알루미늄 히드록시드 보조제와 함께 또는 없이 삼가 백신의 세 번 또는 여섯 번의 주사로 처리된 그룹들 사이에서 차이는 명시되지 않았다. 추가적으로, F1 세대 새끼 생존, 임상적 조건 또는 체중 또는 생식 능력에 대한 효과는 없었다.
토끼 연구를 하기 표 21에 따라 수행하였다:
표 21: 토끼 연구
Figure pct00061
† 혈청형 Ia/Ib/III에 대하여
* 알루미늄 히드록시드, 2 mg/mL
연구 제 1일, 제 15일 및 제 29일 (사전 교배 기간) 및/또는 임신 제 7일 및 제일에, 암컷 토끼에게 삼가 백신 플러스 알루미늄 히드록시드의 근육 내 투여는 모체 독성, 교배에 대한 영향 또는 배아 치사율, 태아 독성 또는 최기성의 증거를 발생시키지 않았다. 대조군의 성체 F1 세대 및 백신-처리된 것들 사이에서 차이가 없었다.
이들 연구는 삼가 백신이 면역원성이고 임신한 래트 또는 토끼 또는 그것들의 새끼에 대하여 어떤 출생 전 또는 출생 후 효과도 갖지 않는다는 것을 나타냈다.
안정성 연구
삼가 GBS 혈청형 Ia, Ib 및 III 캡슐형 당류-CRM 197 접합체 백신의 안정성은 2개의 다른 온도에서 저장의 1 개월 중에 측정되었다. 백신을 각각 10 mM KH2PO4 및 3% 만니톨에서 80 μg 당류/ml로 존재하는, 세 개의 당접합체를 통합함으로써 조제하였다. 3 ml 일회 용량 바이알을 0.3 ml의 용액으로 채웠고, 브로모부틸 실리콘화된 고무 마개로 부분적으로 덮었고 냉동-건조 사이클에 제출하였다. 동결건조 공정이 끝나면, 바이알을 2-8℃ 또는 36-38℃에서 보관하였다. 36-38℃에서 저장시 자유 당류 함량의 약간의 증가가 검출되었다 (HPAEC-PAD를 사용하여). 하지만, 전체적인 삼가 백신은 2-8℃ 및 36-38℃ 둘 다에서 최대 1 개월까지 저장시 안정하였다.
본 발명은 예시의 방법에 의해서만 설명되고 본 발명의 범위 및 사상 내에 유지되면 변형이 이루어질 수도 있다는 것으로 이해될 것이다.
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Asp Ala Thr Pro Asp Thr Ile Lys Asn Asn Lys 465 470 475 480 Arg Pro Ser Ile Pro Asn Thr Gly Gly Ile Gly Thr Ala Ile Phe Val 485 490 495 Ala Ile Gly Ala Ala Val Met Ala Phe Ala Val Lys Gly Met Lys Arg 500 505 510 Arg Thr Lys Asp Asn 515 <210> 7 <211> 525 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of GBS80 sequenced from Streptococcus agalactiae serotype V strain 2603 V/R lacking the C-terminal transmembrane region and downstream amino acids <400> 7 Met Lys Leu Ser Lys Lys Leu Leu Phe Ser Ala Ala Val Leu Thr Met 1 5 10 15 Val Ala Gly Ser Thr Val Glu Pro Val Ala Gln Phe Ala Thr Gly Met 20 25 30 Ser Ile Val Arg Ala Ala Glu Val Ser Gln Glu Arg Pro Ala Lys Thr 35 40 45 Thr Val Asn Ile Tyr Lys Leu Gln Ala Asp Ser Tyr Lys Ser Glu Ile 50 55 60 Thr Ser Asn Gly Gly Ile Glu Asn Lys Asp Gly Glu Val Ile Ser Asn 65 70 75 80 Tyr Ala Lys Leu Gly Asp Asn Val Lys Gly Leu Gln Gly Val Gln Phe 85 90 95 Lys Arg Tyr Lys Val Lys Thr Asp Ile Ser Val Asp Glu Leu Lys Lys 100 105 110 Leu Thr Thr Val Glu Ala Ala Asp Ala Lys Val Gly Thr Ile Leu Glu 115 120 125 Glu Gly Val Ser Leu Pro Gln Lys Thr Asn Ala Gln Gly Leu Val Val 130 135 140 Asp Ala Leu Asp Ser Lys Ser Asn Val Arg Tyr Leu Tyr Val Glu Asp 145 150 155 160 Leu Lys Asn Ser Pro Ser Asn Ile Thr Lys Ala Tyr Ala Val Pro Phe 165 170 175 Val Leu Glu Leu Pro Val Ala Asn Ser Thr Gly Thr Gly Phe Leu Ser 180 185 190 Glu Ile Asn Ile Tyr Pro Lys Asn Val Val Thr Asp Glu Pro Lys Thr 195 200 205 Asp Lys Asp Val Lys Lys Leu Gly Gln Asp Asp Ala Gly Tyr Thr Ile 210 215 220 Gly Glu Glu Phe Lys Trp Phe Leu Lys Ser Thr Ile Pro Ala Asn Leu 225 230 235 240 Gly Asp Tyr Glu Lys Phe Glu Ile Thr Asp Lys Phe Ala Asp Gly Leu 245 250 255 Thr Tyr Lys Ser Val Gly Lys Ile Lys Ile Gly Ser Lys Thr Leu Asn 260 265 270 Arg Asp Glu His Tyr Thr Ile Asp Glu Pro Thr Val Asp Asn Gln Asn 275 280 285 Thr Leu Lys Ile Thr Phe Lys Pro Glu Lys Phe Lys Glu Ile Ala Glu 290 295 300 Leu Leu Lys Gly Met Thr Leu Val Lys Asn Gln Asp Ala Leu Asp Lys 305 310 315 320 Ala Thr Ala Asn Thr Asp Asp Ala Ala Phe Leu Glu Ile Pro Val Ala 325 330 335 Ser Thr Ile Asn Glu Lys Ala Val Leu Gly Lys Ala Ile Glu Asn Thr 340 345 350 Phe Glu Leu Gln Tyr Asp His Thr Pro Asp Lys Ala Asp Asn Pro Lys 355 360 365 Pro Ser Asn Pro Pro Arg Lys Pro Glu Val His Thr Gly Gly Lys Arg 370 375 380 Phe Val Lys Lys Asp Ser Thr Glu Thr Gln Thr Leu Gly Gly Ala Glu 385 390 395 400 Phe Asp Leu Leu Ala Ser Asp Gly Thr Ala Val Lys Trp Thr Asp Ala 405 410 415 Leu Ile Lys Ala Asn Thr Asn Lys Asn Tyr Ile Ala Gly Glu Ala Val 420 425 430 Thr Gly Gln Pro Ile Lys Leu Lys Ser His Thr Asp Gly Thr Phe Glu 435 440 445 Ile Lys Gly Leu Ala Tyr Ala Val Asp Ala Asn Ala Glu Gly Thr Ala 450 455 460 Val Thr Tyr Lys Leu Lys Glu Thr Lys Ala Pro Glu Gly Tyr Val Ile 465 470 475 480 Pro Asp Lys Glu Ile Glu Phe Thr Val Ser Gln Thr Ser Tyr Asn Thr 485 490 495 Lys Pro Thr Asp Ile Thr Val Asp Ser Ala Asp Ala Thr Pro Asp Thr 500 505 510 Ile Lys Asn Asn Lys Arg Pro Ser Ile Pro Asn Thr Gly 515 520 525 <210> 8 <211> 520 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of GBS80 sequenced from Streptococcus agalactiae serotype V strain 2603 V/R lacking the transmembrane and cytoplasmic regions and the cell wall anchor motif <400> 8 Met Lys Leu Ser Lys Lys Leu Leu Phe Ser Ala Ala Val Leu Thr Met 1 5 10 15 Val Ala Gly Ser Thr Val Glu Pro Val Ala Gln Phe Ala Thr Gly Met 20 25 30 Ser Ile Val Arg Ala Ala Glu Val Ser Gln Glu Arg Pro Ala Lys Thr 35 40 45 Thr Val Asn Ile Tyr Lys Leu Gln Ala Asp Ser Tyr Lys Ser Glu Ile 50 55 60 Thr Ser Asn Gly Gly Ile Glu Asn Lys Asp Gly Glu Val Ile Ser Asn 65 70 75 80 Tyr Ala Lys Leu Gly Asp Asn Val Lys Gly Leu Gln Gly Val Gln Phe 85 90 95 Lys Arg Tyr Lys Val Lys Thr Asp Ile Ser Val Asp Glu Leu Lys Lys 100 105 110 Leu Thr Thr Val Glu Ala Ala Asp Ala Lys Val Gly Thr Ile Leu Glu 115 120 125 Glu Gly Val Ser Leu Pro Gln Lys Thr Asn Ala Gln Gly Leu Val Val 130 135 140 Asp Ala Leu Asp Ser Lys Ser Asn Val Arg Tyr Leu Tyr Val Glu Asp 145 150 155 160 Leu Lys Asn Ser Pro Ser Asn Ile Thr Lys Ala Tyr Ala Val Pro Phe 165 170 175 Val Leu Glu Leu Pro Val Ala Asn Ser Thr Gly Thr Gly Phe Leu Ser 180 185 190 Glu Ile Asn Ile Tyr Pro Lys Asn Val Val Thr Asp Glu Pro Lys Thr 195 200 205 Asp Lys Asp Val Lys Lys Leu Gly Gln Asp Asp Ala Gly Tyr Thr Ile 210 215 220 Gly Glu Glu Phe Lys Trp Phe Leu Lys Ser Thr Ile Pro Ala Asn Leu 225 230 235 240 Gly Asp Tyr Glu Lys Phe Glu Ile Thr Asp Lys Phe Ala Asp Gly Leu 245 250 255 Thr Tyr Lys Ser Val Gly Lys Ile Lys Ile Gly Ser Lys Thr Leu Asn 260 265 270 Arg Asp Glu His Tyr Thr Ile Asp Glu Pro Thr Val Asp Asn Gln Asn 275 280 285 Thr Leu Lys Ile Thr Phe Lys Pro Glu Lys Phe Lys Glu Ile Ala Glu 290 295 300 Leu Leu Lys Gly Met Thr Leu Val Lys Asn Gln Asp Ala Leu Asp Lys 305 310 315 320 Ala Thr Ala Asn Thr Asp Asp Ala Ala Phe Leu Glu Ile Pro Val Ala 325 330 335 Ser Thr Ile Asn Glu Lys Ala Val Leu Gly Lys Ala Ile Glu Asn Thr 340 345 350 Phe Glu Leu Gln Tyr Asp His Thr Pro Asp Lys Ala Asp Asn Pro Lys 355 360 365 Pro Ser Asn Pro Pro Arg Lys Pro Glu Val His Thr Gly Gly Lys Arg 370 375 380 Phe Val Lys Lys Asp Ser Thr Glu Thr Gln Thr Leu Gly Gly Ala Glu 385 390 395 400 Phe Asp Leu Leu Ala Ser Asp Gly Thr Ala Val Lys Trp Thr Asp Ala 405 410 415 Leu Ile Lys Ala Asn Thr Asn Lys Asn Tyr Ile Ala Gly Glu Ala Val 420 425 430 Thr Gly Gln Pro Ile Lys Leu Lys Ser His Thr Asp Gly Thr Phe Glu 435 440 445 Ile Lys Gly Leu Ala Tyr Ala Val Asp Ala Asn Ala Glu Gly Thr Ala 450 455 460 Val Thr Tyr Lys Leu Lys Glu Thr Lys Ala Pro Glu Gly Tyr Val Ile 465 470 475 480 Pro Asp Lys Glu Ile Glu Phe Thr Val Ser Gln Thr Ser Tyr Asn Thr 485 490 495 Lys Pro Thr Asp Ile Thr Val Asp Ser Ala Asp Ala Thr Pro Asp Thr 500 505 510 Ile Lys Asn Asn Lys Arg Pro Ser 515 520 <210> 9 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of GBS80 sequenced from Streptococcus agalactiae serotype V strain 2603 V/R lacking the leader or signal sequence region, the transmembrane and cytoplasmic regions and the cell wall anchor motif <400> 9 Ala Glu Val Ser Gln Glu Arg Pro Ala Lys Thr Thr Val Asn Ile Tyr 1 5 10 15 Lys Leu Gln Ala Asp Ser Tyr Lys Ser Glu Ile Thr Ser Asn Gly Gly 20 25 30 Ile Glu Asn Lys Asp Gly Glu Val Ile Ser Asn Tyr Ala Lys Leu Gly 35 40 45 Asp Asn Val Lys Gly Leu Gln Gly Val Gln Phe Lys Arg Tyr Lys Val 50 55 60 Lys Thr Asp Ile Ser Val Asp Glu Leu Lys Lys Leu Thr Thr Val Glu 65 70 75 80 Ala Ala Asp Ala Lys Val Gly Thr Ile Leu Glu Glu Gly Val Ser Leu 85 90 95 Pro Gln Lys Thr Asn Ala Gln Gly Leu Val Val Asp Ala Leu Asp Ser 100 105 110 Lys Ser Asn Val Arg Tyr Leu Tyr Val Glu Asp Leu Lys Asn Ser Pro 115 120 125 Ser Asn Ile Thr Lys Ala Tyr Ala Val Pro Phe Val Leu Glu Leu Pro 130 135 140 Val Ala Asn Ser Thr Gly Thr Gly Phe Leu Ser Glu Ile Asn Ile Tyr 145 150 155 160 Pro Lys Asn Val Val Thr Asp Glu Pro Lys Thr Asp Lys Asp Val Lys 165 170 175 Lys Leu Gly Gln Asp Asp Ala Gly Tyr Thr Ile Gly Glu Glu Phe Lys 180 185 190 Trp Phe Leu Lys Ser Thr Ile Pro Ala Asn Leu Gly Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 Phe Glu Ile Thr Asp Lys Phe Ala Asp Gly Leu Thr Tyr Lys Ser Val 210 215 220 Gly Lys Ile Lys Ile Gly Ser Lys Thr Leu Asn Arg Asp Glu His Tyr 225 230 235 240 Thr Ile Asp Glu Pro Thr Val Asp Asn Gln Asn Thr Leu Lys Ile Thr 245 250 255 Phe Lys Pro Glu Lys Phe Lys Glu Ile Ala Glu Leu Leu Lys Gly Met 260 265 270 Thr Leu Val Lys Asn Gln Asp Ala Leu Asp Lys Ala Thr Ala Asn Thr 275 280 285 Asp Asp Ala Ala Phe Leu Glu Ile Pro Val Ala Ser Thr Ile Asn Glu 290 295 300 Lys Ala Val Leu Gly Lys Ala Ile Glu Asn Thr Phe Glu Leu Gln Tyr 305 310 315 320 Asp His Thr Pro Asp Lys Ala Asp Asn Pro Lys Pro Ser Asn Pro Pro 325 330 335 Arg Lys Pro Glu Val His Thr Gly Gly Lys Arg Phe Val Lys Lys Asp 340 345 350 Ser Thr Glu Thr Gln Thr Leu Gly Gly Ala Glu Phe Asp Leu Leu Ala 355 360 365 Ser Asp Gly Thr Ala Val Lys Trp Thr Asp Ala Leu Ile Lys Ala Asn 370 375 380 Thr Asn Lys Asn Tyr Ile Ala Gly Glu Ala Val Thr Gly Gln Pro Ile 385 390 395 400 Lys Leu Lys Ser His Thr Asp Gly Thr Phe Glu Ile Lys Gly Leu Ala 405 410 415 Tyr Ala Val Asp Ala Asn Ala Glu Gly Thr Ala Val Thr Tyr Lys Leu 420 425 430 Lys Glu Thr Lys Ala Pro Glu Gly Tyr Val Ile Pro Asp Lys Glu Ile 435 440 445 Glu Phe Thr Val Ser Gln Thr Ser Tyr Asn Thr Lys Pro Thr Asp Ile 450 455 460 Thr Val Asp Ser Ala Asp Ala Thr Pro Asp Thr Ile Lys Asn Asn Lys 465 470 475 480 Arg Pro Ser <210> 10 <211> 271 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A particularly immunogenic fragment of GBS80 located towards the N-terminus of the protein <400> 10 Ala Glu Val Ser Gln Glu Arg Pro Ala Lys Thr Thr Val Asn Ile Tyr 1 5 10 15 Lys Leu Gln Ala Asp Ser Tyr Lys Ser Glu Ile Thr Ser Asn Gly Gly 20 25 30 Ile Glu Asn Lys Asp Gly Glu Val Ile Ser Asn Tyr Ala Lys Leu Gly 35 40 45 Asp Asn Val Lys Gly Leu Gln Gly Val Gln Phe Lys Arg Tyr Lys Val 50 55 60 Lys Thr Asp Ile Ser Val Asp Glu Leu Lys Lys Leu Thr Thr Val Glu 65 70 75 80 Ala Ala Asp Ala Lys Val Gly Thr Ile Leu Glu Glu Gly Val Ser Leu 85 90 95 Pro Gln Lys Thr Asn Ala Gln Gly Leu Val Val Asp Ala Leu Asp Ser 100 105 110 Lys Ser Asn Val Arg Tyr Leu Tyr Val Glu Asp Leu Lys Asn Ser Pro 115 120 125 Ser Asn Ile Thr Lys Ala Tyr Ala Val Pro Phe Val Leu Glu Leu Pro 130 135 140 Val Ala Asn Ser Thr Gly Thr Gly Phe Leu Ser Glu Ile Asn Ile Tyr 145 150 155 160 Pro Lys Asn Val Val Thr Asp Glu Pro Lys Thr Asp Lys Asp Val Lys 165 170 175 Lys Leu Gly Gln Asp Asp Ala Gly Tyr Thr Ile Gly Glu Glu Phe Lys 180 185 190 Trp Phe Leu Lys Ser Thr Ile Pro Ala Asn Leu Gly Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 Phe Glu Ile Thr Asp Lys Phe Ala Asp Gly Leu Thr Tyr Lys Ser Val 210 215 220 Gly Lys Ile Lys Ile Gly Ser Lys Thr Leu Asn Arg Asp Glu His Tyr 225 230 235 240 Thr Ile Asp Glu Pro Thr Val Asp Asn Gln Asn Thr Leu Lys Ile Thr 245 250 255 Phe Lys Pro Glu Lys Phe Lys Glu Ile Ala Glu Leu Leu Lys Gly 260 265 270 <210> 11 <211> 473 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of SpbI from Streptococcus agalactiae serotype III strain COH1 lacking the N-terminal leader or signal sequence region <400> 11 Ala Glu Thr Gly Thr Ile Thr Val Gln Asp Thr Gln Lys Gly Ala Thr 1 5 10 15 Tyr Lys Ala Tyr Lys Val Phe Asp Ala Glu Ile Asp Asn Ala Asn Val 20 25 30 Ser Asp Ser Asn Lys Asp Gly Ala Ser Tyr Leu Ile Pro Gln Gly Lys 35 40 45 Glu Ala Glu Tyr Lys Ala Ser Thr Asp Phe Asn Ser Leu Phe Thr Thr 50 55 60 Thr Thr Asn Gly Gly Arg Thr Tyr Val Thr Lys Lys Asp Thr Ala Ser 65 70 75 80 Ala Asn Glu Ile Ala Thr Trp Ala Lys Ser Ile Ser Ala Asn Thr Thr 85 90 95 Pro Val Ser Thr Val Thr Glu Ser Asn Asn Asp Gly Thr Glu Val Ile 100 105 110 Asn Val Ser Gln Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Val Ser Ser Thr Val Asn Asn 115 120 125 Gly Ala Val Ile Met Val Thr Ser Val Thr Pro Asn Ala Thr Ile His 130 135 140 Glu Lys Asn Thr Asp Ala Thr Trp Gly Asp Gly Gly Gly Lys Thr Val 145 150 155 160 Asp Gln Lys Thr Tyr Ser Val Gly Asp Thr Val Lys Tyr Thr Ile Thr 165 170 175 Tyr Lys Asn Ala Val Asn Tyr His Gly Thr Glu Lys Val Tyr Gln Tyr 180 185 190 Val Ile Lys Asp Thr Met Pro Ser Ala Ser Val Val Asp Leu Asn Glu 195 200 205 Gly Ser Tyr Glu Val Thr Ile Thr Asp Gly Ser Gly Asn Ile Thr Thr 210 215 220 Leu Thr Gln Gly Ser Glu Lys Ala Thr Gly Lys Tyr Asn Leu Leu Glu 225 230 235 240 Glu Asn Asn Asn Phe Thr Ile Thr Ile Pro Trp Ala Ala Thr Asn Thr 245 250 255 Pro Thr Gly Asn Thr Gln Asn Gly Ala Asn Asp Asp Phe Phe Tyr Lys 260 265 270 Gly Ile Asn Thr Ile Thr Val Thr Tyr Thr Gly Val Leu Lys Ser Gly 275 280 285 Ala Lys Pro Gly Ser Ala Asp Leu Pro Glu Asn Thr Asn Ile Ala Thr 290 295 300 Ile Asn Pro Asn Thr Ser Asn Asp Asp Pro Gly Gln Lys Val Thr Val 305 310 315 320 Arg Asp Gly Gln Ile Thr Ile Lys Lys Ile Asp Gly Ser Thr Lys Ala 325 330 335 Ser Leu Gln Gly Ala Ile Phe Val Leu Lys Asn Ala Thr Gly Gln Phe 340 345 350 Leu Asn Phe Asn Asp Thr Asn Asn Val Glu Trp Gly Thr Glu Ala Asn 355 360 365 Ala Thr Glu Tyr Thr Thr Gly Ala Asp Gly Ile Ile Thr Ile Thr Gly 370 375 380 Leu Lys Glu Gly Thr Tyr Tyr Leu Val Glu Lys Lys Ala Pro Leu Gly 385 390 395 400 Tyr Asn Leu Leu Asp Asn Ser Gln Lys Val Ile Leu Gly Asp Gly Ala 405 410 415 Thr Asp Thr Thr Asn Ser Asp Asn Leu Leu Val Asn Pro Thr Val Glu 420 425 430 Asn Asn Lys Gly Thr Glu Leu Pro Ser Thr Gly Gly Ile Gly Thr Thr 435 440 445 Ile Phe Tyr Ile Ile Gly Ala Ile Leu Val Ile Gly Ala Gly Ile Val 450 455 460 Leu Val Ala Arg Arg Arg Leu Arg Ser 465 470 <210> 12 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of SpbI from Streptococcus agalactiae serotype III strain COH1 lacking the cell wall anchor motif and sequence C-terminal to this motif <400> 12 Met Lys Lys Lys Met Ile Gln Ser Leu Leu Val Ala Ser Leu Ala Phe 1 5 10 15 Gly Met Ala Val Ser Pro Val Thr Pro Ile Ala Phe Ala Ala Glu Thr 20 25 30 Gly Thr Ile Thr Val Gln Asp Thr Gln Lys Gly Ala Thr Tyr Lys Ala 35 40 45 Tyr Lys Val Phe Asp Ala Glu Ile Asp Asn Ala Asn Val Ser Asp Ser 50 55 60 Asn Lys Asp Gly Ala Ser Tyr Leu Ile Pro Gln Gly Lys Glu Ala Glu 65 70 75 80 Tyr Lys Ala Ser Thr Asp Phe Asn Ser Leu Phe Thr Thr Thr Thr Asn 85 90 95 Gly Gly Arg Thr Tyr Val Thr Lys Lys Asp Thr Ala Ser Ala Asn Glu 100 105 110 Ile Ala Thr Trp Ala Lys Ser Ile Ser Ala Asn Thr Thr Pro Val Ser 115 120 125 Thr Val Thr Glu Ser Asn Asn Asp Gly Thr Glu Val Ile Asn Val Ser 130 135 140 Gln Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Val Ser Ser Thr Val Asn Asn Gly Ala Val 145 150 155 160 Ile Met Val Thr Ser Val Thr Pro Asn Ala Thr Ile His Glu Lys Asn 165 170 175 Thr Asp Ala Thr Trp Gly Asp Gly Gly Gly Lys Thr Val Asp Gln Lys 180 185 190 Thr Tyr Ser Val Gly Asp Thr Val Lys Tyr Thr Ile Thr Tyr Lys Asn 195 200 205 Ala Val Asn Tyr His Gly Thr Glu Lys Val Tyr Gln Tyr Val Ile Lys 210 215 220 Asp Thr Met Pro Ser Ala Ser Val Val Asp Leu Asn Glu Gly Ser Tyr 225 230 235 240 Glu Val Thr Ile Thr Asp Gly Ser Gly Asn Ile Thr Thr Leu Thr Gln 245 250 255 Gly Ser Glu Lys Ala Thr Gly Lys Tyr Asn Leu Leu Glu Glu Asn Asn 260 265 270 Asn Phe Thr Ile Thr Ile Pro Trp Ala Ala Thr Asn Thr Pro Thr Gly 275 280 285 Asn Thr Gln Asn Gly Ala Asn Asp Asp Phe Phe Tyr Lys Gly Ile Asn 290 295 300 Thr Ile Thr Val Thr Tyr Thr Gly Val Leu Lys Ser Gly Ala Lys Pro 305 310 315 320 Gly Ser Ala Asp Leu Pro Glu Asn Thr Asn Ile Ala Thr Ile Asn Pro 325 330 335 Asn Thr Ser Asn Asp Asp Pro Gly Gln Lys Val Thr Val Arg Asp Gly 340 345 350 Gln Ile Thr Ile Lys Lys Ile Asp Gly Ser Thr Lys Ala Ser Leu Gln 355 360 365 Gly Ala Ile Phe Val Leu Lys Asn Ala Thr Gly Gln Phe Leu Asn Phe 370 375 380 Asn Asp Thr Asn Asn Val Glu Trp Gly Thr Glu Ala Asn Ala Thr Glu 385 390 395 400 Tyr Thr Thr Gly Ala Asp Gly Ile Ile Thr Ile Thr Gly Leu Lys Glu 405 410 415 Gly Thr Tyr Tyr Leu Val Glu Lys Lys Ala Pro Leu Gly Tyr Asn Leu 420 425 430 Leu Asp Asn Ser Gln Lys Val Ile Leu Gly Asp Gly Ala Thr Asp Thr 435 440 445 Thr Asn Ser Asp Asn Leu Leu Val Asn Pro Thr Val Glu Asn Asn Lys 450 455 460 Gly Thr Glu 465 <210> 13 <211> 438 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of SpbI from Streptococcus agalactiae serotype III strain COH1 lacking the leader or signal sequence region, the cell wall anchor motif and sequence C terminal to this motif <400> 13 Ala Glu Thr Gly Thr Ile Thr Val Gln Asp Thr Gln Lys Gly Ala Thr 1 5 10 15 Tyr Lys Ala Tyr Lys Val Phe Asp Ala Glu Ile Asp Asn Ala Asn Val 20 25 30 Ser Asp Ser Asn Lys Asp Gly Ala Ser Tyr Leu Ile Pro Gln Gly Lys 35 40 45 Glu Ala Glu Tyr Lys Ala Ser Thr Asp Phe Asn Ser Leu Phe Thr Thr 50 55 60 Thr Thr Asn Gly Gly Arg Thr Tyr Val Thr Lys Lys Asp Thr Ala Ser 65 70 75 80 Ala Asn Glu Ile Ala Thr Trp Ala Lys Ser Ile Ser Ala Asn Thr Thr 85 90 95 Pro Val Ser Thr Val Thr Glu Ser Asn Asn Asp Gly Thr Glu Val Ile 100 105 110 Asn Val Ser Gln Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Val Ser Ser Thr Val Asn Asn 115 120 125 Gly Ala Val Ile Met Val Thr Ser Val Thr Pro Asn Ala Thr Ile His 130 135 140 Glu Lys Asn Thr Asp Ala Thr Trp Gly Asp Gly Gly Gly Lys Thr Val 145 150 155 160 Asp Gln Lys Thr Tyr Ser Val Gly Asp Thr Val Lys Tyr Thr Ile Thr 165 170 175 Tyr Lys Asn Ala Val Asn Tyr His Gly Thr Glu Lys Val Tyr Gln Tyr 180 185 190 Val Ile Lys Asp Thr Met Pro Ser Ala Ser Val Val Asp Leu Asn Glu 195 200 205 Gly Ser Tyr Glu Val Thr Ile Thr Asp Gly Ser Gly Asn Ile Thr Thr 210 215 220 Leu Thr Gln Gly Ser Glu Lys Ala Thr Gly Lys Tyr Asn Leu Leu Glu 225 230 235 240 Glu Asn Asn Asn Phe Thr Ile Thr Ile Pro Trp Ala Ala Thr Asn Thr 245 250 255 Pro Thr Gly Asn Thr Gln Asn Gly Ala Asn Asp Asp Phe Phe Tyr Lys 260 265 270 Gly Ile Asn Thr Ile Thr Val Thr Tyr Thr Gly Val Leu Lys Ser Gly 275 280 285 Ala Lys Pro Gly Ser Ala Asp Leu Pro Glu Asn Thr Asn Ile Ala Thr 290 295 300 Ile Asn Pro Asn Thr Ser Asn Asp Asp Pro Gly Gln Lys Val Thr Val 305 310 315 320 Arg Asp Gly Gln Ile Thr Ile Lys Lys Ile Asp Gly Ser Thr Lys Ala 325 330 335 Ser Leu Gln Gly Ala Ile Phe Val Leu Lys Asn Ala Thr Gly Gln Phe 340 345 350 Leu Asn Phe Asn Asp Thr Asn Asn Val Glu Trp Gly Thr Glu Ala Asn 355 360 365 Ala Thr Glu Tyr Thr Thr Gly Ala Asp Gly Ile Ile Thr Ile Thr Gly 370 375 380 Leu Lys Glu Gly Thr Tyr Tyr Leu Val Glu Lys Lys Ala Pro Leu Gly 385 390 395 400 Tyr Asn Leu Leu Asp Asn Ser Gln Lys Val Ile Leu Gly Asp Gly Ala 405 410 415 Thr Asp Thr Thr Asn Ser Asp Asn Leu Leu Val Asn Pro Thr Val Glu 420 425 430 Asn Asn Lys Gly Thr Glu 435 <210> 14 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence upstream of internal methionine codon of wild-type SpbI, containing core Shine-Dalgarno sequence <400> 14 taatggagct gt 12 <210> 15 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 15 Gly Gly Gly Gly 1 <210> 16 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 16 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 17 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 1 5 10 15 Leu <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 18 Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 19 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> W moiety <400> 19 Met Ala Ser 1 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Z moiety <400> 20 His His His His His His 1 5 <210> 21 <211> 941 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of W, X, L and Y moieties <400> 21 Met Ala Ser Ala Glu Thr Gly Thr Ile Thr Val Gln Asp Thr Gln Lys 1 5 10 15 Gly Ala Thr Tyr Lys Ala Tyr Lys Val Phe Asp Ala Glu Ile Asp Asn 20 25 30 Ala Asn Val Ser Asp Ser Asn Lys Asp Gly Ala Ser Tyr Leu Ile Pro 35 40 45 Gln Gly Lys Glu Ala Glu Tyr Lys Ala Ser Thr Asp Phe Asn Ser Leu 50 55 60 Phe Thr Thr Thr Thr Asn Gly Gly Arg Thr Tyr Val Thr Lys Lys Asp 65 70 75 80 Thr Ala Ser Ala Asn Glu Ile Ala Thr Trp Ala Lys Ser Ile Ser Ala 85 90 95 Asn Thr Thr Pro Val Ser Thr Val Thr Glu Ser Asn Asn Asp Gly Thr 100 105 110 Glu Val Ile Asn Val Ser Gln Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Val Ser Ser Thr 115 120 125 Val Asn Asn Gly Ala Val Ile Met Val Thr Ser Val Thr Pro Asn Ala 130 135 140 Thr Ile His Glu Lys Asn Thr Asp Ala Thr Trp Gly Asp Gly Gly Gly 145 150 155 160 Lys Thr Val Asp Gln Lys Thr Tyr Ser Val Gly Asp Thr Val Lys Tyr 165 170 175 Thr Ile Thr Tyr Lys Asn Ala Val Asn Tyr His Gly Thr Glu Lys Val 180 185 190 Tyr Gln Tyr Val Ile 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Arg Gln Glu Glu Leu Asp Lys Gln Tyr Pro 130 135 140 Leu Thr Gly Ala Tyr Glu Asp Thr Lys Glu Ser Tyr Asn Leu Glu His 145 150 155 160 Val Lys Asn Ser Ile Pro Asn Gly Lys Leu Glu Ala Lys Ala Val Asn 165 170 175 Pro Tyr Ser Ser Glu Gly Glu His Ile Arg Glu Ile Gln Glu Gly Thr 180 185 190 Leu Ser Lys Arg Ile Ser Glu Val Asn Asp Leu Asp His Asn Lys Tyr 195 200 205 Lys Ile Glu Leu Thr Val Ser Gly Lys Ser Ile Ile Lys Thr Ile Asn 210 215 220 Lys Asp Glu Pro Leu Asp Val Val Phe Val Leu Asp Asn Ser Asn Ser 225 230 235 240 Met Lys Asn Asn Gly Lys Asn Asn Lys Ala Lys Lys Ala Gly Glu Ala 245 250 255 Val Glu Thr Ile Ile Lys Asp Val Leu Gly Ala Asn Val Glu Asn Arg 260 265 270 Ala Ala Leu Val Thr Tyr Gly Ser Asp Ile Phe Asp Gly Arg Thr Val 275 280 285 Lys Val Ile Lys Gly Phe Lys Glu Asp Pro Tyr Tyr Gly Leu Glu Thr 290 295 300 Ser Phe Thr Val Gln Thr Asn Asp Tyr Ser Tyr Lys Lys Phe Thr Asn 305 310 315 320 Ile Ala Ala Asp Ile Ile Lys Lys Ile Pro Lys Glu Ala Pro Glu Ala 325 330 335 Lys Trp Gly Gly Thr Ser Leu Gly Leu Thr Pro Glu Lys Lys Arg Glu 340 345 350 Tyr Asp Leu Ser Lys Val Gly Glu Thr Phe Thr Met Lys Ala Phe Met 355 360 365 Glu Ala Asp Thr Leu Leu Ser Ser Ile Gln Arg Lys Ser Arg Lys Ile 370 375 380 Ile Val His Leu Thr Asp Gly Val Pro Thr Arg Ser Tyr Ala Ile Asn 385 390 395 400 Ser Phe Val Lys Gly Ser Thr Tyr Ala Asn Gln Phe Glu Arg Ile Lys 405 410 415 Glu Lys Gly Tyr Leu Asp Lys Asn Asn Tyr Phe Ile Thr Asp Asp Pro 420 425 430 Glu Lys Ile Lys Gly Asn Gly Glu Ser Tyr Phe Leu Phe Pro Leu Asp 435 440 445 Ser Tyr Gln Thr Gln Ile Ile Ser Gly Asn Leu Gln Lys Leu His Tyr 450 455 460 Leu Asp Leu Asn Leu Asn Tyr Pro Lys Gly Thr Ile Tyr Arg Asn Gly 465 470 475 480 Pro Val Arg Glu His Gly Thr Pro Thr Lys Leu Tyr Ile Asn Ser Leu 485 490 495 Lys Gln Lys Asn Tyr Asp Ile Phe Asn Phe Gly Ile Asp Ile Ser Gly 500 505 510 Phe Arg Gln Val Tyr Asn Glu Asp Tyr Lys Lys Asn Gln Asp Gly Thr 515 520 525 Phe Gln Lys Leu Lys Glu Glu Ala Phe Glu Leu Ser Asp Gly Glu Ile 530 535 540 Thr Glu Leu Met Asn Ser Phe Ser Ser Lys Pro Glu Tyr Tyr Thr Pro 545 550 555 560 Ile Val Thr Ser Ala Asp Val Ser Asn Asn Glu Ile Leu Ser Lys Ile 565 570 575 Gln Gln Gln Phe Glu Lys Ile Leu Thr Lys Glu Asn Ser Ile Val Asn 580 585 590 Gly Thr Ile Glu Asp Pro Met Gly Asp Lys Ile Asn Leu His Leu Gly 595 600 605 Asn Gly Gln Thr Leu Gln Pro Ser Asp Tyr Thr Leu Gln Gly Asn Asp 610 615 620 Gly Ser Ile Met Lys Asp Ser Ile Ala Thr Gly Gly Pro Asn Asn Asp 625 630 635 640 Gly Gly Ile Leu Lys Gly Val Lys Leu Glu Tyr Ile Lys Asn Lys Leu 645 650 655 Tyr Val Arg Gly Leu Asn Leu Gly Glu Gly Gln Lys Val Thr Leu Thr 660 665 670 Tyr Asp Val Lys Leu Asp Asp Ser Phe Ile Ser Asn Lys Phe Tyr Asp 675 680 685 Thr Asn Gly Arg Thr Thr Leu Asn Pro Lys Ser Glu Glu Pro Asp Thr 690 695 700 Leu Arg Asp Phe Pro Ile Pro Lys Ile Arg Asp Val Arg Glu Tyr Pro 705 710 715 720 Thr Ile Thr Ile Lys Asn Glu Lys Lys Leu Gly Glu Ile Glu Phe Thr 725 730 735 Lys Val Asp Lys Asp Asn Asn Lys Leu Leu Leu Lys Gly Ala Thr Phe 740 745 750 Glu Leu Gln Glu Phe Asn Glu Asp Tyr Lys Leu Tyr Leu Pro Ile Lys 755 760 765 Asn Asn Asn Ser Lys Val Val Thr Gly Glu Asn Gly Lys Ile Ser Tyr 770 775 780 Lys Asp Leu Lys Asp Gly Lys Tyr Gln Leu Ile Glu Ala Val Ser Pro 785 790 795 800 Lys Asp Tyr Gln Lys Ile Thr Asn Lys Pro Ile Leu Thr Phe Glu Val 805 810 815 Val Lys Gly Ser Ile Gln Asn Ile Ile Ala Val Asn Lys Gln Ile Ser 820 825 830 Glu Tyr His Glu Glu Gly Asp Lys His Leu Ile Thr Asn Thr His Ile 835 840 845 Pro Pro Lys Gly Ile Ile Pro Met Thr Gly Gly Lys Gly Ile Leu Ser 850 855 860 <210> 26 <211> 853 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of GBS67 sequenced from Streptococcus agalactiae serotype Ib strain H36B lacking transmembrane and cell wall anchor motifs <400> 26 Met Arg Lys Tyr Gln Lys Phe Ser Lys Ile Leu Thr Leu Ser Leu Phe 1 5 10 15 Cys Leu Ser Gln Ile Pro Leu Asn Thr Asn Val Leu Gly Glu Ser Thr 20 25 30 Val Pro Glu Asn Gly Ala Lys Gly Lys Leu Val Val Lys Lys Thr Asp 35 40 45 Asp Gln Asn Lys Pro Leu Ser Lys Ala Thr Phe Val Leu Lys Pro Thr 50 55 60 Ser His Ser Glu Ser Lys Val Glu Lys Val Thr Thr Glu Val Thr Gly 65 70 75 80 Glu Ala Thr Phe Asp Asn Leu Thr Pro Gly Asp Tyr Thr Leu Ser Glu 85 90 95 Glu Thr Ala Pro Glu Gly Tyr Lys Lys Thr Thr Gln Thr Trp Gln Val 100 105 110 Lys Val Glu Ser Asn Gly Lys Thr Thr Ile Gln Asn Ser Asp Asp Lys 115 120 125 Lys Ser Ile Ile Glu Gln Arg Gln Glu Glu Leu Asp Lys Gln Tyr Pro 130 135 140 Leu Thr Gly Ala Tyr Glu Asp Thr Lys Glu Ser Tyr Asn Leu Glu His 145 150 155 160 Val Lys Asn Ser Ile Pro Asn Gly Lys Leu Glu Ala Lys Ala Val Asn 165 170 175 Pro Tyr Ser Ser Glu Gly Glu His Ile Arg Glu Ile Gln Glu Gly Thr 180 185 190 Leu Ser Lys Arg Ile Ser Glu Val Asn Asp Leu Asp His Asn Lys Tyr 195 200 205 Lys Ile Glu Leu Thr Val Ser Gly Lys Ser Ile Ile Lys Thr Ile Asn 210 215 220 Lys Asp Glu Pro Leu Asp Val Val Phe Val Leu Asp Asn Ser Asn Ser 225 230 235 240 Met Lys Asn Asn Gly Lys Asn Asn Lys Ala Lys Lys Ala Gly Glu Ala 245 250 255 Val Glu Thr Ile Ile Lys Asp Val Leu Gly Ala Asn Val Glu Asn Arg 260 265 270 Ala Ala Leu Val Thr Tyr Gly Ser Asp Ile Phe Asp Gly Arg Thr Val 275 280 285 Lys Val Ile Lys Gly Phe Lys Glu Asp Pro Tyr Tyr Gly Leu Glu Thr 290 295 300 Ser Phe Thr Val Gln Thr Asn Asp Tyr Ser Tyr Lys Lys Phe Thr Asn 305 310 315 320 Ile Ala Ala Asp Ile Ile Lys Lys Ile Pro Lys Glu Ala Pro Glu Ala 325 330 335 Lys Trp Gly Gly Thr Ser Leu Gly Leu Thr Pro Glu Lys Lys Arg Glu 340 345 350 Tyr Asp Leu Ser Lys Val Gly Glu Thr Phe Thr Met Lys Ala Phe Met 355 360 365 Glu Ala Asp Thr Leu Leu Ser Ser Ile Gln Arg Lys Ser Arg Lys Ile 370 375 380 Ile Val His Leu Thr Asp Gly Val Pro Thr Arg Ser Tyr Ala Ile Asn 385 390 395 400 Ser Phe Val Lys Gly Ser Thr Tyr Ala Asn Gln Phe Glu Arg Ile Lys 405 410 415 Glu Lys Gly Tyr Leu Asp Lys Asn Asn Tyr Phe Ile Thr Asp Asp Pro 420 425 430 Glu Lys Ile Lys Gly Asn Gly Glu Ser Tyr Phe Leu Phe Pro Leu Asp 435 440 445 Ser Tyr Gln Thr Gln Ile Ile Ser Gly Asn Leu Gln Lys Leu His Tyr 450 455 460 Leu Asp Leu Asn Leu Asn Tyr Pro Lys Gly Thr Ile Tyr Arg Asn Gly 465 470 475 480 Pro Val Arg Glu His Gly Thr Pro Thr Lys Leu Tyr Ile Asn Ser Leu 485 490 495 Lys Gln Lys Asn Tyr Asp Ile Phe Asn Phe Gly Ile Asp Ile Ser Gly 500 505 510 Phe Arg Gln Val Tyr Asn Glu Asp Tyr Lys Lys Asn Gln Asp Gly Thr 515 520 525 Phe Gln Lys Leu Lys Glu Glu Ala Phe Glu Leu Ser Asp Gly Glu Ile 530 535 540 Thr Glu Leu Met Asn Ser Phe Ser Ser Lys Pro Glu Tyr Tyr Thr Pro 545 550 555 560 Ile Val Thr Ser Ala Asp Val Ser Asn Asn Glu Ile Leu Ser Lys Ile 565 570 575 Gln Gln Gln Phe Glu Lys Ile Leu Thr Lys Glu Asn Ser Ile Val Asn 580 585 590 Gly Thr Ile Glu Asp Pro Met Gly Asp Lys Ile Asn Leu His Leu Gly 595 600 605 Asn Gly Gln Thr Leu Gln Pro Ser Asp Tyr Thr Leu Gln Gly Asn Asp 610 615 620 Gly Ser Ile Met Lys Asp Ser Ile Ala Thr Gly Gly Pro Asn Asn Asp 625 630 635 640 Gly Gly Ile Leu Lys Gly Val Lys Leu Glu Tyr Ile Lys Asn Lys Leu 645 650 655 Tyr Val Arg Gly Leu Asn Leu Gly Glu Gly Gln Lys Val Thr Leu Thr 660 665 670 Tyr Asp Val Lys Leu Asp Asp Ser Phe Ile Ser Asn Lys Phe Tyr Asp 675 680 685 Thr Asn Gly Arg Thr Thr Leu Asn Pro Lys Ser Glu Glu Pro Asp Thr 690 695 700 Leu Arg Asp Phe Pro Ile Pro Lys Ile Arg Asp Val Arg Glu Tyr Pro 705 710 715 720 Thr Ile Thr Ile Lys Asn Glu Lys Lys Leu Gly Glu Ile Glu Phe Thr 725 730 735 Lys Val Asp Lys Asp Asn Asn Lys Leu Leu Leu Lys Gly Ala Thr Phe 740 745 750 Glu Leu Gln Glu Phe Asn Glu Asp Tyr Lys Leu Tyr Leu Pro Ile Lys 755 760 765 Asn Asn Asn Ser Lys Val Val Thr Gly Glu Asn Gly Lys Ile Ser Tyr 770 775 780 Lys Asp Leu Lys Asp Gly Lys Tyr Gln Leu Ile Glu Ala Val Ser Pro 785 790 795 800 Lys Asp Tyr Gln Lys Ile Thr Asn Lys Pro Ile Leu Thr Phe Glu Val 805 810 815 Val Lys Gly Ser Ile Gln Asn Ile Ile Ala Val Asn Lys Gln Ile Ser 820 825 830 Glu Tyr His Glu Glu Gly Asp Lys His Leu Ile Thr Asn Thr His Ile 835 840 845 Pro Pro Lys Gly Ile 850

Claims (48)

  1. a) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ia의 캡슐형 당류인 접합체;
    b) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ib의 캡슐형 당류인 접합체; 및
    c) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 III의 캡슐형 당류인 접합체를 포함하는 면역원성 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, GBS 캡슐형 당류의 총량은 70 μg 이하인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 각각의 GBS 캡슐형 당류는 단위 용량 당 1 내지 30 μg의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 각각의 GBS 캡슐형 당류는 단위 용량 당 5 μg, 10 μg 또는 20 μg의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 단위 용량 당 GBS 혈청형 Ia, Ib 및 III 캡슐형 당류의 양은 표 C의 두 번째 컬럼에서 설명된 투여 옵션 중 하나에 해당하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 단위 용량 당 GBS 혈청형 Ia, Ib 및 III 캡슐형 당류의 양은 20 μg, 20 μg 및 20 μg; 10 μg, 10 μg 및 10 μg; 및 5 μg, 5 μg 및 5 μg으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 단위 용량 당 GBS 혈청형 Ia, Ib 및 III 캡슐형 당류의 양은 5 μg, 5 μg 및 5 μg인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  8. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 각각의 GBS 캡슐형 당류는 단위 용량 당 0.1 내지 5 μg의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  9. 제 8항에 있어서, 각각의 GBS 캡슐형 당류는 단위 용량 당 0.5, 2.5 또는 5 μg의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  10. 제 9항에 있어서, 단위 용량 당 GBS 혈청형 Ia, Ib 및 III 캡슐형 당류의 양은 표 C'에 설명된 투여 옵션 중 하나에 해당하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, GBS 혈청형 Ia, Ib 및 III 캡슐형 당류의 질량비는 표 F의 두 번째 컬럼에서 설명된 비율 옵션 중 하나에 해당하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  12. 제 11항에 있어서, GBS 혈청형 Ia, Ib 및 III 캡슐형 당류의 질량비는 1:1:1인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 한 단위 용량에 이어서 첫 번째 단위 용량의 3 개월 후에 투여되는 두 번째 단위 용량으로 투여하기 위한 것임을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  14. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
    d) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 V의 캡슐형 당류인 접합체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  15. 제 14항에 있어서, 조성물은 한 단위 용량에 이어서 첫 번째 단위 용량의 1 개월 후에 투여되는 두 번째 단위 용량으로 투여하기 위한 것임을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  16. 제 1항 내지 제 12항 및 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 일회 용량으로 투여하기 위한 것임을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  17. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물은 알루미늄 염 보조제를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  18. 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물은 어떤 보조제도 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  19. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, a), b) 및/또는 c)의 담체 단백질은 디프테리아 변성 독소, 테타누스 변성 독소 또는 CRM 197인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  20. 제 19항에 있어서, a), b) 및/또는 c)의 담체 단백질은 CRM 197인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  21. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 접합체(들)는 당류(들)의 시알산 잔기의 10 내지 30%의 산화에 의한 접합 전에 발생된 알데히드기의 환원성 아민화에 의해 얻을 수 있다는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  22. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, GBS 캡슐형 당류(들)는 실질적으로 위치 7, 8 및/또는 9에서 시알산 잔기의 O-아세틸화를 갖지 않는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  23. 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, GBS 혈청형 Ia의 캡슐형 당류는 150-300 kDa의 범위의 분자량을 갖고; GBS 혈청형 Ib의 캡슐형 당류는 150-300 kDa의 범위의 분자량을 갖고; 및/또는 GBS 혈청형 III의 캡슐형 당류는 50-200 kDa의 범위의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  24. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ia의 캡슐형 당류인 접합체는 약 1:1 내지 1:2의 당류:단백질 중량비 (w/w)를 갖고; 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ib의 캡슐형 당류인 접합체는 약 1:1 내지 1:2의 당류:단백질 중량비 (w/w)를 갖고; 및/또는 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 III의 캡슐형 당류인 접합체는 약 3:1 내지 1:1의 당류:단백질 중량비 (w/w)를 갖는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  25. 제 1항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 근육 내 투여하기 위한 것임을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  26. 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은
    (a) SEQ ID NO: 1 내지 3으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및/또는
    (b) (i) SEQ ID NO: 1 내지 3 중 하나 이상과 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및/또는 (ii) SEQ ID NO: 1 내지 3의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  27. 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 주사 가능한 액체 용액 또는 현탁액인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  28. 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 동결건조되는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  29. 제 28항에 있어서, 조성물은 접합체(들)을 안정화시키기 위해 만니톨을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  30. 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 칼륨 이수소 포스페이트 완충액을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  31. 제 1항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 염화 나트륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  32. 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 백신인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  33. 제 1항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 사람에게 투여하기 위한 것임을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  34. 제 1항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 임신 가능 나이의 여성, 임신한 여성 및 나이 든 환자로부터 선택된 사람에게 투여하기 위한 것임을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  35. 제 34항에 있어서, 조성물은 임신한 여성에게 투여하기 위한 것임을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  36. 제 33항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, 투여 이전에 사람은 GBS 혈청형 Ia의 캡슐형 당류, GBS 혈청형 Ib의 캡슐형 당류, 및/또는 GBS 혈청형 III의 캡슐형 당류에 대하여 검출 불가능한 수준의 항체를 갖는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  37. 제 1항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 약제로서 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  38. 제 37항에 있어서, 조성물은 에스.아갈락티애에 의해 유발된 질환의 방지 및/또는 치료하기 위한 것임을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  39. 제 38항에 있어서, 질환은 신생아 패혈증, 균혈증, 신생아 폐렴, 신생아 수막염, 자궁내막염, 골수염, 또는 화농성 관절염인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  40. 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 디프테리아 변성 독소 또는 이들의 유도체로 사전-면역화된 환자에게 투여하기 위한 것이고 면역원성 조성물에서 적어도 하나의 접합체는 디프테리아 변성 독소 또는 이들의 유도체에 접합된 GBS의 캡슐형 당류의 것임을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  41. 환자에게 디프테리아 변성 독소 또는 이들의 유도체에 접합된 GBS의 캡슐형 당류인 접합체를 투여하는 단계를 포함하는, 환자를 GBS에 의한 감염에 대하여 면역화하는 방법으로서, 환자는 디프테리아 변성 독소 또는 이들의 유도체로 사전-면역화되는 방법.
  42. 제 41항에 있어서, 접합체는
    a) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ia의 캡슐형 당류인 접합체;
    b) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ib의 캡슐형 당류인 접합체; 및
    c) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 III의 캡슐형 당류인 접합체를 포함하는 면역원성 조성물 내에 있으며;
    GBS의 캡슐형 당류는 GBS 혈청형 Ia, Ib 또는 III의 캡슐형 당류인 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 42항에 있어서, GBS의 캡슐형 당류는 GBS 혈청형 III의 캡슐형 당류인 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 42항 또는 제 43항에 있어서, 면역원성 조성물은 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항의 특징을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 환자에게 테타누스 변성 독소 또는 이들의 유도체에 접합된 GBS의 캡슐형 당류인 접합체를 투여하는 단계를 포함하는, 환자를 GBS에 의한 감염에 대하여 면역화하는 방법으로서, 환자는 테타누스 변성 독소 또는 이들의 유도체로 사전-면역화되는 방법.
  46. 제 45항에 있어서, 접합체는
    a) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ia의 캡슐형 당류인 접합체;
    b) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 Ib의 캡슐형 당류인 접합체; 및
    c) 담체 단백질에 접합된 GBS 혈청형 III의 캡슐형 당류인 접합체를 포함하는 면역원성 조성물 내에 있으며;
    GBS의 캡슐형 당류는 GBS 혈청형 Ia, Ib 또는 III의 캡슐형 당류인 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 46항에 있어서, GBS의 캡슐형 당류는 GBS 혈청형 III의 캡슐형 당류인 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 46항 또는 제 47항에 있어서, 면역원성 조성물은 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항의 특징을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
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