TW201304803A - 減輕免疫原組合物因攪動誘發之聚集之新穎調配物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種新穎調配物，其可減輕免疫原組合物(特定言之彼等具有多醣-蛋白質偶聯物者)因攪動誘發之聚集。具體而言，該等新穎調配物包含在1100至17,400之分子量範圍內的泊洛沙姆(poloxamer)，泊洛沙姆提供優於先前所採用包括聚山梨醇酯80在內之表面活性劑之顯著優勢。在一個實施例中，本發明提供具有15種不同多醣-蛋白質偶聯物及泊洛沙姆之多價免疫原組合物。每一偶聯物皆由自肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)之不同血清型(1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F或33F)製得的莢膜多醣偶聯至載體蛋白(較佳CRM197)而組成。

Description

減輕免疫原組合物因攪動誘發之聚集之新穎調配物
本發明提供減輕具有多醣-蛋白質偶聯物之免疫原組合物因攪動誘發之聚集的新穎調配物。具體而言，該等新穎調配物包含在1100至17,400之分子量範圍內的泊洛沙姆表面活性劑，泊洛沙姆提供優於包括聚山梨醇酯80在內之先前所用表面活性劑的顯著優勢。
疫苗調配物通常必須穩定且具有均勻稠度以適應長存架壽命及使用多劑量容器之需要。基於蛋白質(包括多醣-蛋白質偶聯物)之疫苗經受蛋白質聚集及沉澱，此可由於所沉澱蛋白質產物之不可利用性而導致疫苗之較低有效總濃度。特定而言，多醣-蛋白質偶聯物疫苗似乎比單獨載體蛋白具有更強之聚集傾向。參見Berti等人，2004,Biophys J 86:3-9。
用於多醣-蛋白質偶聯物疫苗之調配物之選擇可大大影響蛋白質聚集。參見Ho等人，2001,Vaccine 19:716-725。舉例而言，已發現山梨醇可減輕因水份誘發之聚集(參見Schwendeman等人，1995,Proc Natl Acad Sci USA 92:11234-11238)且顯示聚山梨醇酯80及磷酸鋁二者均抑制多醣-蛋白質偶聯物沉澱(參見美國專利申請公開案2007/0253984 A1)。
業內一直需要可增強具有多醣-蛋白質偶聯物之免疫原組合物的穩定性並抑制其聚集/沉澱的額外疫苗調配物。
本發明係關於抑制具有一或多種多醣-蛋白質偶聯物之免疫原組合物因攪動誘發之聚集的新穎調配物。本發明之調配物穩定免疫原組合物抗諸如聚矽氧油相互作用、剪切力、運輸攪動、熱穩定性及諸如此類等因素。
因此，本發明係關於包含以下之調配物：(i)pH在5.0至8.0範圍內之pH緩衝生理食鹽水溶液，(ii)分子量在1100至17,400範圍內之泊洛沙姆，及(iii)一或多種多醣-蛋白質偶聯物。
在某些實施例中，泊洛沙姆之分子量在7,500至15,000或7,500至10,000範圍內。在某些實施例中，調配物之泊洛沙姆選自由泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆338及泊洛沙姆407組成之群。在一個特定實施例中，泊洛沙姆係泊洛沙姆188或泊洛沙姆237。在另一實施例中，泊洛沙姆於調配物中之最終濃度為0.001%至5%重量/體積調配物。在另一實施例中，泊洛沙姆於調配物中之最終濃度為0.025%至4%、0.025%至1%、0.025%至0.5%或0.025%至0.15%重量/體積調配物。在另一實施例中，泊洛沙姆於調配物中之最終濃度為0.05%至4%、0.05%至1%、0.05%至0.5%或0.05%至0.15%重量/體積調配物。在其他實施例中，泊洛沙姆於調配物中之最終濃度為0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1.0%或5.0%重量/體積調配物。在又一些實施例中，泊洛沙姆188於調配物中之最終濃度為0.05%至1.0%重量/體積調配物，或泊洛沙姆237於調配物中之最終濃度為0.1%至1.0%重量/體積調配物。
在某些實施例中，本發明調配物之pH緩衝生理食鹽水溶液包含pH為5.2至8.0、5.2至7.5或5.8至7.0之緩衝液。在某些實施例中，緩衝液係磷酸鹽、琥珀酸鹽、組胺酸、乙酸鹽、檸檬酸鹽、MES、MOPS、TRIS或HEPES。在某些實施例中，緩衝液係以1 mM至50 mM之濃度存在。在某些實施例中，緩衝液係最終濃度為5 mM至50 mM之組胺酸。在一個特定實施例中，組胺酸緩衝液之最終濃度係20 mM。
在某些實施例中，pH緩衝生理食鹽水溶液中之鹽包含氯化鎂、氯化鉀、氯化鈉或其組合。在一個特定實施例中，pH緩衝生理食鹽水溶液中之鹽係氯化鈉。在一個實施例中，該鹽係以20 mM至170 mM之濃度存在。
在某些實施例中，多醣-蛋白質偶聯物調配物之蛋白質選自由以下組成之群：CRM197、破傷風類毒素、霍亂類毒素、百日咳類毒素、大腸桿菌(E. coli)熱不穩定類毒素(LT)、肺炎球菌溶血素類毒素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌黏附素蛋白A(PsaA)、來自鏈球菌(Streptococcus)之C5a肽酶、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)蛋白D、卵白蛋白、鑰孔貝血藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)及結核菌素(tuberculin)之純化蛋白質衍生物(PPD)。
在某些實施例中，調配物之多醣-蛋白質偶聯物包含一或多種肺炎球菌多醣。在某些實施例中，一或多種肺炎球菌多醣選自由以下組成之群：肺炎鏈球菌血清型1多醣、肺炎鏈球菌血清型2多醣、肺炎鏈球菌血清型3多醣、肺炎鏈球菌血清型4多醣、肺炎鏈球菌血清型5多醣、肺炎鏈球菌血清型6A多醣、肺炎鏈球菌血清型6B多醣、肺炎鏈球菌血清型7F多醣、肺炎鏈球菌血清型8多醣、肺炎鏈球菌血清型9N多醣、肺炎鏈球菌血清型9V多醣、肺炎鏈球菌血清型10A多醣、肺炎鏈球菌血清型11A多醣、肺炎鏈球菌血清型12F多醣、肺炎鏈球菌血清型14多醣、肺炎鏈球菌血清型15B多醣、肺炎鏈球菌血清型17F多醣、肺炎鏈球菌血清型18C多醣、肺炎鏈球菌血清型19A多醣、肺炎鏈球菌血清型19F多醣、肺炎鏈球菌血清型20多醣、肺炎鏈球菌血清型22F多醣、肺炎鏈球菌血清型23F多醣及肺炎鏈球菌血清型33F多醣。在一個實施例中，多醣-蛋白質偶聯物調配物係15價肺炎球菌偶聯物(15vPnC)調配物，其包含：偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型1多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型3多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型4多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型5多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型6A多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型6B多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型7F多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型9V多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型14多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型18C多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型19A多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型19F多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈 球菌血清型22F多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型23F多醣及偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型33F多醣。
在某些實施例中，調配物進一步包括佐劑。在一個實施例中，佐劑係基於鋁之佐劑，例如氫氧化鋁、磷酸鋁或硫酸鋁。在一個具體實施例中，鋁佐劑係磷酸鋁。在某些實施例中，調配物包含0.001 mg至0.250 mg元素鋁。
在某些實施例中，調配物包含0.001 mg至0.250 mg元素鋁(較佳0.112 mg至0.130 mg元素鋁)、140 mM至160 mM氯化鈉及18 mM至22 mM L-組胺酸緩衝液。在實例性實施例中，調配物係經調配含有以下物質之0.5 mL單一劑量：1.8 μg至2.2 μg每一種醣，除6B以外，其係3.6 μg至4.4 μg；約32 μg CRM197載體蛋白；0.125 mg元素鋁(0.5 mg磷酸鋁)佐劑；150 mM氯化鈉及20 mM L-組胺酸緩衝液。
在某些實施例中，調配物進一步包含防腐劑，其係間-甲苯酚、苯酚、2-苯氧基乙醇、氯丁醇、苯甲醇或硫柳汞(thimerosal)。
在某些實施例中，調配物包含於選自由以下組成之群之容器構件中：小瓶、小瓶塞、小瓶蓋、玻璃蓋、橡膠蓋、塑膠蓋、注射器(包括預填充注射器、注射器塞、注射器柱塞)、燒瓶、燒杯、量筒、發酵罐、生物反應器、管道、管、袋、罐、安瓿、藥筒及可棄式筆。在某些實施例中，容器構件經矽化，較佳焙乾。
本發明部分係基於以下發現：在含有多醣-蛋白質偶聯物之調配物中使用泊洛沙姆作為表面活性劑會減輕因攪動誘發之聚集且提供優於諸如聚山梨醇酯等其他表面活性劑之出人意料之優異性質。本發明解決改良諸如多醣-蛋白質偶聯物等免疫原組合物之穩定性並抑制其微粒形成(例如聚集、沉澱)之業內持續需要。
如實例中所述，初始研究檢驗向疫苗調配物中以0.1%(w/v)之濃度添加泊洛沙姆188是否能減輕在熱、機械應力等情況下聚集物之形成。多個振盪研究以及模擬運輸研究(ISTA標準測試)顯示，使用當前ISTA標準方法，泊洛沙姆188具有減輕旋轉振盪及模擬運輸研究後之聚集的能力。
因此，本發明係關於可穩定具有多醣-蛋白質偶聯物之調配物的調配物，該調配物包含pH緩衝生理食鹽水溶液(其中緩衝液之pH為5.0至8.0)、分子量為1100至17,400之泊洛沙姆及一或多種多醣-蛋白質偶聯物。在某些實施例中，多醣-蛋白質偶聯物調配物包含於容器構件中。
如本文所定義術語「含CpG之核苷酸」、「含CpG之寡核苷酸」、「CpG寡核苷酸」及相似術語係指長度為6-50個核苷酸且含有未甲基化CpG部分的核苷酸分子。參見(例如)Wang等人，2003,Vaccine 21:4297。
如本文所定義術語「多醣」意欲包括常用於免疫及細菌疫苗技術中之任一抗原醣元素(或抗原單元)，包括但不限於「醣」、「寡醣」、「多醣」、「脂醣」、「脂寡醣(LOS)」、「脂多醣(LPS)」、「糖基化物」、「醣偶聯物」及諸如此類。
如本文所定義「多醣-蛋白質偶聯物」、「肺炎球菌偶聯物」、「7價肺炎球菌偶聯物(7vPnC)」、「13價肺炎球菌偶聯物(13vPnC)」、及「15價肺炎球菌偶聯物(15vPnC)」包括液體調配物、冷凍液體調配物及固體(例如，冷凍乾燥或凍乾)調配物。術語「PCV15」亦係指15價肺炎球菌偶聯物且可與術語15vPnC互換使用。
如本文所定義術語「沉澱」(「precipitation」、「precipitate」)、「微粒形成」、「渾濁」及「聚集」可互換使用且欲指可使多醣-蛋白質偶聯物「聚集」之任一物理相互作用或化學反應。聚集(例如蛋白質聚集)之過程經常受諸多物理化學應力影響，該等物理化學應力包括熱、壓力、pH、攪動、剪切力、冷凍-解凍、脫水、重金屬、酚系化合物、矽油、變性劑及諸如此類。
如本文所定義之本發明「表面活性劑」係降低免疫原組合物調配物之表面張力的任一分子或化合物。
泊洛沙姆係由聚氧丙烯(聚(氧化丙烯))之中心疏水鏈側接聚氧乙烯(聚(氧化乙烯))之兩條親水鏈構成的非離子型三嵌段共聚物。泊洛沙姆亦由商品名為人所知。由於可定製聚合物嵌段之長度，故存在具有稍微不同性質之許多不同泊洛沙姆。關於通稱「泊洛沙姆」，該等共聚物通常以緊跟三個數位之字母「P」(對於泊洛沙姆而言)命名，前兩個數位×100給出聚氧丙烯核之近似分子質量，且最後數位×10給出聚氧乙烯含量百分比(例如，P407=具有4,000 g/mol之聚氧丙烯分子質量及70%聚氧乙烯含量的泊洛沙姆)。對於Pluronic商品名，該等共聚物之編碼起始於用於界定其室溫下之物理形式的字母(L=液體，P=膏糊，F=薄片(固體))，之後緊跟兩個或三個數位。數字標記中之第一數位(三位數中之兩個數位)乘以300指示疏水物之近似分子量；且最後數位×10給出聚氧乙烯含量百分比(例如，L61=具有1,800 g/mol之聚氧丙烯分子質量及10%聚氧乙烯之)參見美國專利第3740421號。
泊洛沙姆之實例具有通式：
HO(C2H4O)a(C3H6O)b(C2H4O)aH，
其中a及b嵌段具有以下值：
本文所用分子量單位係以道爾頓(Da)或g/mol表示。
在某些實施例中，泊洛沙姆於調配物中之最終濃度為0.001%至5%重量/體積調配物。在另一實施例中，泊洛沙姆於調配物中之最終濃度為0.025%至4%、0.025%至1%、0.025%至0.5%或0.025%至0.15%重量/體積調配物。在另一實施例中，泊洛沙姆於調配物中之最終濃度為0.05%至4%、0.05%至1%、0.05%至0.5%或0.05%至0.15%重量/體積調配物。在其他實施例中，泊洛沙姆於調配物中之最終濃度為0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1.0%或5.0%重量/體積調配物。在另一實施例中，泊洛沙姆188於調配物中之最終濃度為0.05%至1.0%重量/體積調配物，或泊洛沙姆237於調配物中之最終濃度為0.1%至1.0%重量/體積調配物。
表面活性劑較佳不偶聯至載體蛋白。
調配物亦含有pH-緩衝生理食鹽水溶液。緩衝液可選自(例如)由以下組成之群：TRIS、乙酸鹽、麩胺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、碳酸鹽、甘胺酸鹽、組胺酸、甘胺酸、琥珀酸鹽、HEPES(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、MOPS(3-(N-嗎啉基)丙磺酸)、MES(2-(N-嗎啉基)乙磺酸)及三乙醇胺緩衝液。緩衝液能夠將溶液緩衝至4至10、5.2至7.5或5.8至7.0範圍內之pH。緩衝液可進一步(例如)選自用於非經腸用途之USP相容緩衝液，特定而言，在醫藥調配物用於非經腸用途時。緩衝液之濃度將在1 mM至50 mM或5 mM至50 mM範圍內。
儘管生理食鹽水溶液(即含有NaCl之溶液)較佳，但適於調配物之其他鹽包括但不限於CaCl2、KCl及MgCl2。可使用包括但不限於蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇及甘油之非離子型等滲劑代替鹽。適宜鹽範圍包括但不限於25 mM至500 mM或40 mM至170 mM。
在一較佳實施例中，使用氯化鈉將疫苗組合物調配於L-組胺酸緩衝液中。
本發明調配物亦可含有額外表面活性劑。較佳表面活性劑包括但不限於：聚氧乙烯山梨醇酐酯表面活性劑(通常稱為Tween)，尤其聚山梨醇酯20及聚山梨醇酯80；環氧乙烷(EO)、環氧丙烷(PO)、及/或環氧丁烷(BO)之共聚物，以DOWFAXTM商品名出售，例如線性EO/PO嵌段共聚物；辛苯昔醇，其重複乙氧基(氧基-1,2-乙烷二基)基團之數量可有所變化，其中辛苯昔醇-9(Triton X-100、或第三-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)尤其令人感興趣；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂，例如磷脂醯膽鹼(卵磷脂)；乙氧基壬基苯酚，例如TergitolTM NP系列；衍生自月桂醇、鯨蠟醇、硬脂醇及油醇之聚氧乙烯脂肪醚(稱作Brij表面活性劑)，例如三乙二醇單月桂基醚(Brij 30)；及山梨醇酐酯(通常稱為SPAN)，例如山梨醇酐三油酸酯(Span 85)及山梨醇酐單月桂酸酯。
在本發明之某些實施例中，用佐劑進一步調配本發明調配物。佐劑係在與免疫原或抗原一起投與時可增強免疫反應之物質。免疫性佐劑可增強對於抗原之免疫反應(在單獨投與時之免疫原性較弱，例如並不誘發或誘發較弱之抗體效價或細胞調介之免疫反應)，增加對於抗原之抗體效價，及/或降低在個體中有效達成免疫反應之抗原劑量。因此，佐劑常用於加強免疫反應且為熟習此項技術者所熟知。可增強組合物效力之適宜佐劑包括但不限於：
(1)鋁鹽(明礬)，例如，氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；
(2)水包油型乳液調配物(含有或不含其他特定免疫刺激劑，例如胞壁醯肽(包括但不限於N-乙醯基-胞壁醯基-L-蘇胺醯基-D-異麩醯胺(thr-MDP)、N-乙醯基-降胞壁醯基-L-丙胺酸-2-(1'-2'二棕櫚醯基-sn-甘油-3-羥基磷醯基氧基)-乙胺(MTP-PE)等)或細菌細胞壁組份)，例如，(a) MF59(國際專利申請公開案第WO 90/14837號)，其含有5%角鯊烯、0.5% Tween 80、及0.5% Span 85(視情況含有不同量之MTP-PE)，其係使用微射流機(例如110Y型微射流機(Microfluidics,Newton,MA))調配成亞微米顆粒，(b) SAF，其含有10%角鯊烯、0.4% Tween 80、5%普流尼克(pluronic)封阻之聚合物L121、及thr-MDP，其係微流化成亞微米乳液或經渦旋以產生較大粒徑之乳液，(c) RibiTM佐劑系統(RAS)，(Corixa,Hamilton,MT)，其含有2%角鯊烯、0.2% Tween 80、及一或多種細菌細胞壁組份(來自由美國專利第4,912,094號中所述之3-O-脫醯基單磷醯脂質A(MPLTM)、海藻糖二黴菌酸酯(TDM)、及細胞壁支架(CWS)組成之群，較佳為MPL+CWS(DetoxTM))；及(d) Montanide ISA；
(3)皂苷佐劑，例如可使用Quil A或STIMULONTM QS-21(Antigenics,Framingham,MA)(參見(例如)美國專利第5,057,540號)或自其產生之顆粒，例如美國專利第5,254,339號中所述之ISCOM(由膽固醇、皂苷、磷脂、及兩親性蛋白之組合形成之免疫刺激性複合物)及(與ISCOM具有基本上相同之結構但不含蛋白質(CSL Limited,Parkville,Australia))；
(4)細菌脂多醣、合成脂質A類似物，例如胺基烷基葡糖胺磷酸酯化合物(AGP)、或其衍生物或類似物，其可購自Corixa(Hamilton,Mont.)且闡述於美國專利第6,113,918號中；一種此類AGP係2-[(R)-3-十四醯基氧基十四醯基胺基]乙基2-去氧-4-O-磷醯基-3-O-[(R)-3-十四醯基氧基十四醯基]-2-[(R)-3-十四醯基氧基十四醯基胺基]-b-D-吡喃葡萄糖苷，其亦稱作529(先前稱作RC529)，其係調配成水溶液形式或穩定乳液；
(5)合成多核苷酸，例如含有CpG基元之寡核苷酸(美國專利第6,207,646號)，包括彼等具有使用任何合成核苷間鍵之經修飾寡核苷酸、經修飾鹼基及/或經修飾醣者(例如，參見Sur等人，1999,J Immunol. 162:6284-93；Verthelyi,2006,Methods Mol Med. 127:139-58；及Yasuda等人，2006,Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 23:89-110)；
(6)細胞因子及淋巴因子，例如，介白素(例如，IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18等，包括其突變體形式；美國專利第5,723,127號)、干擾素(例如，α、β及γ干擾素)、粒細胞集落刺激因子(GCSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)、協同刺激分子B7-1及B7-2等；及趨化因子，例如MCP-1、MIP-1α、MIP-1β及RANTES；及
(7)補體，例如補體組份C3d之三聚體。
其他佐劑包括愛菲金(Amphigen)、阿夫立定(Avridine)、L121/角鯊烯、D-交酯-聚交酯/醣苷、普羅尼克多元醇、胞壁醯基二肽、殺死之博德特菌(Bordetella)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、IC-31(Intercell AG、Vienna、Austria)(其闡述於歐洲專利第1,296,713號及第1,326,634號中)、百日咳類毒素(PT)、或大腸桿菌熱不穩定毒素(LT)，尤其LT-K63、LT-R72、PT-K9/G129；例如，參見國際專利公開案第WO 93/13302號及第WO 92/19265號。
在另一實施例中，佐劑係2種、3種或更多種上述佐劑之混合物，例如，SBAS2(亦含有3-去醯基化單磷醯脂A及QS21之水包油型乳液)。
在某些實施例中，佐劑係鋁鹽。鋁鹽佐劑可為明礬沉澱性疫苗或明礬吸附性疫苗。鋁鹽佐劑在業內已眾所周知且闡述於(例如)Harlow,E.及D. Lane(1988；Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory)及Nicklas,W.(1992;Aluminum salts. Research in Immunology 143:489-493)中。鋁鹽包括但不限於水合氧化鋁、氧化鋁水合物、氧化鋁三水合物(ATH)、鋁水合物、鋁三水合物、鋁膠、Superfos、Amphogel、氫氧化鋁(III)、羥基磷酸硫酸鋁(磷酸鋁佐劑(APA))、非晶型氧化鋁、三水合氧化鋁、或三羥基鋁。
APA係羥基磷酸鋁之水性懸浮液。APA係藉由摻和體積比為1:1之氯化鋁與磷酸鈉以使羥基磷酸鋁沉澱來製得。摻和過程後，使用高剪切混合器來減小材料之尺寸以達成2-8 μm範圍之目標聚集體粒徑。然後針對生理鹽水將產物透析並實施蒸汽滅菌。
在某些實施例中，使用市售Al(O H)3(例如，Alhydrogel或Superfos，Denmark/Accurate Chemical and Scientific公司，Westbury,NY)以50-200 g蛋白質/mg氫氧化鋁之比率來吸附蛋白質。在另一實施例中，蛋白質吸附取決於蛋白質之pI(等電點pH)及培養基之pH。具有較低pI之蛋白質在帶正電鋁離子上之吸附強於具有較高pI之蛋白質。鋁鹽可建立Ag儲積物，其經2-3週時間緩慢釋放，參與巨噬細胞之非特異性活化及補體活化，及/或刺激先天性免疫機制(可能經由尿酸刺激來達成)。參見(例如)Lambrecht等人，2009，Curr Opin Immunol 21:23。
本發明之多醣-蛋白質偶聯物調配物可包含任一已知多醣及載體蛋白。多醣之實例包括肺炎球菌多醣、奈瑟球菌(neisserial)多醣及鏈球菌多醣。
在某些實施例中，一或多種肺炎球菌多醣選自由以下組成之群:肺炎鏈球菌血清型1多醣、肺炎鏈球菌血清型2多醣、肺炎鏈球菌血清型3多醣、肺炎鏈球菌血清型4多醣、肺炎鏈球菌血清型5多醣、肺炎鏈球菌血清型6A多醣、肺炎鏈球菌血清型6B多醣、肺炎鏈球菌血清型7F多醣、肺炎鏈球菌血清型8多醣、肺炎鏈球菌血清型9N多醣、肺炎鏈球菌血清型9V多醣、肺炎鏈球菌血清型10A多醣、肺炎鏈球菌血清型11A多醣、肺炎鏈球菌血清型12F多醣、肺炎鏈球菌血清型14多醣、肺炎鏈球菌血清型15B多醣、肺炎鏈球菌血清型17F多醣、肺炎鏈球菌血清型18C多醣、肺炎鏈球菌血清型19A多醣、肺炎鏈球菌血清型19F多醣、肺炎鏈球菌血清型20多醣、肺炎鏈球菌血清型22F多醣、肺炎鏈球菌血清型23F多醣及肺炎鏈球菌血清型33F多醣。
本發明尤其適於含有自多種血清型之肺炎鏈球菌獲得之多醣的多價肺炎球菌多醣-蛋白質偶聯物疫苗。7價肺炎球菌偶聯物疫苗含有來自血清型4、6B、9V、14、18C、19F及23F之多醣。美國專利申請公開案第US 2006/0228380 A1號闡述了包括血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及23F之13價肺炎球菌偶聯物疫苗。中國專利申請公開案第CN 101590224 A號闡述了包括血清型1、2、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F及23F之14價肺炎球菌偶聯物疫苗。美國臨時專利申請案第61/302726號闡述了包括血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F及33F之15價肺炎球菌偶聯物疫苗。
在某些實施例中，多醣-蛋白質偶聯物調配物係包含以下之7價肺炎球菌偶聯物(7vPnC)調配物：偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型4多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型6B多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型9V多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型14多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型18C多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型19F多醣及偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型23F多醣。
在某些其他實施例中，多醣-蛋白質偶聯物調配物係包含以下之13價肺炎球菌偶聯物(13vPnC)調配物：偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型4多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型6B多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型9V多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型14多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型18C多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型19F多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型23F多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型1多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型3多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型5多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型6A多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型7F多醣及偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型19A多醣。
在一個實施例中，多醣-蛋白質偶聯物調配物係15價肺炎球菌偶聯物(15vPnC)調配物，其包含：偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型1多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型3多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型4多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型5多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型6A多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型6B多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型7F多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型9V多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型14多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型18C多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型19A多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型19F多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型22F多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型23F多醣及偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型33F多醣。
來自肺炎鏈球菌之莢膜多醣可藉由彼等熟習此項技術者已知之標準技術製得。舉例而言，多醣可自細菌分離且可藉由已知方法(參見(例如)歐洲專利第EP497524號及第EP497525號)且較佳藉由微流化來設定至一定尺寸。可設定多醣之尺寸以減小多醣試樣之黏度及/或改良偶聯產物之濾過率。
在一個實施例中，使每一肺炎球菌多醣血清型在基於大豆之培養基中生長。然後經由標準步驟來純化個別多醣，包括離心、沉澱、及超濾。參見(例如)美國專利申請公開案第2008/0286838號及美國專利第5,847,112號。
載體蛋白較佳係無毒且不具反應原性並可以足夠量及足夠純度獲得之蛋白質。載體蛋白可與肺炎鏈球菌多醣偶聯或連接以增強多醣之免疫原性。載體蛋白應能夠耐受標準偶聯程序。在本發明之一特定實施例中，使用CRM197作為載體蛋白。在一個實施例中，每一莢膜多醣皆偶聯至相同載體蛋白(每一莢膜多醣分子皆偶聯至單一載體蛋白)。在另一實施例中，莢膜多醣偶聯至兩個或更多個載體蛋白(每一莢膜多醣分子皆偶聯至單一載體蛋白)。在此一實施例中，具有相同血清型之每一莢膜多醣通常偶聯至相同載體蛋白。
CRM197係白喉毒素之非毒性變化形式(亦即，類毒素)。在一個實施例中，其係自在基於酪蛋白胺基酸及酵母提取物之培養基中生長之白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheria)菌株C7(β197)培養物分離而來。在另一實施例中，CRM197係根據美國專利第5,614,382號中所述之方法以重組方式製得。通常，經由超濾、硫酸銨沉澱、及離子交換層析之組合來純化CRM197。在一些實施例中，CRM197係使用Pfenex Expression TechnologyTM(Pfenex公司，San Diego,CA)在螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)中製得。
其他適宜載體蛋白包括額外經滅活之細菌毒素，例如DT(白喉類毒素(Diphtheria toxoid))、TT(破傷風類毒素)或TT之片段C、百日咳類毒素、霍亂類毒素(例如，國際專利申請公開案第WO 2004/083251號中所述者)、大腸桿菌LT、大腸桿菌ST及來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)之外毒素A。亦可使用細菌外膜蛋白，例如外膜複合物c(OMPC)、孔蛋白、轉鐵結合蛋白、肺炎球菌表面蛋白A(PspA；參見國際申請案專利公開案第WO 02/091998號)、肺炎球菌黏附素蛋白(PsaA)、來自A組或B組鏈球菌之C5a肽酶(例如，酶滅活鏈球菌C5a肽酶(SCP)，例如闡述於美國專利第6,951,653號、美國專利第6,355,255號及美國專利第6,270,775號中之SCP變體中之一或多者)、或流感嗜血菌蛋白D、肺炎球菌溶血素(Kuo等人，1995，Infect Immun 63；2706-13)(包括以某些方式去毒之ply，例如dPLY-GMBS(參見國際專利申請公開案第WO 04/081515號)或dPLY-formol)、PhtX(包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE及Pht蛋白融合體，例如PhtDE融合體、PhtBE融合體(參見國際專利申請公開案第WO 01/98334號及第WO 03/54007號))。亦可使用其他蛋白質作為載體蛋白，例如卵白蛋白、鑰孔貝血藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或結核菌素之純化蛋白質衍生物(PPD)、PorB(來自腦膜炎雙球菌(N. meningitides))、PD(流感嗜血菌蛋白D；參見(例如)歐洲專利第EP 0 594 610 B號)、或其免疫功能等效物、合成肽(參見歐洲專利第EP 0378881號及第EP 0427347號)、熱激蛋白(參見國際專利申請公開案第WO 93/17712號及第WO 94/03208號)、百日咳蛋白(參見國際專利申請公開案第WO 98/58668號及歐洲專利第EP 0471177號)、細胞因子、淋巴因子、生長因子或激素(參見國際專利申請公開案第WO 91/01146號)、人工蛋白(包含來自各種病原體衍生性抗原之多種人類CD4+ T細胞表位(參見Falugi等人，2001，Eur J Immunol 31:3816-3824)，例如N19蛋白(參見Baraldoi等人，2004，Infect Immun 72:4884-7))、鐵攝取蛋白(參見國際專利申請公開案第WO 01/72337號)、難辨梭狀芽孢桿菌(C. difficile)之毒素A或B(參見國際專利公開案第WO 00/61761號)、及鞭毛蛋白(參見Ben-Yedidia等人，1998，Immunol Lett 64:9)。
可使用其他DT突變體，例如CRM176、CRM228、CRM45(Uchida等人，1973，J Biol Chem 218:3838-3844)；CRM9、CRM45、CRM102、CRM103及CRM107及由Nicholls及Youle在Genetically Engineered Toxins，Frankel,Maecel Dekker公司編輯，1992中所述之其他突變；Glu-148至Asp、Gln或Ser及/或Ala 158至Gly之缺失或突變及美國專利第4,709,017號或美國專利第4,950,740號中所揭示之其他突變；至少一或多個殘基Lys 516、Lys 526、Phe 530及/或Lys 534之突變及美國專利第5,917,017號或美國專利第6,455,673號中所揭示之其他突變；或美國專利第5,843,711號中所揭示之片段。
然後對經純化多醣實施化學活化(例如，經由還原胺化)以使該等醣能夠與載體蛋白發生反應。一旦活化，則每一莢膜多醣會藉由已知偶合技術分別與載體蛋白(例如CRM197)偶聯以形成醣偶聯物(或另一選擇為，每一莢膜多醣偶聯至同一載體蛋白)並調配成單一劑量調配物。
在一個實施例中，多醣之化學活化及隨後與載體蛋白之偶聯係藉由美國專利第4,365,170號、第4,673,574號及第4,902,506號中所述之方式來達成。簡言之，該化學方式藉由使肺炎球菌多醣與將末端羥基氧化成醛之任一氧化劑進行反應來將其活化，該氧化劑係(例如)高碘酸鹽(包括高碘酸鈉、高碘酸鉀、或高碘酸)。該反應使得可隨機氧化性裂解碳水化合物之鄰位羥基，同時形成反應性醛基團。
在一個實施例中，可經由對蛋白質之離胺醯基實施直接胺化藉由還原胺化來與載體蛋白(例如CRM197)進行偶合。舉例而言，藉由使經活化多醣及載體蛋白之混合物與諸如氰基硼氫化鈉等還原劑進行反應來實施偶聯。然後藉由添加諸如硼氫化鈉等強還原劑來對未反應之醛進行封蓋。
在另一實施例中，偶聯方法可依賴於使用1-氰基-4-二甲基胺基四氟硼酸吡啶鎓(CDAP)來活化醣以形成氰酸酯。由此可使經活化醣直接或經由間隔體(連接體)基團偶合至載體蛋白上之胺基。舉例而言，間隔體可為胱胺或半胱胺以得到硫醇化多醣，該硫醇化多醣可在與馬來醯亞胺活化之載體蛋白(例如使用GMBS)或鹵代乙醯化載體蛋白(例如使用碘代乙醯亞胺[例如，乙基碘代乙醯亞胺HCl]或溴乙酸N-琥珀醯亞胺基酯或SIAB、或SIA、或SBAP)反應後經由所獲得之硫醚鍵與載劑偶合。較佳地，使氰酸酯(視情況藉由CDAP化學物質製得)與己二胺或己二酸二醯肼(ADH)進行偶合，且使用碳化二亞胺(例如EDAC或EDC)化學物質，經由載體蛋白上之羧基使胺基衍生之醣與載體蛋白偶聯。該等偶聯物闡述於國際專利申請公開案第WO 93/15760號、第WO 95/08348號及第WO 96/29094號、及Chu等人，1983，Infect Immunity 40:245-256中。
其他適宜技術使用碳化二亞胺、醯肼、活性酯、降莰烷、對-硝基苯甲酸、N-羥基琥珀醯亞胺、S--NHS、EDC、TSTU。許多技術闡述於國際專利申請公開案第WO 98/42721號中。偶聯可涉及羰基連接體，該羰基連接體可藉由使醣之游離羥基與CDI進行反應(參見Bethell等人，1979，J. Biol. Chem. 254:2572-4；Hearn等人,1981,J. Chromatogr. 218:509-18)，隨後與蛋白質反應，形成胺基甲酸酯連接來形成。此可涉及將變旋異構末端還原成一級羥基，對一級羥基視需要進行保護/脫除保護，使一級羥基與CDI反應，形成CDI胺基甲酸酯中間體，及使CDI胺基甲酸酯中間體與蛋白質上之胺基偶合。
在一個實施例中，在調配之前，自肺炎鏈球菌單獨純化每一肺炎球菌莢膜多醣抗原，活化形成反應性醛，然後使用還原胺化法共價偶聯至載體蛋白CRM197。
使莢膜多醣與載體蛋白偶聯後，可藉由多種技術中之一或多者來純化多醣-蛋白質偶聯物(富集多醣-蛋白質偶聯物之量)。該等技術之實例係熟習此項技術者已知，且包括濃縮/透析作業、超濾、沉澱/溶離、管柱層析、及深層過濾。參見(例如)美國專利第6,146,902號。
在純化個別醣偶聯物後，將其複合，調配本發明之免疫原組合物。該等肺炎球菌偶聯物可藉由分開之方法製得，並可將其整體調配成單一劑量調配物。可使用業內公認之方法調配本發明多醣-蛋白質偶聯物。舉例而言，可將15種種別肺炎球菌偶聯物與生理上可接受之媒劑一起調配，以製備組合物。該等媒劑之實例包括但不限於水、緩衝生理食鹽水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇)及右旋糖溶液。
選擇每一疫苗劑量中之偶聯物用量，使其能夠在無明顯副作用下誘發免疫保護反應。該用量端視肺炎球菌血清型而變化。通常，每一劑量包含0.1至100 μg之每一種多醣，特定言之0.1至10 μg，且更特定言之1至5 μg。舉例而言，每一劑量可包含100、150、200、250、300、400、500、或750 ng或1、1.5、2、3、4、5、6、7、7.5、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、22、25、30、40、50、60、70、80、90、或100 μg。
在一個實施例中，鋁鹽之劑量為10、15、20、25、30、50、70、100、125、150、200、300、500、或700 μg、或1、1.2、1.5、2、3、5 mg或更高。在又一實施例中，上述明礬鹽之劑量係以每μg重組蛋白計。
特定疫苗中各組份的最佳量可藉由標準研究來確定，其中涉及觀察個體之適當免疫反應。舉例而言，在另一實施例中，藉由自動物研究外推至人類數據來確定用於人類疫苗接種之劑量。在另一實施例中，根據經驗來確定劑量。
在本發明之一特定實施例中，PCV-15疫苗係單獨偶聯至CRM197之血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F及33F肺炎球菌莢膜多醣的無菌液體調配物。將每一0.5 mL劑量調配成含有：2 μg之每一種醣，除6B以外，其係4 μg；約32 μg CRM197載體蛋白(例如32 μg±5 μg、±3 μg、±2 μg、或±1 μg)；0.125 mg元素鋁(0.5 mg磷酸鋁)佐劑；及氯化鈉與L-組胺酸緩衝液。氯化鈉濃度為約150 mM(例如150 mM±25 mM、±20 mM、±15 mM、±10 mM、或±5 mM)及約20 mM(例如20 mM±5 mM、±2.5 mM、±2 mM、±1 mM、或±0.5 mM)之L-組胺酸緩衝液。
通常將多醣-蛋白質偶聯物組合至多種血清型存於pH-緩衝生理食鹽水中之摻合物中，然後與佐劑(其可存於生理食鹽水中)組合。可在過程中之任何階段添加泊洛沙姆。
在一個實施例中，該方法由以下組成：組合存於組胺酸中之15血清型、生理食鹽水及泊洛沙姆之摻合物，及然後組合此經摻和材料與APA及生理食鹽水。
在具體實施例中，調配物由組胺酸(20 mM)、生理食鹽水(150 mM)及泊洛沙姆188(0.1% w/v)(pH 5.8)與250 μg/mL APA(磷酸鋁佐劑)組成。目前努力已檢驗出5.8-7.0之pH範圍且顯示所列舉調配物會減輕因攪動誘發之聚集。針對泊洛沙姆188發現之範圍目前正檢驗0.025%至0.15%之範圍。
本發明組合物亦可包括一或多種來自肺炎鏈球菌之蛋白質。適於納入之肺炎鏈球菌蛋白質的實例包括彼等在國際專利申請公開案第WO 02/083855號及第WO 02/053761號中所識別者。
上述調配物亦可包含一或多種額外醫藥上可接受之稀釋劑、賦形劑或醫藥上可接受之載劑。本文所用語言「醫藥上可接受之載劑」意欲包括與投與人類或其他脊椎動物宿主相容之任何及所有溶劑、分散介質、塗料、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑及諸如此類。適當載劑已為彼等熟習此項技術者所瞭解且將在很大程度上取決於投與途徑。
用於液體調配物之醫藥上可接受之載劑係水性或非水性溶液、懸浮液、乳液或油。非水性溶劑之實例係丙二醇、聚乙二醇、及可注射之有機酯(例如油酸乙酯)。水性載劑包括(除水外)醇/水溶液、乳液或懸浮液。油之實例係動物、植物、或合成來源之彼等油，例如，花生油、大豆油、橄欖油、向日葵油、魚肝油、另一海產油、或來自牛奶或雞蛋之脂質。
可存於免疫原組合物調配物中之賦形劑包括但不限於防腐劑、化學穩定劑及懸浮劑或分散劑。通常，優化穩定劑、防腐劑及諸如此類以確定靶定接受者(例如人類個體)中之針對功效之最佳調配物。防腐劑之實例包括間-甲苯酚、2-苯氧基乙醇、苯甲醇、硫柳汞、氯丁醇、山梨酸鉀、山梨酸、二氧化硫、沒食子酸丙酯、對羥基苯甲酸、乙基香草醛、甘油、苯酚及對氯苯酚。穩定成份之實例包括酪蛋白胺基酸、蔗糖、明膠、酚紅、N-Z胺、二磷酸單鉀、乳酸、乳白蛋白水解物及乾燥乳粉。
在某些實施例中，免疫原組合物調配物係經製備用於以(例如)液體、粉末、氣溶膠、錠劑、膠囊、腸衣錠劑或膠囊、或栓劑形式投與人類個體。因此，免疫原組合物調配物亦可包括但不限於存於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液、乳液、膏糊及可植入之持續釋放或可生物降解調配物。
在另一實施例中，經口投與本發明調配物，且由此調配成適於經口投與之形式，亦即，固體或液體製劑。固體口服調配物包括錠劑、膠囊、丸劑、顆粒、丸粒及諸如此類。液體口服調配物包括溶液、懸浮液、分散液、乳液、油及諸如此類。
在某些實施例中，調配物係單一劑量小瓶、多劑量小瓶或預填充注射器。
本發明免疫原組合物並不受以下物質之選擇之限制：習用生理上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑，例如溶劑、緩衝液、佐劑、或可用於上述類型之醫藥製劑中之其他成份。自具有適當pH、等滲性、穩定性及其他習用特性之上述組份製備該等醫藥上可接受之組合物已為熟習此項技術者所熟知。
在某些實施例中，本發明係關於包含於容器構件中之免疫原組合物的調配物。如本文所定義，本發明之「容器構件」包括在研究、處理、開發、調配、製造、儲存及/或投與期間用於「含有」、「容納」、「混合」、「摻和」、「分配」、「注射」、「轉移」、「噴射」等免疫原組合物之物質的任何組合物。舉例而言，本發明之容器構件包括但不限於普通實驗室玻璃器皿、燒瓶、燒杯、量筒、發酵罐、生物反應器、管道、管、袋、罐、小瓶、小瓶蓋(例如，橡膠塞、螺旋帽蓋)、安瓿、注射器、注射器塞、注射器柱塞、橡膠蓋、塑膠蓋、玻璃蓋及諸如此類。本發明之容器構件並不受製造材料之限制且包括諸如玻璃、金屬(例如，鋼、不銹鋼、鋁等)及聚合物(例如，熱塑性塑膠、彈性體、熱塑性彈性體)等材料。
熟習此項技術者應瞭解，上述容器構件決不係窮盡列表，而是僅用作熟習此項技術者關於各種容器構件之指導，該等容器構件在組合物之研究、處理、開發、調配、製造、儲存及/或投與期間用於含有、容納、混合、摻和、分配、注射、轉移、噴射等免疫原或免疫原組合物。期望用於本發明中之額外容器構件可參見實驗室設備供應商及製造者(例如United States Plastic公司(Lima,Ohio)、VWR(West Chester,Pa.)、BD Biosciences(Franklin Lakes,N.J.)、Fisher Scientific International公司(Ham pton,N.H.)及Sigma-Aldrich(St. Louis,M o.))之公開目錄。
因此，本發明之新穎調配物之尤其有利之處在於其在組合物之研究、處理、開發、調配、製造、儲存及/或投與之整個期間穩定包含於容器構件中之免疫原調配物並抑制其沉澱。本發明之新穎調配物不僅穩定免疫原組合物抗物理/熱應力(例如，溫度、濕度、剪切力等)，其亦增強免疫原組合物抗諸如免疫原組合物與容器/閉合系統(例如矽化容器構件)不相容等負面因素或影響的穩定性並抑制其沉澱。
使用彼等熟習此項技術者熟知且常用之標準技術確定本發明之免疫原組合物的穩定性。舉例而言，藉由包括但不限於光散射、光學密度、沉降速度離心、沉降平衡離心、圓二色性(CD)、Lowry分析、雙金雞寧酸(BCA)分析、抗體結合及諸如此類等方法分析免疫原組合物之穩定性、聚集、免疫原性、微粒形成、蛋白質(濃度)損失及諸如此類。
參照隨附之說明及圖式闡述本發明之各個實施例後，應理解，本發明並不限於彼等確切之實施例，且熟習此項技術者可在本文中實施各種改變及修改，此並不背離如隨附申請專利範圍所定義之本發明的範圍或精神。
下列實例闡釋但並不限制本發明。
實例 實例1：肺炎鏈球菌莢膜多醣之製備
培養肺炎球菌之方法在業內已眾所周知。參見(例如)Chase,1967,Methods of Immunology and Immunochemistry 1:52。製備肺炎球菌莢膜多醣之方法在業內亦已眾所周知。參見(例如)歐洲專利第EP 0497524號。肺炎球菌亞型分離物可自ATCC獲得。
細菌識別為在血瓊脂上為α溶血性之包膜性、非運動性、革蘭氏陽性(Gram-positive)柳葉刀型雙球菌。基於Quelling反應使用特異性抗血清使亞型進行分化。參見(例如)美國專利第5,847,112號。
細胞庫
自Merck Culture Collection(Rahway,NJ)在冷凍小瓶中獲得代表PCV-15中所存在每一肺炎鏈球菌血清型的細胞庫。
接種
將解凍之晶種培養物轉移至含有適當經預滅菌生長培養基之晶種發酵器中。
晶種發酵
在受控溫度及pH下於晶種發酵器中生長培養物。將晶種發酵器之全部體積轉移至含有經預滅菌生長培養基之生產發酵器中。
生產發酵
生產發酵係該過程之最終細胞生長階段。控制溫度、pH及攪動速率。
滅活
經由添加滅活劑來終止發酵過程。滅活後，將批料轉移至滅活箱中，在此將該批料保持於受控之溫度及攪動下。
純化
使用離心與過濾之組合去除細胞碎片。對批料實施超濾及透析。然後使批料經受基於溶劑之分餾以去除雜質並回收多醣。
實例2：肺炎球菌多醣-CRM197偶聯物之製備 活化方法
使用常見製程流程將不同血清型醣單獨偶聯至經純化CRM197載體蛋白上。在此製程中，將醣溶解，將尺寸設定為目標分子質量，以化學方式活化並藉由超濾更換緩衝液。然後使經純化CRM197與經活化醣偶聯且藉由超濾純化所得偶聯物，然後實施最終之0.2 μm膜過濾。每一步驟內之若干製程參數(例如pH、溫度、濃度、及時間)具有血清型特異性，如此實例中所述。
步驟1：溶解
將經純化多醣溶於水中直至濃度為2-3 mg/mL。使溶解之多醣流經壓力預設為0-1000巴之機械均質器。減小尺寸後，濃縮醣並使用無菌水在10 kDa MWCO超濾機上透析。棄去滲透調節物質且使用乙酸鈉緩衝液將滯留物調節至pH為4.1，最終濃度為50 mM。對於血清型4及5，使用pH為5.0之100 mM乙酸鈉。對於血清型4，在50℃±2℃下培育溶液。藉由冷卻至20℃至24℃來停止水解。
步驟2：高碘酸鹽反應
使用總醣含量來確定肺炎球菌醣活化所需之高碘酸鈉的莫耳當量。在充分混合下，在20℃至24℃下(對於所有血清型，除血清型5、7F、及19F以外，其溫度為2℃至6℃)實施3至20個小時之氧化。
步驟3：超濾
濃縮經氧化醣並使用pH為6.4之10 mM磷酸鉀(對於血清型5，使用pH為4.3之10 mM乙酸鈉)在10 kDa MWCO超濾機上實施透析。棄去滲透調節物質且藉由添加3 M磷酸鉀緩衝液將滯留物調節至pH為6.3-8.4。
偶聯方法
步驟1：偶聯反應
以0.2-2對1之投料比率使經濃縮醣與CRM197載體蛋白混合。經由0.2 μm過濾器過濾摻和之醣-CRM197混合物。
藉由添加氰基硼氫化鈉溶液達成每莫耳醣含有1.8-2.0莫耳氰基硼氫化鈉來引發偶聯反應。將反應混合物在20℃至24℃下(對於血清型3、5、6A、7F、19A、及19F為8℃至12℃)培育48-120小時。
步驟2：硼氫化物反應
在偶聯培育結束時，將反應混合物調節至4℃至8℃，且使用1.2 M碳酸氫鈉緩衝液或3 M磷酸鉀緩衝液將pH調節至8-10(除血清型5以外)。藉由添加硼氫化鈉溶液達成每莫耳醣含有0.6-1.0莫耳硼氫化鈉(對於血清型5，添加0莫耳硼氫化物)來停止偶聯反應。將反應混合物培育45-60分鐘。
步驟3：超濾步驟
使用最少20體積之100 mM磷酸鉀(pH 8.4)緩衝液在100 kDa MWCO超濾機上對反應混合物進行透析。在20℃至24℃下，在300 kDa MWCO超濾機上使用最少20透析體積之150 mM氯化鈉對來自100 kDa超濾機之滯留物進行透析。棄去滲透調節物質。
步驟4：無菌過濾
經由0.2 μm過濾器過濾來自300 kDa MWCO透析之滯留物，且以適宜體積填充至硼矽酸鹽玻璃容器中以供進行釋放測試、過程控制及調配(除血清型19F以外)。使血清型19F偶聯物經過0.2 μm過濾器進入儲料箱中並在20℃至24℃下培育。培育後，在20℃至24℃下，在300 kDa MWCO超濾機上使用最少20透析體積之150 mM氯化鈉對偶聯物進行透析。棄去滲透調節物質，且經由0.2 μm過濾器過濾滯留物並以適宜體積填充至硼矽酸鹽玻璃容器中以供進行釋放測試、過程控制、及調配。在2℃至8℃下儲存最終本體濃縮物。
實例3：15價肺炎球菌偶聯物疫苗之調配
根據批料體積及本體醣濃度來計算所需本體濃縮物之體積。藉由添加包含含有氯化鈉、L-組胺酸(pH為5.8)之緩衝液的賦形劑(例如泊洛沙姆)將合併之15種偶聯物進一步稀釋至目標吸附濃度。充分混合後，經由0.2 μm膜對摻合物實施無菌過濾。在與本體磷酸鋁摻和期間及之後輕輕地混合經調配之無菌本體。在2℃至8℃下儲存經調配疫苗。
實例4：賦形劑對因攪動誘發之聚集的效應
在旋轉攪動研究後利用不同賦形劑及pH條件研究15價肺炎球菌偶聯物疫苗-15(PCV-15)之穩定性。在20 mM組胺酸(pH 5.8)及150 mM氯化鈉與0.25 mg/mL磷酸鋁佐劑(APA)中製備PCV-15。將64 μg/mL之CRM197蛋白偶聯至4 μg/mL之型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F及33F肺炎球菌多醣(PnP)及8 μg/mL之型6B肺炎球菌多醣，總多醣濃度為64 μg/mL。
對於旋轉攪動研究而言，在pH 5.8、6.2及7.0下利用添加表面活性劑及滲透調節物質、及與滲透調節物質組合之表面活性劑製備PCV-15調配物主要成份(backbone)。端視滲透調節物質之濃度，將氯化鈉濃度自150 mM調節至100 mM或50 mM。利用在4℃下豎直及側旋轉攪動24小時設計攪動研究。以目視方式及利用靜態光散射觀察聚集。
調配物材料：
如實例1至3中所述製備PCV-15調配物材料。將經調配材料儲存於2℃至8℃下直至完成所有攪動研究為止。在20 mM組胺酸與0.25 mg/mL磷酸鋁佐劑(APA)及64 μg/mL多醣：CRM偶聯物中製備以下調配物：
1.　150 mM NaCl，pH 5.8
2.　150 mM NaCl，pH 6.0
3.　150 mM NaCl，pH 6.2
4.　150 mM NaCl，pH 6.6
5.　150 mM NaCl，pH 6.8
6.　150 mM NaCl，pH 7.0
7.　3%蔗糖、100 mM NaCl(pH 5.8)
8.　3%蔗糖、100 mM NaCl、0.02% PS-80(pH 5.8)
9.　6%蔗糖、50 mM NaCl(pH 5.8)
10. 6%蔗糖、50 mM NaCl、0.02% PS80(pH 5.8)
11. 3%蔗糖、100 mM NaCl，pH 6.2
12. 3%蔗糖、100 mM NaCl、0.02% PS-80(pH 6.2)
13. 6%蔗糖、50 mM NaCl(pH 6.2)
14. 6%蔗糖、50 mM NaCl、0.02% PS80(pH 6.2)
15. 6%海藻糖、50 mM NaCl、0.02% PS-80(pH 6.2)
16. 6%蔗糖、50 mM NaCl、0.1%泊洛沙姆188(pH 6.2)
17. 0.5%蔗糖、150 mM NaCl、0.02% PS-80(pH 5.8)
18. 0.5%蔗糖、150 mM NaCl、0.1%泊洛沙姆188(pH 5.8)
19. 0.5%蔗糖、150 mM NaCl、0.02% PS-80(pH 5.8)
20. 0.5%海藻糖、150 mM NaCl、0.02% PS-80(pH 5.8)
21. 0.5%蔗糖、150 mM NaCl、0.02% PS-20(pH 5.8)
22. 0.5%海藻糖、150 mM NaCl、0.02% PS-20(pH 5.8)
23. 0.5%蔗糖、150 mM NaCl(pH 5.8)
24. 0.5%海藻糖、150 mM NaCl(pH 5.8)
25. 150 mM NaCl、0.02% PS-80(pH 5.8)
26. 150 mM NaCl、0.02% PS-20(pH 5.8)
27. 150mM NaCl、0.02% PS-80(pH 6.2)
28. 150 mM NaCl、0.1%泊洛沙姆188(pH 5.8)
29. 150 mM NaCl、0.1%泊洛沙姆188(pH 6.2)
30. 150 mM NaCl、0.04% CTAB(pH 5.8)
31. 50 mM NaCl、6%蔗糖、0.1%泊洛沙姆188(pH 7.0)
32. 150 mM NaCl、0.1%泊洛沙姆188(pH 7.0)
攪動研究程序：
攪動研究之目的係使小瓶經受攪動條件且隨後測定彼等條件對聚集物形成之效應。該研究代表PCV-15調配物經由與親水表面(未研磨)相互作用而直接攪動及調配物暴露於最終容器組件及空氣介面中。將PCV-15調配物以0.75 mL之填充體積填充於未經硫酸鹽處理之具有13 mm塞之2 mL小瓶中。
對於旋轉、振動及翻滾攪動方法而言，於4℃及25℃下將小瓶豎直及側攪動24小時。將小瓶直接附接至攪動儀器，只是對於豎直旋轉攪動而言首先將該等小瓶放置於7×7冷凍箱中。使用最大速度下之實驗室規模多用途旋轉器用於旋轉攪動，而使用1,500 rpm下之數位式渦旋器(digital vortex)用於振動攪動。使用最大速度下之旋轉搖床(rota-shake genie)用於翻滾攪動。以1小時時間間隔對旋轉攪動方法觀察長達8小時且對振動及翻滾攪動方法觀察長達9小時，對於所有三種攪動方法在24小時時記錄最終觀察結果。由於調配物材料之有限可用性，對於旋轉方法而言一式兩份地攪動小瓶且對於振動及翻滾方法而言以一式單份攪動小瓶。將所有小瓶與作為對照之未攪動小瓶進行比較。
另外對於旋轉攪動方法而，用0.75 mL調配物填充經3%硫酸鹽處理之2 mL小瓶。於4℃下以最大速度將小瓶豎直及側攪動24小時並在具有及無10-bi產品紙盒情況下包裝以與在相同條件下攪動之未經硫酸鹽處理之小瓶進行比較。10-bi產品紙盒係一類最終銷售產品包裝，其可容納高達10個小瓶且含有一個產品圓盤(product circular)。
結果
在攪動pH 5.8、6.0、6.2、6.6、6.8及7.0下之PCV-15調配物1後，具體而言在側攪動後，確定pH變化並不顯著足以防止聚集物形成。在一些攪動研究中但並非在所有攪動研究中，個別地及與滲透調節物質蔗糖組合添加表面活性劑PS-80會防止因豎直及側攪動誘發之聚集。在一些攪動研究中但並非在所有攪動研究中，向V114調配物中個別地添加表面活性劑PS-20亦防止因豎直及側攪動誘發之聚集。然而，在添加PS-20與pH 5.8下之滲透調節物質蔗糖或海藻糖時，防止因豎直及側攪動誘發之聚集。最後，表面活性劑泊洛沙姆188個別地及與pH 5.8、6.2及7.0下之滲透調節物質蔗糖組合可防止因攪動誘發之聚集。
結論
在使用各種表面活性劑、滲透調節物質及pH條件完成攪動研究後，表面活性劑PS-20與pH 5.8下之滲透調節物質蔗糖及海藻糖組合能夠防止因攪動誘發之聚集。然而，表面活性劑泊洛沙姆188個別地及與滲透調節物質蔗糖(與pH無關)組合能夠防止因攪動誘發之聚集。
實例5：溫度、pH、鹽濃度及蔗糖對因攪動誘發之聚集的效應
利用若干調配物研究熱應力後旋轉攪動損傷對PCV-15之影響。對於旋轉攪動研究而言，藉由改變pH、鹽濃度及添加蔗糖將PCV-15製備成若干調配物(表1)。隨後將該等調配物分成三組：4℃；37℃應力達1週，及25℃應力達45天。立刻攪動4℃群組，而根據上述條件培育另兩組，隨後攪動。使用於4℃下旋轉側攪動24小時來設計攪動研究。所有試樣皆使用目視觀察以檢測微粒且利用靜態光散射測試4℃及37℃試樣以觀看試樣中之粒徑分佈。
表1：所製備用於攪動研究之調配物
方法：
調配物之製備：
在II類生物安全櫃中自上述多醣-蛋白質偶聯物以無菌方式製備調配物，該等偶聯物儲存於10 mM組胺酸(pH 7.0)及生理食鹽水中且隨後如表1中所定義進行調配。
旋轉攪動：
此研究代表PCV-15調配物經由與親水表面(未研磨)相互作用而直接攪動及調配物暴露於最終容器組件及空氣/液體介面中。將PCV-15調配物以0.75 mL之填充體積填充於未經硫酸鹽處理之具有13 mm塞之2 mL小瓶中。使小瓶經受熱應力條件，若需要，隨後於4℃下側攪動24小時。使用最大速度下之實驗室規模多用途旋轉器用於旋轉攪動。將小瓶直接附接至用於側攪動之旋轉器。在24小時時進行觀察。
結果：
在泊洛沙姆188不存在下，不管應力條件如何，於4℃下在小瓶中旋轉攪動24 hr後之PCV-15調配物(表1)形成沉澱。添加泊洛沙姆188未觀察到產生微粒(表2)。針對每一條件檢驗15個小瓶。
在APA存在及不存在下於4℃下利用20 mM組胺酸(pH 5.8)、150 mM NaCl實施對照實驗。結果相當，此顯示APA之存在並不促使抑制因攪動誘發之聚集。
表2：表面活性劑對小瓶中因攪動誘發之聚集形成的影響
亦對4℃及37℃試樣實施靜態光散射以觀看尺寸分佈。在無泊洛沙姆188之調配物中，觀察到較大微粒之群組。僅含有泊洛沙姆188之調配物具有一個與未攪動試樣中觀察到之群組相當之顆粒群組(圖1A-4B)。
結論：
即使在攪動之前對調配物進行熱應力時，最終濃度為0.1%之泊洛沙姆188亦能夠減輕小瓶中因攪動誘發之聚集。
實例6：ISTA標準測試期間表面活性劑對防止因攪動誘發之聚集的影響
介紹：
ISTA標準3A研究之目的係將小瓶調配物暴露於在常規運輸期間觀察到之振動應力及潛在墜落應力。對於研究而言，將PCV15製備成若干調配物，隨後使其經受ISTA 3A程序。參見國際安全運輸協會(International Safe Transit Association)程序3A(East Lansing,MI)。採用ISTA標準方法，結果將更符合材料在運輸至發達國家時將經歷之期望條件。隨後將試樣儲存於2℃至8℃下。在2℃至8℃下儲存後，目視檢查試樣以檢測微粒且隨後另外藉由靜態光散射(SLS)分析粒徑分佈。
方法：
調配物之製備：
在II類生物安全櫃中自上述多醣-蛋白質偶聯物以無菌方式製備調配物，該等偶聯物儲存於10 mM組胺酸(pH 7.0)及生理食鹽水中且隨後如表3中所定義進行調配。
表3：製備用於攪動研究之調配物
ISTA標準攪動研究：
使小瓶經受ISTA 3A程序。
所用材料係彼等於ISTA程序3A中所指定者且包括凝膠運輸器底座(膨脹聚苯乙烯(EPS)熱運輸器之底座)；PolarPack凝膠，28盎司(製冷劑，用於維持產品溫度)；PCS 50913 TempTale監測器，具有0℃低溫報警及25℃高溫報警；PCS 50900波紋墊，有槽；分別用於保持產品紙盒及凝膠運輸器閉合之Tape Scotch膠帶及包裝膠帶；10x產品紙盒(經設計以固持10個帶有塞子並經壓接之小瓶之紙盒，該等小瓶呈5×2圖案，產品圓盤分成2列，每列5個)；及PCS 50837凝膠運輸器蓋(由EPS製得之蓋)。
實施以下紙盒製備：
藉由用scotch膠帶將一側黏合起來組裝1個10x產品紙盒。
將10x產品紙盒在所有側上用黑色永久標記塗抹。
獲得PCV15調配物之10個小瓶。
將V114 DP調配物之所有10個小瓶放置於ProQuad 10x產品紙盒中。
將10x產品紙盒之開口端黏合起來。
將經包裝之10x產品紙盒放置於4種經製冷PolarPak凝膠(28盎司)(底部上2種凝膠及頂部上2種凝膠)間之凝膠運輸器內部。
在完成紙盒製備後立刻將材料輸送至Tegrant公司(Montgomeryville,PA)用於儲存/測試前條件控制。將所有材料放置於以下溫度條件中直至實施測試：於5℃±3℃下製冷之PolarPack凝膠製冷劑、5℃±3℃之PCV15調配物之小瓶；PolarPack凝膠製冷劑於-20℃±5℃下冷凍，所有其他組份處於室溫下。所有材料均於該等溫度儲存條件下保持超過24小時。
於Tegrant公司實施以下包裝：
獲得凝膠運輸器底座。
將1種經製冷PolarPack凝膠(28盎司)平坦放置於凝膠運輸器底座之底部中。
將1個TempTale放置於PolarPack凝膠頂部上並觸及凝膠運輸器內壁之邊緣，將其接通。
將1個有槽之波紋墊放置於經製冷PolarPack凝膠及TempTale頂部上。
將填充有PCV15調配物之產品紙盒放置於波紋墊頂部上。
將1個TempTale放置於填充PCV15調配物之產品紙盒之頂部層中。
將1個有槽之波紋墊放置於填充PCV15調配物之產品紙盒頂部上。
將1個TempTale放置於波紋墊中並觸及作為底部之凝膠運輸器壁之相對邊緣，將其接通。
將1種經製冷PolarPack凝膠(28盎司)平坦放置於波紋墊及TempTale頂部上。
將2種冷凍PolarPack凝膠(28盎司)平坦放置於經製冷PolarPack凝膠頂部上。
將凝膠運輸器蓋放置於凝膠運輸器底座上。
用包裝膠帶將凝膠運輸器黏合起來。
將經包裝之凝膠運輸器輸送至Mid-Atlantic Packaging(Montgomeryville,PA)用以根據ISTA 3A測試程序進行分佈測試。
除ISTA測試外，亦將小瓶之亞群暴露於先前所述之旋轉振盪條件中。使用最大速度下之實驗室規模多用途旋轉器用於旋轉攪動。將小瓶直接附接至用於側攪動之旋轉器。在24小時時進行觀察。
結果：
旋轉攪動結果：
在泊洛沙姆188不存在下於4℃下在小瓶中旋轉攪動24 hr後之PCV15調配物形成沉澱。添加表面活性劑泊洛沙姆188未觀察到產生微粒(表4)。
表4：表面活性劑對小瓶中因攪動誘發之聚集形成的影響
ISTA標準測試結果：
針對聚集物目視檢驗ISTA標準3A程序後之V114調配物(表3)。含有泊洛沙姆188或聚山梨醇酯(PS)之調配物減輕聚集物之外觀(表5)。
表5：表面活性劑對暴露於ISTA 3A程序後小瓶中因攪動誘發之聚集形成的影響
除目視檢查外，亦對試樣之亞群實施靜態光散射以檢驗尺寸分佈。無表面活性劑之對照調配物在ISTA測試後導致粒徑增大、以及顆粒分佈更寬兩種情況(圖5A-B)。而含有泊洛沙姆188之調配物顯示在暴露於ISTA測試後具有更均質產品(圖5C-D)。
結論：
將多種調配物暴露於旋轉及振動應力中並以目視方式以及利用靜態光散射觀察粒徑分佈。結果指示添加表面活性劑(聚山梨醇酯或泊洛沙姆188)可減輕因振動應力引起之攪動誘發之聚集(ISTA標準3A結果)。然而，僅泊洛沙姆188可減輕與V114調配物相關之振動及旋轉應力。
實例7：泊洛沙姆範圍發現
利用20 mM組胺酸(pH 5.8)及150 mM氯化鈉與0.25 mg/mL磷酸鋁佐劑(APA)如實例1至3中所述將PCV-15製備為小瓶映像(vial image)。對於旋轉攪動研究而言，利用在磷酸鋁佐劑(APA)上添加表面活性劑製備PCV-15。使用於4℃下旋轉側攪動24小時來設計攪動研究。穿過小瓶之光束之路徑(Tindel效應)可檢測微粒。
方法：
調配物之製備：
在II類生物安全櫃中如實例1至3中所述以無菌方式製備調配物。將調配物儲存於4℃下直至開始攪動研究為止。
表6：此研究中評估之調配物
旋轉攪動：
攪動研究之目的係使小瓶經受攪動條件且隨後確定彼等條件對聚集物形成之效應。將PCV-15調配物以0.75 mL之填充體積填充於未經硫酸鹽處理之具有13 mm塞之2 mL小瓶中。將小瓶於4℃下攪動24小時。使用最大速度下之實驗室規模多用途旋轉器用於旋轉攪動。將小瓶直接附接至用於側攪動之旋轉器。
在24小時時進行觀察。
結果：
在泊洛沙姆188不存在或PS80存在下，於4℃下在小瓶中旋轉攪動24 hr後之PCV15調配物形成沉澱。添加濃度介於0.025%與0.15%之間之表面活性劑泊洛沙姆188未觀察到產生微粒。然而，在較高濃度0.1%及0.15%下，在出現空氣/液體介面之小瓶區域上觀察到輕微濁度之外觀(展開)(表7)。
表7：表面活性劑對含有鋁之PCV15小瓶中因攪動誘發之聚集形成的影響
結論：
介於0.025-0.15%(w/v)之間之濃度下的表面活性劑泊洛沙姆188能夠防止小瓶中因攪動誘發之聚集。
實例8：防腐劑對因攪動誘發之聚集的效應
在旋轉攪動研究後利用不同防腐劑單獨或與表面活性劑組合研究15價肺炎球菌偶聯物疫苗-15(PCV-15)之穩定性。在20 mM組胺酸(pH 5.8)及150 mM氯化鈉與0.25 mg/mL磷酸鋁佐劑(APA)中製備PCV-15。將64 μg/mL之CRM197蛋白偶聯至4 μg/mL之型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F及33F肺炎球菌多醣(PnP)及8 μg/mL之型6B肺炎球菌多醣，總多醣濃度為64 μg/mL。
如實例4中所述實施旋轉攪動研究。利用添加單獨或與泊洛沙姆188組合之指定濃度之苯酚、2-苯氧基乙醇、間-甲苯酚、苯甲醇或氯丁醇製備PCV-15調配物主要成份。將一些防腐劑溶解於指定溶劑中。利用在4℃下旋轉側攪動24小時來設計攪動研究。以目視方式及在一些情形下利用靜態光散射觀察聚集。
結果：
在不存在泊洛沙姆188之情形下於4℃下在小瓶中旋轉攪動24 hr後之PCV15調配物通常形成沉澱。在所測試防腐劑中之任一者之情形下，添加表面活性劑0.1%泊洛沙姆188未觀察到產生微粒。
表8：防腐劑對含有鋁之PCV15之小瓶中因攪動誘發之聚集形成的影響
亦對代表性試樣實施靜態光散射以觀看尺寸分佈。在無泊洛沙姆188之調配物中，觀察到較大微粒之群組。含有泊洛沙姆188與間-甲苯酚或苯酚之調配物具有一個與未攪動試樣中觀察到之群組相當之顆粒群組(圖6A-C)。
結論：
所測試各種防腐劑對泊洛沙姆188抑制因攪動誘發之聚集的能力無有害效應。
實例9：pH及緩衝液對因攪動誘發之聚集的效應
在旋轉攪動研究後利用不同緩衝液及pH條件研究15價肺炎球菌偶聯物疫苗-15(PCV-15)之穩定性。在20 mM指定緩衝液及150 mM氯化鈉與0.25 mg/mL磷酸鋁佐劑(APA)中製備PCV-15。將64 μg/mL之CRM197蛋白偶聯至4 μg/mL之型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F及33F肺炎球菌多醣(PnP)及8 μg/mL之型6B肺炎球菌多醣，總多醣濃度為64 μg/mL。
對於旋轉攪動研究而言，在pH 5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.6、6.8、7.0及8.0下利用添加表面活性劑及滲透調節物質、及與滲透調節物質組合之表面活性劑製備PCV-15調配物主要成份。使用於4℃下旋轉側攪動24小時來設計攪動研究。目視觀察到聚集。
結果：
對於所測試緩衝液及pH條件而言，在不存在泊洛沙姆188之情形下於4℃下在小瓶中旋轉攪動24 hr後之PCV15調配物形成沉澱。在所測試緩衝液及pH條件中之任一者之情形下，添加表面活性劑0.1%泊洛沙姆188未觀察到產生微粒。
表8：緩衝液及pH條件對含有鋁之PCV15小瓶中因攪動誘發之聚集形成的影響
結論：
所測試各種緩衝液及pH對泊洛沙姆188抑制因攪動誘發之聚集的能力無有害效應。
實例10：不同分子量範圍之泊洛沙姆對因攪動誘發之聚集的效應
在旋轉攪動研究後利用不同市售泊洛沙姆研究15價肺炎球菌偶聯物疫苗-15(PCV-15)之穩定性。在20 mM組胺酸(pH 5.8)及150 mM氯化鈉與0.25 mg/mL磷酸鋁佐劑(APA)中製備PCV-15。將64 μg/mL之CRM197蛋白偶聯至4 μg/mL之型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F及33F肺炎球菌多醣(PnP)及8 μg/mL之型6B肺炎球菌多醣，總多醣濃度為64 μg/mL。
對於旋轉攪動研究而言，利用添加指定濃度之泊洛沙姆237、泊洛沙姆338或泊洛沙姆407製備PCV-15調配物主要成份。使用於4℃下旋轉側攪動24小時來設計攪動研究。目視觀察到聚集。
結果：
於4℃下在小瓶中旋轉攪動24 hr後且具有0.1%泊洛沙姆237之PCV15調配物未觀察到產生微粒。其他測試條件產生極小微粒，但比無泊洛沙姆之對照調配物顯著改良。
表9：不同分子量範圍之泊洛沙姆對含有鋁之PCV15小瓶中因攪動誘發之聚集形成的影響
亦對具有0.1%泊洛沙姆237之試樣實施靜態光散射以觀看尺寸分佈。此調配物與未攪動試樣中看到之群組(圖7)相當。
結論：
不同分子量範圍之泊洛沙姆的不同之處在於其抑制因攪動誘發之聚集的能力。條件之優化應允許完全抑制。
圖1A-B：於4℃(A)及37℃(B)下在攪動及未攪動下pH 5.8調配物的尺寸分佈。
圖2A-B：於4℃(A)及37℃(B)下在攪動及未攪動下具有0.1%(w/v)泊洛沙姆188之pH 5.8調配物的尺寸分佈。
圖3A-B：於4℃(A)及37℃(B)下在攪動及未攪動下具有0.1%(w/v)泊洛沙姆188之pH 7.0調配物的尺寸分佈。
圖4A-B：於4℃(A)及37℃(B)下在攪動及未攪動下具有0.1%(w/v)泊洛沙姆188、6%(w/v)蔗糖及50 mM NaCl之pH 7.0調配物的尺寸分佈。
圖5A-D：在ISTA標準運輸研究後有及沒有0.1%泊洛沙姆188之pH 5.8調配物的尺寸分佈：(A)來自pH 5.8調配物之運行1，(B)來自pH 5.8調配物之運行2，(C)來自具有0.1%泊洛沙姆188之pH 5.8調配物之運行1，(D)來自0.1%泊洛沙姆188之運行2。
圖6A-C：在以下條件下在攪動及未攪動下及pH 5.8、37℃下的尺寸分佈：在0.1%(w/v)泊洛沙姆188不存在下之間-甲苯酚(A)，在0.1%(w/v)泊洛沙姆188存在下之間-甲苯酚(B)，及在0.1%(w/v)泊洛沙姆188存在下之苯酚(C)。
圖7：於37℃下在攪動及未攪動下具有0.1%(w/v)泊洛沙姆237之pH 5.8調配物的尺寸分佈。
(無元件符號說明)

Claims (21)

  1. 一種調配物，其包含：(i) pH緩衝生理食鹽水溶液，其具有5.0至8.0範圍內之pH，(ii)泊洛沙姆(poloxamer)，其具有1100至17,400範圍內之分子量，及(iii)一或多種多醣-蛋白質偶聯物。
  2. 如請求項1之泊洛沙姆，其具有7,500至15,000範圍內之分子量。
  3. 如請求項1之泊洛沙姆，其具有7,500至10,000範圍內之分子量。
  4. 如請求項1之調配物，其中該泊洛沙姆係泊洛沙姆188或泊洛沙姆237。
  5. 如請求項1至4中任一項之調配物，其中該泊洛沙姆於該調配物中之最終濃度為0.001%至5%重量/體積該調配物。
  6. 如請求項1至4中任一項之調配物，其中該泊洛沙姆於該調配物中之最終濃度為0.025%至1%重量/體積該調配物。
  7. 如請求項1至4中任一項之調配物，其中泊洛沙姆188於該調配物中之最終濃度為0.05%至1.0%重量/體積該調配物或泊洛沙姆237於該調配物中之最終濃度為0.1%至1.0%重量/體積該調配物。
  8. 如請求項1至7中任一項之調配物，其中該pH緩衝生理食鹽水溶液具有5.2至8.0範圍內之pH。
  9. 如請求項1至8中任一項之調配物，其中該緩衝液係選自由Tris、磷酸鹽、琥珀酸鹽、組胺酸、MES、MOPS、HEPES、乙酸鹽或檸檬酸鹽組成之群。
  10. 如請求項1至9中任一項之調配物，其中該緩衝液係最終濃度為5 mM至50 mM之組胺酸、或最終濃度為1 mM至20 mM之琥珀酸鹽。
  11. 如請求項1至10中任一項之調配物，其中該生理食鹽水係以20 nM至170 nM之濃度存在。
  12. 如請求項1至11中任一項之調配物，其中該蛋白質係載體蛋白CRM197。
  13. 如請求項1至12中任一項之調配物，其中該多醣-蛋白質偶聯物包含一或多種肺炎球菌(pneumococcal)多醣。
  14. 如請求項1至13中任一項之調配物，其中該多醣-蛋白質偶聯物調配物係15價肺炎球菌偶聯物(15vPnC)調配物，其包含偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)血清型1多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型3多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型4多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型5多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型6A多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型6B多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型7F多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型9V多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型14多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型18C多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型19A多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型19F多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型22F多醣、偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型23F多醣及偶聯至CRM197多肽之肺炎鏈球菌血清型33F多醣。
  15. 如請求項1至14中任一項之調配物，其中該調配物進一步包含佐劑。
  16. 如請求項15之免疫原組合物，其中該佐劑係基於鋁之佐劑。
  17. 如請求項16之調配物，其中該佐劑係磷酸鋁。
  18. 如請求項17之調配物，其包含0.112 mg至0.130 mg元素鋁、140 mM至160 mM氯化鈉及18 mM至22 mM L-組胺酸緩衝液。
  19. 如請求項18之調配物，其係經調配含有以下物質之0.5 mL單一劑量：1.8 μg至2.2 μg每一種醣(但6B除外，其係3.6 μg至4.4 μg)；約32 μg CRM197載體蛋白；0.125 mg元素鋁(0.5 mg磷酸鋁)佐劑；約150 mM氯化鈉及約20 mM L-組胺酸緩衝液。
  20. 如請求項1至19中任一項之調配物，其中該調配物進一步包含防腐劑，該防腐劑係間-甲苯酚、苯酚、2-苯氧基乙醇、氯丁醇、苯甲醇或硫柳汞(thimerosal)。
  21. 一種小瓶或預填充注射器，其包含如請求項1至20中任一項之調配物。
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