ES2694100T3 - Vehículo para distribuir un compuesto en una membrana mucosa y composiciones, procedimientos y sistemas relacionados - Google Patents

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Abstract

Una composición bacteriana para su uso como medicamento, que comprende una vesícula de membrana externa formada por una membrana lipídica que encierra un ambiente acuoso, comprendiendo la vesícula polisacárido A (PSA), en la que la membrana lipídica es de la membrana externa de Bacteroides fragilis.

Description

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DESCRIPCION
Vetftculo para distribuir un compuesto en una membrana mucosa y composiciones, procedimientos y sistemas relacionados
Declaracion de subvencion del gobierno
El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en la presente invencion en virtud de la subvencion N.° DK078938 otorgada por los Institutos Nacionales de la Salud.
Campo de la invencion
La presente divulgacion se refiere a un vetftculo para distribuir un compuesto en composiciones de membrana mucosa, procedimientos y sistemas. En particular, la presente divulgacion se refiere a vetftculos para distribuir un compuesto en una membrana mucosa del tracto digestivo.
Antecedentes de la invencion
La distribucion eficaz de un compuesto o sustancia deseada en la membrana mucosa ha supuesto un reto, en particular cuando se hace referencia a la distribucion en el tracto digestivo, y, en particular, en el tracto gastrointestinal humano.
El tracto gastrointestinal humano alberga un numero extraordinario de microbios (conocidos como microbiota intestinal) que tienen un efecto profundo en el desarrollo y la funcion del sistema inmunologico. De las innumerables especies de bacterias que habitan en el tracto gastrointestinal de los mairnferos, Los bacteroidetes son el filo bacteriano gramnegativo mas abundante.
La identificacion de microorganismos y compuestos inmunomoduladores es de particular interes. En particular, Bacteroides fragilis es un microorganismo comensal humano que ha demostrado tener propiedades inmunomoduladoras. En particular, las propiedades inmunomoduladoras de Bacteroides fragilis se han asociado a la produccion de polisacarido A (PSA) por la bacteria. A este respecto, se observa que la solicitud de patente de Estados Unidos US 2004/0219160 se refiere a "inmunomoduladores zwiterionicos para el tratamiento del asma y la alergia" (tftulo) y el documento US 2009/0124573 se refiere a "compuestos inmunomoduladores y a composiciones y procedimientos relacionados" ( tftulo).
Las bacterias gramnegativas han desarrollado intrincados mecanismos para exportar productos bacterianos; sistemas de secrecion de tipo III (T3SS), T4SS y T6SS, que ensamblan apendices complejos de superficie que translocan los efectores bacterianos despues del contacto directo con las celulas huesped. Otra estrategia de secrecion son las vesfculas de membrana externa (VME) que se distribuyen desde la superficie de las bacterias gramnegativas y distribuyen un conjunto de carga molecular a celulas diana distantes. Aunque muchas bacterias gramnegativas (si no todas) parecen producir VME, las secuencias genomicas de las bacterias comensales humanas revelan una ausencia universal de T3SS, T4SS y T6SS. A este respecto, se observa que D. J. Chen y col., se refieren a "distribucion de antfgenos extranos mediante vacunas de vesfculas de membrana externa disenadas por ingeniena" (tftulo) en PNAS vol. 107, n.° 7, 16 de febrero de 2010, paginas 3099-3104.
Sin embargo, la identificacion del mecanismo y/o los desencadenantes moleculares mediante los cuales B. fragilis (o cualquier bacteria comensal) distribuye moleculas microbianas beneficiosas al sistema inmunitario y realiza las propiedades inmunomoduladoras ha supuesto un reto.
Las enfermedades inflamatorias del intestino (EII), tales como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, representan trastornos graves por los cuales una inflamacion intestinal descontrolada conduce a una patologfa grave del tracto digestivo. La EII afecta aproximadamente a 1 millon de personas en Estados Unidos. Ademas de la carga medica y social de la EII, la incidencia de la enfermedad esta aumentando de manera alarmante en las sociedades "occidentales" y las terapias actuales son en gran medida inadecuadas. Aunque la causa o causas de la EII siguen siendo enigmaticas incluso despues de decadas de investigacion, los defectos en la regulacion inmune hacia las bacterias intestinales parecen desempenar un papel importante en la enfermedad3.
Breve sumario de la invencion
Los detalles de una o mas realizaciones de la divulgacion se exponen en los dibujos adjuntos y la descripcion que se presenta a continuacion. Otras caractensticas, objetos y ventajas seran evidentes a partir de la descripcion y dibujos, de las reivindicaciones.
En el presente documento, los inventores desvelan que el PSA se administra al huesped por medio de vesfculas de membrana externa (VME), estructuras de secrecion que dirigen moleculas bacterianas a las celulas huesped. Las VME que contienen PSA son internalizadas por las celulas dendrfticas del sistema inmunitario del huesped. Tras la captacion de las VME, el PSA programa las celulas dendrfticas para inducir la diferenciacion de los linfocitos T reguladores (Treg) que expresan Foxp3 y la citocina antiinflamatoria interleucina-10 (IL-10). El desarrollo de Treg por las VME requiere la expresion del receptor de tipo toll 2 (TLR2) y la produccion de IL-10 por las celulas dendrfticas.
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De manera destacable, las VME purificadas dirigen la diferenciacion in vitro de los Treg funcionales con una potente actividad supresora de una manera dependiente de PSA. El tratamiento de animales con VME que contienen PSA previene la colitis experimental y suprime las respuestas de citocinas proinflamatorias en el intestino. Estos hallazgos revelan que las bacterias comensales proporcionan factores microbianos beneficiosos a traves de la secrecion de vesfculas, un procedimiento que puede convertirse en un enfoque novedoso para la administracion de terapias probioticas para la EII.
En una realizacion, se proporciona una composicion farmaceutica para administrar un compuesto a una membrana mucosa, que comprende una vesfcula de membrana externa formada por una membrana lipfdica que encierra un ambiente acuoso, la vesfcula que comprende un ligando de PSA; y un vetuculo farmaceuticamente apropiado.
En otra realizacion, se proporciona una composicion farmaceutica para administrar un compuesto a una membrana mucosa, que comprende una vesfcula de membrana externa formada por una membrana lipfdica que encierra un ambiente acuoso, la vesfcula que comprende un ligando de PSA; y un transportador farmaceuticamente apropiado, en la que la membrana lipfdica deriva de la membrana externa de B. fragilis.
En una realizacion mas particular de la composicion para su uso de acuerdo con el parrafo [0011], el ligando de PSA es L-PSA.
En aun otra realizacion de la composicion para su uso de acuerdo con el parrafo [0011], la composicion farmaceutica comprende ademas uno o mas medicamentos o tratamientos que se sabe que son utiles en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal.
En una realizacion, un procedimiento para tratar una enfermedad inflamatoria o inflamacion en un individuo, que comprende administrar una cantidad eficaz de una composicion que comprende una vesfcula de membrana externa formada por una membrana lipfdica que encierra un ambiente acuoso, la vesfcula que comprende un ligando de PSA, en la que la membrana lipfdica deriva de la membrana externa de Bacteroides fragilis.
En una realizacion particularizada del procedimiento en el parrafo [0015], la enfermedad inflamatoria es enfermedad inflamatoria intestinal.
En aun otra realizacion, una vesfcula para administrar un compuesto a una membrana mucosa, que comprende una vesfcula de membrana externa formada por una membrana lipfdica que encierra un ambiente acuoso, comprendiendo la vesfcula un ligando de PSA.
En una realizacion mas particularizada de la vesfcula en el parrafo [0017], la vesfcula comprende ademas un compuesto distinto de PSA.
En otra realizacion, se proporciona un procedimiento para dirigir la diferenciacion de Treg funcionales con una potente actividad supresora, que comprende una vesfcula de membrana externa formada por una membrana lipfdica que encierra un ambiente acuoso, comprendiendo la vesfcula un ligando de PSA.
En una realizacion mas particularizada del procedimiento en el parrafo [0019], los linfocitos Treg inhiben la proliferacion de linfocitos T y/o suprimen adicionalmente a inmunidad al reducir la activacion de las celulas dendnticas.
En otra realizacion del procedimiento en el parrafo [0019], el procedimiento comprende adicionalmente proporcionar CD para el cocultivo, en el que se produce IL-10 y la produccion de IL-10 depende de la presencia de expresion de TLR2 en las CD, en comparacion con la actividad de PSA solo (en ausencia de VME) en la produccion en CD de IL- 10 donde no se requiere la expresion de TLR2 en las CD.
En otra realizacion, se proporciona un procedimiento para identificar compuestos que reducen la inflamacion o mejoran los smtomas de una enfermedad inflamatoria in vitro, que comprende proporcionar un compuesto candidato e incubar el compuesto con linfocitos Treg; proporcionando ademas linfocitos T y, a continuacion, determinando si dichos linfocitos Treg inhiben la activacion de los linfocitos T.
En una realizacion mas particularizada del procedimiento en el parrafo [0022], el procedimiento comprende ademas celulas dendnticas y/o en el que los linfocitos Treg expresan Foxp3.
En otra realizacion, se proporciona una composicion bacteriana para su uso como un medicamento, que comprende una vesfcula de membrana externa formada por una membrana lipfdica que encierra un ambiente acuoso, comprendiendo la vesfcula un ligando de PSA.
En una realizacion mas particularizada de la composicion para su uso de acuerdo con el parrafo [0024], la sustancia bacteriana comprende ademas un excipiente y/o uno o mas medicamentos que se sabe que son utiles en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal.
En otra realizacion, se proporciona una composicion bacteriana para su uso en el tratamiento de enfermedad inflamatoria o inflamacion que comprende una vesfcula de membrana externa formada por una membrana lipfdica
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que encierra un ambiente acuoso, comprendiendo la vesfcula un ligando de PSA.
En una realizacion mas particularizada de la composicion para su uso de acuerdo con el parrafo [0026], la enfermedad inflamatoria es enfermedad inflamatoria intestinal.
En otra realizacion, una composicion para dirigir la diferenciacion de Treg funcional con potente actividad supresora, que comprende una vesfcula de membrana externa formada por una membrana lipfdica que encierra un ambiente acuoso, comprendiendo la vesfcula un ligando de PSA.
En una realizacion mas particularizada de la composicion para su uso de acuerdo con el parrafo [0028], los Treg inhiben la activacion de los linfocitos T y/o en la que los linfocitos Treg expresan Foxp3.
Tambien se proporcionan en el presente documento procedimientos y sistemas para detectar microorganismos y sustancias relacionadas que tienen propiedades inmunomoduladoras y, en particular, antiinflamatorias. En particular, en el presente documento se proporcionan procedimientos y sistemas que, en varias realizaciones, permiten la identificacion de sustancias bacterianas que pueden inducir en un individuo una respuesta inmunomoduladora comparable a la de Bacteroides fragilis.
De acuerdo con otra realizacion, se describe un procedimiento para identificar una sustancia bacteriana que tiene capacidad inmunomoduladora. El procedimiento comprende poner en contacto una sustancia bacteriana candidata con un linfocito T solo o en presencia de una celula presentadora de antigeno, y detectar la expresion de al menos uno de uno o mas biomarcadores antiinflamatorios seleccionados del grupo que consiste en IL-10, Foxp3, TGFp1, TGFp2, perforina y granzima B, y uno o mas biomarcadores inflamatorios seleccionados del grupo que consiste en IFNy, IFNa, IFNp, IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-13, IL-21, IL-22, IL-23, IL-17 o TNFa. El procedimiento comprende ademas determinar una capacidad antiinflamatoria de la sustancia bacteriana candidata mediante la deteccion de un aumento de la expresion de uno o mas biomarcadores antiinflamatorios o una disminucion de la expresion de uno o mas biomarcadores inflamatorios despues del contacto.
De acuerdo con aun otra realizacion, se describe un procedimiento para identificar una sustancia bacteriana que tiene capacidad inmunomoduladora. El procedimiento comprende poner en contacto una sustancia bacteriana candidata con una celula presentadora de antfgeno e incubar la celula presentadora de antfgeno con un linfocito T despues de la puesta en contacto. El procedimiento comprende ademas detectar la expresion de al menos uno de uno o mas biomarcadores antiinflamatorios seleccionados del grupo que consiste en IL-10, Foxp3, TGFpl, TGFp2, perforina y granzima B, y uno o mas biomarcadores inflamatorios seleccionados del grupo que consiste en IFNy, IFNa, IFNp, IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-13, IL-21, IL-22, IL-23, IL-17 o TNFa. El procedimiento comprende ademas determinar una capacidad antiinflamatoria de la sustancia bacteriana candidata mediante la deteccion de un aumento de la expresion de uno o mas biomarcadores antiinflamatorios o una disminucion de la expresion de uno o mas biomarcadores inflamatorios despues de la incubacion.
De acuerdo con otro aspecto, se describe un procedimiento para identificar una sustancia bacteriana que tiene capacidad inmunomoduladora en animales. El procedimiento comprende tratar un marcador transgenico de un animal no humano con una sustancia bacteriana candidata, estando el marcador transgenico de animal no humano modificado geneticamente para expresar al menos uno de uno o mas biomarcadores antiinflamatorios marcados seleccionados del grupo que consiste en IL-10, Foxp3, TGFp1, TGFp2, perforina y granzima B, y uno o mas biomarcadores inflamatorios marcados seleccionados del grupo que consiste en IFNy, IFNa, IFNp, IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-13, IL-21, IL-22, IL-23, IL-17 o TNFa. El procedimiento comprende ademas detectar la expresion en el marcador transgenico de animales no humanos de al menos uno de los uno o mas biomarcadores antiinflamatorios o al menos uno de los biomarcadores inflamatorios despues del tratamiento y la determinacion de una capacidad antiinflamatoria de la sustancia bacteriana candidata a traves de la deteccion de un aumento de la expresion de uno o mas biomarcadores antiinflamatorios o una disminucion de la expresion de los uno o mas biomarcadores inflamatorios despues del tratamiento.
De acuerdo con otro aspecto, se describe un sistema para seleccionar una sustancia bacteriana. El sistema comprende al menos dos de un linfocito T, una celula presentadora de antfgeno y reactivos para la deteccion de al menos uno de uno o mas biomarcadores antiinflamatorios seleccionados del grupo que consiste en IL-10, Foxp3, TGFp1, TGFp2, perforina y granzima B, y uno o mas biomarcadores inflamatorios marcados seleccionados del grupo que consiste en IFNy, IFNa, IFNp, IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-13, IL-21, IL-22, IL-23, IL-17 o TNFa, para el uso simultaneo, combinado o secuencial en un procedimiento para identificar una sustancia bacteriana antiinflamatoria descrita en el presente documento.
Los procedimientos y sistemas descritos en el presente documento pueden usarse en relacion con aplicaciones medicas, farmaceuticas, veterinarias asf como estudios biologicos fundamentales y diversas aplicaciones que un experto podra identificar tras la lectura de la presente divulgacion, en la que es deseable investigar la capacidad inmunomoduladora y, en particular, la capacidad antiinflamatoria de una sustancia.
Breve descripcion de los dibujos
Los dibujos adjuntos, que se incorporan y forman parte de esta especificacion, ilustran una o mas realizaciones de la
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presente divulgacion y, junto con la descripcion detallada y las secciones de ejemplo, sirven para explicar los principios e implementaciones de la divulgacion.
La figura 1 muestra que las vesfculas de membrana externa (VME) de Bacteroides fragilis contienen PSA. La figura 1a muestra VME producidas por B. fragilis de tipo silvestre y APSA de B. fragilis que se detectaron mediante microscopia electronica de transmision de B. fragilis enriquecida con EDL (capa electrodensa). La figura 1b muestra un analisis de inmunotransferencia de celulas enteras (CE) y extractos de vesfculas de membrana externa (VMO) de bacterias de tipo silvestre y mutantes para SA. La figura 1c muestra el marcaje inmunologico de VME purificadas, tenidas con anti-PSA y conjugado de anti-IgG-oro coloidal (5 nm), analizado por microscopia electronica. La figura 1d muestra una tincion con glicoprotemas de preparaciones de polisacaridos capsulares a partir de celulas enteras y VME.
La figura 2 ilustra los resultados de ejemplo que muestran que las VME protegen a los animales de la colitis experimental y la inflamacion intestinal de una manera dependiente de PSA. La figura 2a muestra un diagrama que notifica la perdida de peso en grupos de animales tras la induccion de colitis TNBS (dfa 0) medida como la reduccion desde el peso inicial hasta el dfa del sacrificio (dfa 4). Todos los grupos conteman al menos 4 animales, con barras de error que indican el error estandar de la media (SEM). Los resultados son representativos de 3 ensayos independientes. Los valores de p se determinan mediante ANOVA de una via: * p<0,05; ***p<0,001. La figura 2b muestra imagenes de dos colon no manipulados inmediatamente despues de la reseccion y la cuantificacion de la longitud (grafico) del grupo tratado con vehnculo (EtOH) y TNBS (n = 4 animales/grupo). Las barras de error indican SEM. Los resultados se muestran a partir de 3 experimentos combinados realizados independientemente. Los valores de p se determinaron mediante un ANOVA de una via: ***p<0,001. NS: no significativo. La figura 2c muestra imagenes de secciones de colon tenidas con hematoxilina y eosina (H&E) representativas de cada grupo de tratamiento. La figura 2d muestra las puntuaciones de colitis de animales asignados por un anatomopatologo con enmascaramiento (G.W.L) de acuerdo con un sistema de puntuacion estandar (PROCEDIMIENTOS EN LfNEA) (Scheiffele y Fuss. (2001) Induction of TNBS colitis in mice. Current Protocols in Immunology. 1.19.1-15.19.14) Cada sfmbolo representa un animal individual. Los resultados se muestran a partir de 3 experimentos combinados realizados independientemente. ***p<0,001. NS: no significativo. Las figuras 2e y f muestran diagramas que ilustran el analisis de transcripcion de citocinas mediante qRT-PCR a partir del ARN recuperado de dos colon enteros (Figura 2e) o linfocitos T CD4+ purificados de ganglios linfaticos mesentericos (Figura 2f). Las barras de error indican SEM de 4 animales/grupo. Los resultados son representativos de 3 ensayos independientes.
La figura 3 muestra resultados que indican que las VME que contienen PSA inducen la produccion de IL-10 y la expresion de Foxp3 de linfocitos T co-cultivados con CD tratadas. La Figura 3a muestra el analisis por citometna de flujo (CF) de la internalizacion de VME por las CD. Las VME se marcaron con FITC (isotiocianato de fluorescema) y se incubaron con CD cultivadas varias veces (como se indica). Las celulas se tineron con anti-CD11c. Los porcentajes muestran poblaciones de CD11C + VME +. La figura 3b muestra las representaciones de CF de las CD incubadas con SV-VME y APSA-VME varias veces (segun se indica) y tenidas con anti-CD11c y anti-MHCII. Los porcentajes muestran poblaciones MHCII+ entre las celulas CD11c+. La Figura 3c muestra el analisis ELISA para IL- 10 de sobrenadantes de cultivos de CD o cocultivos de celulas CD-T, donde las CD se pulsaron con VME durante 18 horas, se lavaron y se incubaron con linfocitos T CD4+ primarios o no. Los sobrenadantes se recogieron el dfa 4 de cultivo. Las muestras de medios indican CD que no recibieron pulsos de VME, pero por lo demas se trataron de manera identica. Se anadio anti-CD3 a algunas muestras para aumentar las respuestas de los linfocitos T. Las barras de error indican SEM de muestras por triplicado. Los resultados son representativos de mas de 5 ensayos independientes. * p<0,05; ** p < 0,01. La figura 3d (panel izquierdo) muestra un analisis ELISA similar a la figura 3c, pero tambien incluye CD diferenciadas de animales IL-10-/-. Las barras de error indican SEM de muestras por triplicado. Los resultados son representativos de 3 ensayos independientes. * p<0,05. NS: no significativo. La figura 3d (panel derecho) muestra un analisis ELISA similar a la figura 3c, pero tambien incluye CD diferenciadas de animales TLR2-/-. SEA: enterotoxina A estafilococica. Las barras de error indican SEM de muestras por triplicado. Los resultados son representativos de 3 ensayos independientes. * p<0,05. NS: no significativo. La figura 3e muestra los niveles de transcripcion de IL-10 (izquierda) y Foxp3 (derecha) segun lo determinado mediante qRT-PCR del ARN recibido de los subconjuntos de linfocitos T purificados despues de un cultivo in vitro con CD. Los cocultivos se establecieron como en (c-e); el dfa 4, los linfocitos T CD4+ CD25+ y CD4+ CD25- se purificaron mediante separacion con perlas magneticas (> 95 % de pureza) y se extrajo el ARN con un mini kit RNeasy. Los valores relativos se normalizaron respecto a p-actina. Las barras de error indican SEM de muestras por triplicado. Los resultados son representativos de 3 ensayos independientes. * p<0,05; ***p<0,001. NS: no significativo. La figura 3f muestra cocultivos configurados como en (c-e), pero utilizando linfocitos T CD4+ de ratones Foxp3-GFP. Tras 4 dfas de cultivo con CD con pulsos de VME, las celulas se tineron con anti-CD4 y Foxp3 se detecto mediante la expresion de GFP usando FC. Los resultados son representativos de 2 ensayos independientes.
La figura 4 muestra resultados de ejemplo que indican la generacion in vitro de la funcion supresora de Treg por VME que contienen PSA. La Figura 4a muestra los histogramas de FC de la expresion de IL-10 por subconjuntos de linfocitos T CD4+ despues de un cocultivo de 4 dfas con CD tratados con VME. Los linfocitos T CD4+ de bazo se purificaron en ratones IL-10-GFP, se tineron con anti- CD4 y anti-CD25 tras el cocultivo y se midio la expresion de IL- 10 mediante la expresion de GFP. Los porcentajes muestran las poblaciones de IL-10+ entre las subpoblaciones CD4+CD25+ y CD4+CD25-. Los resultados son representativos de 3 ensayos independientes. La figura 4b muestra la supresion in vitro de celulas respondedoras intactas por linfocitos T CD4+ CD25+ purificadas despues del
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cocultivo con CD tratadas con medios (control), SV-VME y APSA-VME. La proliferacion celular se midio mediante FC de dilucion de CFSE. Se indican las relaciones Treg:Tef y los porcentajes muestran las celulas en proliferacion totales. No Treg: solo las celulas CD4+CD25-. Los resultados son representativos de 2 ensayos independientes. La figura 4c muestra la cuantificacion del porcentaje de linfocitos T CD4+ en cada pico de proliferacion (marcado como 1,2, 3, 4, 5 en la figura 4b). Los resultados se muestran a partir de 3 experimented combinados realizados independientemente. ***p<0,001; * p<0,05. NS: no significativo.
La figura 5 muestra que B. fragilis de tipo salvaje y mutante con delecion de PSA de B. fragilis producen una cantidad similar de VME durante el cultivo in vitro. La cantidad de protema total recuperada de cada preparacion de VME normalizada por DO600 del cultivo en el momento de la cosecha. Las barras de error indican SEM. El resultado se muestra a partir de > 10 experimentos combinados preformados independientemente. El valor p se determino mediante la prueba t de Student. NS: no significativo.
La figura 6 muestra que las VME mayoritarias purificadas a partir de B. fragilis de tipo salvaje contienen PSA. El marcaje Immunogold de PSA en VME purificadas muestra que el 60 % de las SV-VME observadas entre muestras aleatorias de 10 areas (1 pm x 1 pm) de muestra estan asociadas con PSA, pero ninguna de las APSA-VME observadas se tinen positivamente para el PSA. (El marcaje Immunogold de las SV-VME con oro anti-IgG-oro solo confirma la especificidad del marcaje).
La figura 7 muestra las VME de B. fragilis salvaje o mutante con delecion de PSA no muestran una diferencia significativa en la composicion proteica. La espectrometna de masas de proteomas muestra una superposicion del 100 % de las protemas identificadas (> 1 peptido unico identificado para cada protema) entre SV-VME y APSA-VME. Entre todas las protemas identificadas, los inventores compararon de forma semicuantitativa la cantidad de esas protemas relativamente abundantes segun el numero de peptidos unicos identificados para cada una de ellas. La mayona de ellas no muestran diferencias realizadas de forma independiente. Los errores indican SEM. El valor p se determino mediante la prueba t de Student. **: p<0,01; *: p<0,05; NS: no significativo.
La figura 8 muestra que se requiere polimerizacion de actina para la captacion de VME por parte de las CD. Analisis de citometna de flujo de la internalizacion de VME por CD pretratadas con citochalasina D. Las VME se marcaron con FITC (isotiocianato de fluorescema) y se incubaron con CD cultivadas varias veces (como se indica). Las celulas se tineron con anti-CD11c. Los porcentajes muestran poblaciones de CD11C + VME +.
La figura 9 muestra que las SV-VME o APSA-VME estan internalizadas y localizadas en el citoplasma de las CD. Micrograffas fluorescentes de la internalizacion de VME (SV o APSA) por las CD. Las VME se marcaron con FITC (flecha gris) y se incubaron con CD cultivadas durante 2 horas. Las celulas se fijaron y la membrana celular se tino con aglutinina de germen de trigo (WGA)-tetrametilrodamina (flecha negra). Barra de escala: 7,5 pm.
La figura 10 muestra que las SV-VME y PSA-VME regulan por aumento la molecula coestimuladora para la activacion de CD. Los diagramas de FC de las CD se incubaron con SV-VME y APSA-VME varias veces (como se indica) y se tineron con anti-CD11c y anti-CD86. Los porcentajes muestran poblaciones CD86+ entre las celulas CD11c+.
La figura 11 muestra la expresion de biomarcadores inducida por PSA en una realizacion descrita en el presente documento. Los datos ilustrados en cada diagrama son representativos de tres experimentos independientes. Las barras claras indicaron celulas derivadas de ratones tratados con PBS y barras oscuras de ratones tratados con PSA.
Descripcion detallada de la invencion
Los vehteulos se describen en el presente documento que son adecuados para administrar un compuesto a una membrana mucosa.
Los terminos "VME de tipo salvaje", "VME que contienen PSA" y "PSA-VME", se usan indistintamente en el presente documento.
El termino "vehteulo" en el sentido de la presente divulgacion indica un medio en el que se administra un compuesto, y en el que el compuesto esta comprendido, se expresa y/o se muestra. Los vehteulos de ejemplo comprenden cualquiera de los diversos medios que actuan generalmente como disolventes, vehteulos o aglutinantes para principios activos, con particular referencia a farmacos.
El termino "administrar" y que administra" en referencia a un compuesto o sustancia en el sentido de la presente divulgacion indica el paso del compuesto o sustancia desde una ubicacion de origen a una ubicacion de destino, y, en particular, a una ubicacion formada por una o mas celulas, tejidos u organos de un individuo. En particular, un compuesto se administra en el sentido de la presente divulgacion cuando el paso se realiza de modo que al menos una actividad asociada al compuesto administrado se pueda ejercer sobre una o mas celulas, tejidos u organos del individuo.
El termino "compuesto" como se usa en el presente documento indica cualquier sustancia qmmica que comprende
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uno o mas elementos qmmicos y comprende varias sustancias, moleculas o componentes que incluyen, entre otros, biomoleculas y, en particular, farmacos. El termino "biomolecula", como se usa en el presente documento, indica un compuesto o componente de sustancia asociado a una actividad biologica que incluye, entre otros, azucares, aminoacidos, protemas de peptidos, oligonucleotidos, polinucleotidos, polipeptidos, moleculas organicas, haptenos, epftopos, celulas biologicas, partes de celulas biologicas, vitaminas, hormonas y similares. El termino "farmaco", tal como se usa en el presente documento, indica la sustancia que, cuando se absorbe en el cuerpo de un organismo vivo, altera la funcion corporal normal. En particular, los farmacos en el sentido de la presente divulgacion incluyen una sustancia qmmica utilizada en el tratamiento, la cura, la prevencion o el diagnostico de enfermedad o utilizado para mejorar el bienestar ffsico o mental.
Si el PSA es, por ejemplo, el "compuesto" anterior, tambien podnan administrarse compuestos diferentes adicionales, ademas de PSA, por la vesmula.
La expresion "membrana mucosa" en el sentido de la presente divulgacion indica un revestimiento de origen principalmente endodermico, cubierto de epitelio, que estan involucrados en la absorcion y secrecion. En un individuo, las membranas mucosas recubren varias cavidades corporales que estan expuestas al ambiente externo y a los organos internos. Las membranas mucosas se encuentran en varios lugares continuos con la piel: en las fosas nasales, la boca, los labios, los parpados, las orejas, el area genital y el ano.
En las composiciones y los procedimientos y sistemas relacionados descritos en el presente documento, el vehuculo esta formado por una vesmula que comprende uno o mas compuestos que se van a administrar.
Una "vesmula" en el sentido de la presente divulgacion es un complejo supramolecular formado por un lfpido formador de membrana y moleculas adicionales ensambladas en un ambiente acuoso. En particular, en las vesmulas descritas en el presente documento, los lfpidos formadores de membrana estan dispuestos en una capa lipfdica que encierra un ambiente acuoso interno en el presente documento tambien indicado como citosol.
La expresion "lfpido formador de membrana" o "lfpido anfipatico" como se usa en el presente documento indica un lfpido que posee propiedades hidrofilas e hidrofobas que en un ambiente acuoso se ensamblan en una estructura de capa lipfdica que consiste en una o dos capas opuestas de moleculas anfipaticas conocidas como lfpidos polares. Cada lfpido polar tiene un resto hidrofilo, es decir, un grupo polar tal como, un fosfato derivatizado o un grupo sacarido, y un resto hidrofobo, es decir, una cadena larga de hidrocarburo. Los lfpidos polares de ejemplo incluyen fosfolfpidos, esfingolfpidos, glicolfpidos, lfpidos de eter, esteroles y alquilfosfocolinas. Los lfpidos anfipaticos incluyen, entre otros, lfpidos de membrana, es decir, lfpidos anfipaticos que son constituyentes de una membrana biologica, tales como fosfolfpidos como dimirisoilfosfatidilcolina (DMPC) o dioleoilfosfoetanolamina (DOPE) o dioleoilfosfatidilcolina (DOPC). La membrana de la vesmula esta formada por una bicapa lipfdica que simula una membrana plasmatica (una membrana biologica que separa el interior de una celula del ambiente exterior y encierra un ambiente acuoso), es decir, la membrana externa de B. fragilis.
Las vesmulas descritas en el presente documento tambien comprenden un lipopolisacarido (LPS) asociado con la membrana de la vesmula o que esta comprendido en el ambiente acuoso de la vesmula. El termino "lipopolisacarido" como se usa en el presente documento indica moleculas grandes que consisten en un lfpido y un polisacarido unidos por un enlace covalente; se encuentran en la membrana externa de las bacterias gramnegativas, actuan como endotoxinas y provocan respuestas inmunes fuertes en los animales. Las vesmulas descritas en el presente documento comprenden uno o mas LPS de B. fragilis que un experto puede identificar.
Las vesmulas descritas en el presente documento tambien pueden comprender un peptidoglicano asociado con la membrana de la vesmula o comprendido en el ambiente acuoso de la vesmula. El termino "peptidoglicano", como se usa en el presente documento, indica un polfmero que consiste en azucares y aminoacidos que forman una capa similar a una malla fuera de la membrana plasmatica de las bacterias (Eubacteria, no Archaebacteria), formando la pared celular. En particular, las vesmulas descritas en el presente documento comprenden uno o mas peptidoglicanos de B. fragilis que puede identificar un experto.
Compuestos adicionales que pueden estar comprendidos en las vesmulas comprenden protemas de membrana, lfpidos de membrana, hidratos de carbono y acidos nucleicos, y en particular, protemas de membrana, lfpidos de membrana, hidratos de carbono y acidos nucleicos de B. fragilis.
Las vesfculas de ejemplo en el sentido de la presente divulgacion comprenden pequenos sacos encerrados en membranas que pueden almacenar o transportar sustancias. Las vesfculas pueden formarse de modo natural debido a las propiedades de la membrana que forma el lfpido o pueden prepararse a partir de membranas bacterianas. La mayona de las vesfculas tienen funciones especializadas dependiendo de los materiales que contienen en la membrana y/o el ambiente acuoso.
En una realizacion, las vesfculas descritas en el presente documento estan formadas por porciones de membranas de bacterias. En una realizacion, las vesfculas estan formadas por las vesfculas de membrana externa (VME) de las bacterias.
Las vesfculas descritas en el presente documento estan formadas por porciones de membranas de B. fragilis, a
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saber, de la VME de B. fragilis como se ilustra en la seccion de Ejemplos.
En una realizacion, el compuesto administrado puede ser un farmaco, un farmaco candidato, un suplemento (un producto tomado por via oral que contiene uno o mas ingredientes (como vitaminas o aminoacidos) que se pretende que complementen la dieta y no se consideran alimentos) o cualquier otro compuesto cuya administracion a la membrana mucosa se desee. Uno o mas de esos compuestos pueden incluirse en las vesfculas descritas en el presente documento en una dosis adecuada que el experto en la materia puede determinar a la vista del compuesto espedfico que se va a administrar.
El compuesto comprende uno o mas polisacaridos zwiterionicos, a saber, el polisacarido A.
La expresion "polisacarido zwiterionico" como se usa en el presente documento indica polfmeros sinteticos o naturales que comprenden uno o mas monosacaridos unidos por enlaces glicosfdicos, e incluyen al menos un resto cargado positivamente y al menos un resto cargado negativamente. Los polisacaridos zwiterionicos incluyen, entre otros, poifmeros de cualquier longitud, desde un polfmero monosacarido o disacarido hasta polfmeros que incluyen cientos o miles de monosacaridos. En algunas realizaciones, un polisacarido zwiterionico puede incluir unidades de repeticion en las que cada unidad de repeticion incluye de dos a diez monosacaridos, un resto cargado positivamente (por ejemplo, un resto amino cargado positivamente libre) y un resto cargado negativamente (tal como sulfonato, sulfato, fosfato y fosfonato). En alguna realizacion, los PZ pueden tener un peso molecular comprendido entre 500 Da y 2.000.000 Da. En algunas realizaciones, los PZ pueden tener un peso molecular comprendido entre 200 y 2.500. Los ejemplos de PSZ incluyen, entre otros, PSA y PSB de Bacteroides Fragilis, CP5/CD8 de Staphylococcus aureus y Sp1/CP1 de Streptococcus pneumonia. Los polisacaridos zwiterionicos pueden aislarse de fuentes naturales y, en particular, de fuentes bacterianas, por ejemplo, mediante purificacion. Los polisacaridos zwiterionicos tambien pueden producirse por procedimientos qmmicos o bioqmmicos, asf como mediante tecnologfas de microorganismos recombinantes, todas identificables por un experto. Por lo tanto, dichos procedimientos y tecnologfas no se describiran mas detalladamente en el presente documento.
La expresion "polisacarido A" (o PSA, o ligando de PSA), como se usa en el presente documento, indica una molecula producida por el locus de PSA de Bacteroides fragilis y sus derivados, que incluyen, entre otros, polfmeros de la unidad de repeticion {^ 3) a-d -AAT Galp (1 ^ 4) - [p-d-Galf (1 ^ 3)] a-d-GalpNAc (1 ^ 3) - [4,6-piruvato] -p- d-Galp (1 ^), donde AATGal es acetamido-amino-2,4,6-tridesoxigalactosa y el residuo galactopiranosilo se modifica por un sustituyente piruvato que abarca 0-4 y 0-6. El termino "derivado", como se usa en el presente documento con referencia a un primer polisacarido (por ejemplo, PSA), indica un segundo polisacarido que esta relacionado estructuralmente con el primer polisacarido y se puede derivar del primer polisacarido mediante una modificacion que introduce una caractenstica que no esta presente en el primer polisacarido al tiempo que retiene las propiedades funcionales del primer polisacarido. Por consiguiente, un polisacarido derivado de PSA, por lo general, difiere del polisacarido original por la modificacion de las unidades de repeticion o del componente sacarido de una o mas de las unidades de repeticion que pueden o no estar asociadas con una funcion adicional que no esta presente en el polisacarido original. Un polisacarido derivado de PSA conserva, sin embargo, una o mas actividades funcionales que se describen en el presente documento en relacion con el PSA en asociacion con la actividad antiinflamatoria del PSA.
En una realizacion, el PSA de bajo peso molecular (L-PSA) tiene de 70 kDa a 200 kDa y el PSA de alto peso molecular (H-PSA) esta por encima de 200 kDa.
En una realizacion, la membrana mucosa es una membrana mucosa del tracto digestivo de un individuo, y, en particular, de la mucosa intestinal, la mucosa gastrica, la mucosa esofagica, la mucosa bucal, la mucosa oral y/o la mucosa bucal.
En una realizacion, las vesfculas descritas en el presente documento se pueden usar en relacion con procedimientos y aplicaciones como las descritas en la solicitud provisional de Estados Unidos S/N 61/321,527.
En una realizacion, las vesfculas descritas en el presente documento se pueden usar en relacion con procedimientos y sistemas como los descritos en el documento Us 2010/0275282.
En una realizacion, las vesfculas descritas en el presente documento se pueden usar en un procedimiento para administrar el compuesto a una membrana mucosa de un individuo. En particular, el procedimiento comprende poner en contacto una vesfcula que comprende el compuesto con la membrana mucosa durante un tiempo y en condiciones para permitir el contacto de la sustancia con la membrana. En el procedimiento, la vesfcula esta formada por una membrana lipfdica que encierra un ambiente acuoso y el compuesto que se va a administrar esta comprendido en el ambiente acuoso de la vesfcula.
En otra realizacion, una composicion o composicion farmaceutica que comprende la vesfcula o VME se pone en contacto con la membrana mucosa durante un tiempo y en condiciones que permitan el contacto de la sustancia con la membrana.
El termino "contactar" o "incubar" como se usa en el presente documento indica acciones dirigidas a la creacion de una relacion espacial entre dos elementos proporcionados durante un tiempo y en condiciones tales que se pueda
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ejercer al menos una de las acciones redprocas o no redprocas o influencia entre los dos elementos. En particular, la incubacion se puede realizar entre una vesfcula y una membrana mucosa y puede dar lugar a un contacto directo y/o interaccion entre la vesfcula y la membrana mucosa o puede dar lugar a una modificacion de la membrana mucosa despues de una accion indirecta de la vesfcula (por ejemplo, tras la activacion o modificacion de otra sustancia que interacciona directamente con la membrana).
Las condiciones adecuadas para realizar el contacto o la incubacion son identificables por un experto en la lectura de la presente divulgacion en vista del compuesto, la membrana mucosa y el diseno experimental.
En una realizacion, las vesfculas descritas en el presente documento pueden estar comprendidas en una composicion para administrar un compuesto a una membrana mucosa. La composicion comprende una o mas vesfculas descritas en el presente documento opcionalmente en combinacion con un vehffculo adicional que actua como disolvente, vetnculo, aglutinante o diluyentes para las vesfculas.
El termino "afeccion", cuando se refiere al estado de un animal o un ser humano, como se usa en el presente documento, indica generalmente el estado ffsico del cuerpo de un individuo, en conjunto o de una o mas de sus partes, que no se ajuste a un estado ffsico del individuo, en conjunto o de una o mas de sus partes, que se asocia con un estado de ffsico completo, bienestar mental y posiblemente social. Las afecciones descritas en el presente documento incluyen, entre otras, trastornos y enfermedades en las que el termino "trastorno" indica una afeccion del individuo vivo que esta asociada a una anomaffa funcional del cuerpo o de cualquiera de sus partes, y el termino "enfermedad" indica una afeccion del individuo vivo que perjudica el funcionamiento normal del cuerpo o de cualquiera de sus partes y se manifiesta ffpicamente por signos y smtomas distintivos. Las afecciones de ejemplo incluyen, entre otras, lesiones, discapacidades, trastornos (incluyendo trastornos mentales y ffsicos), smdromes, infecciones, comportamientos desviados del individuo y variaciones affpicas de la estructura y funciones del cuerpo de un individuo o partes del mismo.
En particular, en realizaciones en las que el compuesto se usa como un compuesto antiinflamatorio, la afeccion puede ser cualquier afeccion asociada a una inflamacion o respuesta inflamatoria; o una afeccion descrita como una enfermedad inflamatoria en sf misma. La expresion "asociado a" como se usa en el presente documento con referencia a dos elementos indica una relacion entre los dos elementos, de manera que la aparicion de un primer elemento se acompana de la aparicion del segundo elemento, que incluye, pero sin limitaciones, a una relacion causa-efecto y una relacion enfermedad-signo/smtomas.
Las afecciones asociadas con una inflamacion (o enfermedades inflamatorias) en los seres humanos incluyen, aunque sin limitaciones, enfermedad inflamatoria intestinal, incluyendo, pero sin limitaciones, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, asma, dermatitis, artritis, miastenia gravis, enfermedad de Graves, esclerosis multiple (EM) y psoriasis. Un experto en la materia podna identificar a tales sujetos que padecen las enfermedades mencionadas anteriormente utilizando los criterios clmicos apropiados.
En una realizacion, las composiciones, la composicion farmaceutica que comprende VME que contienen PSA se pueden usar para la prevencion de enfermedades inflamatorias, tales como, pero sin limitaciones, enfermedades inflamatorias intestinales (incluyendo enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), asma, dermatitis, artritis, miastenia gravis, enfermedad de Graves, esclerosis multiple y psoriasis.
El termino "tratamiento" o "tratado" como se usa en el presente documento indica cualquier actividad, ya sea parte de una atencion medica, o no, o trata una afeccion medica o quirurgicamente en animales o seres humanos. Tales tratamientos pueden ser administrados por personal medico o no medico.
En algunas realizaciones, cuando la composicion se administre a un individuo, la composicion puede ser una composicion farmaceutica, y comprende una o mas vesfculas que comprenden cada una PSA. En una realizacion mas particular, la composicion farmaceutica puede comprender una o mas vesfculas, cada una de las cuales comprende PSA y uno o mas de otro compuesto, y/o un transportador/vehffculo farmaceuticamente aceptable o apropiado.
En otra realizacion, la composicion farmaceutica anterior, que comprende una o mas vesfculas, cada una de las cuales comprende PSA y uno o mas de otro compuesto, y/o un transportador/vehffculo farmaceuticamente aceptable o apropiado, en la que un individuo/sujeto con una afeccion inflamatoria o inflamacion dada esta composicion muestra una mejora.
En algunas realizaciones, las vesfculas descritas en el presente documento pueden incluirse en composiciones farmaceuticas junto con un excipiente o diluyente. En particular, en algunas realizaciones, las composiciones farmaceuticas contienen vesfculas descritas en el presente documento en combinacion con uno o mas vehffculos compatibles y farmaceuticamente aceptables, y, en particular, con diluyentes o excipientes farmaceuticamente aceptables.
El termino "excipiente" como se usa en el presente documento indica una sustancia inactiva usada como un transportador farmaceuticamente aceptable o apropiado para los principios activos de un medicamento. Los excipientes adecuados para las composiciones farmaceuticas descritas en el presente documento incluyen cualquier
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sustancia que mejore la capacidad del cuerpo de un individuo para absorber las vesmulas descritas en el presente documento. Los excipientes adecuados tambien incluyen cualquier sustancia que pueda usarse para aumentar las formulaciones con vesmulas descritas en el presente documento para permitir una dosificacion conveniente y precisa. Ademas de su uso en la cantidad de dosis unica, los excipientes se pueden usar en el procedimiento de fabricacion para ayudar en la manipulacion de las vesmulas descritas en el presente documento. Dependiendo de la via de administracion y la forma de medicacion, se pueden usar diferentes excipientes. Los excipientes de ejemplo incluyen, entre otros, antiadherentes, aglutinantes, disgregantes de recubrimientos, cargas, sabores (tales como edulcorantes) y colores, sustancias de deslizamiento, lubricantes, conservantes, sorbentes.
Los transportadores farmaceuticamente aceptables o apropiados pueden ser, pero sin limitaciones, excipientes organicos o inorganicos, solidos o lfquidos adecuados para el modo de aplicacion seleccionado, tal como aplicacion oral o inyeccion, y se administran en forma de una preparacion farmaceutica convencional. Tal preparacion incluye solidos tales como comprimidos, granulos, polvos, capsulas, y lfquidos tales como solucion, emulsion, suspension y similares. Dicho transportador incluye almidon, lactosa, glucosa, sacarosa, dextrina, celulosa, parafina, glicerido de acido graso, agua, alcohol, goma arabiga y similares. Si es necesario, se pueden anadir adyuvantes, estabilizantes, emulsionantes, lubricantes, aglutinantes, controladores para ajustar el pH, agentes isotonicos y otros aditivos convencionales.
El transportador farmaceuticamente aceptable o apropiado puede incluir otros compuestos que se sabe que son beneficiosos para una situacion deteriorada del intestino, (por ejemplo, antioxidantes, tales como vitamina C, vitamina E, selenio o cinc); o una composicion alimentaria. La composicion alimentaria puede ser, aunque sin limitaciones, leche, yogur, cuajada, queso, leches fermentadas, productos fermentados a base de leche, helados, productos a base de cereales fermentados, polvos a base de leche, formulas infantiles, comprimidos, suspensiones bacterianas lfquidas, suplemento oral seco o suplemento oral humedo.
El termino "diluyente", como se usa en el presente documento, indica un agente diluyente que se emite para diluir o transportar un principio activo de una composicion. El diluyente adecuado incluye cualquier sustancia que pueda disminuir la viscosidad de una preparacion medicinal.
En determinadas realizaciones, las composiciones, compuestos y, en particular, las composiciones farmaceuticas pueden formularse para administracion enteral, incluidas, pero sin limitaciones, i) por boca (oral) en forma de comprimidos, capsulas o gotas; ii) por sonda de alimentacion gastrica, sonda de alimentacion duodenal o gastrostoirna; y nutricion enteral; y iii) por via rectal como supositorio.
En algunas realizaciones, las vesmulas descritas en el presente documento que comprenden PSA se pueden usar en un procedimiento para tratar o prevenir una afeccion en un individuo.
El procedimiento comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composicion o composicion farmaceutica. El termino "individuo", tal como se usa en el presente documento, incluye un unico organismo biologico en el que puede producirse una inflamacion, incluyendo, aunque sin limitaciones, animales y, en particular, animales superiores y, en particular, vertebrados tales como mamfferos y en particular seres humanos.
La "cantidad eficaz", "cantidad efectiva para" o "cantidad de X eficaz para" se refiere a una cantidad del compuesto, composicion o composicion farmaceutica que sea eficaz para tratar, aliviar, reducir o mejorar hasta cierto punto uno o mas de los smtomas de la enfermedad que necesitan tratamiento, o retrasar la iniciacion de marcadores clmicos o smtomas de una enfermedad que necesita prevencion, cuando se administra el compuesto. Por lo tanto, por ejemplo, una cantidad eficaz se refiere a una cantidad del compuesto/composicion/ingrediente farmaceutico que exhibe los efectos "mejorados", como se indica a continuacion.
La "cantidad eficaz" puede determinarse empmcamente experimentando con los compuestos en cuestion en sistemas de modelos conocidos in vivo e in vitro para una enfermedad que necesita tratamiento. Una cantidad eficaz variara segun el peso, el sexo, la edad y el historial medico del individuo, asf como la gravedad de la o las afecciones del paciente, el tipo de enfermedad o enfermedades, el modo de administracion y similares. Una cantidad eficaz puede determinarse facilmente mediante experimentacion de rutina, por ejemplo, mediante titulacion (administracion de dosis crecientes hasta que se encuentre una dosis eficaz) y/o por referencia a cantidades que fueron eficaces para pacientes anteriores. En general, la cantidad eficaz de la presente invencion se administrara a dosis que oscilan entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg del peso corporal del paciente.
Como se utiliza en el presente documento, la frase "cantidad profilacticamente eficaz" incluye la cantidad del compuesto/composicion/composicion farmaceutica que es suficiente para dar como resultado la prevencion o reduccion del desarrollo, recurrencia o aparicion de uno o mas smtomas asociados con un trastorno (o para potenciar o mejorar el efecto o efectos profilacticos de otra terapia (por ejemplo, otro agente profilactico).
Se contempla ademas que el compuesto/composicion/composicion farmaceutica de la presente invencion se puede usar con uno o mas medicamentos conocidos que se sabe que son utiles en el tratamiento o prevencion de enfermedades inflamatorias, ya sea por separado o en combinacion.
Por ejemplo, el compuesto/composicion/composicion farmaceutica de la presente invencion se puede combinar con
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uno o una combinacion de medicamentos/tratamientos que se sabe que son utiles en el tratamiento de la EII, tales como, pero sin limitaciones, sulfasalazina (Azulfadine), mesalamina (Asacol, Pentasa), inmunosupresores (Imuran, 6-MP, ciclosporina); metotrexato, inhibidores del TNF-alfa (Remicade y Humira); y corticosteroides (Entocort y prednisona). Otros tratamientos (experimentales) para la colitis ulcerosa, incluyen aloe vera, butirato, boswellia, probioticos, antibioticos, terapia inmunosupresora y nicotina.
Por ejemplo, el compuesto/composicion/composicion farmaceutica de la presente invencion se puede combinar con uno o una combinacion de medicamentos/tratamientos que se sabe que son utiles en el tratamiento de la EM, tal como, pero sin limitaciones, Avonex®, Betaseron® y Copaxone®. Rebif®; Extavia® Novantrone® (mitoxantrona); Tysabri® (natalizumab) y Gilenya® (fingolimod). Otros farmacos incluyen la terapia de inmunoglobulina intravenosa (IVIg), metotrexato, azatioprina (Imuran®) y ciclofosfamida (Cytoxan®); corticoesteroides; cytoxan® (ciclofosfamida); Imuran® (azatioprina); metotrexato; intercambio de plasma; pulso de solu-medrol® (metilprednisolona IV); prednisona; Decadron® (dexametasona); Medrol® (metilprednisolona oral); plasmaferesis (intercambio de plasma); terapia de inmunoglobulina intravenosa (IgIV).
En otra realizacion, es posible que estos otros medicamentos puedan expresarse o administrarse dentro de las propias VME.
Como se utiliza en el presente documento, "mejorado/a", "mejora", y otras variantes gramaticales, incluyen cualquier cambio beneficioso en el individuo/sujeto que resulte de un tratamiento. Un cambio beneficioso es cualquier forma en que el estado del paciente sea mejor de lo que hubiera sido en ausencia del tratamiento. "Mejorado/a" incluye, aunque sin limitaciones, prevencion de una afeccion no deseada, ralentizacion de la velocidad a la que empeora una afeccion, retraso del desarrollo de una afeccion no deseada, restauracion a una condicion esencialmente normal; hacer que el paciente entre en remision con mas frecuencia o permanezca en remision durante penodos mas prolongados que sin tratamiento (es decir, cuando el grado de inflamacion en el paciente es menor (o esta ausente); o la persona normalmente esta sin smtomas); reduccion en el numero y/o gravedad de las recafdas; y reduccion del desarrollo de nuevas areas de inflamacion, como se ve en las imagenes de resonancia magnetica (IRM).
De manera mas particular, la mejora en la EII abarca una reduccion en la gravedad o la duracion de uno o mas smtomas clmicos de la EII, tales como, pero sin limitaciones, calambres abdominales y dolor; heces con sangre; diarrea; urgencia por movimientos intestinales; fiebre; perdida de apetito; perdida de peso; mucosidad en las heces; ulceracion del intestino grueso; y anemia (por perdida de sangre). Por ejemplo, la mejora en la EM abarca una reduccion en la gravedad o la duracion de uno o mas smtomas clmicos de EM, tales como, pero sin limitaciones, fatiga; trastornos visuales; entumecimiento; mareos/vertigo; disfuncion vesical e intestinal; debilidad; temblor; movilidad alterada; disfuncion sexual; habla confusa; espasticidad (rigidez de la pierna); trastornos de la deglucion; dolor cronico; depresion; dificultades cognitivas y de memoria leves
Ademas, "mejorado/a", "mejora", y otras variantes gramaticales incluyen cualquier cambio que resulte en la reduccion de la gravedad, la duracion y/o el riesgo de desarrollar complicaciones de la enfermedad inflamatoria. Para la EII, "mejorado/a" podna significar, por ejemplo, un riesgo reducido de que el sujeto con EII desarrolle hemorragia profusa de las ulceras; perforacion (rotura) del intestino; estenosis y obstruccion; fistulas (pasaje anormal) y enfermedad perianal; megacolon toxico (dilatacion aguda no obstructiva del colon); y neoplasia maligna (por ejemplo, cancer de colon).
En una realizacion, al menos dos de los lfpidos formadores de membrana, vesmulas, PSA y uno o mas compuestos adicionales para administrar pueden estar comprendidos en un sistema posiblemente junto con otros reactivos adecuados para su uso en los procedimientos descritos en el presente documento.
Los sistemas se pueden proporcionar en forma de kits de piezas. En un kit de piezas, los lfpidos formadores de membrana, vesmulas, PSA, compuestos de adicion, medicamentos y otros reactivos pueden incluirse en una o mas composiciones, o cada lfpido, vesmulas, PSA, compuestos de adicion, los medicamentos compuestos y reactivos pueden estar en una composicion junto con un vehmulo adecuado.
Los componentes adicionales pueden incluir moleculas marcadas y, en particular, agentes de captura marcados espedficos para un biomarcador antiinflamatorio o inflamatorio o una molecula asociada a su expresion, un chip microfluido, patrones de referencia y componentes adicionales identificables por un experto al leer la presente divulgacion.
La expresion "agente de captura" como se usa en el presente documento indica un compuesto que se puede unir espedficamente a un objetivo. La expresion "espedfica" "espedficamente" o "especificidad" como se usa en el presente documento con referencia a la union de una primera molecula a una segunda molecula se refiere al reconocimiento, contacto y formacion de un complejo estable entre la primera molecula y la segunda molecula, junto con sustancialmente menos o ningun reconocimiento, contacto y formacion de un complejo estable entre cada una de la primera molecula y la segunda molecula con otras moleculas que puedan estar presentes. Los enlaces espedficos de ejemplo son interaccion anticuerpo-antfgeno, interacciones celulares receptor-ligando, hibridacion de polinucleotidos, interacciones enzima-sustrato, etc. Por "complejo estable" se entiende un complejo que es detectable y no requiere ningun nivel arbitrario de estabilidad, aunque generalmente se prefiere mayor estabilidad.
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En algunas realizaciones, el kit puede comprender polinucleotidos marcados o anticuerpos marcados.
Los componentes del kit pueden proporcionarse con las instrucciones adecuadas y otros reactivos necesarios, con el fin de realizar los procedimientos descritos en el presente documento. El kit normalmente contendra las composiciones en recipientes separados. Las instrucciones, por ejemplo, instrucciones escritas o de audio, en papel o soporte electronico, tales como cintas o CD-ROM, para la realizacion del ensayo, habitualmente se incluiran en el kit. El kit tambien puede contener, dependiendo del procedimiento particular utilizado, otros reactivos y materiales envasados (es decir, tampones de lavado y similares).
El termino "inmunomodulador" como se usa en el presente documento indica la capacidad de estimular un estado asociado con la ausencia de una respuesta inflamatoria. Las propiedades inmunomoduladoras particulares comprenden propiedades antiinflamatorias, en las que el termino antiinflamatorio se refiere a la propiedad de una sustancia o tratamiento que previene o reduce la inflamacion.
El termino "inflamacion", "estado inflamatorio" o "respuesta inflamatoria" como se usa en el presente documento indican la respuesta biologica compleja de los tejidos vasculares de un individuo a estfmulos daninos, tales como patogenos, celulas danadas o irritantes, e incluye la secrecion de citocinas y, mas particularmente, de citocinas proinflamatorias, es decir, las citocinas que son producidas predominantemente por celulas inmunes activadas, tales como la microglia, y estan involucradas en la amplificacion de las reacciones inflamatorias. Las citocinas proinflamatorias de ejemplo incluyen, pero sin limitaciones, IL-1, IL-6, TNF-a, IL-17, IL21 e IL23. Las inflamaciones de ejemplo incluyen inflamacion aguda e inflamacion cronica. La expresion "inflamacion aguda", como se usa en el presente documento, indica un procedimiento a corto plazo caracterizado por los signos clasicos de inflamacion (hinchazon, enrojecimiento, dolor, calor y perdida de funcion) debido a la infiltracion de los tejidos por plasma y leucocitos. Una inflamacion aguda normalmente se produce siempre que el estfmulo perjudicial este presente y cese una vez que se haya eliminado el estfmulo, degradado o envuelto por la cicatrizacion (fibrosis). La expresion "inflamacion cronica", como se usa en el presente documento, indica una afeccion caracterizada por una inflamacion activa concurrente, destruccion de tejidos e intentos de reparacion. La inflamacion cronica no se caracteriza por los signos clasicos de inflamacion aguda mencionados anteriormente. En cambio, el tejido inflamado cronicamente se caracteriza por la infiltracion de celulas inmunitarias mononucleares (monocitos, macrofagos, linfocitos y celulas plasmaticas), destruccion de tejidos e intentos de cicatrizacion, incluyendo angiogenesis y fibrosis.
El termino "sustancia", como se usa en el presente documento, indica una cuestion de constitucion qmmica particular o definida. La expresion "sustancia bacteriana" indica materia de origen bacteriano tal como, una bacteria viva, bacterias muertas y, en particular, bacterias muertas por calor, extractos bacterianos, moleculas purificadas de bacterias, una combinacion de moleculas purificadas de bacterias, o vesroulas que contienen una molecula o una combinacion de moleculas purificadas de bacterias o vesroulas purificadas de bacterias. En particular, la sustancia bacteriana puede estar formada por, o comprende, las vesroulas de membrana externa (VME), que son vesroulas distribuidas desde la superficie de las bacterias y distribuyen un conjunto de carga molecular a celulas diana distantes. Aun mas particularmente, la sustancia bacteriana puede estar formada por, o comprende, las VME de B. Fragilis, y, mas particularmente, dichas VME estan ademas compuestas por PSA.
La sustancia bacteriana comprende una sustancia derivada de las mismas bacteria y sustancias derivadas de dos o mas bacterias diferentes.
El termino "bacteria", como se usa en el presente documento, indica un gran grupo de microorganismos unicelulares procariotas, por lo general, de unos pocos micrometres de longitud y con una amplia gama de formas. En particular, las bacterias en el sentido de la presente divulgacion comprenden bacterias de la flora humana, es decir, el ensamblaje de microorganismos que residen en la superficie y en tejidos humanos y fluidos corporales, tales como capas profundas de la piel, en la saliva, la mucosa oral o vaginal, y en el tracto gastrointestinal. La flora bacteriana comprende flora intestinal (bacterias detectables en el tracto digestivo de seres humanos), flora vaginal (bacterias detectables en el tracto tubular fibromuscular que va desde el utero al exterior del cuerpo en seres humanos) y flora de la piel (bacterias detectables en la piel humana). De manera mas espedfica, las bacterias en el sentido de la presente divulgacion pueden estar formadas por uno o mas bacteroidetes de la flora intestinal y, en particular, uno o mas bacteroides, un genero de bacterias bacilos gramnegativas, anaerobias no formadoras de endosporas, simbioticas con seres humanos e identificables por un experto. Un bacteroides representativo es B. fragilis.
La expresion "animal no humano marcador transgenico" como se usa en el presente documento, se refiere a un animal que contiene material genetico no nativo que se ha transferido de forma natural o mediante una serie de tecnicas de ingeniena genetica. Tal material genetico no nativo (o transgen) puede actuar como "biomarcador" (como se define en el presente documento) y/o retener la capacidad de producir ARN o proterna en el animal no humano.
El termino "celula T" como se usa en el presente documento indica un subgrupo de linfocitos (un tipo de globulo blanco o leucocito) que incluye diferentes tipos de celulas identificables por un experto. los linfocitos T auxiliares de acuerdo con la presente divulgacion e incluyen linfocitos Th efectores (tales como Th1, Th2 y Th17), es decir, linfocitos Th que secretan citocinas, proternas o peptidos que estimulan o interaccionan con otros leucocitos, incluidos los linfocitos Th y los linfocitos Th supresores (como los Treg), es decir, los linfocitos Th que suprimen la
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activacion del sistema inmunitario y, por lo tanto, mantienen la homeostasis del sistema inmunitario y la tolerancia a los antfgenos propios.
La expresion "celula presentadora de antigeno" como se usa en el presente documento indica una celula que muestra un complejo de antigeno extrano con un complejo de histocompatibilidad principal (MHC) en su superficie. En particular, las celula presentadoras de antigeno comprenden celulas dendnticas, macrofagos, celulas B y celulas adicionales identificables por un experto.
El termino "contactar" o "incubar" como se usa en el presente documento indica acciones dirigidas a la creacion de una relacion espacial entre dos elementos proporcionados durante un tiempo y en condiciones tales que se pueda ejercer al menos una de las acciones redprocas o no redprocas o influencia entre los dos elementos. En particular, la incubacion se puede realizar entre una sustancia bacteriana y una celula y puede resultar en un contacto directo y/o interaccion entre la sustancia bacteriana y la celula o puede resultar en una modificacion de la celula despues de una accion indirecta de la sustancia bacteriana (por ejemplo, despues de la activacion). o modificacion de otra sustancia que interacciona directamente con la celula).
El "tratamiento" se puede realizar administrando la sustancia bacteriana, el compuesto, la composicion o la composicion farmaceutica mediante administracion topica o sistemica. La administracion sistemica incluye la administracion enteral (por ejemplo, administracion oral, administracion por sonda de alimentacion gastrica, administracion por sonda de alimentacion duodenal, gastrostoirna, nutricion enteral y administracion rectal) y administracion parenteral (por ejemplo, administracion intravenosa, administracion intraarterial, administracion intramuscular, administracion subcutanea, administracion intradermica, administracion intraperitoneal e infusion intravesical. La administracion topica incluye, pero sin limitaciones, administracion epicutanea, administracion por inhalacion (por ejemplo, en medicamentos para el asma), enema, gotas para los ojos (por ejemplo, en la conjuntiva), gotas para el ofdo, via intranasal (por ejemplo, aerosoles nasales descongestivos) y administracion vaginal.
De forma similar, la cantidad de composicion farmaceutica administrada a individuos que padecen una enfermedad inflamatoria tal como, pero sin limitaciones, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, asma, dermatitis, artritis, miastenia gravis, enfermedad de Graves, esclerosis multiple, o psoriasis, puede determinarla el experto experimentalmente.
La incubacion de ejemplo de una celula presentadora de antfgeno con un linfocito T se puede realizar in vitro mezclando un cultivo celular que comprende la celula presentadora de antfgeno con un cultivo celular que comprende el linfocito T, anadiendo una celula presentadora de antfgeno purificada a un cultivo de linfocitos T, o anadiendo un linfocito T purificado a un cultivo de celulas presentadoras de antigeno. Una incubacion de ejemplo adicional entre un linfocito T y una celula presentadora de antfgeno in vivo comprende trasplantar la celula presentadora de antfgeno aun tejido de un individuo, comprendiendo el tejido linfocitos T, o trasplantar linfocitos T aun tejido de un individuo, comprendiendo el tejido celulas presentadoras de antigeno. En una realizacion, el individuo es un animal transgenico distinto de seres humanos geneticamente modificados para expresar un biomarcador inflamatorio o antiinflamatorio marcado.
Un experto puede identificar procedimientos y tecnicas adicionales adecuados para realizar el contacto entre una sustancia y un linfocito T o celula presentadora de antfgeno y la incubacion entre una celula presentadora de antfgeno y un linfocito T in vitro o in vivo tras la lectura de la presente divulgacion.
En los procedimientos y sistemas descritos en el presente documento, la deteccion de la expresion de un biomarcador inflamatorio o antiinflamatorio se puede realizar in vitro e in vivo mediante tecnicas identificables por un experto que comprenden el uso de moleculas marcadas, incluyendo biomarcadores marcados o moleculas marcadas espedficas para el biomarcador o molecula asociada a ellos.
El termino "detectar" o "deteccion" como se usa en el presente documento indica la determinacion de la existencia, presencia o hecho de un analito o senal relacionada en una porcion limitada de espacio, incluyendo, pero sin limitaciones, una muestra, una mezcla de reaccion, un complejo molecular y un sustrato. Una deteccion es "cuantitativa" cuando se refiere, se relaciona o implica la medicion de la cantidad o el monto del analito o senal relacionada (tambien denominada cuantificacion), que incluye, pero sin limitaciones, cualquier analisis disenado para determinar las cantidades o proporciones del analito o la senal relacionada. Una deteccion es "cualitativa" cuando se refiere, se relaciona o implica la identificacion de una calidad o tipo de analito o senal relacionada en terminos de abundancia relativa respecto a otro analito o senal relacionada, que no esta cuantificado.
Los terminos "marcador" y "molecula marcada" o, como se usan en el presente documento como un componente de un complejo o molecula en referencia a una molecula capaz de deteccion, incluyendo, pero sin limitaciones, isotopos radiactivos, fluoroforos, colorantes quimioluminiscentes, cromoforos, enzimas, sustratos enzimaticos, cofactores enzimaticos, inhibidores enzimaticos, colorantes, iones metalicos, nanopartfculas, soles metalicos, ligandos (tales como biotina, avidina, estreptavidina o haptenos) y similares. El termino “fluoroforo” se refiere a una sustancia o porcion de la misma que es capaz de exhibir fluorescencia en una imagen detectable. Como consecuencia, la palabra "senal" o "senal de marcaje" como se usa en el presente documento indica la senal emitida por el marcador que permite la deteccion del marcador, incluyendo, pero sin limitaciones, radiactividad, fluorescencia,
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quimioluminiscencia, produccion de un compuesto en el resultado de una reaccion enzimatica y similares.
La deteccion se puede realizar detectando los niveles de expresion del biomarcador, un precursor o analogo del mismo, y/o de un analito asociado al mismo. La expresion "asociado a" como se usa en el presente documento con referencia a dos elementos indica una relacion entre los dos elementos, de manera que la aparicion de un primer elemento se acompana de la aparicion del segundo elemento, que incluye, pero sin limitaciones, a una relacion causa-efecto y una relacion enfermedad-signo/smtomas. En particular, la deteccion se puede realizar de forma cualitativa o cuantitativa y puede implicar la deteccion de moleculas tales como ARN, protema, sus precursores, diferentes tipos (es decir, ARNm, ARNt y ARNr) y/o productos de degradacion, y/o deteccion o propiedades medibles asociadas a los mismos. Las tecnicas y procedimientos para realizar la deteccion son identificables por un experto tras la lectura de la presente divulgacion.
Los procedimientos de ejemplo para la deteccion de la expresion de biomarcadores comprenden procedimientos conocidos por un experto que incluyen, entre otros, ELISA, Q-PCR y tincion intracelular de citocinas detectada por FACS. En algunas realizaciones, la expresion de un biomarcador puede detectarse mediante lecturas basadas en fluorescencia en un cultivo celular realizado utilizando un anticuerpo espedfico para el biomarcador o molecula asociada al mismo, marcado con fluoroforo, que incluye, pero no exhaustivamente, colorantes moleculares pequenos, cromoforos de protemas, puntos cuanticos y nanopartfculas de oro. En una realizacion, la expresion de un biomarcador puede detectarse detectando la expresion de un marcador bajo el control transcripcional de un promotor de biomarcador in vivo (por ejemplo, en un tejido animal) o in vitro (por ejemplo, en un cultivo celular). En algunas de esas realizaciones, el biomarcador puede ser, en particular, IL-10 o Foxp3. Las tecnicas adicionales son identificables por un experto en la materia al leer la presente divulgacion y no se analizaran adicionalmente con detalle.
En los procedimientos y sistemas descritos en el presente documento, se puede determinar una capacidad antiinflamatoria de la sustancia bacteriana candidata mediante la deteccion de un aumento de la expresion de uno o mas biomarcadores antiinflamatorios o una disminucion de la expresion de uno o mas biomarcadores inflamatorios despues del contacto y/o la incubacion. La determinacion del aumento y/o la disminucion de la expresion de un biomarcador se puede realizar comparando la expresion detectada del biomarcador despues del contacto y/o la incubacion, con una expresion detectada predeterminada del mismo biomarcador en ausencia de contacto y/o incubacion. La determinacion del aumento y/o disminucion de la expresion de un biomarcador puede realizarse comparando el marcador de expresion detectado con la expresion detectada del mismo biomarcador en una celula de control en ausencia de contacto y/o incubacion.
Se hace referencia a la seccion de Ejemplos en la que aumenta la expresion de los biomarcadores antiinflamatorios IL-10, Foxp3, TGFp1, TGFp2, perforina y la granzima B y la disminucion de la expresion en los biomarcadores inflamatorios TNF-a r IL-17A estan asociados con el mecanismo de accion de Bacteroides fragilis que apoya la asociacion entre el patron de expresion anterior y las actividades biologicas de Bacteroides fragilis, con particular referencia a las habilidades antiinflamatorias. Las habilidades antiinflamatorias de Bacteroides fragilis son identificables por un experto y se describen en varias publicaciones y patentes, incluidos, pero sin limitaciones, los documentos US05679654, US07083777, US2004092433, WO07092451 y WO2009062132, Un experto entendera que la capacidad antiinflamatoria espedfica de la sustancia bacteriana candidata posiblemente se determinara basandose en la determinacion adicional del conjunto espedfico de citocinas producidas y las celulas activadas por la sustancia bacteriana candidata identificada por los procedimientos descritos en el presente documento.
En una realizacion, la deteccion de un aumento en la expresion del antiinflamatorio o la deteccion de una disminucion en la expresion de un biomarcador inflamatorio indica la capacidad de una sustancia para inducir moleculas antiinflamatorias, tales como IL-10, Foxp3, TGFpl o TGF-p2, perforina y granzima B o una combinacion de las mismas, o suprimir citocinas inflamatorias, tales como IFNy, IFNa, IFNa, IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-13, IL-21, IL-22, IL-23, iL-17 o TNFa o una combinacion de los mismos.
En una realizacion, el procedimiento comprende poner en contacto una sustancia bacteriana candidata in vitro y/o in vivo con un linfocito T solo o en presencia de una celula presentadora de antfgeno, y detectar la expresion de al menos un biomarcador antiinflamatorio seleccionado del grupo que consiste en IL-10, Foxp3, TGFp1, TGFp2, perforina y granzima B, en el que un aumento de la expresion del biomarcador antiinflamatorio despues del contacto indica una capacidad antiinflamatoria de la sustancia bacteriana candidata. En particular, en algunas de esas realizaciones, la expresion de IL-10, TGFp1, TGFp2 perforina y/o granzima B se pueden realizar en linfocitos T que expresan Foxp3, y, mas particularmente, en linfocitos Treg que expresan Foxp3.
En una realizacion, el procedimiento comprende poner en contacto una sustancia bacteriana candidata con una celula presentadora de antfgeno, e incubar la celula presentadora de antfgeno con un linfocito T despues de la puesta en contacto. El procedimiento comprende ademas detectar la expresion de al menos un biomarcador antiinflamatorio seleccionado del grupo que consiste en Foxp3, IL-10, TGFp1, TGFp2, TGFp2, perforina y granzima B, en el que la deteccion de un aumento de la expresion del biomarcador despues de la incubacion indica una capacidad antiinflamatoria de la sustancia candidata. En particular, en algunas de esas realizaciones, la expresion de IL-10, perforina y/o granzima B se pueden realizar en linfocitos T que expresan Foxp3, y, mas particularmente, en linfocitos Treg que expresan Foxp3.
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En una realizacion, el procedimiento comprende poner en contacto una sustancia bacteriana candidata con un linfocito T solo o en presencia de una celula presentadora de antfgeno, y detectar la expresion de al menos un biomarcador inflamatorio seleccionado del grupo que consiste en IL-17 y TNFa, en el que una disminucion de la expresion del biomarcador antiinflamatorio despues del contacto indica una capacidad antiinflamatoria de la sustancia bacteriana candidata.
En una realizacion, el procedimiento comprende poner en contacto una sustancia bacteriana candidata con una celula presentadora de antigeno, e incubar la celula presentadora de antigeno con un linfocito T despues de la puesta en contacto. El procedimiento comprende ademas detectar la expresion de al menos un biomarcador inflamatorio seleccionado del grupo que consiste en IL-17 y TNFa, en el que una disminucion de la expresion del biomarcador antiinflamatorio despues del contacto indica una capacidad antiinflamatoria de la sustancia bacteriana candidata.
En una realizacion, la sustancia bacteriana candidata comprende bacterias en un grupo puro. En otras realizaciones, la sustancia bacteriana candidata comprende bacterias en un grupo mixto. Las bacterias pueden ser bacterias vivas, bacterias muertas, extractos o productos aislados de bacterias, o combinaciones de cada uno. Las bacterias tambien pueden ser de cepas de laboratorio, aislados de depositos, tales como la ATCC, aislados de animales, aislados de seres humanos, o combinaciones de cada uno.
En una realizacion, el aislado de los animales se afsla de heces. El aislado tambien puede provenir de contenidos intestinales o combinaciones de heces y otros contenidos intestinales. En una realizacion, el aislado de seres humanos se afsla de heces. El aislado tambien puede provenir de contenidos intestinales o combinaciones de heces y otros contenidos intestinales.
En una realizacion, el procedimiento comprende tratar un marcador transgenico de un animal no humano y, en particular, un mairnfero marcador transgenico, tal como un raton o una rata, con una sustancia candidata, el animal marcador transgenico no humano modificado geneticamente para expresar un biomarcador antiinflamatorio o inflamatorio marcado seleccionado del grupo que consiste en IL-10 y Foxp3, pero tambien perforina y granzima B, IL17 y TNFa; y detectar la expresion de biomarcadores en el animal marcador transgenico despues del tratamiento.
En particular, en una realizacion, los modelos animales no humanos transgenicos mencionados anteriormente pueden tratarse por via oral o intravenosa con la sustancia, o colonizarse permanentemente con bacterias vivas por sonda oral y la cantidad de expresion del biomarcador Foxp3 o IL-10 se controlara en los diversos compartimentos del raton incluyendo el bazo, los ganglios linfaticos mesentericos, el intestino delgado y grueso, los pulmones, el pancreas y la medula osea como medida de la capacidad inmunomoduladora de la sustancia.
En una realizacion, las celulas dendnticas, los linfocitos T, los linfocitos T reguladores, los linfocitos B o los macrofagos pueden purificarse o diferenciarse de ratones en los que la expresion de IL-10 (o Foxp3 en el caso de analisis de linfocitos T) esta marcada por la protema fluorescente verde fluorofora (GFP). En esas realizaciones, la sustancia bacteriana candidata se pone en contacto con uno de los tipos de celulas mencionados anteriormente y la cantidad de expresion de GFP se determinara indicando la capacidad inmunomoduladora de la sustancia que se esta analizando. Como alternativa, las celulas dendnticas u otras celulas presentadoras de antfgenos pueden incubarse con la sustancia, la sustancia se puede eliminar mediante lavado y las celulas dendnticas se pueden incubar posteriormente con linfocitos T para determinar la capacidad de las celulas dendnticas para provocar actividad inmunomoduladora de los linfocitos T. La expresion de GFP se puede determinar utilizando clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS) o un lector de microplacas.
En una realizacion, un linfocito T, celula presentadora de antfgeno y reactivos para la deteccion de al menos uno de uno o mas biomarcadores antiinflamatorios seleccionados del grupo que consiste en IL-10, Foxp3, TGFp2, perforina y granzima B, y uno o mas biomarcadores inflamatorios marcados seleccionados del grupo que consiste en IL-17 y TNFa, puede estar comprendido en un sistema para identificar una sustancia bacteriana que tiene capacidad inmunomoduladora de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento.
En una realizacion, el sistema comprende: celulas dendnticas, linfocitos T, linfocitos T reguladores, linfocitos B y/o macrofagos que, en algunas realizaciones, se pueden purificar o diferenciar de ratones en los que la expresion de IL- 10 (o Foxp3 en el caso de analisis de linfocitos T) esta marcada por la protema fluorescente verde fluorofora (GFP).
Los sistemas se pueden proporcionar en forma de kits de piezas. En un kit de piezas, el agente de captura multi- ligando y otros reactivos para realizar el procedimiento pueden incluirse en el kit de forma independiente. La celula presentadora de antfgeno, el linfocito T y los reactivos pueden incluirse en una o mas composiciones, y cada celula y reactivo pueden estar en una composicion junto con un vehmulo adecuado.
Los componentes adicionales pueden incluir moleculas marcadas y, en particular, agentes de captura marcados espedficos para un biomarcador antiinflamatorio o inflamatorio o una molecula asociada a su expresion, un chip microfluido, patrones de referencia y componentes adicionales identificables por un experto al leer la presente divulgacion.
Un experto en la tecnica puede identificar mas detalles sobre la identificacion del agente transportador o agente
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auxiliar adecuado de las composiciones y, en general, sobre la fabricacion y el embalaje del kit a la luz de la lectura de la presente divulgacion.
Ejemplos
Las vesfculas, composiciones y procedimientos y sistemas relacionados descritos en el presente documento se ilustran adicionalmente en los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustracion y no se pretende que sean limitantes.
En particular, los siguientes ejemplos ilustran ejemplos de cultivos celulares, procedimientos para poner en contacto con las VME que comprenden PSA (o ligando de PSA) con celulas y la deteccion de la expresion de un biomarcador. Un experto en la tecnica apreciara la aplicabilidad de las caractensticas descritas con detalle para las VME y el PSA y Bacteroides fragilis para vesfculas adicionales y la administracion de sustancias ademas de PSA en las VME u otras vesfculas de acuerdo con la presente divulgacion.
Se usaron los siguientes materiales y procedimientos para todos los procedimientos y sistemas para la deteccion de sustancias inmunomoduladoras ilustradas en el presente documento.
Cepas bacterianas y condiciones del cultivo y ratones La cepa de B. fragilis NCTC 9343 se obtuvo de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo, se han descrito su mutante isogenico por delecion de PSA y el mutante mpi44 (solo produce PSA pero ningun otro polisacarido) (M.J. Coyne, A.O. Tzianabos, B.C. Mallory, V.J. Carey, D.L. Kasper y L.E. Comstock, (2001) Polysaccharide biosynthesis locus required for virulence of Bacteroides fragilis, Infect. Immun. 69: 4342-4350.) Las bacterias se cultivaron en un medio rico que contema 37 g de BHI (BD n.° 237200), 0,5 pg/ml de hemina (Sigma H5533) y 0,5 pg/ml de vitamina K (Sigma V3501) en 1 l de ddH2O o un medio mmimo (MM) adaptado, que contema 8 g de glucosa, FBS al 1 %, 0,5 pg/ml de hemina y 0,5 pg/ml de vitamina K en 1 l de RPMI (Invitrogen SKU n.° 11835-030). Los ratones SPF de las cepas C57BL/6 y Balb/c se adquirieron en Taconic Farms (Germantown, NY). Los ratones defectivos para TLR2 y los ratones defectivos para IL-10 se adquirieron en Jackson laboratories. Los ratones IL-10GFP se adquirieron en el laboratorio de Christopher Karp en el hospital medico de Cinncinati Children, y los ratones Foxp3GFP fueron un obsequio del laboratorio de Talal Chatila de la Universidad de California en Los Angeles.
Aislamiento de la poblacion bacteriana enriquecida con EDL. Se uso centrifugacion por gradiente de densidad en Percoll (GE Healthcare n.° 17-0891-01) para el aislamiento de EDL tanto de B. fragilis de tipo salvaje como de B. fragilis APSA (Patrick S, Reid JH. (1983) Separation of capsulate and non-capsulate Bacteriodes fragilis on a discontinuous density gradient. J Med Microbiol. 16(2): 239-41.) En resumen, se creo un gradiente de Percoll al 20 %, 40 %, 60 %, 80 % (diluido con PBS) en un tubo de ensayo de 14 ml (2 ml para cada capa). A continuacion, el cultivo de B. fragilis resuspendido en PBS se anadio cuidadosamente sobre la capa de Percoll al 20 %. Posteriormente, el gradiente se centrifugo a 800 g durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las bacterias enriquecidas con EDL se pueden recuperar de la interfaz al 40 % -60 % del gradiente despues de la separacion.
Purificacion y marcaje de VME. Este procedimiento se adapta de un protocolo descrito previamente para la preparacion de VME de E. coli (Amanda L. Horstman y Meta J. Kuehn). (2000) Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles. J Biol Chem. 275: 12489-12496.) En resumen, B. fragilis enriquecido con EDL se cultivo en MM adaptado. Las VME se recuperaron del sobrenadante libre de bacterias del cultivo mediante centrifugacion a 40.000 g durante 2 horas a 4 °C y luego se lavaron dos veces con PBS y se filtraron a traves de columnas de centrifugacion de 0,45 pm (Millipore n.° 20-218). La concentracion de protemas totales de las VME purificadas se determino mediante el ensayo de Bradford (Biorad n.° 500-0205). Las VME marcadas con FITC se prepararon como se ha descrito anteriormente (Nicole C. Kesty y Meta J. Keuhn. (2004) Incorporation of heterologous outer membrane and periplasmic proteins into Escherichia coli outer membrane vesicles. J Biol Chem. 279: 2069-2076). En resumen, las VME se incubaron en el tampon de tincion (1 mg/ml de FITC (Thermo Scientific n.° 46424), NaCl 100 mM, Na2CO3 50 mM, pH 9,2) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las VME marcadas se recogieron por centrifugacion a 40.000 g durante 30 minutos a 4 °C y se lavaron dos veces con PBS + NaCl 200 mM.
Microscopia electronica de seccion bacteriana ultrafina. Las secciones ultrafinas de B. fragilis enriquecidas con EDL se prepararon como se ha descrito anteriormente (Patrick S, McKenna JP, O'Hagan S, Dermott E. (1996) A comparison of the haemagglutinating and enzymic activities of Bacteroides fragilis whole cells and outer membrane vesicles. Microb Pathog. 20(4): 191-202.) En resumen, las muestras se fijaron en glutaraldehfdo (Sigma, G5882) al 2,5 % (v/v) en tampon de cacodilato durante la noche a 4 °C, seguido de una fijacion adicional en tetroxido de osmio (1 %, p/v) durante 3 horas a temperatura ambiente en la oscuridad. Se incluyo rojo de rutenio (1 mg/ml, Sigma R2751) en ambos procedimientos de fijacion. A continuacion, las muestras fijadas se incluyeron en resina epoxi despues de la deshidratacion en una serie graduada de alcoholes. Las secciones ultrafinas (100 ~ 200 nm) se cortaron y se tineron negativamente con acetato de uranilo al 2 % y citrato de plomo en rejillas de cobre recubiertas de formvar/carbono (EMS n.° FCF200-Cu) antes de la visualizacion por TEM.
Marcaje Immunogold de VME purificadas. Este procedimiento se adapto de un protocolo previamente descrito (Patrick S, McKenna JP, O'Hagan S, Dermott E. (1996) A comparison of the haemagglutinating and enzymic
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activities of Bacteroides fragilis whole cells and outer membrane vesicles. Microb Pathog. 20(4):191-202.) En resumen, se aplico una pequena gota de VME purificada a las rejillas de oro recubiertas de formvar/carbono (EMS n.° FF200-Au) y se seco al aire. El marcaje Immunogold se realizo a temperatura ambiente mediante la flotacion de estas rejillas con "VME", al lado de una serie de pequenas gotas de anticuerpo y soluciones de lavado. Particularmente, las muestras se bloquearon en FBS al 10 % durante 10 minutos despues de 5 minutos de incubacion en glicina al 0,12 %. Despues de bloquear, las muestras se incubaron adicionalmente con anticuerpo contra PSA diluido en FBS al 10 % durante 20 minutos, seguido de 5 lavados x 3 minutos con PBS. Posteriormente, se aplico a las muestras el conjugado anticuerpo secundario-IgG con oro de 5 nm (regalo del Dr. Paul Webster, House Ear Institute, Los Angeles) durante 20 minutos, seguido de nuevo por 5 lavados x 4 min con PBS. Despues de marcar, las muestras se fijaron en glutaraldehfdo al 1% durante 5 minutos y se lavaron exhaustivamente transfiriendo las rejillas a gotas de PBS 4x1min y H2O 4x1min. Se realizo contratincion colocando las rejillas en gotas de acetato de uranilo al 3-5 % en metilcelulosa al 2 % durante 10 minutos en hielo. Finalmente, se retiraron las rejillas de la solucion de tincion mediante un asa de alambre y se secaron al aire. Las muestras cubiertas por una pelfcula delgada de metilcelulosa se retiraron del asa y se usaron para visualizar mediante microscopia electronica de transmision (TEM).
Ensayo de glicoproteinas. El PSA purificado a partir de extractos de celulas enteras o VME (del mutante mpi44 de B. fragilis) se sometio a SDS-PAGE y el gel se tino posteriormente con un kit de tincion con glicoprotema (G bioscience n.° 786-254) para mostrar la presencia de PSA.
Colitis experimental inducida por sustancias quimicas (TNBS). Este protocolo esta adaptado de un procedimiento descrito anteriormente (Scheiffele y Fuss. (2001) Induction of TNBS colitis in mice. Current Protocols in Immunology.15.19.1-15.19.14.) En resumen, se trato a los ratones macho de tipo salvaje (Balb/c) por via oral con PBS, SV-VME (5 |jg) o APSA-VME (5 |jg) en dfas alternos durante una semana antes de la administracion de TNBS. Se anestesio a los ratones tratados con isofluoreno y se aplico administracion rectal de TNBS al 2 % (en EtOH al 50 %, Sigma P2297) a traves de un cateter 3,5F (Instech Solomon; SIL-C35). El tratamiento oral continuo otras dos veces despues de la administracion de TNBS y los ratones se analizaron 1-2 dfas despues del ultimo tratamiento.
En un ejemplo profetico, los mismos ratones pueden tratarse con el TNBS, como se ha indicado anteriormente, antes de tratar oralmente a los ratones con PBS, SV-VME (5 jg) o APSA-VME (5 jg) en dfas alternos durante una semana antes de la administracion de TNBS. A continuacion, se anestesio a los ratones tratados con isofluoreno y se les administro por via rectal TNBS al 2 % (en EtOH al 50 %, Sigma P2297) aplicados a traves de un cateter 3,5F (Instech Solomon; SIL-C35). El tratamiento oral continuana otras dos veces despues de la administracion de TNBS y, despues, los ratones se analizaron 1-2 dfas despues del ultimo tratamiento. Los inventores esperan que, usando este protocolo, el grado de colitis en estos ratones mejorana, se reducina o se curana. Esta expectativa se basa en el hecho de que los estudios anteriores de los inventores que utilizaron PSA solo (Round y col., 2010) tanto antes como despues del tratamiento con TNBS han prevenido y reducido la colitis, respectivamente; y el hecho de que algunos de los actuales resultados de los inventores muestran que su efecto de las VME en estos ratones depende de la dosis de PSA.
Analisis de patologia tisular Los colones de raton se fijaron en formalina al 10 % tamponada neutra (ScyTek Laboratories n.° CAS 50-00-0) y se procesaron mediante Pacific Pathology para la tincion con H y E. Las puntuaciones de colitis para cada seccion de colon fueron evaluadas de forma ciega por un anatomopatologo (Dr. Gregory Lawson, David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles). Se tomaron imagenes histologicas utilizando microscopia optica (Zeiss) con un aumento de 20x.
PCR cuantitativa en tiempo real. El ARN se recolecto de tejidos de raton utilizando Trizol (Invitrogen n.° 15596-018) o de celulas purificadas usando RNeasy Mini Kit (Qiagen n.° 74104). Se utilizo el kit de smtesis de ADNc iSCRIPT (BioRad n.° 170-8890) para la conversion del ADNc y se uso supermix IQ SYBR Green supermix (BioRad n.° 1728882) para la PCR en tiempo real. Los cebadores utilizados en este estudio son: TNF (F- 5'ACG GCA TGG ATC TCA AAG AC 3' (SEQ ID NO:1); R- 5' GTG GGT GAG GAG CAC GTA GT 3') (SEQ ID NO 2); IL-17 (F- 5' TTA AGG TTC TCT CCT CTG AA 3'(SEQ ID NO:3); R- 5' TAG GGA GCT AAA TTA TCC AA 3') (SEQ ID NO: 4) IL-10 (F- 5' GGT TGC CAA GCC TTA TCG GA 3' (SEQ ID NO:5); R- 5' ACC TGC TCC ACT GCT TGC T 3') (SEQ ID NO: 6) Foxp3 (F- 5' GCA ATA GTT CCT TCC CAG AGT TCT 3'(SEQ ID NO: 7); R- 5' GGA TGG CCC ATC GGA TAA G 3' (SEQ ID NO: 8)) actina (F-5' TTC GTT GCC GGT CCA CA 3'(SEQ ID NO:9); R-5' ACC AGC GCA GCG ATA TCG-3' (SEQ ID NO: 10)).
Microscopia de fluorescencia Las CDMO diferenciadas in vitro se colocaron en un portaobjetos de camara de 8 pocillos Lab-Tek II (Nunc n.° 154534) a 50.000 celulas/pocillo. Las VME marcadas con FITC se anadieron al cultivo celular a 10 jg/ml. Despues de 2 horas de incubacion, las celulas se fijaron en PFA al 4 % durante 20 minutos a temperatura ambiente. Despues de 3 lavados x 5 min con PBS, la membrana celular se tino con 1 jg/ml de conjugado de tetrametilrodamina de WGA (Invitrogen W849) durante 1 hora a 4° C. Se aplico a la muestra el reactivo anti-desvanecimiento ProLong Gold (P36930) tras lavados extensos despues de la tincion de la membrana. Se tomaron imagenes fluorescentes utilizando el microscopio LSM 510 y el objetivo de aceite Plan-Neofluar 63x/1,25.
Citometria de flujo y tincion. Las CDMO del ensayo de captacion de VME o el ensayo de activacion se recogieron y se bloquearon en suero de raton al 5 % durante 30 minutos en hielo. Despues de bloquear, las celulas se tineron con
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anti-CD11c-CPA, anti-MHCII-FITC o anti-CD86-PE (ebioscience) durante 30 minutos en hielo y se lavaron 2x con tampon de FACS (HBSS (sin Ca2 +/Mg2 +), FBS al 1 %, EDTA 2mM, HEPES 10 mM) a 4 °C antes del analisis de citometna de flujo. De forma similar, las celulas del cocultivo de CDMO-linfocitos T in vitro se bloquearon y se tineron con anti-CD4-CPA/anti-CD25-PE de la misma manera, excepto que las celulas se volvieron a estimular usando PMA/Ionomicina durante 4-4,5 horas antes de la recoleccion. Toda la citometna de flujo se realizo con BD FACSCalibur y los resultados se analizaron con FlowJo.
Cocultivo in vitro de CDMO-linfocitos T. La medula osea se recogio de diferentes tinciones de ratones y se diferenciaron in vitro en presencia de 20 ng/ml de GM-CSF (Miltenyi Biotec n.° 9517571) durante 8 dfas como se ha descrito anteriormente (Mazmanian, Liu, Tzianabos y Kasper (2005) An Immunomodulatory Molecule of Symbiotic Bacteria Directs Maturation of the Host Immune System. Cell 122:1 107-118.). (La pureza celular fue > 90 %.) los linfocitos T esplenicos CD4+ se aislaron mediante purificacion de microesferas magneticas (Miltenyi Biotec # 130090-860) (la pureza celular es > 95 %). Las CDMO con pulsos de VME (10 pl/ml de VME, 100.000 celulas/ml, 12 h- 24 h) se lavaron con HBSS y despues se incubaron con linfocitos T CD4+ (1.000.000 celulas/ml) en una placa de 96 pocillos de fondo redondo con la adicion de 0,01 pl/ml de anti-CD3 (dfa 0, figura 3c como se indica, 3d, e, f, figura 4a), 2 ng/ml de TGFb (dfa 0, figura 3c, d y f, figura 4a) y 5 ng/ml de IL-2 (dfa 1 y dfa 3, todos los ensayos de cocultivo de CD-linfocitos T in vitro). Despues de un total de 4 dfas de cultivo, los sobrenadantes se recolectaron para el ELISA (ebioscience n.° 88-7104-77) o las celulas se recolectaron para tincion y analisis de citometna de flujo.
Ensayo de supresion in vitro: Se usaron celulas CD4+ CD25+ purificadas de cocultivo de CDMO (pulsadas con SV- VME o APSA-VME)-linfocitos T como fuente de Treg (Miltenyi Biotec, n.° 130-091-041). Los esplenocitos de raton con deplecion de CD4 tratados con mitomicina C (Sigma M4278) se utilizaron como CPA (100.000 celulas/ml). Los linfocitos T CD4+CD25- purificados directamente de bazo de raton se pulsaron con CFSE durante 10 minutos a 37 °C, seguido de un primer lavado con PBS y un segundo lavado con medios de cultivo y se usaron inmediatamente (500.000 celulas/ml) como celulas respondedoras (Tef). Este ensayo se realizo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo con una adicion de 5 pg/ml de anti-CD3 (ebioscience n.° 16-0031-86) en un volumen de 200 pl. Se titulo la relacion Tef:Treg y las celulas se recogieron despues de 2-3 dfas de cultivo para el analisis FACS.
Analisis estadisticos: Se aplicaron la prueba T de Student y un ANOVA de una via para comparaciones pareadas y comparaciones entre > 2 grupos, respectivamente. Las diferencias significativas entre los grupos detectadas por ANOVA se analizaron mediante la prueba de Newman-Keuls como prueba post-hoc para identificar grupos que muestran diferencias estadfsticamente significativas. Todas las barras de error indican SEM. NS: no significativo; * p<0,05; ***p<0,01; ***p<0,001.
Ejemplo 1: El polisacarido capsular inmunomodulador PSA se clasifica activamente en VME de B. fragilis.
Las secciones ultrafinas de B. fragilis enriquecidas con EDL se prepararon como se describe en los materiales y procedimientos y se tomaron imagenes mediante microscopia electronica de transmision.
Los resultados ilustrados en la Figura 1a muestran que las VME eran producidas abundantemente por bacterias y se pudieron observar brotando de la envoltura bacteriana (Figura 1a, mayor aumento). Los estudios previos de los solicitantes han demostrado que la delecion de PSA anula la capacidad inmunomoduladora de B. fragilis (Mazmanian, Liu, Tzianabos y Kasper (2005) An Immunomodulatory Molecule of Symbiotic Bacteria Directs Maturation of the Host Immune System. Cell 122:1 107-118.) (Mazmanian, Round y Kasper (2008) A microbial symbiosis factor prevents intestinal inflammatory disease. Nature. 453 (7195) 620-625. Las micrograffas electronicas de una cepa mutante de PSA (B. fragilisAPSA) no ilustran ningun defecto en la smtesis de VME, y el tamano, la forma y la abundancia de las VME producidas no se distingrnan de las de las bacterias de tipo salvaje (Figura 1a y Figura 5). En particular, los resultados ilustrados en la figura 1a revelan que las vesfculas estan brotando activamente de la superficie de las bacterias.
Para determinar si el PSA esta asociado con VME de B. fragilis, Las vesfculas purificadas de bacterias de tipo salvaje y APSA se sometieron a analisis de inmunotransferencia como se describe en la seccion de materiales y procedimientos.
Los resultados ilustrados en la Figura 1b muestran que las vesfculas de tipo natural mostraban inmunorreactividad para PSA, a diferencia de las VME de B. fragilisAPSA. B. fragilis produce al menos 8 polisacaridos capsulares distintos que recubren la superficie de las celulas bacterianas, denominados PSA, PSB, PSC, PSD, PSE, PSF, PSG, y PSH. Mientras que tambien se detecto PSB en preparaciones de vesfculas, el PSG estaba ausente, lo que demuestra selectividad para ciertos polisacaridos para su empaquetado en VME (Figura 1b). Por consiguiente, los resultados de la Figura 1b muestran que el PSA y el PSB estan asociados con vesfculas, mientras que el PSG solo se encuentra en la superficie bacteriana. Los mutantes de delecion para los polisacaridos capsulares confirman la especificidad de cada anti-suero.
Los resultados del analisis de inmunotransferencia se confirmaron mediante experimentos de marcaje inmunogold realizado como se describe en la seccion de materiales y procedimientos. Los resultados del marcaje Immunogold de las vesfculas purificadas ilustradas en la Figura 1c y confirman que el PSA esta asociado ffsicamente con las VME, y que la gran mayona de las VME de B. fragilis de tipo salvaje se tinen positivamente para el PSA (Figura 6).
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Para verificar que la ausencia de PSA no alteraba la composicion molecular de las VME, se realizo un analisis proteomico por espectrometria de masas que no revelo diferencias cualitativas o cuantitativas importantes en la composicion proteica entre las vesmulas de bacterias de tipo salvaje o mutantes de PSA (Figura 7).
El PSA es un polfmero heterogeneo de subunidades que se repiten. Se realizo separacion por tamano del PSA recuperado de extractos de celulas enteras mediante cromatograffa, as^ como un analisis inmunotransferencia con anti-PSA de preparaciones de polisacarido capsular de celulas enteras y V,E purificadas como se indica en Materiales y procedimientos.
Los resultados relevantes ilustrados en la figura 1d muestran, sorprendentemente, solo la especie de bajo peso molecular, L-PSA, esta asociada con VME, lo que ilustra la especificidad del empaquetado del pSa en vesmulas. En particular, los resultados de la Figura 1d muestran que solo el PSA de bajo peso molecular (L-PSA) se empaqueta en vesmulas, al contrario que la especie de alto peso molecular (H-PSA) que permanece asociada con la cubierta de la celula bacteriana.
Conjuntamente, los resultados anteriores revelan que el polisacarido capsular inmunomodulador PSA se clasifica de forma activa en VME de B. fragilis.
Ejemplo 2: Las VME protegen a los animales frente a la colitis experimental y a la inflamacion intestinal de una manera dependiente de PSA.
Para investigar si las VME pueden mejorar los smtomas clmicos de la enfermedad, se trato a los ratones con sonda con VME durante la induccion de colitis por TNBS (acido 2,4,6-trinitrobenceno sulfonico).
Los resultados ilustrados en la Figura 2a indican que los animales de control perdieron peso rapidamente despues de la administracion rectal de TNBS (Figura 2a; TNBS+PBS), que no se recuperaron en comparacion con los ratones tratados con vehnculo (Figura 2a; ETOH+PBS). De manera destacable, las VME administradas por via oral a animales TNBS protegieron significativamente frente a la perdida de peso (Figura 2a; TNBS+SV-VME). Mas importante, cuando se administraron VME de B. fragilisAPSA, la perdida de peso fue indistinguible de los animales TNBS (Figura 2a; TNBS+APSA-VME), TNBS + APSA-VME), lo que demuestra que el PSA es responsable de prevenir la enfermedad por emaciacion.
Los esfuerzos de los inventores para detectar vesmulas intactas en el colon despues de una sonda intragastrica fueron confundidos por observaciones de vesmulas derivadas del huesped, incluso en ratones libres de germenes (esteriles) como se ha informado anteriormente (datos no mostrados).
Dado que la reduccion en la longitud del colon es un rasgo distintivo de la colitis TNBS, la deteccion de la longitud del colon se realizo en colones no manipulados inmediatamente despues de la reseccion del ciego al recto y la cuantificacion de la longitud (grafico) del vetnculo tratado (EtOH) y los grupos TNBS (n = 4 animales/grupo). En particular, la medicion se realizo en el momento del sacrificio (dfa 4 despues de la induccion de la enfermedad).
Los resultados ilustrados en la Figura 2b mostraron longitudes intestinales normales en animales tratados con vesmulas que contienen PSA, pero no en animales tratados con VME deficientes en PSA (Figura 2b).
La colitis experimental produce alteraciones patologicas graves en la arquitectura intestinal. Por consiguiente, Se proporcionaron secciones de colon tenidas con hematoxilina y eosina (H&E) representativas de cada grupo de tratamiento y se muestran en la Figura 2c. Las imagenes de la Figura 2c muestran que en el analisis histologico de los tejidos colonicos se observo una enfermedad significativa en los animales tratados con TNBS que mejoraron con la administracion oral de vesmulas que contienen PSA.
Los resultados de la Figura 2c se confirmaron mediante las puntuaciones de colitis de animales asignados por un anatomopatologo enmascarado. La colitis por TNBS se manifiesta en lesiones focales en todo el colon que imitan la patologfa observada en la enfermedad de Crohn. Para evaluar cuantitativamente la enfermedad, los smtomas clmicos fueron evaluados por un anatomopatologo enmascarado utilizando un sistema de puntuacion estandar (Scheiffele y Fuss. (2001) Induction of TNBS colitis in mice. Current Protocols in Immunology.l5.19.1-15.19.14.) Los resultados ilustrados en la figura 2d indican que aunque todos los animales tratados con TNBS y APSA-VME se vieron gravemente afectados, las SV-VME redujeron significativamente la enfermedad en la mayona de los animales. Los animales tratados con VME de bacterias de tipo salvaje tuvieron muchos menos signos focales de patologfa, y cuando se observaron lesiones, eran mas pequenas y conservaban una arquitectura tisular considerablemente normal en comparacion con los animales que recibieron APSA-VME.
Los resultados anteriores establecen que el PSA es necesario para la actividad protectora de la enfermedad de las VME.
Ejemplo 3: Las VME que contiene PSA inhiben TNF-a/IL-17, potencian la expresion de IL-10.
La produccion de citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias canonicas asociadas con colitis se midio en ratones tratados como se ilustra en el Ejemplo 2. En particular, el analisis de transcripcion de citocinas se realizo mediante
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qRT-PCR a partir del ARN recuperado de dos colon enteros o linfocitos T CD4+ purificados de ganglios linfaticos mesentericos.
Los resultados relevantes representativos de 3 ensayos independientes se indican en la Figura 2e (colon completes) y en la Figura 2f (linfocitos T CD4+ purificados de los ganglios linfaticos mesentericos). Esos resultados muestran que los niveles de transcripcion de biomarcadores proinflamatorios/citocinas, factor de necrosis tumoral (TNF-a) e IL- 17A, se elevaron en animales tratados con TNBS, pero se redujeron mediante la administracion de VME de una manera dependiente de PSA (Figura 2e). Consistente con la proteccion de la patologfa, las VME provocaron la produccion de mayores niveles de biomarcadores antiinflamatorios/citocinas IL-10 en comparacion con los animales administrados por via oral APSA-VME (Figura 2f). El analisis de la produccion de citocinas por linfocitos T CD4+ purificados de ganglios linfaticos mesentericos (GLM) confirmo que los linfocitos T en realidad estaban produciendo IL-10 en respuesta al PSA (Figura 2f). La infiltracion de linfocitos Th17, que son necesarios para la enfermedad, fue reducida significativamente por las VME, al igual que los niveles del potente marcador proinflamatorio TNF-a (Figura 2f). Los inventores concluyeron que el empaquetamiento de PSA en VME de B. fragilis protege a los animales de las manifestaciones patologicas e inmunologicas de la colitis experimental.
Ejemplo 4: Las VME que contienen PSA de B. fragilis inducen respuestas de las celulas dendriticas.
Las celulas dendriticas (CD) extienden las protrusiones en la luz intestinal y las partteulas intestinales de la muestra y, posteriormente, miran a los GLM con el fin de iniciar las reacciones de los linfocitos T. De hecho, el PSA administrad por via oral a los animales se asocia con las CD CD11c+ en los GLM. Por consiguiente, Los solicitantes buscaron analizar si las VME que conteman PSA tambien pueden ser captadas por las CD.
Los resultados ilustrados en la figura 3a muestran que las CD derivadas de la medula osea internalizaron rapidamente las VME de una manera dependiente de la actina, ya que el tratamiento de las celulas con citochalasina D inhibio significativamente la captacion de vesteulas (Figura 3a y Figura 8). La localizacion intracelular se confirmo mediante microscopia confocal (Figura 9).
Tambien se investigo la induccion mediada por PSA en las CD de los marcadores de activacion de linfocitos T. Los resultados ilustrados en la Figura 3b indicaron que la expresion de los marcadores de activacion de linfocitos T (MHCII, CD86) se elevo igualmente despues de la internalizacion de ambos SV-VME y APSA-VME (Figura 3b y Figura 10). El aumento de la expresion de MHC y las moleculas coestimuladoras indican que las VME que contienen PSA de B. fragilis puede influir en las respuestas de los linfocitos T.
Ejemplo 5: Las VME que contienen PSA inducen la expresion de IL-10 en linfocitos T CD4+ a traves de la expresion de IL-10 en CD.
A la luz del papel protector de las VME que contienen PSA en la colitis mostrado con los experimentos ilustrados en los Ejemplos 1 a 3, se analizaron los efectos biologicos de las VME en la induccion de respuestas de linfocitos T supresores. En particular, dado que se sabe que varias poblaciones de linfocitos T reguladores (Treg) inhiben la colitis, se analizo la capacidad de las VME para promover el desarrollo de Treg.
Los resultados ilustrados en la Figura 3c indican que las SV-VME indudan la expresion de IL-10 a partir de cocultivos in vitro de CD-linfocitos T, mientras que no se produjo IL-10 a partir de CD solas en estas condiciones. Las vesteulas purificadas a partir de B. fragilisAPSA indujeron significativamente menos IL-10 que SV-VME, aunque se detecto un aumento sobre los controles de medios. Se sabe que la produccion de IL-10 a partir de CD apoya el desarrollo de linfocitos CD4+IL-10+ in vivo e in vitro. Por consiguiente, se realizo el analisis de ELISA similar a aquel cuyos resultados se ilustran en la Figura 3c incluyendo CD diferenciadas de animales IL-10 -/-.
Los resultados ilustrados en la Figura 3d (panel izquierdo) muestran una produccion de IL-10 muy reducida en los cocultivos de CD-linfocitos T cuando las CD de IL-10 -/- se trataron con VME de tipo salvaje, lo que sugiere que la expresion de IL-10 por las CD es necesaria para inducir IL-10 de linfocitos T CD4 + de una manera paracrina.
Ejemplo 6: Las VME que contienen PSA programa las CD para dirigir el desarrollo y/o expansion de Treg Foxp3.
Los ligandos microbianos son detectados por varias clases de receptores de reconocimiento de patrones, y se ha demostrado que el PSA senaliza a traves del receptor 2 de tipo toll (TLR2) para provocar la produccion de citocinas Th1. Por lo tanto, se realizaron una serie de experimentos para analizar si se requiere TLR2 para la induccion de IL- 10 por las VME de tipo salvaje (que contienen PSA), como informes recientes han demostrado que la funcion DE Treg y la expresion de IL-10 estan influenciadas por TLR2.
Los resultados ilustrados en la Figura 3d (panel derecho) indican que, en comparacion con las CD de tipo salvaje, la ausencia de TLR2 (CD de animales TLR2 -/-) inhibe completamente la produccion de IL-10 en respuesta a las VME. Ambas CD respondieron igualmente a la estimulacion de superantfgeno (SEA), demostrando un defecto espedfico en la deteccion de PSA y no una falta general de activacion de linfocitos T por CD TLR2 -/- (Figura 3d). Los linfocitos T CD4+CD25+ que expresan el factor de transcripcion Foxp3 son una importante subpoblacion de Treg. Estudios recientes han demostrado que Treg CD4+CD25+Foxp3+ pueden expresar IL-10 y la produccion de IL-10 de Treg es
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necesaria para prevenir la inflamacion intestinal.
Para determinar la fuente de IL-10 inducida por PSA en VME, los linfocitos T CD4+CD25+ y CD4+CD25- se purificaron despues del cocultivo con CD y la expresion de IL-10 y Foxp3 se midio mediante qRT-PCR.
Los resultados ilustrados en la Figura 3e indican que notablemente, las VME-PSA indudan significativamente la expresion de IL-10 en la poblacion de Treg CD4+CD25+, pero no de linfocitos T CD4+CD25-. Las VME purificadas a partir de B. fragilis- APSA no pudieron estimular la produccion de IL-10 a partir de ninguna de las poblaciones de linfocitos T, con niveles identicos a los controles de medios. La expresion de Foxp3 tambien se incremento de manera significativa exclusivamente en los linfocitos T CD4+CD25+ por las VME de una manera dependiente de PSA (Figura 3e).
Los cocultivos se establecieron como para los experimentos ilustrados en las Figuras 3c-e, pero utilizando linfocitos T CD4+ de ratones Foxp3-GFP. Tras 4 dfas de cultivo con CD con pulsos de VME, las celulas se tineron con anti- CD4 y Foxp3 se detecto mediante la expresion de GFP usando FC.
Los resultados representativos de 2 ensayos Independientes se ilustran en la Figura 3f. Consistente con el aumento de la transcripcion de Foxp3 entre los linfocitos T CD4+, las proporciones de linfocitos T CD4+Foxp3+ aumentaron en respuesta al tratamiento con SV-VME pero no con el tratamiento con PSA-VME (Figura 3f). En conjunto, las VME que contienen PSA programan a las CD para dirigir el desarrollo y/o expansion de Treg en un sistema de cultivo completamente in vitro.
Ejemplo 7: Las VME que contienen PSA inducen la funcion supresora de Treg Foxp3 mediada por IL10
El uso de Treg como terapias celulares se ha propuesto para la EII, autoinmunidad y alergias. Se investigo la expresion de IL-10 por subpoblaciones de celulas T CD4+ despues de 4 dfas de cocultivo con CD tratadas con VME. Los linfocitos T CD4+ de bazo se purificaron en ratones IL-10-GFP, se tineron con anti-CD4 y anti-CD25 tras el cocultivo y se midio la expresion de IL-10 mediante la expresion de GFP.
Los resultados del tratamiento relevante con VME de las CD y los linfocitos T purificados ilustrados en la Figura 4a indican que revelo que el PSA estimula la produccion espedfica de IL-10 a partir de Treg CD4+ CD25+.
Segun este hallazgo, se investigo la capacidad del PSA para promover la capacidad supresora de Treg ex vivo. La supresion in vitro de las celulas intactas respondedoras por linfocitos T CD4+CD25+ purificados despues de cocultivo con CD tratadas con medios (control), SV-VME y APSA-VME. las celulas respondedoras CD4+CD25- (celulas efectoras; Tef) se purificaron de bazos de ratones de tipo salvaje, se pulsaron con CFSE de colorante intracelular (ester de succinimidil carboxifluorescema), se incubaron con Treg y se estimularon con anti-CD3 durante 3 dfas. La proliferacion celular se midio mediante FC de dilucion de CFSE.
Los resultados ilustrados en la Figura 4b y 4c indican que las Treg recuperadas de condiciones con CD tratadas con SV-VME mostraron una capacidad supresora significativamente mejorada en comparacion con las celulas T CD4 + CD25 + en respuesta a las APSA-VmE.
Por lo tanto, la ausencia espedfica de PSA de las VME que, de lo contrario, contienen numerosos ligandos microbianos (LPS, lipoprotemas, peptidoglicano, etc. anula la capacidad de las vesfculas de B. fragilis para inducir Treg funcionales.
Ejemplo 8: El PSA induce varias combinaciones de biomarcadores en Treg Foxp3
Se trato a los ratones Foxp3-GFP por via oral con PSA purificado en dfas alternos durante 6 dfas. Se extrajeron los GLM y los linfocitos T CD4+Foxp3+ o CD4+Foxp3- se purificaron mediante FACS segun la expresion ±GFP (pureza > 99 %). Se extrajo el ARN y se uso para q-PCR.
Los resultados ilustrados en la Figura 11 demuestran que el PSA coordina la induccion de multiples genes antiinflamatorios, incluyendo IL-10, TGF-p, perforina y granzima A, y la inhibicion de TNFa e IL17 (en particular IL17A).
Los resultados anteriores proporcionan un mecanismo molecular para la actividad probiotica de B. fragilis y revelan un ejemplo seminal para un ligando microbiano que vincula la senalizacion del receptor inmunitario innato al desarrollo de linfocitos T reguladores. En particular, los resultados anteriores indican que el PSA se administra al huesped mediante vesfculas de membrana externa (VME), estructuras de secrecion que dirigen moleculas bacterianas a las celulas huesped. Las VME que contienen PSA son internalizadas por las celulas dendnticas del sistema inmunitario del huesped. Tras la captacion de las VME, el PSA programa las celulas dendnticas para inducir la diferenciacion de los linfocitos T reguladores (Treg) que expresan Foxp3 y la citocina antiinflamatoria interleucina- 10 (IL-10). El desarrollo de Treg por las VME requiere la expresion del receptor de tipo toll 2 (TLR2) y la produccion de IL-10 por las celulas dendnticas. De manera destacable, las VME purificadas dirigen la diferenciacion in vitro de los Treg funcionales con una potente actividad supresora de una manera dependiente de PSA. El tratamiento de animales con VME que contienen PSA previene la colitis experimental y suprime las respuestas de citocinas
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proinflamatorias en el intestino. Estos hallazgos revelan que las bacterias comensales proporcionan factores microbianos beneficiosos a traves de la secrecion de vesfculas, un procedimiento que puede convertirse en un enfoque novedoso para la administracion de terapias probioticas para la EII.
En particular, los resultados anteriores muestran que los Treg inducidos por VME que contienen PSA son funcionalmente supresores e inhiben la activacion de los linfocitos T en el cultivo. Esta es la primera demostracion del desarrollo de Treg in vitro por un ligando microbiano y proporciona una prueba de principio a la nocion ampliamente especulada de que la senalizacion del receptor inmunitario innato modula la funcion de Treg. Como las terapias actuales para la EII son ineficaces o tienen efectos secundarios graves, los probioticos representan nuevas opciones de tratamiento prometedoras al aprovechar mecanismos evolutivos bien desarrollados para la inmunmodulacion. Dado que los Treg suprimen las respuestas inmunitarias en multiples tejidos, la demostracion seminal de los inventores del desarrollo de Treg in vitro por PSA sugiere la posibilidad emocionante de nuevas terapias celulares para numerosos trastornos inflamatorios, incluyendo autoinmunidad, asma y alergias.
Para identificar moleculas producidas por microorganismos que median la inmunomodulacion, las fracciones de los productos bacterianos se pueden purificar y se realizan los mismos ensayos que anteriormente hasta que se encuentra un compuesto puro que imita ese resultado cuando se usan bacterias completas. Asimismo, los enfoques anteriores podnan usarse para seleccionar una biblioteca mutante de un microorganismo de interes para identificar moleculas inmunomoduladoras que se han eliminado en un clon respectivo de una cepa que posee esta actividad.
Los estudios anteriores de los inventores han demostrado que el PSA solo puede tratar y prevenir la colitis en ratones (Round y col., 2010). Por consiguiente, dados los resultados actuales de los inventores que muestran que las VME de tipo salvaje que contienen PSA pueden prevenir la colitis en ratones, y que este efecto con las VME parece depender del PSA, ahora proponen que las vMe de tipo salvaje sera eficaz en el tratamiento de la colitis en el mismo modelo de ratones TNBS y tienen un efecto beneficioso o mejorado en seres humanos con EII.
Cabe senalar en el momento actual que, aunque no se conocen los marcadores predictivos de la aparicion de enfermedades inflamatorias (tal como la EII), una vez identificados, estos marcadores predictivos significaran que los sujetos/seres humanos en riesgo de desarrollar la enfermedad pueden tratarse de manera similar con las sustancias/composiciones/VME como se describe en el presente documento, para prevenir la aparicion de la enfermedad.
En otra realizacion, las VME (que contienen PSA) podnan alterarse de manera que no expresen o tengan una expresion reducida de ciertas enzimas (por ejemplo, actividades hemaglutinantes y enzimaticas (enzimas hidrolizantes tales como las fosfatasas alcalinas y acidas, esterasa lipasa, fosfohidroliasa, glucosaminidasa, etc.) utilizando procedimientos moleculares o ffsicos conocidos por los expertos en la tecnica. Dichas VME modificadas podnan utilizarse para tratar o prevenir la inflamacion o enfermedades inflamatorias.
Los ejemplos expuestos anteriormente se proporcionan para dar a los expertos en la tecnica una descripcion y divulgacion completas de como hacer y usar las realizaciones de las vesfculas, los sistemas y procedimientos de la divulgacion, y no se pretende que limiten el alcance de lo que los inventores consideran su divulgacion. Las modificaciones de los modos descritos anteriormente para llevar a cabo la divulgacion que son obvias para los expertos en la tecnica estan destinadas a estar dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones. Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas de los niveles de habilidad de los expertos en la tecnica a la que pertenece la invencion.
Debe entenderse que las divulgaciones no se limitan a composiciones o sistemas biologicos concretos, que, por supuesto, pueden variar. Se entendera tambien que la terminologfa usada en el presente documento es con el fin de describir solo realizaciones particulares y no se desea que sea limitante. Como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una/uno", y "el" o "la", incluyen referencias en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. El termino "pluralidad" incluye dos o mas referentes a menos que el contenido indique claramente lo contrario. Salvo que se defina de otra manera, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que un experto en la tecnica a la que la divulgacion pertenece entiende habitualmente.
Aunque se puede usar cualquier procedimiento y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento en la practica para analizar los ejemplos espedficos, en el presente documento se describen materiales y procedimientos adecuados.
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15. Documento US 2009/0124573 A1 (Mazmanian Sarkis y col.)
Aunque la presente invencion se ha descrito en relacion con las realizaciones preferidas, debe entenderse que pueden utilizarse modificaciones y variaciones sin apartarse de los principios y alcance de la invencion, como entenderan facilmente los expertos en la tecnica. Por consiguiente, tales modificaciones pueden practicarse dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (17)

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    REIVINDICACIONES
    1. Una composicion bacteriana para su uso como medicamento, que comprende una vesfcula de membrana externa formada por una membrana lipfdica que encierra un ambiente acuoso, comprendiendo la vesfcula polisacarido A (PSA), en la que la membrana iipfdica es de la membrana externa de Bacteroides fragilis.
  2. 2. La composicion bacteriana para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende ademas un excipiente.
  3. 3. La composicion bacteriana para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en la que el PSA es PSA de bajo peso molecular (L-PSA).
  4. 4. La composicion bacteriana para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que ademas comprende uno o mas medicamentos que se sabe que son utiles en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal.
  5. 5. Una composicion bacteriana para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria o inflamacion que comprende una vesfcula de membrana externa formada por una membrana lipfdica que encierra un ambiente acuoso, comprendiendo la vesfcula PSA, en la que la membrana lipfdica es de la membrana externa de Bacteroides fragilis.
  6. 6. La composicion bacteriana para su uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en la que la composicion se usa en combinacion con otro medicamento que se sabe que es util en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria.
  7. 7. La composicion bacteriana para su uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en la que la enfermedad inflamatoria es enfermedad inflamatoria intestinal.
  8. 8. La composicion bacteriana para su uso de acuerdo con la reivindicacion 7, en la que el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal comprende la reduccion de la gravedad, la duracion y/o el riesgo de desarrollar malignidad.
  9. 9. La composicion bacteriana para su uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en la que la malignidad es o comprende cancer de colon.
  10. 10. La composicion bacteriana para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el medicamento dirige la diferenciacion de los linfocitos T reguladores funcionales con una potente actividad supresora.
  11. 11. La composicion bacteriana para su uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en la que el PSA es L-PSA.
  12. 12. La composicion bacteriana para su uso de acuerdo con la reivindicacion 10 u11, en la que dichos linfocitos T reguladores inhiben la activacion de linfocitos T.
  13. 13. La composicion bacteriana para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en la que los linfocitos T reguladores expresan Foxp3.
  14. 14. El uso de una composicion bacteriana que comprende una vesfcula de membrana externa formada por una membrana lipfdica que encierra un ambiente acuoso, comprendiendo la vesfcula polisacarido A (PSA), en el que la membrana lipfdica es de la membrana externa de Bacteroides fragilis, para dirigir la diferenciacion de linfocitos T reguladores funcionales con una potente actividad supresora, en el que la diferenciacion se produce in vitro.
  15. 15. El uso de acuerdo con la reivindicacion 14, en el que el PSA es L-PSA.
  16. 16. El uso de acuerdo con la reivindicacion 14 o 15, en el que dichos linfocitos T reguladores inhiben la activacion de linfocitos T.
  17. 17. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el que los linfocitos T reguladores expresan Foxp3.
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