JPH03175994A - 治療上活性のある組換え体酸性繊維芽細胞成長因子の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酸性繊維芽細胞成長因子ははじめに抽出及び分別塩析、
カルボキシメチル−セファデックスクロマトグラフィー
、ゲル濾過、カルボキシメヂルーセフ？デックスクロマ
トグラフィー、等電点電気泳動及び逆相高性能液体クロ
マトグラフィ（ＨＰＬ（：）を含む多段階法で均質に精
製されている（トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）米国特許筒４
．４４４．７６０号）。

組換え体ａＦＧＦ　（ｒ−ａＦＧＦｌはヘパリン−セフ
ァロースアフィニティークロマトグラフィー次いで逆用
１１ＰＬｃを組合せて用いる簡単な２段階クロマトグラ
フィー操作によって均質に精製されている（欧州特許出
願公告番号第２５９，９５３号）。

本発明は、細胞分裂誘起能が５倍増強され、投与緩衝液
に於ける溶解度が１７０　（＠増加し、回収率が９０％
以上である高濃度組換え体由来酸性繊維芽細胞成長因子
の改良ｇ４製方法を提供する。これは高投薬量のｒ　−
ａＦＧＦを処方することを可能にする。この方法はｒ　
−ａＦＧＦの全長形と末端欠損形を分離することちでき
る。

従って本発明の目的は１組換え体由来ヒト酸性繊維芽細
胞成長因子の大規模なバッチ精製に対して効率の良い方
法を提供することである。もう一つの目的は最終調剤に
先立ち、投与緩衝液中高濃度の活性タンパク質の大量溶
液を提供することである。更なる目的はａＦＧＦの全長
形と末端欠損形の分離を迅速且つ容易に行う方法を提供
することである。別の目的はグリコサミノグリカン安定
化ａＦＧＦを提供することである。

酸性繊維芽細胞成長因子［ａＦＧＦｌの改良された精製
方法を開示する。その方法は抽出、イオン交換クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相
ＨＰＬｃ、溶媒交換可溶化及び疎水的相互作用クロマト
グラフィーな含む、この方法は細胞分裂誘発能の増強及
び溶解度の増加をもたらし、組換え体ａＦＧＦの末端欠
損形と組換え体ａＦＧＦの分離を可能にする。

本発明は原核細胞あるいは真核細胞で産生された組換え
体酸性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦｌの精製に有用で
ある。真核細胞の種類としては酵母細胞及び補乳類細胞
がある。原核細胞の種類としては細菌細胞があり大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｃｉａ　ｃｏｌｉ）が好適である。

組換え体由来ａＦＧＦは欧州特許出願公告番号第２５９
．９５３号に記載されるような標準の組換え法を用いて
得られる０組換え体ａＦＧＦを生産する形質転換細胞は
それぞれの細胞のタイプに合った標準法を用いて増殖さ
せる。　ａＦＧＦは細胞培養液の回収又は洗浄細胞の機
械的又は化学的破壊によって得られ、細胞の機械的破壊
が好適である。一般に可溶性ａＦＧＦは、最初のイオン
交換クロマトグラフィープロセスに於てマトリックスへ
の結合が阻害される可能性のある不純物とａＦＧＦの結
合を最小にするために希釈される。

希釈された細胞を含まない抽出液に存在するａＦＧＦの
分離及び最初の精製はイオン交換クロマトグラフィーに
よって行なわれる。一般には弱カチオン交換体例えばＣ
ＭセファデックスＣ−５０，ＣＭセファロースファスト
フロー及びＳセファロースファストフロー（ファーマシ
ア）又はバイオ・レックス７０（バイオラド）をａＦＧ
Ｆの分離に使用することが好ましい、好適な樹脂はＣＭ
セファデックスＣ−５０である。分離は試料を大型（Ｊ
ｌセファデックスＣ−５０カラムに負荷し、不純物をリ
ン酸緩衝食塩水ｆＰＢｓｌ巾約１０ｍＭＥＤＴＡで溶出
し、　ａＦＧＦをＰＢＳ中約０．６　ＭＮａ（：１及び
２０＋＋ＭＥＤＴＡで溶出して行なわれる。従来の分離
方法と比較して著しい改良は樹脂量を増加し、バッチ吸
着法からカラム手法に切り換えることによって行なわれ
た１回収率は３倍以−Ｅ改善される。

分離ａＦＧＦの史なる精製はヘパリン又はヘパリン類似
体アフィニティー樹脂を用いて行なわれる。

アフィニティー樹脂の具体例はヘパリン−セファロース
２ヘパリン−セファロースファストフロー（ファーマシ
ア）　、　ＴＳＫゲルヘパリン５ｐＨ（トーソーーハー
ス）及びセルフイン（Ｃｅｌｌｆｉｎｅｌ−スルフェー
ト（アミコン社）を含みこれらに限定されないが、ヘパ
リン−セファロースが好適である。

ＣＭセファデックスカラムから溶出された酸性ａＦＧＦ
はヘパリン−セファロースカラムにかけられ、このカラ
ムはＰＢＳ中約０．８　ＭＮａＣｌで洗浄される。吸着
した生産物はＩｊＢＳ中約１．５　ＭＮａＣｌを用いて
カラムから溶出される。

典型的にはアフィニティーで精製されたａＦＧＦはまた
Ｃ４マトリックス例えばグイナマックス又はパイタック
を用いた分取用逆相高性能液体クロマトグラフ（−（Ｒ
Ｐ−１１Ｐ１．ｃ、ニヨッテｍ′ｇＪすり、　’ｌｌナ
ナックスが好適である。アフィニティーカラムからの試
料は分取用カラムにかけられ、０．１％トリフルオロ酢
酸（ＴＦＡ）巾約（０〜６０％）のＣＨＩＣＮの勾配で
溶出される。この工程は痕跡量の不純物例えばＤＮＡ及
びリポポリサッカライドを除き約９０％の回収をもたら
す。

約５０ｕ　ｇ／＋ｓ１以上に濃縮したＲＰ−１１ＰＬｃ
精製品をＰＢＳのような水性処方緩衝液に導入するとき
、精製ａＦＧＦは凝集体を形成しａＦＧＦが溶液から析
出するまでそのサイズが増大する。凝集は処理中に用い
られる容２３にその凝集体が付着するのでａＦＧＦのｔ
１失をきたす。

溶媒交換操作を行うことによって凝集が防止されａＦＧ
Ｆが可溶性の生物学的に活性な状態に保たれる１本明細
書で用いられる溶媒交換とはａＦＧＦの凝集体の形成を
妨げる条件下ＲＰ−ＨＰＬＣ溶出液溶媒を水性溶媒とコ
ントロールしながら交換することとして定義される。溶
媒交換を行う方法としてはこれに限定するちのではない
が透析、透析濾過、限外濾過及び透析を伴うアフィニテ
ィークロマトグラフィーが好ましい、一般にはａＦＧＦ
がアセトニトリル／トリフルオロ酢酸中にとけた形のＲ
Ｐ−ＨＰＬＣ溶出液を発熱物質を含まない水を加えて溶
液１ａ＋１当り約２ｍｇのタンパク質となるよう希釈す
る１次に希釈された溶液は中間溶液に対して透析され次
いで投与緩衝液に対して透析される。中間溶液は一般に
水溶液中及び適当な濃度下でタンパク質の空間立体配置
を変えることができるカオトロピック剤を含む、このよ
うな薬剤の具体例としては尿素グアニジン塩酸塩、ナト
リウムチオシアネート及び界面活性剤例えばドデシル硫
酸ナトリウムがあるがこれに限定されず、グアニジン塩
酸塩が好適である。スクロース又はマルトースのような
糖をカオトロピック剤の代わりに中間溶液ｔｉｖ＋とし
て使用することができる。中間溶液としてはまたジスル
フィド結合を還元する既知の還元剤例えばメルカプトエ
タノール、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリ
スリトール及びシスチンがあり、これらに限定されない
がＤＴＴが好適である。

好適な中間溶液は約０．１−１０ｍ１−１Ｏと約２〜５
Ｍグアニジン塩酸塩を含み透析は約２〜１５時間行なわ
れ、約７〜１１時間が好適である。中間溶液の容量は約
１０〜５００容量の範囲である。　ａＦＧＦはさらに試
料容量の約２〜６　Ｘ　１００　＠のＰＢＳのような投
与緩衝液に対して約１〜３日間透析される。　ＰＢＳに
対して透析を行なうと、　ｐｕｓ中約１．５〜２．５ｍ
ｇ／ｍｌ溶液に達する濃度が得られる。透析された酸性
繊維芽細胞成長因子は更に限外濾過によってＰＢＳ中約
巾約ｍｇ／ｍｌ溶液にａｔｍされる。限外濾過ハＹＭＵ
Ｕ（ｙｕｔｏ又はＹ１４３０）を有するアミコンセルで
行なうことが好ましく　ＹＭ３０が好適である溶媒交換
プロセスは大量の非沈殿性のａＦＧＦの生産のためスケ
ールアップされる。スケールアッププロセスでは透析チ
ューブのかわりに連続クロスフロー透析カートリッジを
用いる。このカートリッジは実際には半透膜で分かれた
２つの容器である。特に良いカートリッジは中空糸セル
ロース膜カートリッジｆＥｎＫａＡＧ）である。ＲＰ−
１１Ｐ！、Ｃカラムからの溶出液を発熱物質を含まない
水で約２　ｍｇ／ｍｌに希釈しこの試料はポンプで中空
糸に送られ透析液は繊維の外側で循環されて透析が行な
われる０両液は別のポンプで送られる。上述した溶媒交
換プロセスはクロスフロー透析システムの性能を高める
ために変更される。グアニジン塩酸塩の量を最少にする
ため最初の透析溶液として発熱物質を含まない水（最初
の溶液）約５〜２０容量を用いて大部分の有機性溶出液
を除去する。ついでａＦＧＦは約０．１〜ＩＯ＋＋ｍＤ
ＴＴを含む約２〜５Ｍのグアニジン塩酸塩に対して透析
されるが、約３Ｍグアニジン塩酸塩及び約５　ｍＭＤＴ
Ｔが好適である。この第二溶液に対するａＦＧＦの透析
は約５分から約Ｉ時間行うが、約２５分が好ましい、約
０，０５〜０．５Ｍグアニジン塩酸塩、約２〜１０容量
からなる第三溶液に対しａＦＧＦを約５分から約１時間
透析した。次いでａ　Ｆ　Ｇ　ＦはＰＢＳ約ｌＯ〜４０
容量に対して約５分から約１時間透析した。溶液は全て
ｐｌ＋約６．０〜８．０で用いられ透析溶液は約１〜５
０ｍ１／分の速度で循環させた。この多段階プロセスに
より組織修復の薬理物質としてｒ　−ａＦＧＦを処方す
るには十分過ぎるほどの収率でｒ　−ａＦＧＦを生じる
。

欧州特許出願公告番号第２５９．９５３号明細書に記載
される手法を変更して大腸菌で発現された組換え体由来
酸性繊維芽細胞成長因子は、形質転換細胞を特定条件下
で増殖させたとき完全長ｒ　−ａＦＧＦ及び末端欠損形
のｒａ　Ｆ　Ｇ　Ｆの両方を含む不均一標品を生じる。

本明細書で用いられる末端欠損形とは予憇される又は通
常の末端アミノ酸の１例以上が欠けでいるタンパク質を
、意味する。タンパク質をヘパリン−セファロース工程
により精製するとき疎水的相互作用（Ｈｌ）クロマトグ
ラフィーｆｌｌｌｃｌで定量したその濃度は約６５〜７
５％完全長ｒ　−ａＦＧＦ及び約２５〜３５％の末端欠
損形ｒ−ａＦＧＦの範囲にあると思われる。疎水的相互
作用クロマトグラフィーは従来の液体カラムクロマトグ
ラフィー操作又は高性能液体クロマトグラフィー操作を
用いて行なうことができる０通常の旧Ｃ樹脂としてはブ
チル−アガロース（ファーマシア）ヘキシル−アガロー
ス（アガロースヘキサン、ファーマシア）及びオクチル
−アガロース（ファーマシア）がありブチル−アガロー
スが好適である。これらの樹脂による標準クロマトグラ
フィー操作はタンパク質の統合性を維持し、これらは投
与緩衝液に極めて可溶性である。通常の旧Ｃはｒ　−ａ
ＦＧＦの溶解度を維持するための溶媒交換を必要とせず
、ＲＰ−１（ＰＬＣの代りに用いることができる。

Ｈｌ−ＨＰＬＣｌｆ’ｌ脂の具体例としてはヒドロボア
ー１１１ｃ　　（レーニン）５スフエロゲルー旧Ｃ（ベ
ックマン）　ＴＳＫゲルエーテル−５ｐＨ（トーソーハ
ス〉がありこれらに限定されないが、ＴＳＫゲルエーテ
ル−５ｐＨ及びヒドロポアー旧Ｃが好適である。ヘパリ
ン−セファロース生成物をヒドロポアー旧Ｃカラム（レ
ーニン）にかけ、　ＰＢＳ中約巾約ＬＭｔＮＨ，ｌ　２
ＳＯ４の逆塩勾配で溶出する。末端欠損形のｒａＦＧＦ
は完全長ｒ　−ａＦＧＦの前に溶出しこれは完全長ｒ　
−ａＦＧＦが末端欠損形より事実上疎水性であることを
示している。ｒ−ａＦＧＦはＰＢＳに対して透析時に不
溶性であり投与処方の而に上記操作による溶媒交換を必
要とする。　ｌ（［−ＨＰｌ、Ｃは精製プロセスでＩＰ
−ＨＰＬＣの代りに用いることができるが可溶性生産物
維持するために溶媒交換工程を必要とする。

精製ｒ−ａＦＧＦの生物活性はトーマスｉＴｈｏｍａｓ
）等Ｊ２口ｉｏ１．ｃｈｅｍ、第　２２５巻　５５１７
〜５５２０頁（１９８０年）から変更した繊維芽細胞細
胞分裂誘発検定を用いて評価される。先行技術の熱非働
化仔ウシ血清の代りにペニシリン−ストレプトマイシン
及びＩ４−グルタミンの両方を含む約７５％ダルベツコ
改良イーグル培地−２５％ハムＦ１２のＩＱ当り、約１
％インシュリン−セレン−トランスフェリンｆｌＴｓｌ
　、約０．４　ｇ　Ｌ−ヒスー’ｆ−ジン、５（ＩＩｉ
、ｇｃ７）ｊＭエタノールアミン、５．３５ｍｇのリノ
ール酸を含むウシ油清アルブミン１．２５ｇ、を加える
。

高純度可溶性ｒ　　ａＦＧＦは凍結より高い温度で長時
間貯蔵したとき生物活性を喪失し、製品寿命が短くなる
。この活性の損失は主に沈殿又は凝集によるものでｒ　
−ａＦＧＦの製剤を傷治癒製剤として必要な時間貯蔵す
ることができなくなるため欠点となる９本発明は貯蔵中
生物活性の損失を減少させる手段を提供する。熱不安定
性はグリコサミノグリカンをｒ　−ａＦＧＦに加えるこ
とによって防止することができる。グリコサミノグリカ
ンはプロテオグリカンに見い出されるポリサッカライド
鎖でありヒアルロネート、コンドロイチン硫酸、ケラタ
ン硫酸、ヘパラン硫酸及びヘパリンを含むが、これらに
限定されない、ヘパリンは好適な安定化剤である。ヘパ
リンはナトリウム、カリウム、アンモニウム、バリウム
、カルシウム又はマグネシウム塩として製造することが
でき、ナトリウム塩が好適である。酸性繊維芽細胞成長
因子はヘパリンナトリウム約０．０１１１ｇ／ｍｌ〜１
０．０ａｅｇ／ｍｌの添加によって安定化され、約０．
０１−１．５ｍｇ／ｍｌが好適である。４℃で貯蔵した
ｒ−ａＦＧＦ中ヘパリンを存在させると高い可溶性状態
のｒａＦＧＦを維持して生物活性の損失を完全に防止す
る。ヘパリンの安定化効果はｒ−ａＦＧＦを２５℃で貯
蔵するときいっそう顕著である。ヘパリン安定化ｒ　−
ａＦＧＦは約２０％活性を喪失するが、非安定化対照は
１００％活性を喪失する。

安定化ｒ　−ａＦＧＦは局所の傷癒合又は組織修復に有
用である。局所適用には種々の医薬処方が安定化ｒ−ａ
ＦＧＦの投与に有用である。このような処方には次の親
水性ワセリン又はポリエチレングリコール軟膏のような
軟膏、キサンタンゴムのようなゴムを含むことができる
ペースト剤、水酸化アルミニウム又はアルギン酸ナトリ
ウムゲルのようなゲル剤、ヒト又は動物アルブミンのよ
うなアルブミン剤、ヒト又は動物コラーゲンのようなコ
ラーゲン剤、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキル
セルロース及びアルキルヒドロキシアルキルセルロース
例えばメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース
、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメ
チルセルロース及びヒドロキシプロピルセルロースのよ
うなセルロース剤、プルロニック■、ポリオール例えば
プルロニックＦ　−１２７のようなポロキサマー剤、テ
トロニック１５０８のようなテトロニック剤及びアルギ
ン酸ナトリウムのようなアルギネート剤があるがこれら
に限定されない、医薬処方は可溶化及び安定化ｒ　−ａ
ＦＧＦを約０．１〜１００　ｕｇ／ｌの量で含む。

次の実施例は本発明を具体的に説明するものであるが、
これに限定される６のではない。

Ｘ嵐亘ユ 通貫 精製工程はＨＰＬＣ工程を除き４℃で行なった。大腸菌
細胞で発現した組換え体ヒトａＦＧＦ（ｒ−ｈａＦＧＦ
ｌの凍結細胞ペースト（７００ｇ）を細胞破壊緩衝液１
０、１２　Ｍ　Ｎａｃ、，１０ｍＭ　ＥＤＴＡの２，８
氾に６．２閤−リン酸ナトリウムｐＨ７，２中１　ｍＭ
ＰＭｓＦを存在させた又は存在させないもの）に浮遊さ
せ細胞を冷却系を備えたラボラトリ−ホモジナイザー（
ゴーリンコーポレーション）に２回通過させて破壊した
。この細胞溶解物を細胞破壊緩衝液（２，８β）を加え
て希釈し生産物と不純物をかい離させた。希釈した溶菌
液をベックマン遠心分離機（モデルＪ−６Ｍ／Ｅ）を用
いて４．００Ｏｒｐｍ（４，０００ｘ９）で２０分間遠
心分離して細胞破片を除去した。得られた上清は細胞を
含まない抽出液であり、大腸菌細胞に存在するほとんど
のａＦＧＦ！＞９５％、　ａＦＧＦ約１２ｇ）を含む、
　ａＦＧＦの濃度はグアニジン−ＨＣｌで処理した試料
をＲＰ−ＨＰＬＣにより定量した。

実施例１で得た細胞を含まない抽出液に存在する生産物
（１２ｇｌをまず６．２ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７，
２中０．１２Ｍ　Ｎａｃ、，１０ｍＭ　ＥＤＴＡで予め
平衡にしたｃ、ｌセファデックスＣ−５０カラム（２５
，２Ｘ　３０ｃｍ１　に試料を負荷して精製した。試料
負荷が完了した後、不純物を６．２−リン酸ナトリウム
ｐＨ７，２中０．１２Ｍ　ＮａＣＬ、　ｌＯｍｕ　ＥＤ
ＴＡの４０４２を用いてカラムから溶出した。結合した
成長因子ｉ７．７ｇ）は６．２−リン酸ナトリウムｐＨ
７，２中０．６　ＭＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡを用
いて１本のピークとしてカラムから溶出した。

生成物の細胞分裂誘発検定は成長因子が生物学的に活性
状態にあることを示した（ｐｎｓｏ・２５０ｐｇ／ｍ４
）。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色は生成物中少量の不純物（Ｍｒ
＜１０．０００）ノ存在を示した　（＆［９０Ｘ馳）。

タンパク質、ＤＮＡ及びリポポリサッカライド（ＬＰＳ
Ｉ　を含むほとんどの不純物はこのクロマトグラフィー
工程で除去された（表１）。

衣１ 大腸菌からｒ−ｈａＦＧＦの精製 ｇｌ （％） ｌｐｇ／ａ＋ｌ） 粗細胞 溶解物 １２．５ １［］０ ０９ ３、７００ ４、δｘｌＯ” （Ｊｌセフ７デツクス ７．７ ２ ５ ＜１３ １．６ｘｌＯ’ ５０ ＲＰ−１１ＰＬｃ ４．５ ６ 〈１３ ３ ０００ 実１０生旦 実施例２で得たＣＭセファデックス溶出液（７，７ｇｒ
　−ｈａＦＧＦ）を６．２ｎ＋ｕ　リン酸ナトリウムｐ
Ｈ７，２中０．６　ＭＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡで
流速２０ｍ１／分で予め平衡にしたヘパリン−セファロ
ースカラム１１１．３　ｘ１３ｃｍｌ　に負荷した。吸
着されない物質を６．２ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７，
２中０．８　ＭＮａＣｌで溶出しで洗浄した。結合した
成長因子を６．２ｍ−リン酸ナトリウムｐＨ７，２中１
．５　ＭＮａＣｌにより１本のピークとして溶出した。

ｒ　−ｈａＦＧＦ（ａＦＧＦ７．５　ｇ）の回収率は９
７％であり、ＬＰＳは１８０分の１に減少した。アフィ
ニティー精製生成物の細胞分裂誘発活性はＥＤｓｏ＝１
４１ｐｇ／ｍｌであり（表１参照）　、　ＰＢＳ中成長
因子の高溶解度（５ｒａｇ／ｍｌ　）は生産物が高活性
状態にあることを示した。

実施例３で得たヘパリン−セファロース精製物を０．１
％）−リフ　ルオｃ、酢酸（ＴＦＡＩ中１２％ＣＨ，Ｃ
Ｎ　１’平衡にした分取用Ｃ，−ＲＰ−ＨＰＬＣカラム
（グイナマックスＣ，３００人１２ｕ　４．１４Ｘ　２
５ｃｍ＋）に負荷した。このカラムを流速２０ｍ１／分
で０．１％ＴＦＡ中１２〜２４％ＣＯユＣＨの直線勾配
により８分間溶出し次いで（１，１％ＴＦＡ中２４〜６
０％ＣＨ，ＣＮの直線勾配により３６分間溶出した。成
長因子は１本のピークとして溶出し＋０．８ｇ）　、　
ＬＰＳは３９分の１に減少した。

ｒ　−ｈａＦＧＦはこのプロセス中凝集するようになり
ＰＢＳにおける生産物の溶解度を高めるために脱凝集を
必要とした。

実施例４で得たＲＰ−１（ＰＬＣ精製生成物ｆ（：ｌ＋
、（：Ｎ／ＴＦＡ中０．１８ｇ）を水で濃度２．４ｍｇ
／＋ｍｌ　（７５ｍＭ）に希釈し、透析セルロースバッ
グ（分子Ｊｉ１６．０００〜ａ、ｏｏｏカットオ）・ス
ペクトラムメディカルインダストリーズ社）に入れた。

この物質をふたをしたビン中で５薄ＭＤＴＴ中３Ｍグア
ニジンーＨＣｌ　３．５１２で２回９時間、次いでＰＢ
Ｓ７Ｊ２で４回２日間透析した。

いくらかの沈殿を含む得られた透析物をＩＥＣ遠心分離
機モテルＤＰＲ−６００（ダモン／ＩＥ（：ｌ　テ２．
００Ｏｒｐｍに於て５分間遠心分離して沈殿を除去した
。次いで上演を０．２μステリペツクスーＧＶフイルタ
ーユニツト（ミリボア）により濾過した。ｉ！！過後非
凝集ａＦＧＦ　（０，１７ｇ　）　ハ９０％回収率及び
ＰＥｌ５中濃度２　ｍｇ／ａ＋１を示し、生物学的に活
性であった（ＥＤ、。・１２６ｐｇ／Ｉａｌｌ　。

２段階透析によるｒ　−ｈａＦＧＦの凝集防止として透
析チューブを使用する代わりとして迅速な拡大可能な方
法がＥｎＫａクロスフロー透析システムを用いて開発さ
れた。このシステムは中空糸セルロース膜カートリッジ
（１０，ロロＯＭＷカットオフ）と２個のポンプを使用
する。アセトニトリル／　ＴＦＡ中ａＦＧＦ　（１，６
ｎ＋ｇ／ｍ１．０．２７　ｇ　）の溶液は中空糸細管の
内側を通って循環させ、外ＩＩ＋には透析溶液を反対の
方向に一度循環させた。

２段階透析はカートリッジでの方法の性能を高めるため
に変更を加えた（表２）。発熱物質を含まない水（ｌＩ
２）を最初に１回通してほとんどのＴＦＡ／アセトニト
リルを除去した１次いで３Ｍグアニシン−Ｈ（：ｌ　／
　５　ｍＭＤＴＴ／１０ｍ−リン酸ナトリウムｐＨ７，
２ｆ０．５　Ｒ）を２５分間にわたって１回通した。グ
アニジン−ＨＣｌの迅速除去によるｒ　−ｈａＦＧＦの
沈殿を避けるために段階的透析を１０ｍＭリン酸ナトリ
ウムｐ１１７．２中０．１Ｍグアニジン−１１ｃＩ（Ｉ
Ｒ）を用いて行なった。残留グアニジンを１回通過のＰ
ＢＳ（２Ｉ２）に対して透析して除去した。透析したｒ
　−ｈａＦＧＦを０．２ｕフイルターに通過させた。

この拡大可能な操作により高細胞分裂誘発活性を有する
ｆＥＤｓｏ：２２４ｐｇ／ｍｌ）可溶性ｒ　−ｈａＦＧ
Ｆ　０．２６ｇが得られた。

及１ ＥｎＫａクロスフロー透析カートリッジを用いる溶媒交
換条件 （Ｃ） ｍ１７分 分 発熱物質を 含まない水 ０ ０ ５ｍ［ｌＴＴ中３Ｍ り？ニシン　塩酸塩 ０．５ ０ ５ ０、＋１４り７ニシン 塩酸塩 ０ ０ ＰＢＳ ０ 【００ 約ＩＯ％の末端欠損ｒ　−ｈａＦＧＦ及び約９０％の完
全長ｒ　−ｈａＦＧＦを含むことがわかっているアフィ
ニティー精製物（０，２ｍ１．２．６ｍｇ）をＰＢＳ中
３Ｍ（Ｎ＋４．１　、ＳＯ，で予め平衡にしたヒドロボ
アー旧Ｃカラム（４，６ｘ　１０！Ｉ１１、粒子サイズ
１２μ、細孔サイズ３００＾、レーニンインスッルメン
ト社）に流速１　ｍ１７分で負荷した。このカラムをＰ
ＢＳ中２〜Ｉ　Ｍ　（Ｎｌ＋４＋　２ＳＯ，の逆境勾配
で４０分間溶出した（第１図）、末端欠損ａＦＧＦを含
む小さなピーク画分は完全長ｒ　−ｈａＦＧＦ（＞　９
９％）を含む大きなピークの前に溶出した。これらの画
分のＮ−末端アミノ酸配列解析の結果は大きなピークで
ある全長ｒ　−ｈａＦＧＦが末端欠損ｒ　−ｈａＦＧＦ
を含まないことを示し、小さい方のピークは７９％の末
端欠損ｒ　−ｈａＦＧＦと２１％の完全長ｒ　−ｈａＦ
ＧＦを含んでいた。細胞分裂誘発検定の結果は両ピーク
画分が生物学的に有効な成長因子を含むことを示した。

Ｘ眞奥ニ ブチル−アガロース及びヘキシル−アガロース疎互　　
クロマトグラフィー 約７０％の完全長ｒ−ａＦＧＦを含み、２０％は１個ア
ミノ酸が欠損し、約ｔＯ％は２個のアミノ酸が欠損して
いることがわかっているヘパリン−セファロース精製ｒ
　−ｈａＦＧＦ　（１６５ｎ＋ｇｌを同量の３Ｍ（Ｎｌ
（、！、ＳＯ，と混合した。この混合液をＰＢＳ中２Ｍ
ｆＮＨ，ｌ　２ＳＯ，で予め平衡にしたブヂルーアガロ
ースカラム（２Ｘ５ｃｍ、ファーマシア）にかけた、こ
のカラムをＰＢＳ中１．８〜１．　Ｍ　（ＮＨ４１２Ｓ
０４の逆境勾配４００ｍ１で溶出しこの溶出液をＵ、Ｖ
、吸収により２８０ｎｍでモニターした。Ｕ、Ｖ、吸収
画分を実施例６で記載した疎水的相互作用］ＩＰＬｃに
よって検定した。完全長ｒ　−ｈａＦ［、Ｆ画分が溶出
する前にまず末端が２つ欠損したｒ　−ｈａＦＧＦの多
い両分が溶出し、次いで１つの末端が欠損したｒ　−ｈ
ａＦＧＦが溶出した。このプロセスでｒ　　ｈａＦＧＦ
の末端欠損を含まない完全長ｒ　−ｈａＦＧＦ５６ｍｇ
が得られた。ブチル−アガロースカラムクロマトグラフ
ィーの分解能は旧−ＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃで見られるよりわ
ずかに少なかった。このカラムから溶出した精製全長ｒ
　−ｈａＦＧＦはＰＢＳに対する透析によってｆＮｌｌ
、）　、ＳＯ，を除去した後処方緩衝液［ＰＢＳ＋　に
加えたとき可溶のままであった。

上述したヘパリン−セファロース精％ｌｒ−ｈａＦＧＦ
（１１０ｍｇｌ　を上述した条件下でヘキシル−アガロ
ースカラム（２，５Ｘ　５　ｃｍ、ファーマシア、ヘキ
サミン）により処理した。同様に、他の成分を含まない
完全長ｒ−ｈａＦＧＦ（２０ｍｇ）は末端欠損ｒ　−ｈ
ａＦＧＦの多い画分の後に溶出した。精製ｒ　−ｈａＦ
ＧＦはＰＢＳに対する透析時に可溶であった。

実施例５及び６で得た０、　４ｍｇ／ｍ１．１．２Ｈ／
ｉＩｌ及び２．　ｌＩＩＩｇ／＋１の濃度の高純度可溶
性ｒ　−ｈａＦＧＦを最終濃度０．１５ｍｇ／ｍｌのヘ
パリンナトリウムＵＳＰ　（粉末、ヘパーインダストリ
ーズ社）と混合した。この混合したｒ　−ｈａＦＧＦと
ヘパリンを４℃あるいは２５℃で４〜７ケ月間貯蔵し安
定性と細胞分裂誘発活性を定量した。結果を次の表に示
す ＦＧＦ （ｎ＋ｇ、ｍｌｌ 衣旦 ＰＢＳ中可溶性ａＦＧＦの安定性 安定化剤　　貯　蔵　　条　件　　ＢＦＧＦヘパリン　
　温　度　　長　さ　　安定性ｆＯ，１５ｍｇ／ｎ＋ｌ
）　　（℃）　　　　（月）　　　（％）マイトジエネ
シス 活性 ＥＤ、。ｆｐｇ／ｍ１１ ０．４ ４　　　　　　７　　　　　５０　　　　　　１５０＋
　　　　　　４　　　　　　７　　　　　＞９５　　　
　　　１４５５５０ ＋　　　　　２５　　　　　　７　　　　８０　　　　
　　１８２１．２ ２．１ ４　　　　　　６　　　　　５８　　　　　　２２４＋
　　　　　　４　　　　　　６　　　　　＞９５　　　
　　　１５８５６５ ＋　　　　　　２５　　　　　　６　　　　８３　　　
　　　２００５６４ ＋　　　　　　４　　　　　　５　　　　　＞９５　　
　　　　１５８−　　　　　２５　　　　　　４　　　
　　０＋　　　　　　２５　　　　　　５　　　　　＞
９５　　　　　　１７０

【図面の簡単な説明】

第１図は ａ）完全長及び末端欠損ｒ　−ｈａＦＧＦを含む混合試
料 ｂ）完全長ｒ　−ｈａＦＧＦ Ｃ）最初の１個のアミノ酸がアミノ末端から取り除かれ
た末端欠損ｒ−ｈａＦＧＦ ｄ） 最初の２個のアミノ酸がアミン末端から取り除かれた末
端欠損ｒ　−ｈａＦＧＦ の旧Ｃ分離図を示す。 図面の；ンＺ丁向吉に変更なし） ＩＧ　１Ｂ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ａ、抽出、 ｂ、分離、 ｃ、アフィニティークロマトグラフィー、 ｄ、分取用逆相クロマトグラフィー及び ｅ、溶媒交換、 の一連の工程を包含している、形質転換微生物から均質
   的で純粋な生物学的に活性なヒト組換え体酸性繊維芽細
   胞成長因子を得る方 法。 ２、ａ、酸性繊維芽細胞成長因子を形質転換微生物から
   機械的破壊次いで迅速希釈、遠心分 離及び上清液の回収によって抽出し、 ｂ、分難がカルボキシメチルセファデック ス樹脂により酸性繊維芽細胞成長因子を ｐＨ７．２のリン酸緩衝液中０．６Ｍ塩化ナトリウムで
   溶出するイオン交換クロマトグラ フィーを包含し、 ｃ、アフィニティークロマトグラフィーはヘパリン−セ
   ファロースカラムによりｐＨ７．２の１．５ＭＮａＣｌ
   で溶出し、 ｄ、分取用逆相高性能液体クロマトグラ フィーはダイナマツクスＣ＿４カラムによるものであり
   、 ｅ、溶媒交換は蒸留水、次に還元剤と混合したカオトロ
   ピック剤に対して透析し、次い で蒸留水に対して透析する 請求項１記載の方法。 ３、請求項１記載の方法によって調製されていることを
   特徴とする均質で純粋な生物学的に活性なヒト酸性繊維
   芽成長因子。 ４、ヒト酸性繊維芽細胞成長因子が水性処方緩衝液に５
   ０μｇ／ｍｌ以上の濃度で可溶である請求項３記載の均
   質で純粋な生物学的に活性なヒト酸性繊維芽細胞成長因
   子。 ５、疎水的相互作用クロマトグラフィーの使用を含む、
   成長因子の混合物から生物学的に活性な均質的に純粋な
   完全長の成長因子及び末端欠損形組換え体酸性繊維芽細
   胞成長因子を得る方法。 ６、実質的に末端除去形組換え体ヒト酸性繊維芽細胞成
   長因子を含まない請求項５記載の方法で調製した完全長
   組換え体ヒト酸性繊維芽細胞成長因子。 ７、実質的に完全長組換え体ヒト酸性繊維芽細胞成長因
   子を含まない請求項５記載の方法で調製した末端除去形
   組換え体ヒト酸性繊維芽細胞成長因子。 ８、生物活性の損失を防ぐため組換え体ヒト酸性繊維芽
   細胞成長因子を十分に安定化する量のヘパリンを組成物
   に混合することを特徴とする、活性成分として組換え体
   ヒト酸性繊維芽細胞成長因子を含む可溶性水性医薬組成
   物を安定化する方法。 ９、ａ、抽出、 ｂ、分離、 ｃ、アフィニティークロマトグラフィー ｄ、疎水的相互作用クロマトグラフィー及びｅ、溶媒交
   換、 の一連の工程を包含している、形質転換微生物から均質
   で純粋な生物学的に活性なヒト組換え体酸性繊維芽細胞
   成長因子を得る方法。 １０、ａ、酸性繊維芽細胞成長因子を形質転換微生物か
   ら機械的破壊次いで迅速希釈、遠心分 離及び上清液の回収によって抽出し、 ｂ、分離がカルボキシメチルセファデック ス樹脂によるイオン交換クロマトグラ フィーを包含し、酸性繊維芽細胞成長因子 をｐＨ７．２のリン酸緩衝液中０．６Ｍ塩化ナトリウム
   で溶出し、 ｃ、ヘパリン−セファロースカラムによるアフィニティ
   ークロマトグラフィーはｐＨ７．２の１．５ＭＮａＣｌ
   で溶出し、 ｄ、ＴＳＫゲルＥｔｈｅｒ−５ＰＷ又はＨｙｄｒｏｕｏ
   ｒｅ−ＨＩＣによる疎水的相互作用−高性能液体クロマ トグラフィーにおいて酸性繊維芽細胞成長 因子をリン酸緩衝食塩水中２〜１Ｍ硫酸ア ンモニウムの逆塩勾配で溶出し、 ｅ、溶媒交換は蒸留水次に還元剤と混合したカオトロピ
   ック剤に対して透析し次にカオ トロピック剤、次いで蒸留水に対して透析 する 請求項９記載の方法。 １１、請求項９記載の方法によって調製されていること
   を特徴とする均質で純粋な生物学的に活性なヒト酸性繊
   維芽細胞成長因子。 １２、ヒト酸性繊維芽細胞成長因子が水性処方緩衝液に
   ５０μｇ／ｍｌ以上の濃度で可溶である請求項１１記載
   の均質で純粋な生物学的に活性なヒト酸性繊維芽細胞成
   長因子。 １３、ａ、抽出、 ｂ、分離、 ｃ、アフィニティークロマトグラフィー、 ｄ、疎水的相互作用クロマトグラフィー、 の一連の工程を包含している、形質転換微生物から均質
   的に純粋な生物学的に活性なヒト組換え体酸性繊維芽細
   胞成長因子を得る方 法。 １４、ａ、酸性繊維芽細胞成長因子を形質転換微生物か
   ら機械的破壊次いで迅速希釈遠心分離 及び上清液の回収によって抽出し、 ｂ、分離がカルボキシメチルセファデック ス樹脂によるイオン交換クロマトグラ フィーにおいて酸性繊維芽細胞成長因子を ｐＨ７．２のリン酸緩衝液中０．６Ｍ塩化ナトリウムで
   溶出することを包含し、 ｃ、ヘパリン−セファロースカラムによるアフィニティ
   ークロマトグラフィーはｐＨ７．２の１．５ＭＮａＣｌ
   で溶出し、 ｄ、ブチル−アガロース又はヘキシル−アガロースによ
   る疎水的相互作用クロマトグラ フィーは酸性繊維芽細胞成長因子をリン酸 緩衝食塩水中１．８〜１Ｍ硫酸アンモニウムの逆塩勾配
   で溶出する 請求項１３記載の方法。 １５、請求項１３記載の方法で調製されていることを特
   徴とする均質で純粋な生物学的に活性なヒト酸性繊維芽
   細胞成長因子。 １６、ヒト酸性繊維芽細胞成長因子が水性処方緩衝液に
   ５０μｇ／ｍｌ以上の濃度で可溶である請求項１５記載
   の均質で純粋な生物学的に活性なヒト酸性繊維芽細胞成
   長因子。