JP2001519817A

JP2001519817A - 糖断片生成法

Info

Publication number: JP2001519817A
Application number: JP54328198A
Authority: JP
Inventors: ユィンワン; ラウルアイ．ホーリングスワース; デニスエル．キャスパー
Original assignee: ブリガムアンドウイメンズホスピタル
Priority date: 1997-03-26
Filing date: 1998-03-26
Publication date: 2001-10-23
Also published as: CA2284606A1; US6274144B1; EP0977764A4; US6027733A; EP0977764A1; WO1998042718A1

Abstract

(57)【要約】糖断片を含む多糖を、オゾン分解を用いて脱重合する方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】糖断片生成法関連出願のクロスレファレンス本出願は、1997年3月26日に提出された、その全体が本明細書に組込まれている、米国特許仮出願第60/042,416号に基づいて請求するものである。連邦助成研究に関する陳述本研究は一部、国立医療研究所(NIH)の基金AI30628、AI75326、AI23339、およびAI25152により支援された。政府は、本発明に一定の権利を有する。発明の背景本発明は、糖断片の調製法の一般的分野に属する。糖質は、商品化学物質として重要であり、かつ食品および工業の用途で多用される。更にこれらは、バイオテクノロジー、例えば抗生物質もしくは抗体の調製において、ワクチン用の抗原として、または診断薬として、重要で特別な化学物質である。糖質は、天然の原料から得るか、または酵素的もしくは化学的に合成して得ることができる。約5個より多くの単糖ユニットを有する糖質の合成は、特にこれらのユニットの1個が酸に不安定なシアル酸である場合に困難である。酵素的合成は、利用できる酵素および基質により限界があり、かつ比較的高価である。天然の多糖が利用可能な場合もあるが、これらの使用は、いくつかの場合において、それらが非常に巨大である場合に問題を引き起こしている。例えば、多くの食品および工業的使用は、特定のサイズの多糖類を必要とし、一部の多糖類はそのままでは大きすぎることがある。一部の用途において、多糖のサイズの減少により、操作性を高め、生産コストを削減することができる。例えばワクチンにおいて使用する際に免疫原性を高めるためなどのように、架橋した糖質が望ましい場合、高分子量で利用可能な材料は、架橋した場合に不溶性ゲルを形成することがある。出発糖質の鎖長を短くすることで、この問題は避けることができる。多糖類は、酸、塩基、または酵素により触媒された加水分解により、分子量の小さい断片に切断することができる。酸により触媒された分解は、多糖類を炭水化物部分および他の官能部分の両方において非選択的に切断し、一貫しない生成物または非機能生成物を生じることがある。例えば、シアル酸は、多くの生物学的に重要な多糖類の炭水化物部分に発見されており、認識および付着を含む生物学的機能の決定因子であり得る。更にこれらは、抗体産生のためのエピトープの決定因子であることができ、そのようなものは多糖類から糖断片を生成する試みにおいて保存されるべきである。しかしながら、シアル酸は酸によって容易に除去される。多糖類の酵素的加水分解は、高度に特異的であり得るが、通常これは望ましい特異性を持つ酵素が容易に利用できる場合に限定されている。あるいは一部の糖断片は、天然の原料から直接単離することができるが、これらの天然に生じる比較的短い多糖類は、典型的には限定量で存在する。いくつかの場合において、糖断片は、化学的および／または酵素的に合成することができる。しかしながらこのような場合であっても、合成の実施に必要な酵素および基質が高価なことがある。一般に、5個よりも多い単糖残基の糖断片の合成は、極めて困難である。発明の要約本発明は、オゾンが多糖類の切断に使用可能であり、全般的に多糖の構造的特徴を保持している望ましい長さの、有用な比較的短い糖断片を生じるという発見に基づく。従って、本発明は、β-Dグリコシド結合においてアルドース残基のC1アノマー炭素と第2の単糖残基の酸素原子との間に少なくとも1個の共有結合を有する比較的大きい多糖を酸化することによって、糖断片を製造する方法を特徴付とする。この方法は更に、共有結合がα-L結合を形成している場合にも用いることができる。典型的には、これらのβ-Dおよびα-L結合は、類似した反応性を示す。同様に、このα-Dおよびβ-L結合も、類似の反応性を示すであろう。この方法は、比較的大きい多糖上の遊離のヒドロキシル基を保護する段階；比較的大きい多糖をオゾンと反応してC1アノマー炭素を酸化し、その結果アルドース残基をアルドン酸エステル残基に転換する段階；および、アルドン酸エステル残基を切断し、糖断片を形成する段階を含む。別の側面において、本発明は、αまたはβグリコシド結合におけるアルドース残基のC1アノマー炭素と第2の単糖残基の酸素原子との間に少なくとも1個の共有結合を有する比較的大きい多糖の酸化によって、糖断片を調製する方法を特徴とする（以下「１段階法」と称する）。このグリコシド結合は、例えば、α-L、α-D、β-Lまたはβ-Dなどのいずれかの形であり得る。前述のように、β-Dおよびα-L結合は、典型的には同様の反応性を示し、かつα-Dおよびβ-L結合が同様の反応性を示す。前述の１段階法は、比較的大きい多糖をオゾンと反応してこの多糖中の2個の単糖サブユニットを連結している結合を切断し、糖断片を形成をする段階を含む。本明細書に記載の方法において、比較的大きい多糖は、どのような原料由来のものであってもよく、かつ不安定な残基、例えばシアル酸を含みうる。この比較的大きい多糖は、実質的に純粋であることが好ましい。この比較的大きい多糖は、天然の状態でこれを伴う細胞成分から分離される場合に、実質的に精製される。同様に糖断片は、任意に引き続き精製することができる。精製された糖断片とは、出発多糖から分離された糖断片を意味する。診断およびワクチンの開発という目的のために、多糖は、病原菌、例えばGBS （Group B streptcoccal）タイプII、III、IV、V、VI、VII、およびVIIIなどのB 群レンサ球菌(Streptococcus)の莢膜多糖；リポ多糖のO-抗原；黄色ブドウ球菌( Staphylococcus aureus)の莢膜多糖、例えば黄色ブドウ球菌莢膜多糖のタイプ5 またはタイプ8の抗原；肺炎レンサ球菌(Streptococcus pneumonia)の莢膜多糖；およびバクテロイデス・フラギリス(Bacteroides fragilis)の莢膜多糖由来であることができる。オゾンは、溶液中に添加するか、インサイチューで生成するか、または例えば気泡の送入のように外部供給源から供給することができる。前述のアルドン酸エステル中間体は、例えばヒドロキシルイオン、アミン、チオール、またはカルボアニオンなどの求核剤により切断することができる。あるいはこのアルドン酸エステル中間体は、加熱または加水分解により切断することもできる。本発明は更に、オゾン分解によって製造された糖断片を用いて抗体を製造する方法を含む。これらの糖断片は、担体に結合されて免疫原を生じ、その後この免疫原は、適当な宿主に注入される。いずれかの認められた宿主、例えば、ウサギ、ラット、マウス、ヤギなどが適している。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを生成することができる。本発明は多くの利点を有している。これらの方法は、グリコシド結合を含むあらゆる多糖を分解することが可能である。前述の１段階法は、オゾン分解が水溶液中で進行し、かつ出発多糖の前処理を必要とせずに進行することを可能にする。これに加えて、１段階法は、任意のグリコシド結合を含む多糖類を脱重合するために使用可能である。切断が同じグリコシル残基で生じる場合には、同じ反復ユニット構造を有する糖断片を、天然に生じる豊富な多糖類から回収することができる。この方法で製造された糖断片は、容易に修飾が可能であり、かつ他の分子（例えばタンパク質担体）に結合することができる。このことは、糖断片を薬物およびワクチンの設計において有用なものにし得る。これらの糖断片は、更に発色団、ビオチン、ペプチド、および脂質で標識することができ、従って様々な用途への可能性をもつ。本発明の更なる利点は、オゾン分解の条件を変えることによって、生成した糖断片の分子量を変化させることが可能なことである。本明細書において使用する「糖断片」とは、「出発多糖」である出発材料から本発明に従って形成されるあらゆる複合炭水化物である。従って、この生成物は常に出発材料よりも小さいが、出発材料または生成物について特定のサイズ制限を伴うものではない。出発材料のサイズは一般に、容易に入手できる多糖の供給源によって左右される。この糖断片のサイズは、最終的な使用（例えば溶解された、または標識物と反応された）へより都合良く適用され、より大きい出発材料の立体配置または特性（例えば、免疫学的特性）を保持するための必要性と結びついているような、望ましい小さい分子などの種々の要因の機能となろう。一般に、多糖の出発材料は、10個より多くの糖ユニットを有し、これはその天然供給源およびこの供給源から多糖を回収する技術によって決まったサイズであろう。得られる糖断片の切断生成物は、1個より多くのユニットを有し、典型的には、1 00ユニットよりも小さい。本発明によって製造された糖断片は、一部の場合において、100ユニットよりもはるかに長くてもよい。用語「オリゴ糖」が本明細書において使用される場合は、この用語は「糖断片」と同意語であると理解される。特に指定しない限り、本明細書において使用された全ての技術的およひ科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されているものと同じ意味を有する。本明細書において記載されたものと類似または同等な方法および材料を、本発明の実践または試験において使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記す。本明細書において言及した全ての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それ全体が参照として組み入れられている。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が制御する。これに加えて、材料、方法および実施例は、単に例証するものであり、限定を意図するものではない。図面の簡単な説明図1は、B群レンサ球菌(GBS)莢膜多糖の反復ユニット構造を示す概略図である。図2は、オゾン処理後にGBSタイプII多糖から生成された糖断片の、液体クロマトグラフィー後の溶出プロファイルを示すグラフである。図3A〜Dは、各々、GSBタイプII未変性多糖および図2のピーク3から1の糖質の¹ H NMRスペクトルである。図4は、指定された時間オゾン処理した後の、GBSタイプVIII多糖から生成された糖断片の溶出プロファイルを示すグラフである。図5は、オゾン処理後の、GBSタイプVIII多糖から生成されプールされた7kDaの糖断片の¹H NMRスペクトルである。図6は、オゾン処理後の、GBSタイプIII莢膜多糖から生成された糖断片の溶出プロファイルを示すグラフである。図7A〜Cは、GBSタイプIII未変性多糖(A)、ならびにオゾン分解して生成した糖断片の3個(B)および2個(C)の反復ユニットの、¹H NMRスペクトルである。図8A〜Dは、それぞれ、150、195、270および355分間オゾン処理した後のGBSタイプIII多糖から生成した糖断片の溶出プロファイルを示すグラフである。図9A〜Bは、バクテロイデス・フラギリス多糖Aの反復ユニット構造(9A)、およびバクテロイデス・フラギリス多糖Aから生成した糖断片の液体クロマトグラフィー後の溶出プロファイル(9B)を示すグラフである。図10は、出発物質GBSタイプIII多糖を指定された時間オゾン処理した後の糖断片分子量を示すグラフである。図11は、NaHCO₃緩衝液中でオゾン分解した後のGBSタイプIII未変性多糖の¹H N MRスペクトルである。発明の詳細な説明本発明は、オゾン分解を用いて多糖類を切断するための新規の方法を提供する。ひとつの方法において、オゾン分解は、3つの段階で実施される：1)多糖のヒドロキシル基を保護する段階；2)この保護された多糖にオゾンを適用し、アルドン酸エステルを含む、部分的に酸化された中間体を形成する段階；および3)このアルドン酸エステル中間体を脱保護して加水分解し、その結果出発多糖を糖断片に切断する段階。第2の方法において、オゾン分解は、1段階で実施される：αまたはβ結合のいずれかで結合した糖質サブユニットを含みうる多糖に、水溶液中においてオゾンが直接適用される。この多糖が、β-Dグリコシド結合で結合した場合、オゾン分解により、前述のようにエステルまたはラクトンを生成することができる。あらゆる多糖は、一般に、オゾン分解法に適した出発材料である。多糖類は、購入するか、または常法により天然の供給源から単離することができる。例えば、Wesselsら、J．Biol．Chem.、266:6714(1991)、Tzianabosら、J．Biol．Chem. 、267:18230(1992)、およびLeeら、Infect．Immum.、61:1853(1993)に記載された方法により、多糖類を細菌種から単離することができる。3 段階法を用いるオゾン分解この方法は、β-Dまたはα-Lグリコシド結合を有する多糖類の選択的脱重合に使用することができる。この方法の第1の段階は、多糖の遊離のヒドロキシル基を、その後のオゾン処理から保護することである。利用できる保護法の中で、過アセチル化が一般に好ましいが、過シリル化および過メチル化のような他の方法も適している。過アセチル化は、通常多糖類を無水酢酸およびピリジンにより処理することにより達成される；しかしながら、無水酢酸／酢酸カリウムまたは無水酢酸エステル／酢酸ナトリウムなども、アセチル化剤として使用することができる。前述の多糖が、無水酢酸／ピリジン中に溶解しない場合は、ホルムアミドのような補助溶剤を添加してもよい。この反応時間は、温度が上昇することにより短縮することができる。例えば反応は、室温で一晩（12〜24時間）、または70℃で 2時間のいずれかで行う。過アセチル化反応の完了時に、過剰な試薬および溶媒は、当該技術分野において公知の方法を用いて除去される。例えば、この反応混合物を、蒸留水に対し透析することができ、その後、凍結乾燥もしくは窒素下または回転蒸発装置での蒸発により、水が除去される。あるいはこの溶媒は、回転蒸発装置を用いて直接除去することができる。直接の除去は典型的には、ピリジンおよびホルムアルミドの蒸発速度を増すために、加熱またはエタノールの添加が必要である。次の段階では、保護された多糖は、酢酸エチル、無水酢酸／酢酸カリウム、またはオゾン非反応性の他の溶媒、例えばジクロロメタンまたはテトラヒドロフランなどに溶解される。この溶液は、多糖を溶解するために数分間超音波処理され、その後室温でオゾンが添加される。蒸発する溶媒量を減少するために、このオゾンを適用する段階の期間には、凝縮装置が使用される。保護された多糖へのオゾンの適用により、アルドン酸エステル中間体の形成を生じる。オゾンを適用する様々な方法が使用できる。例えばオゾンは、酸素または空気から電気工学的にオゾンを生成する外部オゾン生成器（More-Zon10、More Production、台湾）から送ることができる。他のオゾン適用法も使用することができる。オゾン処理後、溶媒は回転蒸発装置において蒸発される。第3の段階では、前述の多糖のアルドン酸エステル結合を、0.1N NaOHのような塩基により、室温で30分間加水分解し、同時に保護基を除去することができる。あるいは新生オリゴマーが遊離され、末端が同時にエステル結合を切断することが公知である他の求核剤により官能基化される。適当な求核剤は、アルコキシド、フェノキシド、カルボアニオン、チオール、およびヒドラジンを含む（しかしこれらに限定されるものではない）。例えばα,ω−ジアミンの使用は、アミンの一端の糖質へのアミド結合をもたらし、遊離のアミノ基は、担体または支持マトリックスへのカップリングのために利用できる。あるいは、アルドン酸エステルは、単純な加熱によりラクトンに転換することができ、その後アセチル保護基は、続く別の段階により除去することができる。1 段階法を用いるオゾン分解１段階法では、多糖の分解は、多糖溶液をオゾンで処理することにより、1段階で達成される。この多糖基質は任意の適当な水性溶媒または緩衝液、例えば水に溶解される。酸感受性残基を含む多糖類の分解には、酸感受性基の破壊を防止するために、反応が塩基性緩衝液（例えば、リン酸緩衝化塩類溶液、または炭酸水素ナトリウム）中で進行することが好ましい。オゾン分解反応時に生成された酸は、更にアルカリ、アルカリ性炭酸塩、炭酸水素塩、水酸化物のような塩基、または他の無機もしくは有機塩基により中和することもできる。 α-L、α-D、β-L、もしくはβ-D結合を含むαまたはβ結合を含有する多糖類が、1段階オゾン分解法の出発材料に適している。多糖がβ-Dまたはα-L結合を含む場合、これはアルドン酸エステルを含む部分的に酸化された中間体を形成し、これはラクトンを形成して自動的に多糖を切断する。オゾン処理は、好ましいことにβ-Dまたはα-L結合に作用し；その結果、オゾンへの比較的短時間の暴露により、β-Dまたはα-L結合を有する多糖類が、これらの部位において優先的に脱重合される。多糖類が水溶液中において非常に長時間オゾンに暴露された場合には、別の反応、例えば多糖のグリコシド結合の切断時のラジカルの形成、多糖類の酸化、または酸の形成が生じる。これらの反応はβ-Dまたはα-Lグリコシド結合の存在を必要としないので、α結合のみを含む多糖類（例えばデキストランまたはデンプン）の切断にこれを使用することができる。異なる時間オゾン分解を受ける物質のモニダリングのように、オゾン分解の程度をモニタリングすることによって、所望の反応生成物を得ることができる。オゾン分解により生成した糖断片の更なる加工オゾン分解法により得られた生成物は、カルボン酸(carboxylate)基を末端とする糖断片である。このカルボン酸基は、ゼロ長(zero-length)の架橋剤として機能するカルボジイミドにより活性化され、かつこの糖質がアミン含有分子にカップリングされる。全ての得られる糖断片は、更に他の目的のために操作することができる。1個以上のジオール官能基を有する糖断片は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムにより選択的に酸化され、アルデヒド基を形成することができる。例えば、シアル酸は過ヨウ素酸ナトリウムにより容易に酸化され、遊離のアルデヒド基をC8位に生成する。このような糖断片は次に、タンパク質のようなアミン部分を有する分子に、またはスペーサーとして利用される二官能分子に、カップリングすることができ、さらに他の分子にもカップリングしうる。 β-D結合を有する多糖類について、オゾン分解が媒介した切断は、オゾンがこれらの結合に選択的に反応する場合には、高度に選択的である；しかしながら、この切断部位は、一般に多糖中の同じβ-Dグリコシド結合の全てにおいて不定である。この糖質のサイズ分布は、多糖の濃度、反応時間、反応混合物をオゾンが通過する速度、および消費されたオゾン総量を含む、オゾン分解の条件を制御することにより調節することができる。例えば、より長い反応時間およびより多くのオゾンの消費は、より小さい糖質をもたらす。従って多糖の制御された切断は、親多糖の反復ユニット構造を維持する、サイズ範囲の狭い望ましい糖質の混合物を生じる。オゾン分解反応の生成物は、当該技術分野において周知の技術、例えばゲル濾過法、サイズ排除(size-exclusion)、またはイオン交換カラムクロマトグラフィーなどにより分離することができる。溶離液は、PBS、トリスまたは蒸留水などの適当な緩衝液であることができる。分画は、屈折率検出装置によりモニタリングし、または炭水化物含量についてアッセイされる。異なるサイズの糖質を示す分画をプールして、分光学的方法、典型的にはNMR分光法により分析する。得られる糖断片のサイズは、質量分析（例えばエレクトロスプレー法）、またはそれらの溶離容積の測定およびカラムの検量線からの算出のいずれかにより、検出される。多糖の機能の維持は、適当なアッセイ（例えばELISA）により証明することができる。本発明での使用に適した多糖類の重要な種類は、細菌の莢膜多糖およびリポ多糖であり、例えば、病原菌B群レンサ球菌、B.フラギリス、黄色ブドウ球菌、および肺炎レンサ球菌などに由来するものを含む。これらの細菌に関連した保護的多糖類は、エピトープの保護に重要である反応活性シアル酸またはピルビル（ca rboxyethylidene）残基を含む。オゾン分解によりこれらの多糖類から生成された糖断片は、診断剤、治療剤、またはワクチンの調製のための試薬として使用することができる。これらの用途において、生物体の外側の多糖被膜(coat)の断片は、分子マトリックスに組込むか、または担体に付着することができる。以下の限定を意図しない実施例を用いて、オゾン分解による糖断片の生成およびこのようにして生成された糖断片の使用について説明する。実施例材料および方法特に記さない限り、下記実施例に記された実験を行うに際して、以下の材料および方法を用いる。 B群レンサ球菌莢膜多糖は、Wesselsら（J．Biol．Chem．266:6714(1991)）に記載の通りに単離精製した。バクテロイデス・フラギリス多糖Aの調製は、Tzian abosら（J．Biol．Chem.、267:18230(1992)）に従い、かつ黄色ブドウ球菌タイプ5の莢膜多糖の調製は、Leeら（Infect．Immun.、61:1853(1993)）に従った。アシアロ(desialyated)GBSは、肺炎レンサ球菌タイプ14の多糖と同じ構造を有する。これは、前述のGBS多糖からシアル酸を除去するための、以下のような緩徐な酸の加水分解によって得た：GBSタイプIII多糖の10mg試料のひとつを、6％酢酸5mlに添加し、かつ80℃で1時間加熱した。その後試料を脱イオン水に対して透析し、かつ凍結乾燥した。デキストランは、ファルマシア社（Pharmacia，Pisca taway，NJ）から購入した。スーパーデックス75およびスーパーロース12カラムは、ファルマシアLKBバイオテクノロジー社（Pharmacia LKB Biotechnology，Inc.）から得た。過アセチル化多糖の試料10mgを、ホルムアミド5mlに溶解し、ピリジン1mlおよび無水酢酸0. 5mlで処理した。この混合物を室温で16時間マグネチックスターラーで攪拌し、その後蒸留水に対して十分に透析し、凍結乾燥した。オゾン処理酢酸エチル10ml量を乾燥生成物に添加し、この混合物を特に記さない限りは、 21％オゾンで、流量3.17ml/秒で5時間通気した。オゾンは圧縮した空気または酸素から、オゾン発生器(More-Zon10)により生成した。この溶媒を、その後回転蒸発装置上で蒸発することにより除去した。 1段階オゾン分解法については、オゾン分解は水性緩衝液中で実施した。多糖の10mg試料を、水2mlで溶解し、指定された時間通気した。GBSおよびB.フラギリス由来のような、酸感受性基を含む多糖類は、0.2M PBS pH7.2または0.1M NaHCO₃ pH 8.6のいずれかに溶解した。エステル中間体の加水分解アルカリ性加水分解において、乾燥し酸化した材料を、0.1N NaOH 0.5mlに室温で2時間混合し、その後希釈した酢酸または塩酸で中和した。アリルアミンの加水分解のために、この酸化された生成物を、アリルアミン5mlにより、室温で3 0分間処理した。過剰なアリルアミンは、フード内で窒素流下で蒸発した。糖断片の分離糖質混合物を、スーパーデックス75またはスーパーデックス30カラムを用いる FPLCシステム(ファルマシア社)により、0.025％アジドを含む0.3mM PBS緩衝液(p H7.2)で溶離することにより分離した。断片は、屈折率検出装置によりモニタリングした。所望のサイズ範囲のものをプールし、かつ分光光度法により分析した。これらのカラムは、デキストラン標準物質で検量線を作成し、かつ糖断片の分子量を、カラムの検量線から得た。 1段階オゾン分解法を用いる実験においては、糖質のサイズを、デキストラン標準物質で検量線を作成したスーパーロース12カラムを用いて得た。糖質のサイズは、それらの分子量対それらの溶離容積関数(elution volume function)から算出した。多糖類の構造は、¹H NMR分光法により解析した。器材による方法 NMR分析は、プロトン共鳴周波数500Hzを用い、Varian VXR500分光光度計（Pal o Alto，CA）またはBruker AMX 500で実施した。¹Hスペクトルは、D₂O中において70℃で記録した。プロトン化学シフトは、70℃で4.290ppm、37℃で4.632ppm、および25℃で4,755ppmと算出した水の共鳴に対して参照した。実施例1：3段階オゾン分解法を用いるGBSタイプII多糖類からの糖断片の生成 GBSタイプII多糖（図1）を記載されたように調製し、かつオゾンで5時間処理した。この糖断片を、サイズ分離範囲0.5-30kDaを有するスーパーデックス75カラム(HiLoad（登録商標）16/60、調製グレード、ファルマシア社)上で分離した。これらの分画を示差屈折計（WATERSR401（登録商標），Milliprore Corp.，Bedf ord，MA）によりモニタリングした。溶離された分画を図2に示す。3個のピークが検出され、1、2および3と称した。このカラムの検量線を基に、ピーク1および2は、各々平均分子量2.7kDaおよび 4.3kDaを有していた。未変性のGBSタイプII多糖は、1.3kDaの七糖の反復ユニットを有するので、これらのピークは、各々、2個および3個の反復ユニットに相当していた。ピーク3およびより大きい分子量のピークでは、4個またはそれ以上の反復ユニットを伴う糖断片が溶離した。 GBSタイプII未変性多糖およびピーク1〜3の糖断片の¹H NMRスペクトルを図3に示す。未変性の多糖のNMR構造は、2.85ppmおよび1.86ppmの¹H-共鳴によって明らかであるようなシアル酸残基と共に、ヘキソース残基からの4.4ppmから5.2ppmの間の6個のアノマープロトンによって示される、七糖の反復ユニットを明らかにした（図3A）。図3Bは、主要ピーク3が、未変性の多糖のNMRスペクトルと同じNMRスペクトルを有する4個の反復ユニットの糖断片であることを示す。同様に、図3Cおよび3D は、ピーク2および1が、各々、3個および2個の反復ユニットの糖質に相当することを示す。図3Dにおいて、4.90ppm(2)、4.84ppm(2)、4.76ppm、4.66ppm、4.62pp m、および4.50ppm(4)である11個のアノマーシグナルは、2個の反復ユニットの、 11個のヘキソース残基に相当し、2個のシアル酸残基および末端のアルドン酸残基を伴っていた。このシアル酸残基は、全てのスペクトルにおいて2.85ppmおよび1.86ppmの¹Hシグナルによって示され、全ての断片において保存されている。実施例2：異なる時間オゾン分解された後の、3段階オゾン分解法を用いるGBSタイプVIII多糖からの糖断片の生成オゾンに20、40または80時間曝露したGBSタイプVIII多糖のLPプロファイルを図4に示す。これらの糖断片は、スーパーデックス75カラム（分離範囲、0.5〜30 kDa）上で、溶離緩衝液として0.3mM PBSを用いて分離した。反応時問が増すと、糖断片の平均サイズは減少した。40時間後、糖質の平均サイズは15kDaであった。8 0時間後、主要生成物は、分子量803の四糖の反復ユニットに相当した。平均分子量7kDaのプールした断片の¹H NMRスペクトルを図5に示す。4.8〜5.0p pmの間に3個のアノマープロトン共鳴があり、各々、グルコース、ガラクトースおよびラムノース(rhamnose)残基からのものであった。1.4ppmの二重線は、ラムノース残基の6-デオキシプロトンに起因している。2.9ppmおよび1.9ppmのシグナルは、シアル酸残基の3-Hに起因する。プールした7kDa分画のスペクトルは、未変性の多糖のものと一致し、この糖質が親物質の反復構造を保持していることを示した。実施例3：3段階オゾン分解法を用いるGBSタイプIII多糖の糖断片の生成オゾンによるGBSタイプIII多糖を処理した際に生成した糖断片のLCプロファイルを図6に示す。糖断片は、スーパーデックス75カラム上で分離し、かつ0.3mM P BSにより溶離した。ピーク1および2は、各々、タイプIIIの反復単位(repeat)の2 個および3個のコピーを含む糖断片に相当した。図7は、それぞれ、未変性のGBSタイプIII多糖ならびに図6のピーク2および1の¹ H NMRスペクトルを示す。未変性の多糖（図7A）は、4個のヘキソース残基からの4個のアノマープロトン（4.4ppm〜4.8ppm）によって、七糖の反復ユニットを有することが明らかにされ、かつ2.77ppmおよび1.80ppmの3-H共鳴によりシアル酸残基が明らかにされた。ピーク2（図7B）は、主に3個の反復ユニットの糖質であった。そのNMRスペクトルは、未変性の多糖のものと一致した。ピーク1（図7C ）は、2個の反復ユニットを持つ糖質と一致した（10残基）。4.78ppm(1)、4.63p pm(2)、4.55ppm(2)、および4.48ppm(2)である7個のアノマーシグナルによって示される、7個のヘキソース残基があった。これに加え、2個のシアル酸残基および末端のアルドン酸残基があった。このシアル酸残基は、全ての断片中に保存され、全てのスペクトルにおいて2.77ppmおよび1.80ppmの3-Hシグナルによって示された。タイプIII多糖に対する異なる時間維持されるオゾン分解の作用を調べた。図8 は、各々、150、195、270および355分オゾン分解した後のLCプロファイルを示した。各時点で生成した糖質は、均一なサイズであり、狭いサイズ分布に納まった。オゾン分解の各時間についての糖断片生成物のサイズは、サイズ分離範囲が1 〜 300kDaであるスーパーロース12カラムで決定した。図8Aから8Dに示された時点でのこれらの糖質の平均サイズは、各々、42、23、21および20kDaに相当していた。更に延長された反応時間455、625、および820分に得られた糖質の平均サイズは、各々、16、14および5kDaであった（データは示していない）。実施例4：3段階オゾン分解法を用いるバクテロイデス・フラギリス多糖Aからの糖断片の生成バクテロイデス・フラギリス多糖A由来の反復ユニットは、図9Aに示した構造を有する。図9Bは、バクテロイデス・フラギリス多糖Aの、スパーデックス75カラムを用いるオゾン分解処理時に生成した糖質のLCプロファイルである。ピーク 1〜3の平均分子量は、それぞれ、2.1、4.3および6.6kDaであった。実施例5：3段階オゾン分解法によって製造した糖断片を使用する破傷風毒素複合ワクチンの調製オゾン分解後に得られたGBSタイプIII多糖の糖断片(5mg)を、水0.375mlに溶解し、0.01Mメタ過ヨウ素酸ナトリウム0.125mlで、暗所室温で90分間酸化した(Wes selsら、J．Clin．Invest.、86:1428(1990))。その後この混合物を水に対して透析し、凍結乾燥した。酸化された糖質試料を破傷風毒素4mgと一緒にし、かつこの一緒にしたものを、0.1M NaHCO₃（pH8.2）0.3ml中に溶解し、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(cyanoborohydride)20mgを添加した。この混合物を、37℃で一晩インキュベーションした。この複合ワクチン生成物を、S-300カラム（ファルマシア社）で精製した。実施例6：1段階オゾン分解法を用いるβ-含有多糖およびα-含有多糖からの糖断片の生成オゾン分解を１段階法を用いて行うことができるかどうかを調べるために、出発材料として、GBSタイプIII多糖、肺炎レンサ球菌14型、またはデキストランを用いた。 GBSタイプIII多糖試料(8.3mg)を、水1mlに溶解し、47分間オゾンを通気した。この間、溶液のpHをモニタリングした。この反応混合物は、20分間オゾン分解した後、わずかに酸性となり、この時点で0.033M NaHCO₃溶液を数滴、該溶液のpH が中性に戻るまで滴下した。様々な時間間隔で、この反応混合物の30μlのアリコート(aliquote)を採取し、生成物のサイズをチェックするために、スーパーロース 12カラムにおいてスクリーニングした。図10に示したように、これらの生成物の減少したサイズは迅速に変化した。32 分後、再度酸性になったので、0.1N NaOHを溶液のpHが9になるまで添加した。反応を更に15分問継続し、この間溶液のpHは変化しなかった。最終的な糖断片の平均分子量は、4.4kDaであった。この生成物を、P2バイオゲルカラム（Biorad，He rcules，CA）において精製し、かつFPLCシステム上で水で溶離した。1個の大きなピークが得られた。次にFPLCカラムから収集した分画をプールし、凍結乾燥し、かつ¹H NMR分光法を行った。¹H NMRスペクトルを図11に示す。このスペクトルは、出発多糖のものと同じであり、従って、糖断片生成物が、出発多糖と同じサブユニット構造を有していることを示している。特に2.8および1.8ppmの特徴的なH-3共鳴によって示されるように、GBSタイプIIIの酸に不安定なシアル残基が保持された。これらのデータは、１段階法を用いるオゾン分解が、出発多糖と同じ内部反復構造を有する糖断片を生じることを示している。 1段階オゾン分解法を、更に出発基質として肺炎レンサ球菌14型多糖を用いて実施した。試料10.5mgを、0.033M NaHCO₃溶液5mlに溶解し、5時間オゾン化した。このオゾン化の間に、反応混合物の75μlアリコートを採取し、スーパーロース12サイジングカラム上でスクリーニングした。この未変性の多糖は、平均分子量130kDaである。反応が30、140、および330分間進行した後、反応混合物中の糖質のサイズは、各々23、6、および3kDaに減少した。糖断片の¹H NMR分析は、該多糖の内部構造がこれらの断片において保存されていることを明らかにした。 GBSタイプIII多糖および肺炎レンサ球菌14型多糖を用いた結果は、β結合を有する多糖類は、そのサブユニット結合を保持しながら、糖断片へと切断されうることを明らかにした。更に糖断片がα結合を含む多糖から製造可能かどうかを決定するために、1段階オゾン分解法を、出発多糖としてデキストランを用いて実施した。デキストランは、主としてα-(1,6)-結合を介して結合したD-グルコピラノシルユニットから成る多糖である。デキストラン（分子量110kDa）の試料4.9mgを、0.03M NaHCO₃の2.4mlに溶解して 2.5時間オゾン分解し、定期的に溶液のpHをモニタリングした。この溶液は徐々に酸性となり、オゾン分解の最後にはpH1になっていた。この反応生成物のサイズをモニタリングしたところ、300Daであった。これらの結果は、α結合を有する多糖類も、オゾン分解を用いて切断できることを示す。 GBSタイプIIIおよび肺炎レンサ球菌14型に由来した多糖の1段階オゾン分解法の前述の用途に加えて、この方法は、更にB.フラギリスA型由来の糖断片、セロビオース(cellobiose)、およびラクトースを製造するためにもうまく使用される。他の実施態様本発明は、その詳細な説明と共に記載されている一方で、前述の説明は、本発明の範囲を例証することを意図し、限定することを意図するものではなく、本発明は添付の請求の範囲によって限定されるということが理解されなければならない。他の側面、利点および修飾法は、下記請求の範囲内にある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者キャスパーデニスエル. アメリカ合衆国マサチューセッツ州ニュートンセンターウォードストリート 544

Claims

【特許請求の範囲】１．比較的大きい多糖を分解することによる、糖断片生成物の製造法であって、多糖が、糖断片生成物よりも大きく、かつβ-Dまたはα-Lグリコシド結合におけるアルドース残基のC1アノマー炭素と第2の残基の酸素原子との間に少なくとも1 個の共有結合を含み； a）比較的大きい多糖上の遊離のヒドロキシル基を保護する段階； b）該比較的大きい多糖をオゾンと反応してC1アノマー炭素を酸化し、その結果アルドース残基をアルドン酸エステル残基に転換する段階；および c）該アルドン酸エステル残基を切断して糖断片を形成する段階を含む方法。２．多糖がシアル酸を含む、請求項1記載の方法。３．多糖がB群レンサ球菌莢膜多糖である、請求項1記載の方法。４．多糖がリポ多糖のO-抗原である、請求項1記載の方法。５．多糖が黄色ブドウ球菌莢膜多糖である、請求項1記載の方法。６．多糖が、黄色ブドウ球菌タイプ5または黄色ブドウ球菌タイプ8の莢膜多糖である、請求項5記載の方法。７．多糖が肺炎レンサ球菌莢膜多糖である、請求項1記載の方法。８．多糖がバクテロイデス・フラギリス莢膜多糖である、請求項1記載の方法。９．多糖が、GBSタイプII多糖、GBSタイプIII多糖、バクテロイデス・フラギリス莢膜多糖、およびGBSタイプVIII多糖からなる群より選択される、請求項1記載の方法。 10．担体に結合された請求項１記載の方法において生成された糖断片を含む免疫原を投与すること、および該免疫原を適当な宿主に注入することを含む、糖断片に特異的な抗体を製造する方法。 11．オゾンが溶液として添加される、請求項1記載の方法。 12．オゾンがインサイチューで生成される、請求項1記載の方法。 13．オゾンが外部供給源から送られる、請求項1記載の方法。 14．エステルが求核剤により切断される、請求項1記載の方法。 15．求核剤がヒドロキシルイオンである、請求項14記載の方法。 16．求核剤がアミンである、請求項14記載の方法。 17．求核剤がチオールである、請求項14記載の方法。 18．求核剤がカルボアニオンである、請求項14記載の方法。 19．エステルが加熱により切断される、請求項1記載の方法。 20．ヒドロキシル基がエステル基を形成することにより保護される、請求項1記載の方法。 21．比較的大きい多糖を酸化することによる糖断片生成物の製造法であって、多糖が、糖断片生成物よりも大きく且つグリコシド結合のアルドース残基のC1アノマー炭素と第2の残基の酸素原子との間に少なくとも1個の共有結合を含み、該比較的大きい多糖をオゾンと反応させて糖断片を含む混合物を生成させる段階を含み、該反応が水溶液中で進行する方法。 22．アルドース残基のC1アノマー炭素と第2の残基の酸素原子との間の共有結合がαグリコシド結合である、請求項21記載の方法。 23．アルドース残基のC1アノマー炭素と第2の残基の酸素原子との間の共有結合がβグリコシド結合である、請求項21記載の方法。 24．比較的大きい多糖がオゾンと反応してC1アノマー炭素を酸化し、その結果アルドース残基をアルドン酸エステル残基に転換する、請求項23記載の方法。 25．多糖がB群レンサ球菌莢膜多糖である、請求項23記載の方法。 26．多糖がリポ多糖のO-抗原である、請求項23記載の方法。 27．多糖が黄色ブドウ球菌の莢膜多糖である、請求項23記載の方法。 28．多糖が、黄色ブドウ球菌タイプ5または黄色ブドウ球菌タイプ8の莢膜多糖である、請求項27記載の方法。 29．多糖が肺炎レンサ球菌の莢膜多糖である、請求項21記載の方法。 30．多糖がバクテロイデス・フラギリスの莢膜多糖である、請求項21記載の方法。 31．多糖が、GBSタイプII多糖、GBSタイプIII多糖、バクテロイデス・フラギリス莢膜多糖、およびGBSタイプVIII多糖からなる群より選択される、請求項21記載の方法。 32．担体に結合された請求項21記載の方法において生成された糖断片を含む免疫原を投与すること、および該免疫原を適当な宿主に注入することを含む、糖断片に特異的な抗体を製造する方法。 33．オゾンが溶液として添加される、請求項21記載の方法。 34．オゾンがインサイチューで生成される、請求項21記載の方法。 35．オゾンが外部供給源から送られる、請求項21記載の方法。 36．エステルが求核剤によって切断される、請求項24記載の方法。 37．求核剤がヒドロキシルイオンである、請求項36記載の方法。 38．求核剤がアミンである、請求項36記載の方法。 39．求核剤がチオールである、請求項36記載の方法。 40．求核剤がカルボアニオンである、請求項36記載の方法。 41．エステルが加熱により切断される、請求項24記載の方法。